Orientador: Mario Sergio Palma / Banca: João Ruggiero Neto / Banca: Carlos Henrique Inácio Ramos / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Clovis Ryuchi Nakaie / Resumo: Neste trabalho foram realizados estudos de caracterização estrutural e funcional de alguns peptídeos da classe dos mastoparanos de vespas, que apresentam diferentes padrões de anfipaticidade, em função das diferentes seqüências de aminoácidos que cada um possui. Os peptídeos foram manualmente sintetizados, utilizando-se estratégia Fmoc, e purificados através de técnicas de cromatografia líquida de alta performance. Após a obtenção do material sintético, foram realizadas análises de espectrometria de massas ESI-MS, para monitoração do controle de qualidade. A estrutura secundária foi investigada com o uso de espectroscopia de dicroísmo circular. Além disso, foram realizadas as modelagens moleculares e dinâmica dos peptídeos para análise de suas trajetórias. Foram feitos ensaios para investigar a interação desses peptídeos com membranas fosfolipídicas sintéticas (lipossomos), sendo esta interação, monitorada por medidas de dicroísmo circular e de troca isotópica H/D combinada com espectrometria de massas. Além disto, foram realizados ensaios de atividades biológicas de cada um dos peptídeos, onde foram testadas as atividades de degranulação de mastócitos, hemólise e antibiose. Os dados de Dicroísmo Circular revelaram que todos os peptídeos possuem a tendência de se estruturar em hélice-a quando em ambientes hidrofóbicos, ou em contato com membranas. Além disso, a presença de fosfolipídios ácidos nas membranas aumenta a interação eletrostática destas com peptídeos positivamente carregados. Os estudos de dinâmica molecular em meio aquoso mostraram alta flexibilidade estrutural dos peptídeos e uma variedade de estados conformacionais, em que predominam conformações randômicas, sem, contudo deixar de apresentar alguma porção helicoidal. Além disso, foi mostrado que esses peptídeos possuem caráter anfifílico quando estruturados em hélice / Abstract: The aim of the present investigation was to study the structure/activity relationship of a series of mastoparan-like peptides presenting different patterns of amphipathicit given by their distinct amino acid sequences. The peptides were manually synthesized by using Fmoc strategy and purified under HPLC. The synthetic material homogeneity was analyzed by ESI mass spectrometry and Edman Degradation Chemistry. The secondary structure was investigated through circular dichroism (CD) spectroscopy. In addiction, the secondary structures were modeled and their structural trajectories observed through Molecular Dynamics. The interaction of peptides with membranes was investigated through the combination of synthetic vesicles with H/D exchange and ESI-mass spectrometry. Some biological activities, like: mast cell degranulation, hemolysis and antibiosis were investigated for all the peptides. The CD spectra revealed that the peptides in presence of hydrophobic environment or in presence of biological membranes have the tendency to form helix conformations. Highly organized structures were not observed in aqueous or buffer solutions, however, the peptides always presented some tendency to form helices. The mastoparans interacts strongly and preferentially with the charged PG headgroups. The positive charges of these peptides enable selective binding to bacterial membranes through electrostatic interactions. The molecular dynamic studies of the peptides in water solvent revealed that all the peptides have high structural flexibility and many conformational states. Probably, these molecules assume different conformational states depending on the environment. In addition, it has been shown that the helical conformation gives the amphipathic feature to these peptides. The insertion and orientation of the mastoparan in the bilayer environment was investigated by H/D exchange, combined with mass spectrometry analysis / Doutor

Orientador: Lucia Maria Xavier Lopes / Banca: Ângela Regina Araujo / Banca: Edson Rodrigues Filho / Banca: Massuo Jorge Kato / Banca: Juceni Pereira de Lima David / Resumo: O presente trabalho descreve o isolamento, a identificação e a elucidação estrutural dos constituintes químicos de Aristolochia ridicula H.B.K., bem como a avaliação das potenciais atividades inseticidas, antiplasmódicas e antimicobacterianas dos extratos e das substâncias isoladas dessa espécie. Os extratos acetônico de folhas e etanólico de caules foram fracionados por partição, lavagem e métodos cromatográficos, resultando em seis e quatorze substâncias, respectivamente. Dentre essas substâncias estão uma nova biflavona (ridiculuflavona D), uma nova chalcona-flavona (ridiculuflavonilchalcona B) e um tetraflavonóide com esqueleto carbônico inédito (ridiculuflavonilchalcona C), juntamente com a ridiculuflavona C e o proto-quercitol, os quais foram previamente isolados dessa espécie. Além desses compostos, isolou-se um flavonóide (luteolina), três alcalóides [()-coclaurina, (−)-cloreto de N-steponina e (−)-metilwarifteina], uma alcamida (N-trans-feruloi-tiramina), duas ribonolactonas [(+)-2-desoxi-D-ribono-1,4-lactona e seu derivado 3,5-bis(tripolifosfato)], um derivado glucosídico (etil--D-glucopiranosídio) e o ácido 2-butinodióico. Além disso, identificou-se os íons 3-hidroxipropanoato, acetato e formiato por RMN 1D e 2D, sugerindo que esses compostos são derivados do ácido 2-butinodióico, o qual não foi detectado por RMN de 1H. As estruturas de todos os compostos isolados foram determinadas por métodos espectrométricos (RMN 1D e 2D, EMAR, IV, UV e DC). Transformações químicas (metilações e/ou acetilações) dos flavonóides ridiculuflavona C e ridiculuflavonilchalcona B, bem como dos alcalóides cloreto de N-steponina e metilwarifteina e da alcamida N-trans-feruloil-tiramina também auxiliaram na elucidação estrutural dessas substâncias. A susceptibilidade do inseto Anticarsia gemmatalis às soluções de extratos e de flavonóides... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work describes the isolation, identification, and structural elucidation of the chemical constituents of Aristolochia ridicula H.B.K., as well as the evaluation of insecticidal, antiplasmodial, and antimycobacterial activities of extracts and the chemical constituents from this species. The acetone extract of the leaves and ethanol extract of the stems were fractionated by partitions and washing, followed by chromatographic column, PTLC, and/or HPLC methods to give, respectively, six and fourteen compounds. These included a new biflavone (ridiculuflavone D), a new chalcone-flavone (ridiculuflavonylchalcone B), and a tetraflavonoid with a new carbon skeleton (ridiculuflavonylchalcone C), together with a biflavone (ridiculuflavone C) and a cyclitol (proto-quercitol), which were previously isolated from this species. In addition, a flavonoid (luteolin), three alkaloids [()-coclaurine, (−)-N-steponine chloride, and (−)-methylwarifteine], an alkylamide (N-trans-feruloyl tiramine), two ribonolactones [(+)-2-deoxy-D-ribono-1,4-lactone and its derivative 3,5-bis(tripolyphosphate)], a glucose derivative (ethyl -D-glucopyranoside), and 2-butynedioic acid were isolated. Moreover, 3-hydroxypropanoate, acetate, and formate were detected by NMR techniques, which suggests that they are derivatives from 2-butynedioic acid, which is not detected by 1H NMR. The structures of all isolated compounds were determined by spectrometric method (1D and 2D NMR, HRMS, IR, UV, and CD). Chemical transformations (methylations and/or acetylations) of ridiculuflavone C, ridiculuflavonylchalcone B, N-steponine chloride, methylwarifteine, and N-trans-feruloyl tiramine, also provide further evidences in the structural elucidations of these compounds. The susceptibility of Anticarsia gemmatalis to solutions of extracts and several flavonoids from A. ridicula were evaluated by topical... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell / Coorientadora : Profª. Drª. Nadia Krieger / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/06/2017 / Inclui referências: f. 100-105 / Resumo: O Brasil é o maior produtor de suco de laranja do mundo e a previsão é que processe 12,85 milhões de toneladas da fruta na safra 2016/2017, o que representaria 62% do processamento mundial. Por consequência, o Brasil é o maior gerador de polpa cítrica, composta pelas cascas, resíduos da polpa e sementes (aproximadamente 50% da massa da fruta). Atualmente, a polpa cítrica é em grande parte descartada em aterros industriais, o que gera ônus econômico e ambiental. Em busca da solução, surgiu o conceito da biorrefinaria de polpa cítrica, com o objetivo de transformar essa biomassa em energia, biocombustíveis e químicos. Em torno de 25% da polpa cítrica é composta por pectina, um heteropolissacarídeo estrutural formado majoritariamente por ácido D-galacturônico, aproximadamente 70% dos seus monossacarídeos. Como a pectina possui pequena demanda no mercado em relação ao seu potencial de produção, sua hidrólise para obter ácido D-galacturônico é uma alternativa para viabilizar a biorrefinaria. O ácido D-galacturônico é um intermediário para a produção de ácido L-galactônico, ácido L-ascórbico e ácido múcico, compostos com aplicação na indústria de alimentos, cosméticos e fármacos. A obtenção do ácido D-galacturônico depende da hidrólise completa de substratos pécticos realizada pela ação de diferentes enzimas, uma vez que a hidrólise química pode degradar o monossacarídeo de interesse. A modelagem matemática da hidrólise enzimática é uma ferramenta para o dimensionamento e a otimização dessa etapa. Contudo, os atuais modelos da hidrólise completa de substratos pécticos são ferramentas limitadas, pois são demasiadamente simplificados. Um modelo útil como ferramenta de otimização deve individualizar a ação das diferentes pectinases e prever a concentração dos substratos, intermediários e produtos ao longo do tempo. Neste trabalho, foram realizadas as primeiras etapas do desenvolvimento desse modelo. Foram desenvolvidos dois modelos estocásticos, baseados no método Monte Carlo, para a ação de enzimas cruciais na produção de ácido D-galacturônico, as endo- e exopoligalacturonases. Esses modelos estão de acordo com a teoria da cinética enzimática clássica, fato que não ocorre em modelos estocásticos de reações similares já descritos na literatura. Os parâmetros cinéticos utilizados nos modelos são as constantes de especificidade relativas da enzima, tanto para cada substrato, como para cada reação possível com um mesmo substrato. A etapa final de uma sacarificação é a hidrólise de oligossacarídeos, e as especificidades das enzimas variam significantemente frente o tamanho do oligômero e a posição de clivagem. Para caracterizar essas especificidades, o método Fingerprinting foi estendido nesse trabalho para ser aplicado em esquemas de reação ramificados, como é o caso da hidrólise de oligossacarídeos. Esse método traz vantagens frente aos métodos já descritos na literatura, como ensaios de velocidade inicial e método da frequência de clivagem por ligação, uma vez que todas as especificidades relativas podem ser determinadas a partir de um único perfil completo de reação. Diante das limitações dos modelos matemáticos atuais, este trabalho lança bases para o desenvolvimento de um modelo matemático da hidrólise total de substratos pécticos por consórcio de enzimas. Palavras-chave: Biorrefinaria, