Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica / Streptococcus agalactiae (SGB) es una bacteria Gram positiva anaeróbica facultativa capaz de colonizar el tracto genitourinario de un 15 a un 40% de mujeres sexualmente activas. En la mayoría de los casos la infección con este patógeno es asintomática pero en neonatos puede originar sepsis, meningitis y neumonía. A partir del año 1990 el CDC (Center for Disease Control and Prevention) ha implementado una serie de protocolos de prevención dirigidos a mujeres embarazadas los cuales constan de pruebas microbiológicas realizadas entre las 35 y 37 semanas de gestación y la aplicación de antibióticos intraparto en mujeres colonizadas. A pesar de que medidas han tenido un alto impacto en la disminución de la incidencia de la infección por SGB este patógeno persiste como el único y más frecuente aislado desde la sangre o del fluido cerebroespinal de infantes menores de 3 meses de edad y de mujeres con infecciones intraparto en Estados Unidos y en otros países industrializados. Numerosos estudios realizados a neonatos sanos nacidos de madres colonizadas con SGB indican que estos tienen niveles superiores de anticuerpos IgG transferidos transplacentalmente que aquellos que desarrollaron la infección. Basado en este hecho actualmente se trabaja arduamente en el desarrollo de una vacuna capaz proteger a mujeres embarazadas y sus infantes. En la actualidad, vacunas en base a polisacáridos conjugados están en Fase clínica III, con el inconveniente de que la vacuna ensayada será serotipo dependiente y solamente inducirá una respuesta inmune protectora contra los serotipos incluidos en su formulación (3 de 10 serotipos). Vacunas en base a proteínas conservadas de SGB se encuentran en estudio, una de ellas es la proteína SIP (Surface Immunogenic Protein), con la cual se trabaja en la Sección de Biotecnología del ISPCH. En este estudio se evaluará la respuesta inmune protectora de un prototipo de vacuna en base a la proteína recombinante SIP de SGB, evaluando parámetros inmunológicos que permitan demostrar la inducción de inmunidad protectora en modelo ratón

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / En el metabolismo heterotrófico, NADH y NADPH se producen a partir de la oxidación de intermediarios por las deshidrogenasas presentes en las vías del metabolismo central. Durante el crecimiento de Escherichia coli en glucosa como única fuente de carbono, un tercio de la producción total del NADPH proviene de las deshidrogenasas de la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato: la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Diversos grupos han estudiado como se altera la fisiología de E. coli cuando se modifican las razones NADH/NAD y NADPH/NADP, encontrando que la sobreproducción de NADPH puede llevar a la inviabilidad celular cuando se utiliza glucosa como única fuente de carbono. Estudios para comprender la importancia del balance de cofactores han llevado a cambiar la especificidad de sustrato de estas enzimas, de modo que puedan usar NAD como cofactor en lugar de NADP. Este enfoque ha sido fructífero en el caso de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, pero no en el caso de 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Esta enzima cataliza la descarboxilación de 6-fosfogluconato para producir ribulosa 5-fosfato, usando NADP como cofactor con alta especificidad. Una forma de estudiar este problema es investigando el efecto en el metabolismo, de forzar el flujo de glucosa hacia la vía de las pentosas fosfato. Bajo condiciones de crecimiento en glucosa, la sobreproducción de NADPH generaría una reducción significativa de la tasa de crecimiento de E. coli. La hipótesis de este trabajo es que el cambio de especificidad in vivo de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa de Escherichia coli desde NADP a NAD, permite una recuperación parcial en la tasa de crecimiento en una cepa Δpgi ΔudhA, incapaz de sobrevivir en medio mínimo con glucosa como única fuente de carbono, debido a la alteración en la topología de las vías centrales del metabolismo. Para cambiar la especificidad por cofactor de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa, en este trabajo, se implementaron metodologías de diseño racional y evolución dirigida para lograr la forma NAD específica. Para identificar posiciones determinantes de la especificidad por NAD(P) se realizó un análisis de traza evolutiva de la familia 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Se encontró 3 loops que serían relevantes para la especificidad por NAD(P), incluyendo el motivo NRX3K contenido en el loop β2-α2 del bolsillo de unión a dinucleótido en la enzima de E. coli. Desde este análisis, se generó mediante mutagénesis sitio dirigida la variante N33D-R34V-S35K-K38N. Debido a la presencia de estas mutaciones, la KM para NAD disminuyó 5 veces mientras que no se observó actividad con NADP. Se generó la cepa de E. coli Δpgi Δ(edd-eda) ΔudhA Δgnd mediante la eliminación del gen de fosfoglucosa isomerasa, el operón Entner-Doudoroff, de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa y de la transhidrogenasa UdhA, que reoxida el NADPH. Esta cepa presentó una marcada disminución en la tasa de crecimiento debido al incremento en la producción de NADPH al desviar el flujo de glucosa a través de la vía de las pentosas fosfato. Esta mutante se transformó con un plásmido que poseía la versión del gen de 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NAD, encontrándose que la presencia de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa productora de NADH le permite a esta bacteria recuperar la capacidad de crecer en medio mínimo suplementado con glucosa como única fuente de carbono. Para incrementar la especificidad de la enzima por NAD, se generó una librería por mutagénesis de saturación de sitios en 4 residuos dentro de los 3 loops. Además, se desarrolló un sistema de selección basado en la cepa de E. coli Δpgi Δ(edd-eda) ΔudhA Δgnd. Debido a las diferencias en las velocidades de crecimiento, se logró diseñar un sistema de selección basado en el enriquecimiento de cultivo, aislando aquellas cepas que estaban complementadas con 6-fosfogluconato deshidrogenasa productora de NAD. Sin embargo, al usar el protocolo propuesto se observó que los niveles de expresión de las variantes de enzimas varían considerablemente entre antes y después de someter la cepa a selección en medio mínimo, por lo que el protocolo debe ser optimizado para que el cepa sea utilizada como sistema de selección para una librería de variantes 6-fosfogluconato deshidrogenasa. De este trabajo se concluye que el uso in vivo de una variante de 6-fosfogluconato deshidrogenasa con un cambio de especificidad de cofactor desde NADP a NAD, permite recuperar parcialmente el crecimiento en medio mínimo suplementado con glucosa como única fuente de carbono, probablemente debido a modificaciones en el balance de los cofactores NAD(P)H/NAD(P). Finalmente, la relación entre el crecimiento y la especificidad de las deshidrogenasas del metabolismo central puede ser utilizada como método de selección de variantes con especificidad de cofactor cambiada de NADP a NAD mediante evolución dirigida / In the heterotrophic metabolism, NADH and NADPH are produced from the oxidation of intermediates by dehydrogenases present in central metabolism pathways. During the growth of Escherichia coli in glucose as sole carbon source, one third of the total NADPH production belongs to the oxidative branch of the pentose phosphate pathway: the glucose 6-phosphate dehydrogenase and the 6-phosphogluconate dehydrogenase. Several groups have been studying how the E. coli physiology is modified when NADH/NAD and NADPH/NADP are altered, finding that NADPH overproduction could lead to cell unviability when glucose is the sole carbon source. Studies to understand the importance of cofactor balance have lead to change the substrate specificity of theses enzymes, in order to use NAD as cofactor instead of NADP. This approach has been succeeding for glucose 6-phosphate dehydrogenase, but not for 6-phosphogluconate dehydrogenase. This enzyme catalyzes the decarboxylation of 6-phosphogluconate to produce ribulose 5-phosphate, using NADP as cofactor with high specificity. One form of to study this problem is investigating the effect in the metabolism, due to force the glucose flux through the pentose phosphate pathway. Under glucose growth conditions, NADPH overproduction would generate a significant reduction in growth rate of E. coli. The hypothesis of this work is that the specificity change in vivo of the 6-phosphogluconate dehydrogenase from E. coli, from NADP to NAD, allows to restore partially the growth rate in a Δpgi ΔudhA strain, unable to grow in minimal media with glucose as sole carbon source, due to modifications in the topology of the central metabolism pathways. To change the cofactor specificity of the 6-phosphogluconate dehydrogenase, in this work, rational design and directed evolution methodologies were implemented to obtain the NAD-specific form. To identify determinants positions of the NAD(P) specificity, evolutionary trace analysis to the 6-phosphogluconate dehydrogenase family was performed, finding 3 loops that could be relevant for NAD(P) specificity, including the β2-α2 loop containing the NRX3K motif of the dinucleotide binding pocket of the E. coli enzyme. From this analysis, the variant N33D-R34V-S35K-K38N was generated by site-directed mutagenesis. Due the presence of these substitutions, the NAD KM decreased 5-times and no activity was observed with NADP. A E. coli Δpgi Δ(edd-eda) ΔudhA Δgnd strain was generated by deleting phosphoglucose isomerase gen, Entner-Doudoroff operon, 6-phosphogluconate dehydrogenase and UdhA transhydrogenase, which reoxidize NADPH. This strain shows a remarkable decreased growth rate due to NADPH production increment by forcing glucose flux through pentose phosphate pathway. This strain was transformed with a plasmid bearing a 6-phosphogluconate dehydrogenase gen variant NAD-dependent, finding that the presence of the NADH-producing 6-phosphogluconate dehydrogenase allows the bacteria to restore the capacity to grow in minimal media with glucose as sole carbon source. In order to increase the NAD specificity, a clone library by site-saturation mutagenesis of 4 residues within the 3 loops was performed. In addition, a selection strategy based on the designed strain was developed. Since the growth rates differences, a selection system based on enrichment culture, isolating NAD-producing 6-phosphogluconates bearing strains. However, with the proposed protocol, enzymes variants expression levels vary between before and after strain culturing in minimal media, so the protocol must be optimized in order to use the strain as a selection system for a 6-phosphogluconate dehydrogenase library. We conclude from this work that the usage in vivo of a 6-phopshogluconate dehydrogenase variant with a specific change from NADP to NAD, allows partially restore the growth rate of an unviable strains in glucose as sole carbon source, probably by modifications in the NAD(P)H/NAD(P) cofactors balance. Finally, the relation between growth rate and central metabolism dehydrogenase specificity can be used for biotechnological purposes, like a selection system for directed evolution / FONDECYT 1121170 y 1140754 ; CONICYT PCHA/Beca Magíster

Los hidrocarburos de petróleo constituyen uno de los mayores contaminantes de ambientes terrestres y marinos. Aunque la evaporación y la fotooxidación contribuyen a la detoxificación, su degradación completa es sólo llevada a cabo por microorganismos. Las dos estrategias generales de la biorremediación son la modificación ambiental o bioestimulación (aplicación de nutrientes, biosurfactantes y aireación para mejorar las condiciones metabólicas de la microbiota autóctona), y la siembra de microorganismos degradadores de xenobióticos apropiados o bioaumentación. Esta última no siempre alcanza el objetivo propuesto dado que los microorganismos elegidos deben superar los inconvenientes que plantean los factores bióticos y abióticos del ambiente en que son introducidos. El uso de formulaciones de inoculantes que comprenden materiales soportes a los que se fijan las células microbianas para su introducción en ecosistemas naturales constituye una opción interesante. El soporte brinda a los microorganismos protección, favoreciendo su supervivencia y permitiendo su actividad degradadora. En esta Tesis se plantea el desarrollo de inoculantes, utilizando quitina y derivados como soportes, con el fin de optimizar la biorremediación de ambientes contaminados y los tratamientos biológicos de efluentes con hidrocarburos. Se evalúa el potencial de la quitina y sus derivados, obtenidos a partir de cáscaras de langostinos y camarones para su utilización como soportes de bacterias hidrocarburolíticas. La cepa degradadora seleccionada, Rhodococcus corynebacterioides (accesion number AY 157677) fue aislada en estudios anteriores de suelos costeros de Bahía Blanca. Se realiza el estudio de los parámetros de crecimiento y de la actividad metabólica vinculados al desarrollo de inoculantes de la misma: rango de temperaturas de crecimiento, cinética de crecimiento, desarrollo frente a diferentes hidrocarburos, determinación del coeficiente de hidrofobicidad y actividad degradadora frente a petróleo crudo. Se estudia el comportamiento de la quitina y derivados, obtenidos a partir de los exoesqueletos de langostinos (Pleoticus mülleri) en el Laboratorio de Investigaciones Básicas y Aplicadas en Quitina (L.I.B.A.Q.) del Departamento de Química de la Universidad Nacional del Sur, como posibles soportes de cepas bacterianas. Se establecen procedimientos para su decontaminación. Se plantean y seleccionan las estrategias más eficientes para la inmovilización de los microorganismos en la superficie de las escamas y posterior formación de biofilm. Una vez logrado el inoculante, se procede al estudio de la supervivencia de las cepas inmovilizadas sobre los distintos soportes y evaluación de su actividad biodegradativa. También se determinan las condiciones de almacenamiento más adecuadas del inoculante obtenido. Se evalúa el potencial de la cepa degradadora de hidrocarburos inmovilizada sobre los soportes para optimizar tratamientos de biorremediación. Se trabaja sobre tres microcosmos diferentes: un suelo típico de zona semiárida de uso agronómico contaminado con petróleo crudo, un suelo proveniente de una refinería de petróleo local y agua de mar contaminada con petróleo crudo. En términos de porcentajes de remoción de petróleo crudo los microcosmos de suelo de zona semiárida y de agua de mar inoculados alcanzan los valores más altos. Es importante enfatizar que los inoculantes formulados con quitina como soporte muestran el mejor desempeño en cuanto a condiciones de almacenamiento y tratamientos de biorremediación. El trabajo realizado permite el aprovechamiento de un residuo que se genera en grandes cantidades en nuestro litoral costero, como son los exoesqueletos de crustáceos, a la vez que se hace un aporte al tratamiento de aguas y suelos impactados por la actividad industrial y portuaria de la zona de Bahía Blanca. / Petroleum hydrocarbons are one of the major pollutants of terrestrial and marine environments. Although evaporation and photo-oxidation play an important role in detoxification, ultimate and complete degradation is accomplished mainly by microorganisms. The general strategies for bioremediation are biostimulation (release of nutrients, biosurfactans and aereation to enhance the metabolic conditions of the native microbial community), and the inoculation of appropriated degradative organisms or bioaugmentation. Bioaugmentation not always reaches the objective successfully because the selected microorganisms must also be able to overcome biotic and abiotic stresses in the environment in which they are introduced. The use of inoculant formulations involving carrier materials for the delivery of microbial cells to natural ecosystems, is an attractive option. The carrier provides microorganisms favorable conditions for survival as well as functioning of the inoculant cells, resulting in a sufficiently long shelf life as well as improved survival and activity. In this Thesis the development of inoculants, using chitin and derivates as carriers, to optimize the bioremediation of polluted environments and the biological treatment of hydrocarbons efluents is studied. Potential of chitin and derivates flakes obtained from shrimp wastes as carrier materials for a hydrocarbon-degrading bacterial strain is examined. The selected microorganism, Rhodococcus corynebacterioides, was isolated in previous research, from coastal soils of Bahía Blanca Estuary. Growing parameters and metabolic activity of the selected strain related to the development of the inoculant are determined: growing temperature range, generation range, use of different hydrocarbon products, hidrophobicity coefficient and crude oil biodegrading activity. Chitin and derivates, obtained from the exoskeletons of shrimps (Pleoticus mülleri) at the Laboratorio de Investigaciones Básicas y Aplicadas en Quitina (L.I.B.A.Q.) of the Departamento de Química at Universidad Nacional del Sur, were studied as carrier material of bacterial strains. Suitable methods for reducing the microbial load of the carrier and the ability to link bacterial cells are determined. Suitable conditions for the immobilization of microorganisms and formation of an abundant biofilm on the flakes are established. Once developed the inoculant, the survival of the immobilized strains on the different carrier materials and its biodegrading activity is evaluated. Also storage conditions and viability assessment of the inoculant are tested. The effectiveness of inoculant addition in bioremediation process is evaluated. Different microcosms are prepared: an agricultural soil contaminated with crude oil, soil of a local petrochemichal refinery and seawater polluted with crude oil. In all the cases the developed inoculants improve survival and degrading activity of the immobilized microorganisms. In terms of removal percentaqe of crude oil after the different treatments agricultural soil and seawater microcosms prove to be most successful. It is important to emphasize that the inoculants formulated with chitin flakes show the best perfomance during storage and bioremediation treatments. These results allow the use of an abundant residue of the local fishing industry, the exoskeletons of shrimps, that is produced in high amounts in our coasts, meanwhile there is a contribution for the treatment of waters and soils polluted with crude oil that come from the industrial and port activity of Bahía Blanca zone.

El avance logrado en los últimos años en el conocimiento de la biología del cáncer ha permitido el desarrollo de diversas terapias oncológicas. Sin embargo, dada la complejidad de esta patología y la variabilidad de respuestas halladas en los pacientes, es necesario continuar la búsqueda y el desarrollo de terapias dirigidas con el fin de mejorar el pronóstico y la calidad de vida de los pacientes. El calcitriol, la forma activa de la vitamina D3, actúa como una hormona reguladora de la homeostasis fosfocálcica y las investigaciones desarrolladas en las últimas tres décadas avalan su potencial uso como agente antineoplásico en la prevención y tratamiento de varios tipos de cáncer. Si bien algunos ensayos clínicos realizados a la fecha han aportado resultados alentadores, en la mayoría de los casos se han evidenciado efectos colaterales, como hipercalcemia, a las dosis necesarias para lograr una respuesta antitumoral efectiva. Tales razones han llevado al diseño y síntesis de análogos del calcitriol con el objeto de hallar compuestos que conserven o superen su actividad antitumoral y carezcan de los efectos hipercalcemiantes. En este trabajo de tesis nos propusimos evaluar las propiedades antitumorales y calcemiantes de un nuevo análogo del calcitriol de tipo gemini que hemos diseñado y sintetizado en colaboración con un laboratorio de Química Orgánica. Demostramos que el nuevo análogo, denominado UVB1, posee efectos antineoplásicos en varias líneas celulares de cáncer. Específicamente, el UVB1 redujo la viabilidad celular mediante un mecanismo de acción que es dependiente del tipo tumoral en cuestión, es decir, el análogo ejerció acciones anti-proliferativas en células de carcinoma celular escamoso de cabeza y cuello y pro-apoptóticas en células de carcinoma colorrectal (CCR). Además, el análogo exhibió propiedades anti-metastásicas, al disminuir la capacidad migratoria e invasiva de líneas tumorales modulando la actividad de metaloproteasas implicadas en estos procesos celulares. También, el UVB1 presentó características pro-diferenciantes al aumentar la expresión de E-cadherina en células tumorales mamarias y de CCR. En relación a estos efectos antitumorales, comenzamos a evaluar los mecanismos moleculares implicados. Posteriormente, realizamos ensayos in vivo en distintos modelos animales de cáncer, lográndose reproducir los efectos antitumorales del UVB1 obtenidos en células de CCR en el modelo animal correspondiente. La importante inhibición del crecimiento tumoral en los animales tratados con el análogo fue resultado de la inducción de apoptosis, aumento de la expresión de E-cadherina y disminución de la expresión nuclear de β-catenina. En relación a la actividad calcemiante, el análogo no provocó hipercalcemia a las dosis y tiempos evaluados, ni tampoco detectamos signos de toxicidad como disminución del peso corporal de los ratones, cambios en el hematocrito o en la histología de los órganos. Por último, dado que el calcitriol y sus análogos ejercen la mayoría de sus efectos antitumorales a través de su receptor VDR, se realizaron estudios computacionales que permitieron predecir que el UVB1 es capaz de unirse con gran afinidad al receptor VDR, sugiriendo su participación en las acciones biológicas demostradas por el análogo. Los resultados obtenidos en esta tesis aportan evidencia que indica que este nuevo compuesto podría ser, solo o en combinación con otros tratamientos, un posible agente terapéutico contra el cáncer. / In recent years, progress in the knowledge of cancer biology has allowed the development of various oncology therapies. However, owing to the complexity of this pathology and the variability of responses found in cancer patients, it is necessary to continue the search and development of targeted drugs in order to improve the prognosis and quality of life of patients. The active form of vitamin D3, calcitriol, acts as a hormone that regulates phospho-calcium homeostasis, and the research over the last three decades supports its potential use in the prevention and treatment of various types of cancer. So far, some clinical trials have provided encouraging results; however, at the doses necessary to achieve an effective antitumor response, side effects, such as hypercalcemia, occur in most cases. To prevent this particular undesirable effect, our research has focused on the design and synthesis of calcitriol analogs in order to obtain compounds that retain or even increase the antitumor activity but preclude the hypercalcemic effects. In this thesis we have aimed to evaluate the antitumor properties and the calcemic activity of a new gemini calcitriol analog that we have designed and synthesized in collaboration with a laboratory of Organic Chemistry. We demonstrate that the new analog, called UVB1, has antineoplastic effects on several cancer cell lines. In particular, UVB1 reduced cell viability by a mechanism of action that depends on the tumor type; specifically the analog exerted anti-proliferative actions on head and neck squamous cell carcinoma cells and pro-apoptotic effects on colorectal carcinoma (CRC) cells. In addition, the analog exhibited anti-metastatic properties by decreasing the migratory and invasive capacity of tumor cell lines and modulating the activity of metalloproteinases involved in these cellular processes. Also, UVB1 exhibited pro-differentiating features by increasing E-cadherin expression in tumor mammary and CRC cells. In relation to these antitumor effects, we began to evaluate the molecular mechanisms involved. We subsequently performed in vivo assays using different animal models of cancer, and the UVB1 antitumor effects obtained in CRC cells were successfully reproduced in the corresponding animal model. The significant inhibition of tumor growth in animals treated with the analog was a consequence of the induction of apoptosis, increase in E-cadherin expression, and decrease in nuclear β-catenin expression. In regard to calcemic activity, the analog showed lack of hypercalcemia at the doses and times evaluated, and no toxic effects, such as loss of body weight, changes in the hematocrit and in the histology of the organs of mice were observed. Finally, since calcitriol and its analogs exert their antitumor effects through their receptor VDR, we carried on computational studies that allowed us to predict that UVB1 is able to bind to VDR with high affinity, suggesting its participation in the biological actions demonstrated by the analog. The results obtained in this thesis provide evidence that this new compound could be, alone or in combination with other treatments, a potential therapeutic agent against cancer.

La pérdida de masa y fuerza del músculo esquelético, característico de ciertas miopatías como la sarcopenia, es una condición frecuente durante el envejecimiento, y está asociada a disfunciones de los sistemas muscular y esquelético. Aunque los mecanismos moleculares involucrados en esta patología no están totalmente esclarecidos, existen evidencias que demuestran que la apoptosis es en parte responsable de la pérdida de miocitos en la adultez, contribuyendo a la patogénesis de la sarcopenia. Puesto que los niveles de hormonas sexuales disminuyen con la edad, la sarcopenia se ha asociado al déficit de las mismas. En este trabajo, se ha demostrado que la testosterona, a concentración fisiológica, protege frente a la apoptosis inducida por H2O2 en la línea celular de músculo esquelético murino C2C12. Las alteraciones morfológicas típicas de la apoptosis tales como fragmentación nuclear, desorganización del citoesqueleto, reorganización/disfunción mitocondrial y liberación de citocromo c inducidos por el H2O2, son inhibidas cuando las células son previamente tratadas con la hormona. Se ha observado que las células C2C12 muestran una respuesta bifásica en presencia del agente apoptótico. A tiempos cortos de exposición al H2O2, las células activan un mecanismo de defensa, para evitar entrar en apoptosis, el cual consiste en la fosforilación de ERK2, Akt y Bad y en un aumento de expresión de la proteína asociada a eventos de supervivencia, HSP70. Simultáneamente y a partir de aproximadamente media hora de tratamiento con H2O2, se observa la fosforilación de JNK, p66Shc y p53, estas últimas mostrando un pico máximo de activación a la 1-2 hs. A tiempos más largos de exposición al agente apoptótico (4 hs) se produce la defosforilación de ERK2, Akt y Bad, se mantiene la fosforilación de JNK, disminuye la activación de p53 y p66Shc, se produce la liberación de citocromo c, el clivaje de PARP, la fragmentación del ADN y la pérdida del potencial de la membrana mitocondrial, indicando que las células inician finalmente el proceso de muerte celular programada. Sin embargo, cuando las células son tratadas con testosterona, previo a la exposición al H2O2, se reduce la fosforilación de JNK, se observa la inactivación de la proteína apoptótica Bad, disminución de los niveles de la proteína apoptótica Bax, inhibición del clivaje de PARP, prevención de la pérdida del potencial de membrana mitocondrial y disminución de la fosforilación y localización mitocondrial de la proteína amplificadora del estrés oxidativo, p66Shc. El empleo de un antagonista no esteroideo específico para la testosterona, la Flutamida, reduce el efecto protectivo del esteroide, involucrando al receptor de andrógenos (AR) en los efectos antiapoptóticos de la hormona. También, se obtuvieron evidencias bioquímicas, farmacológicas e inmunológicas, que demuestran la presencia del AR con localización clásica (nuclear) y no clásica en microdominios (específicamente caveolas y rafts) y mitocondrias. Las distintas localizaciones del AR podrían mediar el efecto antiapoptótico de la testosterona a distintos niveles subcelulares. Los resultados aquí presentados permiten comenzar a definir y esclarecer los mecanismos de señalización activados por la testosterona y su receptor, que median el efecto protectivo frente al daño oxidativo en músculo esquelético y su relación con miopatías asociadas al déficit de hormonas sexuales. / The loss of muscle mass and strength with aging, also referred to as sarcopenia, is a highly prevalent condition among the elderly, and it is associated with skeletal mechanisms underlying accumulating evidence muscle dysfunction. sarcopenia suggests are that far an Although from age-related the being exact clarified, acceleration of myocyte loss via apoptosis might represent a key mechanism responsible for impairment of muscle performance. Sarcopenia has been associated with a deficit of sex hormones as the levels of estrogens and/or testosterone decline with aging. In this work, it has been demonstrated that, at physiological concentrations, testosterone protects against H2O2- induced apoptosis in C2C12 muscle cells. Typical changes of apoptosis such as nuclear fragmentation, cytoskeleton disorganization, mitochondrial reorganization/dysfunction and cytochrome c release induced by H2O2, are abolished when cells are previously exposed to the hormone. It has been observed that C2C12 cells show a biphasic response when they are treated with the apoptotic agent. At short times of exposure to H2O2, C2C12 cells exhibit a defense response showing ERK2, Akt and Bad phosphorylation and an increase of HSP70 levels. Simultaneously and approximately after half an hour from the beginning of H2O2 treatment, JNK, p53 and p66Shc phosphorylation are observed, with maximum activation for p53 and p66Shc after 1-2 hours. At longer treatment times (4hs), dephosphorylation of ERK2, Akt and Bad is observed, JNK continues phosphorylated, the activation of p53 and p66Shc decreases and cytochrome c release, PARP cleavage, DNA fragmentation and the loss of mitochondrial membrane potential occur, indicating that cells finally enter into apoptosis. However, incubation with testosterone prior to H2O2, reduces JNK phosphorylation, induces Bad inactivation, inhibition of PARP cleavage, a decrease in Bax levels; reduces the loss of mitochondrial membrane potential and p66Shc phosphorylation and its mitochondrial localization. The employment of the androgen receptor (AR) antagonist, Flutamide, decreases the protective effects of the hormone, pointing to a possible participation of the AR in the anti-apoptotic effect of testosterone. Moreover, biochemical, pharmacological and immunological data demonstrate a classical (nuclear) and non-classical localization of the AR in microdomains (caveolae and rafts) and mitochondria. These results assign an active role for the AR during the anti-apoptotic effect of the hormone, possibly, at different subcellular levels. The data presented in this work unravel in part the molecular mechanisms activated by testosterone and its receptor, underlying the survival action of the hormone against oxidative stress damage in skeletal muscle and its relationship with myopathies associated with sex hormonal dysregulation.

En este trabajo se abordaron estudios sobre el metabolismo del Fe y su desregulación, centralizados en la identificación y caracterización funcional de proteínas como Hepcidina, Ferroportina (FPN) y Eritropoyetina (Epo) en tejidos que forman parte del ciclo del Fe. Para el desarrollo de esta Tesis, se diseñaron y desarrollaron Modelos Animales de disfunción para reproducir situaciones fisiopatológicas específicas que comprometen el eritrón y la biodisponibilidad del Fe. Para el estudio de FPN y prohepcidina se utilizaron los siguientes modelos: anemia post-esplenectomía, anemia hemolítica aguda, hipoxia normobárica, sobrecarga de Fe, inflamación y un modelo acoplado, donde coexistieron dos situaciones disfuncionales específicas: exceso de Fe seguido hipoxia. En todos los casos, se aplicó un diseño experimental, metodoló-gico y estadístico adecuado. Los estudios realizados en alta demanda como en la anemia hemolítica, mostraron cambios adaptativos en FPN revelando su localización intracelular y su redistribución a la membrana para exportar Fe. En hipoxia, los cambios en la expresión de FPN y su localización en membrana respondieron a la demanda de Fe eritropoyética y su relación directa con Epo reflejó la ausencia de inhibición de hepcidina. En exceso de Fe, la regulación negativa de hepcidina sobre FPN se evidencia por la disminución en su expresión en el SRE y en duodeno. La coexistencia de estímulos antagónicos como exceso de Fe e hipoxia, permitieron analizar las interacciones específicas entre hepcidina-FPN-Epo y la coordinación de señales para la expresión simultánea de hepcidina y Epo: la señal Fe", predominó sobre hepcidina e indujo disminución de FPN en el SRE y en riñón; la señal hipoxia predominó sobre Epo y modificó la expresión de FPN duodenal. Los estudios de inflamación aguda (Turpentina) mostraron síntesis de prohepci-dina y degradación de FPN en el SRE reflejando que la señal regulatoria fue hepcidina. En duodeno FPN fue estimulada por la hipoferremia. En la inflamación inducida con Brucella abortus en ratones WT y KO para hepcidina, se observó que la respuesta de FPN duodenal a la inflamación aguda depende-ría del Fe, y en inflamación crónica, respondería a hepci-dina. En el SRE la regulación de FPN en inflamación aguda y crónica no dependería sólo de hepcidina. Los ensayos de inflamación en macrófagos medulares con ligandos de recep-tores tipo Toll-like (TLRs), mostraron regulación dual de FPN vía TLR-2, 4,5 y vía hepcidina de origen autocrino. / This work was based on different studies concerning iron metabolism and its deregulation which were focused on the identification and functional characterization of proteins such as Hepcidin, Ferroportin (FPN), and Erythropoietin (Epo) present in tissues involved in the iron cycle. For the deve-lopment of this Thesis, we designed and developed Dysfunctional Animal Models to reproduce specific physio-pathological situations that compromise the erythron and iron availability. To study FPN and prohepcidin we used the follo-wing models: Post-splenectomy anemia, acute hemolytic anemia, normobaric hypoxia, iron overload, inflammation, and a coupled model, where two specific and dysfunctional situations coexisted, i.e, iron overload followed by hypoxia. In all cases, a proper experimental, statistical and methodology design was applied. Studies in high demands such as hemolytic anemia showed adaptative changes in FPN, exhibiting its intracellular localization and redistribution to the membrane for iron exportation. In hypoxia, changes in FPN expression and its membrane localization responded to erythropoietic iron demand, and its direct relation with Epo showed the absence of hepcidin inhibition. In iron overload, the negative regulation of hepcidin on FPN can be seen by its decrease in the RES and duodenum. The coexistence of opposite stimuli such as iron overload and hypoxia allowed us to analyze the specific interactions between hepcidin-FPN-Epo and signal coordination for the simultaneous expression of hepcidin and Epo: Hepcidin depends on "iron" signal, causing a decrease in FPN in the RES and in kidney; Epo depends on "hypoxia" signal and changed the expression of duodenal FPN. Studies of acute inflammation (Turpentine) demons-trated prohepcidin synthesis and FPN degradation in the RES, showing that the regulatory signal was "hepcidin." Duodenal FPN was induced by "hypoferremia." In B. abortus induced inflammation in WT and KO mice it was observed that duodenal FPN response to acute inflammation would depend on "iron," and in chronic inflammation, it would respond to "hepcidin. FPN regulation in RES in acute and chronic inflammation would depend not only on hepcidin. Inflammation tests in bone marrow macrophages with ligands of Toll-like receptors (TLRs) showed dual FPN regulation by TLR-2, 4, 5, and by autocrine derived hepcidin.

La retina es el tejido neural que tapiza la parte posterior del ojo. En los vertebrados está constituida por cinco clases de neuronas: los fotorreceptores (conos y bastones), las amacrinas, las horizontales, las ganglionares, y las bipolares. Debido a su relativa simplicidad, accesibilidad y a que los distintos tipos celulares están organizados formando un tejido altamente estructurado, la retina ha sido ampliamente utilizada como tejido modelo de estudio del sistema nervioso central, y es la estructura neural más estudiada. Las neuronas de retina debido a su constante exposición a la luz, su alta tasa metabólica y el alto contenido de ácidos grasos en sus membranas son muy sensibles a sufrir daño oxidativo. Este daño es el responsable de disparar procesos de apoptosis en este tejido. Muchas enfermedades neurodegenerativas de la retina involucran la muerte por apoptosis de las neuronales retinales, y tienen en común que el daño oxidativo es un desencadenante. Este estrés activa vías que involucran a las mitocondrias y conduce a la apoptosis. El conocimiento de los mecanismos por los cuales induce dicha activación es fundamental en el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas. Trabajos previos de nuestro laboratorio demuestran que la carencia de factores tróficos durante el desarrollo neuronal in vitro y el estrés oxidativo inducido por PQ inducen la muerte por apoptosis de las neuronas fotorreceptoras. El ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6 n-3) es un ácido graso poliinsaturado esencial de la familia de los omega 3, sintetizado a partir del ácido ɑ-linolénico (18:3 n-3) y se encuentra altamente concentrado en las células del sistema nervioso, principalmente en las membranas sinápticas y en los fotorreceptores. El DHA en el sistema nervioso desarrolla múltiples funciones, juega un papel importante en el proceso de fototransducción, en la formación de la memoria, es neuroprotector y puede regular procesos antiinflamatorios. Tradicionalmente al DHA en la retina se lo relaciona con un importante rol estructural, el de favorecer los cambios de conformación inducidos por la luz en la rodopsina, y es indispensable para el adecuado desarrollo de la visión. En nuestro laboratorio, se ha establecido un rol completamente nuevo para el DHA, el de ser un factor de supervivencia previniendo la apoptosis de los fotorreceptores por ausencia de factores tróficos durante su desarrollo in vitro y previniendo la apoptosis inducida por el oxidante Paraquat (PQ). Además hemos establecido que promueve la diferenciación de los fotorreceptores de retina de rata en cultivo. Hemos demostrado que el PQ dispara la apoptosis de las neuronas de retina en cultivo; el aumento de la apoptosis se encuentra en estrecha relación con la pérdida de integridad mitocondrial en las neuronas y se observó que los fotorreceptores son más sensibles que las neuronas amacrinas a la apoptosis inducida por PQ. El H2O2 es un agente oxidante que, a diferencia del PQ, es en sí mismo una especie oxígeno reactiva (ROS) y un mediador fisiológico del daño oxidativo en retina. En nuestro laboratorio también se demostró que el H2O2 induce un aumento de la muerte celular por apoptosis de los fotorreceptores. Es por eso que decidimos investigar en este trabajo de tesis si el DHA también puede prevenir la apoptosis disparada por H2O2, que induce la muerte de las células de retina luego de agotar los sistemas de defensa antioxidante. Para ello suplementamos cultivos neuronales de retina con o sin DHA e indujimos daño oxidativo con H2O2. Evaluamos viabilidad celular con ioduro de propidio y observamos que, al tratar a los cultivos con H2O2, en ausencia de DHA, disminuye la viabilidad celular respecto a los controles. Si previo al tratamiento con H2O2 los cultivos fueron suplementados con DHA el porcentaje de células muertas descendió a niveles comparables con los de los controles. Para determinar el efecto del DHA frente a la apoptosis inducida por H2O2 realizamos el ensayo de TUNEL y vimos un aumento de los fotorreceptores TUNEL+ en los cultivos tratados con H2O2, y una disminución de los mismos en los cultivos preincubados con DHA. Cuantificamos el porcentaje de fotorreceptores con núcleos picnóticos o fragmentados, teñidos con DAPI, para evaluar apoptosis y observamos que el H2O2 provocó un aumento de la apoptosis de los fotorreceptores respecto a los cultivos controles y que el DHA agregado previo al tratamiento con H2O2 previno la apoptosis de los fotorreceptores. Estos resultados, junto con el hecho de que el DHA protege a los fotorreceptores del daño oxidativo inducido por PQ, nos permiten concluir que el DHA es un eficaz protector de las neuronas fotorreceptoras de retina expuestas a distintos tipos de agentes oxidantes. Resultados previos de nuestro laboratorio establecieron que el DHA en cultivos neuronales de retina se incorpora a la membrana de las células, aumenta su concentración en las mismas y tiene la capacidad de activar la vía de la ERK/MAPK y regular la relación de proteínas pro y antiapoptóticas para promover la supervivencia de los fotorreceptores frente al daño oxidativo (Ger)man et al., 2006a;Rotstein et al., 2003. En este trabajo de tesis nos propusimos investigar si el DHA, además de activar las vías de supervivencia citadas, también podría estar ejerciendo su efecto protector actuando como antioxidante. Para determinar si el DHA estaría actuando como un agente antioxidante utilizamos la sonda DCFDA para medir la formación de (ROS en los cultivos y así tener una medición aproximada del daño oxidativo en los cultivos (Halliwell and Whiteman, 2004;Lu et al., 2006). Determinamos el porcentaje de fluorescencia de la sonda DCFDA oxidada respecto al control. Observamos que el porcentaje de fluorescencia aumentó al tratar los cultivos con H2O2, indicando un aumento en la formación de ROS. Observamos también que el DHA disminuyó la formación de ROS disparada por H2O2 en los cultivos neuronales de retina de rata. Para investigar si el DHA estimula enzimas del sistema de defensa antioxidante, determinamos la actividad de la GPx, que participa de la reducción de hidroperóxidos al catalizar la oxidación del Glutatión. Vimos que en cultivos suplementados con DHA previo a inducir daño oxidativo, la actividad de la enzima fue mayor que en los cultivos controles, por lo que el DHA estaría estimulando la actividad de esta enzima. Decidimos medir los niveles de sustancias reactivas con el ácido barbitúrico (TBARS) como indicador de peroxidación lipídica en los cultivos neuronales de retina tratados con H2O2. Observamos que el H2O2 aumentó los niveles de TBARS y por lo tanto la peroxidación lipídica en los cultivos neuronales de retina. Además al suplementar con DHA, independientemente de si se indujo o no estrés oxidativo con H2O2, aumentaron los niveles de TBARS respecto a cultivos sin DHA. De estos resultados se desprende que el DHA, a pesar de aumentar la peroxidación lipídica en los cultivos neuronales, promueve la supervivencia de los fotorreceptores al activar enzimas de defensa antioxidante, como la GPx, y disminuir la formación de ROS. La síntesis de DHA a partir de EPA (Acido eicosapentaenoico, 20:5 n-3) requiere de dos elongaciones que forman TPA (ácido tetracosapentaenoico, 24:5 n-3), que es posteriormente desaturado por la Δ6-desaturasa produciendo THA (ácido tetracosahexaenoico, 24:6 n-3). Finalmente este, por acción de una β-oxidasa peroxisomal, da origen al DHA. Este proceso biosintético requiere de la incorporación de los precursores desde la dieta y es principalmente llevado a cabo en el hígado. El DHA así sintetizado es luego distribuido a distintos tejidos por el sistema circulatorio. Si bien la mayor cantidad de DHA del sistema nervioso proviene de la síntesis hepática y su transporte unido a lipoproteínas de la sangre también ocurre la síntesis in situ, aunque en menor medida. Las enzimas necesarias para la síntesis de DHA están presentes en el ojo, siendo el epitelio pigmentario el sitio donde es más efectivo este proceso de síntesis. Está comprobado que este camino biosintético puede llevarse a cabo en células gliales, pero no se ha demostrado la síntesis del DHA en neuronas. En este camino metabólico el ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5n-3) es un intermediario, y al igual que el DHA, el EPA ha demostrado tener efectos importantes en el cerebro y retina. En retinas de rata alimentadas con dietas ricas en ácidos grasos de la serie n-3 aumenta la relación EPA/AA (EPA/Acido Araquidónico) en los segmentos externos de los fotorreceptores y disminuyen los daños a nivel de dichos segmentos externos cuando se somete a estas ratas a un daño agudo inducido por luz. Por otro lado el aumento de los niveles de EPA plasmático en pacientes humanos sanos se relaciona directamente con el aumento de la densidad del pigmento macular que regula procesos inflamatorios y previene el daño oxidativo previniendo el avance de la degeneración macular. De todos modos, aun se desconocen los mecanismos celulares y moleculares por medio de los cuales el EPA actúa como un agente neuroprotector. Como el EPA ha demostrado tener efectos muy similares a los que se observan con el DHA en diferentes modelos animales y celulares, en esta tesis investigamos si al igual que ocurre con el DHA, la suplementación de cultivos neuronales de retina con EPA es capaz de prevenir la apoptosis inducida por daño oxidativo en los fotorreceptores y promover su diferenciación. También analizamos si el EPA en neuronas de retina aisladas puede actuar como precursor metabólico del DHA, promoviendo su síntesis y si esta síntesis es indispensable para que el EPA actúe como agente neuroprotector y promotor de la diferenciación de los fotorreceptores. Para evaluar si el EPA es capaz de proteger a los FR de la apoptosis inducida por PQ, suplementamos los cultivos con EPA en concentraciones crecientes (2, 3, y 6 μM) y los tratamos con PQ. Evaluamos luego viabilidad celular, con IP y apoptosis por el estudio de la morfología nuclear con DAPI. Tanto en los cultivos controles, como en los suplementados con las distintas concentraciones de EPA se observaron porcentajes bajos de muerte celular y de fotorreceptores apoptóticos. La suplementación con EPA, previa al tratamiento con PQ previno el aumento en la mortalidad celular y en la apoptosis inducida por PQ de los fotorreceptores en una forma dosis dependiente. Determinamos que la concentración 3 μM de EPA era la más efectiva. Confirmamos el efecto protector del EPA 3 μM frente a la apoptosis inducida por PQ en los fotorreceptores utilizando el ensayo de TUNEL. El PQ indujo un aumento de los FR TUNEL + y la adición de EPA previa al tratamiento con PQ disminuyó el número de fotorreceptores TUNEL + a niveles comparables con los de los cultivos controles. Por lo tanto, el EPA, al igual que el DHA actúa como un agente protector frente a la muerte inducida por PQ en los fotorreceptores en cultivos. Esto nos llevó a plantearnos si otros ácidos grasos también podrían actuar de esta manera. Para contestarlo decidimos investigar si los ácidos araquidónico (20:4 n-6, AA), palmítico (16:0, PA) y oleico (18:1 n-9, OA) presentaban efectos antiapoptóticos frente al daño oxidativo inducido con PQ. A diferencia del EPA, ninguno de estos ácidos al ser agregados a los cultivos, evitó los procesos de muerte celular y apoptosis de fotorreceptores desencadenados por el tratamiento con PQ. Podemos afirmar entonces que sólo el EPA y el DHA disminuyen la apoptosis de los fotorreceptores inducida por PQ. Quisimos evaluar si el EPA también podría tener efecto protector frente a otro oxidante como el H2O2. El tratamiento con H2O2 provocó un marcado aumento de la apoptosis, aumentando significativamente el número de fotorreceptores con núcleos picnóticos y mitocondrias despolarizadas. La suplementación de los cultivos con EPA previo al tratamiento con H2O2 previno el aumento del número de fotorreceptores con núcleos picnóticos o fragmentados y mantuvo intacto el potencial de membrana mitocondrial en la mayoría de los fotorreceptores, al igual que en los controles. Estos resultados demuestran el rol protector del EPA frente a la apoptosis inducida por distintos tipo de daño oxidativo inducido a los fotorreceptores en cultivo. Resultados anteriores de nuestro laboratorio establecieron que in vitro, debido a la carencia de factores tróficos, la diferenciación de los fotorreceptores está restringida y en nuestros cultivos, los fotorreceptores, presentan morfología característica de fotorreceptores no diferenciados. El DHA estimula la diferenciación de los fotorreceptores. En este trabajo quisimos ver si el EPA jugaba algún rol en la diferenciación de los fotorreceptores en cultivo. Establecimos que la adición de EPA provocó un aumento de la expresión de opsina en los fotorreceptores y promovió el crecimiento de procesos apicales, rudimentos de los segmentos externos. Por lo que el EPA estimula la diferenciación de los fotorreceptores durante el desarrollo en cultivo. También nos propusimos evaluar si el EPA es capaz de modificar la composición de ácidos grasos de los fosfolípidos de la retina neural. El análisis por GLC de la composición de ácidos grasos de los cultivos neuronales reveló valores de EPA muy bajos en los cultivos controles. Sorprendentemente, no existió una acumulación significativa de este ácido graso en los fosfolípidos luego de la incubación con EPA pero que sí se duplicaron los niveles de DHA. Esto nos llevó a suponer que los fotorreceptores y/o neuronas amacrinas en nuestros cultivos eran capaces de elongar y desaturar al EPA para producir DHA. Para que este proceso metabólico pueda llevarse a cabo es clave la presencia de la enzima Δ6 desaturasa, responsable de la transformación del TPA al THA. Investigamos por técnicas inmunocitoquimicas y western blot si esta enzima se expresa en los cultivos neuronales de retina. El western blot reveló la expresión de la enzima en los cultivos neuronales de retina. La citoquímica mostró que la enzima estaba presente tanto en el citoplasma como en los núcleos de los fotorreceptores y las células amacrinas. Estos resultados demuestran, por primera vez, que las neuronas de retina son capaces de sintetizar DHA a partir de EPA como precursor. El hecho de que el EPA en nuestros cultivos esté promoviendo la síntesis de DHA sumado a que los efectos que presenta son los mismos que se vieron con anterioridad por parte del DHA, nos llevó a plantearnos la hipótesis de que este ácido graso no estuviera actuando por sí mismo, sino como consecuencia de su metabolización a DHA. Para respondernos este interrogante, preincubamos a los cultivos con CP24879 (CP), un inhibidor de las Δ5 y Δ6 desaturasas, antes de suplementarlos con EPA. Como era de esperar, la presencia del inhibidor previno el aumento de los niveles de DHA y condujo a un aumento del contenido de DPA en los cultivos suplementados con EPA. Evaluamos el efecto del agregado de CP sobre la protección del EPA frente al tratamiento con H2O2. El agregado de CP bloqueó por completo el efecto protector del EPA frente a la apoptosis inducida por H2O2, y el porcentaje de fotorreceptores apoptóticos fue el mismo que el que observamos en los cultivos tratados con H2O2 sin EPA. También analizamos si la síntesis de DHA era necesaria para promover la diferenciación de los fotorreceptores. Para ello, investigamos si la incubación con CP afectaba al aumento en la expresión de opsina que provoca el EPA en los cultivos neuronales. El EPA provocó un aumento en la cantidad de fotorreceptores que expresaron opsina, pero la incubación previa con CP bloqueó este efecto y la cantidad de fotorreceptores opsina + en estos cultivos fue comparable con la que observamos en los cultivos controles. Por lo tanto estos resultados indican que la adición de EPA a los cultivos neuronales de retina previene la apoptosis de los fotorreceptores expuestos a condiciones de estrés oxidativo y estimula el avance de la diferenciación de las neuronas fotorreceptoras. También demuestran que al inhibir la actividad de la Δ6 desaturasa, enzima que cataliza la reacción requerida para la síntesis de DHA a partir de EPA, se bloquean los efectos del EPA sobre los fotorreceptores. Esto implica que no es el EPA en sí mismo el que previene la apoptosis y favorece la diferenciación de los FR en cultivo, sino que es el DHA sintetizado a partir del EPA En resumen, las conclusiones más destacadas de este trabajo de tesis son las siguientes:  El DHA previene la muerte por apoptosis inducida por H2O2 de los fotorreceptores en cultivo.  El DHA frena la formación de ROS inducida por H2O2  El agregado de DHA aumenta los niveles de peroxidación lipídica en los cultivos neuronales de retina.  El DHA activa enzimas que participan de los mecanismos de defensas antioxidantes para prevenir la formación de ROS que estimula el H2O2.  El agregado de EPA, y no de otros ácidos grasos, previene la apoptosis inducida por PQ y H2O2, efecto que son comparables al observados al suplementar los cultivos con DHA.  El agregado de EPA promueve la diferenciación de los fotorreceptores durante el desarrollo in vitro, aumentando los niveles de expresión de opsina y la formación de procesos apicales.  Los fotorreceptores de rata en cultivo expresan Δ6 desaturasa, esencial para la síntesis de DHA.  Las neuronas de retina de rata en cultivo son capaces de sintetizar DHA a partir de EPA.  El EPA debe ser metabolizado a DHA para proteger a los fotorreceptores de la apoptosis inducida por estrés oxidativo y para promover la diferenciación de los mismos. / The neural retina is the tissue in the back of the eye. In vertebrates it consists of five types of neurons: photoreceptor (rods and cones), amacrine, horizontal, ganglion, and bipolar neurons. The retina is the most studied neural structure because its different cell types are arranged to form a highly structured tissue, and due to its relative simplicity, and its accessibility, and has been widely used as a model for studying the central nervous system. Due to their constant exposure to light, high metabolic rate and high content of fatty acids in their membranes retinal neurons are very sensitive to oxidative damage. This damage is responsible for triggering apoptosis in this tissue. Many neurodegenerative retinal diseases have in common the apoptotic death of retinal neuronal and that oxidative damage acts as a trigger of this death. This stress-activated pathway involving mitochondria leads to apoptosis. Knowledge of the mechanisms by which this activation is induced is critical in the development of future therapeutical strategies. Previous work from our laboratory has shown that the absence of trophic factors during neuronal development in vitro and induction of oxidative stress by paraquat (PQ) treatment leads to the apoptotic death of photoreceptor neurons. Docosahexaenoic acid (DHA, 22:6-3) is a polyunsaturated fatty acid of the omega-3 family, synthesized from linolenic acid (18:3 n-3) and is highly concentrated in the cells of the nervous system, especially in synaptic membranes and in photoreceptors. DHA plays multiple functions in the nervous system; it has an important role in the phototransduction process, in the formation of memory, it is neuroprotective and it can regulate inflammatory processes. Traditionally, DHA in the retina has been related to an important structural role, favoring the conformational changes induced by light in rhodopsin, and it is known to be essential for proper development of vision. In our lab, we have established a completely new role for DHA, that of being a survival factor preventing apoptosis of photoreceptors in the absence of trophic factors during in vitro development. We have also established that it promotes differentiation of rat retinal photoreceptors. We have also shown that the oxidant paraquat (PQ) triggers apoptosis of retina neurons in culture, the increase in apoptosis being closely related to the loss of mitochondrial integrity. We demonstrated that photoreceptors are more sensitive than amacrine neurons to PQ-induced apoptosis. H2O2 is an oxidizing agent that, unlike PQ, is in itself a ROS (Reactive oxygen species) and a physiological mediator of oxidative damage in the retina. In our laboratory we demonstrated that H2O2 induces apoptosis of photoreceptors. In this Thesis we investigated if DHA can also prevent H2O2-induced apoptosis after exhausting the retinal antioxidant defense systems. To do this we supplemented retina neuronal cultures with or without DHA and we induced oxidative stress with H2O2. We assessed cell viability with propidium iodide and observed that treatment of cultures with H2O2 in the absence of DHA decreased cell viability relative to controls. If cultures were supplemented with DHA previous to H2O2 treatment, the percentage of dead cells decreased to levels comparable to those found in controls. To determine the efficacy of DHA to prevent apoptosis induced by H2O2 we evaluated apoptosis with the TUNEL assay and established that H2O2 treatment increased TUNEL + photoreceptors, while they were decreased in cultures preincubated with DHA. To evaluate apoptosis we quantified the percentage of photoreceptors showing fragmented or pyknotic nuclei by staining nuclei with DAPI and observed that H2O2 treatment increased apoptosis of photoreceptor compared to controls and pretreatment with DHA prevented H2O2-induced apoptosis of photoreceptors. These results, together with the fact that DHA protects photoreceptors from oxidative damage induced by PQ, allow us to conclude that DHA is an effective protector of retinal neurons exposed to various types of oxidizing agents. Previous results from our laboratory have established that DHA added to retinal neuronal cultures is incorporated into cell membranes, increasing its levels in neuronal lipids, activating the ERK / MAPK pathway and regulating the ratio of pro to anti-apoptotic proteins, thus promoting photoreceptor survival upon oxidative damage. In this Thesis we investigated whether DHA could also be exerting its protective effect by acting as an antioxidant. To evaluate this we used the DCFDA probe to measure the formation of ROS in culture and get a rough measure of oxidative damage. We determined the percentage of the DCFDA fluorescence probe oxidized over control and established that the percentage of fluorescence increased by treating the cultures with H2O2, indicating an increase in ROS formation. We also showed that DHA decreased ROS formation triggered by H2O2 in neuronal cultures of rat retina. To investigate whether DHA stimulates enzymes from the antioxidant defense system, we determined the activity of glutathione peroxidase (GPx), which participates in the reduction of hydroperoxides by catalyzing the oxidation of GSH. We established that in cultures supplemented with DHA previous to the induction of oxidative damage the enzimatic activity was higher than in control cultures, suggesting DHA stimulates the activity of this enzyme . We measured the levels of TBARS as an indicator of lipid peroxidation in neuronal cultures treated with H2O2. We observed that H2O2 increased TBARS levels and therefore lipid peroxidation in retinal neuronal cultures. DHA supplementation caused an increase in TBARS levels compared to cultures without DHA, both in the presence or the absence of oxidative damage. From these results it is apparent that DHA, in spite of the increase it triggers in lipid peroxidation in neuronal cultures, promotes photoreceptor survival by activating antioxidant defense enzymes such as GPx, and reducing the formation of ROS. DHA synthesis from EPA (eicosapentaenoic acid, 20::5 n-3) requires two elongations that form TPA (tetracosapentaenoic acid, 24:5 n-3), which is subsequently desaturated by the Δ6-desaturase producing THA (24:6 n-3, tetracosahexaenoic acid). Finally THA is decarboxylated to DHA by a peroxisomal β-oxidase. This biosynthetic pathway requires the provision of precursors in the diet and is mainly carried out in the liver. DHA is then distributed to various tissues through the circulatory system. While most of the DHA in the nervous system comes from the hepatic synthesis and lipoprotein transport of blood, in situ synthesis also occurs though to a lesser extent. The enzymes necessary for the synthesis of DHA are present in the eye and its synthesis is more effective in retinal pigment epithelium than in the retina. It has been shown that this biosynthetic pathway can be carried out in glial cells, but it is still unknown whether this synthesis occurs in neurons. In this metabolic pathway EPA is an intermediate, and like DHA, it has been shown to have significant effects on the brain and retina. In rats fed diets rich in fatty acids of the n- 3 series, the EPA/AA (EPA /arachidonic acid) ratio increases in the outer segments of photoreceptors and the damage to these outer segments is reduced when rats are subjected to acute light-induced damage. Moreover, increased levels of EPA in plasma of healthy human patients are directly related to increased macular pigment density, which regulates inflammatory response, and prevents oxidative damage and the progression of macular degeneration. However, the molecular and cellular mechanisms by which EPA acts as a neuroprotective agent are still unknown. As EPA has demonstrated effects very similar to those observed with DHA in different animal and cellular models, here we investigated whether EPA was able to prevent apoptosis of photoreceptors induced by oxidative damage and promote their differentiation. We also investigated if EPA acted as a metabolic precursor of DHA in retina neurons, promoting its synthesis and if this synthesis was essential for EPA effects in photoreceptors. To assess whether EPA is able to protect photoreceptors from PQ-induced apoptosis, we supplemented cultures with increasing concentrations of EPA (2, 3, and 6 μM) and treated them with PQ. Then we evaluated cell viability with PI, and studied apoptosis by DAPI staining. Low percentages of cell death and apoptotic photoreceptors were observed both in control cultures and in those supplemented with different concentrations of EPA. Supplementation with EPA prevented the increased in cell death and apoptosis induced by PQ in a dose dependent manner. We determined that the 3 uM EPA concentration is the most effective. We confirmed the protective effect of 3 μM EPA from apoptosis induced by PQ in photoreceptors by TUNEL assay. PQ induced an increase in TUNEL + photoreceptors and EPA addition prior to treatment with PQ decreased the number of TUNEL + photoreceptors to levels comparable with control cultures. Therefore, the EPA, like DHA acts as a protective agent against PQ-induced death in photoreceptors in culture. This led us to ask whether other fatty acids might also act in this way. To answer this we decided to investigate whether arachidonic acid (20:4 n-6, AA), palmitic (16:0 PA) and oleic (18:1 n- 9) acids had antiapoptotic effects against oxidative damage induced by PQ. Unlike EPA or DHA, none of these fatty acids when added to the cultures prevented cell death and photoreceptor apoptosis triggered by PQ. We can propose that only EPA and DHA decreased photoreceptor apoptosis induced by PQ. We wanted to assess whether EPA was also protective against other oxidants such as H2O2.Treatment with H2O2 caused a marked increase in apoptosis, significantly increasing the number of photoreceptors with pyknotic nuclei and depolarized mitochondria. Supplementation of the cultures with EPA prior to treatment with H2O2 prevented the increase in the amount of photoreceptors with fragmented or pyknotic nuclei and retained mitochondrial membrane potential in most photoreceptors, with values similar to control cultures. These results demonstrate the protective role of EPA from apoptosis induced by different types of induced oxidative damage to photoreceptors in culture. Previous results from our laboratory have established that in vitro, due to lack of trophic factors, differentiation of photoreceptors is restricted and in our cultures, photoreceptors exhibit an undifferentiated morphology. DHA stimulates photoreceptors differentiation. In this study we investigated whether EPA played a role in the differentiation of photoreceptors in culture. We established that EPA addition promoted an increase in opsin expression in photoreceptors and promoted the development of apical processes. EPA therefore stimulates the differentiation of photoreceptors during development in culture. We also set out to assess whether EPA was able to modify the fatty acid composition of phospholipids of cultured neurons. GLC analysis of fatty acid composition of the cultured neurons revealed very low levels of EPA in control cultures. Surprisingly, there was no significant accumulation of this fatty acid in phospholipids after incubation with EPA but DHA levels were doubled. This led us to presume that photoreceptors or amacrine neurons in our cultures were able to elongate and desaturate EPA to produce DHA. Δ6-desaturase enzyme is a key enzyme in this process. It is responsible for the transformation of TPA to THA. We investigated by Western blot and immunocytochemical techniques if this enzyme was expressed in the retinal neuronal cultures. Western blot analysis revealed the expression of the enzyme in retinal neurons. Cytochemistry showed that the enzyme was present in both the cytoplasm and nuclei of photoreceptors and amacrine neurons. These results demonstrate, for the first time, that retinal neurons are able to synthesize DHA using EPA as a precursor. The fact that EPA addition leads to DHA synthesis together with the evidence that its effects were the same as those shown for DHA, led us to consider the hypothesis that this fatty acid was not acting by itself, but rather due to its metabolization to DHA. To answer this question, cultures were preincubated with CP24879 (CP), a Δ5 and Δ6-desaturase inhibitor before supplementation with EPA. As expected, the presence of the inhibitor prevented the increase in DHA levels in spite of EPA addition and showed a tendency to increase the levels of DPA in cultures supplemented with EPA. We evaluated the effect of the addition of CP on EPA neuroprotection. The addition of CP completely blocked the protective effect of EPA against H2O2-induced apoptosis, and the percentage of apoptotic photoreceptors was the same as that observed in cultures treated with H2O2 without EPA. We also analyzed whether DHA synthesis is required to promote photoreceptors differentiation. For this, we investigated whether incubation with CP affected EPA-induced increase in opsin expression in neuronal cultures. EPA caused an increase in the amount of opsin expression, but preincubation with CP blocked this effect and the amount of opsin + photoreceptors in these cultures was comparable to that observed in controls. Therefore these results indicated that EPA addition to retina neuronal cultures prevented apoptosis of photoreceptors exposed to conditions of oxidative stress and stimulated the differentiation of photoreceptors. EPA effects on photoreceptors were blocked when Δ6-desaturase was inhibited. This implies that it is not EPA by itself that prevents apoptosis and promotes differentiation of cultured photoreceptor but it is DHA synthesized from EPA the fatty acid responsible for these effects. In summary, the main conclusions of this thesis are: - DHA prevents H2O2- induced apoptosis of photoreceptors -DHA decreases the formation of ROS induced by H2O2 - DHA increases the levels of lipid peroxidation in neural retina cultures - DHA activates enzymes involved in the antioxidant defense mechanisms to prevent ROS formation stimulating H2O2 - EPA, like DHA, prevents oxidative stress-induced apoptosis - EPA and not other fatty acids, prevents PQ-induced apoptosis - EPA promotes differentiation of photoreceptors during development in vitro, increasing opsin expression and the formation of apical processes - Cultured rat photoreceptors express Δ6-desaturase - Rat retinal neurons in culture are able to synthesize DHA from EPA - EPA must be metabolized to DHA to protect photoreceptors from apoptosis induced by oxidative stress and for promoting their differentiation.

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Atendendo a um mercado em crescimento nos últimos anos, o curso de Tecnólogo em Viticultura e Enologia é oferecido no Instituto Federal de São Paulo, campus São Roque para a formação de profissionais qualificados para o trabalho nas vinícolas e outros estabelecimentos comerciais voltados à produção e comercialização da uva, suco de uva e do vinho existentes, não só na região de São Roque-SP, como também em outras regiões do estado e do pais. O curso conta com a disciplina de Bioquímica, que vinha sendo aplicada em moldes convencionais. Na tentativa de melhorar a qualidade da disciplina, o interesse e o aproveitamento dos alunos, o presente projeto desenvolveu um novo currículo para a disciplina de Bioquímica, voltado para as especificidades e peculiaridades do curso de Viticultura e Enologia. Com assessoria de profissionais experientes, realizamos uma seleção criteriosa de conteúdos e definimos o grau de complexidade com que cada tema deveria ser trabalhado para atender às reais necessidades do Viticultor Enólogo. Os temas foram tratados de forma interdisciplinar e totalmente contextualizados, na tentativa de promover uma aprendizagem significativa. Sob a óptica do ensino centrado no aluno, procuramos incluir, ao longo da disciplina uma série de atividades que promovessem uma aprendizagem ativa, visando dividir com o aluno a responsabilidade pelo seu aprendizado. Utilizando o conceito de zona de desenvolvimento proximal de Vygotsky, inserimos atividades em grupo para estimular a interação e o desenvolvimento entre os pares.A coleta e análise de dados reuniu as abordagens quantitativa e qualitativa, utilizando questionários com escala Likert e entrevistas semiestruturadas. Nossos resultados mostram que o novo currículo foi bem aceito pelos estudantes. Apesar de ainda termos, em função do perfil de alunos que atendemos, um índice de insucesso considerado alto, a nova disciplina de Bioquímica foi capaz de motivar os estudantes e fornecer subsídios bioquímicos que contribuíram para o prosseguimento do curso. Desenvolvemos uma nova metodologia de seminários em grupo que contribuiu para o engajamento dos estudantes em relação aos conteúdos apresentados. Além dos conteúdos, a disciplina contribuiu para a formação científica dos alunos, forneceu um ambiente de aprendizagem colaborativa que estimulou o desenvolvimento da autonomia dos estudantes. Deste modo, o novo currículo proposto procurou promover uma contribuição mais efetiva da Bioquímica para a continuidade do curso e também para a atuação profissional dos futuros Viticultores Enólogos. / Taking into account a growing market in the recent years, the Viticulture and Oenology Technology course is offered at the Federal Institute of São Paulo, São Roque campus, to educate qualified professionals to work in wineries and other commercial establishments focused on production and commercialization of grape, grape juice and wine that are located not only in the region of São Roque-SP, but also in other regions of the state and the country. The course counts with the Biochemistry discipline, which had been applied in conventional formats. In an attempt to improve the quality of the discipline, as well as students interest and achievements, the present project developed a new curriculum for the discipline of Biochemistry, focused on the specificities and peculiarities of Viticulture and Oenology course. With the assistance of experienced professionals, we made a judicious selection of contents and defined the degree of complexity that each theme should be worked to meet the real needs of the Wine-grower Oenologist. The themes were treated in an interdisciplinary and fully contextualized way, in an attempt to promote significant learning. From the perspective of student-centered teaching, we seek to include throughout the course a series of activities that would promote an active learning, aiming to share with the student the responsibility for his/her learning. Using the concept of Vygotsky\'s Zone of Proximal Development, we included group activities to stimulate the interaction and the development among peers.Data collection and analysis gathered quantitative and qualitative approaches using Likert-scale questionnaires and semi-structured interviews. Our results show that the new curriculum has been well accepted by the students. In spite of the fact that we still have, due to the profile of students that we attend, a failure rate, which is considered high, the new discipline of Biochemistry was able to motivate the students and to provide biochemical subsidies that contributed to the follow up of the course. We developed a new methodology in the format of group seminars that contributed to the engagement of the students related to the presented contents. Besides the contents, the discipline contributed to the students\' scientific education, provided a collaborative learning environment, which stimulated the students\' autonomy development. In this way, the new proposed curriculum sought to promote a more effective contribution of Biochemistry to the continuity of the course and also to the professional performance of the future Wine-grower Oenologists.

Tesi realitzada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC) / Metallopeptidases are major players in the physiology and pathology of all living organisms. Their exquisite regulation is therefore essential for proper function and to prevent misdirected temporal and/or spatial proteolytic activity, which may lead to disease. This regulation is achieved through a wide variety of mechanisms, including their biosynthesis as inactive precursors, also known as zymogens. In the present thesis, various mechanisms of metallopeptidase regulation were studied by using a combination of biochemical, biophysical, and structural techniques. In the first project, the crystal structure of a zymogen fragment of Tannerella forsythia karilysin revealed the shortest propeptide reported to date for a metallopeptidase. Additional biochemical and biophysical assays allowed ascertaining the importance of the propeptide in protein expression, folding and stability. In the second project, a novel family of minimal prokaryotic metallopeptidases termed “minigluzincins” was discovered, providing a minimal soluble scaffold for gluzincin metallopeptidases and integral-membrane metallopeptidases. Two members of this family, called proabylysin and projannalysin, showed two unique zymogenic forms of latency maintenance exerted, respectively, via intramolecular and intermolecular interactions through their C-terminal segments. In the third project, a further member of this novel family, called selecase, evinced selective and specific proteolytic activity against casein. A set of biophysical and structural studies showed that selecase reversibly commutes between several conformations of defined three- dimensional structure, which are associated with loss of enzymatic activity due to autoinhibition (i.e. active monomers vs. inactive dimers, tetramers and octamers). Overall, the present thesis contributes substantially to the field broadening previous knowledge at the molecular level on metallopeptidases and their regulatory mechanisms, which paves the way for the design of specific inhibitors to modulate their activity as part of therapeutic approaches. / Les metal·lopeptidases participen de manera decisiva en la fisiologia i patologia de tots els organismes vius. La seva estricta regulació és, per tant, essencial pel correcte funcionament d’aquestes i per a prevenir una activitat proteolítica inadequada en el temps i/o espai que podria causar malalties. Aquesta regulació s’aconsegueix mitjançant un ampli ventall de mecanismes, incloent la seva biosíntesis com a precursors inactius, també coneguts com a zimògens. En la present tesi s’han estudiat diversos mecanismes de regulació de metal·lopeptidases, tot combinant tècniques bioquímiques, biofísiques i estructurals. En el primer projecte, l’estructura cristal·lina d’un fragment zimogènic de la proteïna “karilysin” de Tannerella forsythia ha revelat el propèptid més curt descrit fins al moment per una metal·lopeptidasa. Assajos bioquímics i biofísics addicionals han permès determinar la importància del propèptid en l’expressió, plegament i estabilitat de la proteïna. En el segon projecte, s’ha descobert una nova família de metal·lopeptidases mínimes d’origen procariota, que s’han anomenat “minigluzincins”, les quals proporcionen un model estructural per a metal·lopeptidases pertanyents al clan de les gluzincines i per a d’altres integrals de membrana. Dues membres d’aquesta família, anomenades “proabylysin” i “projannalysin”, han exhibit formes úniques de manteniment de latència exercides, respectivament, de forma intra- i intermolecular mitjançant llurs segments C-terminals. En el tercer projecte, una altra membre d’aquesta nova família, anomenada “selecase”, ha presentat una activitat proteolítica selectiva i específica sobre caseïna. La conjunció d’estudis duts a terme, tant biofísics com estructurals, ha evidenciat que “selecase” transita de manera reversible entre diverses conformacions d’estructura tridimensional definida, associades amb una disminució d’activitat enzimàtica deguda a autoinhibició (és a dir, monòmers actius i dímers, tetràmers i octàmers inactius). En definitiva, aquesta tesi contribueix de manera substancial a ampliar el coneixement previ sobre metal·lopeptidases a nivell molecular i a entendre els mecanismes que en regulen l’activitat, facilitant així el disseny d’inhibidors específics com a part d’aproximacions terapèutiques.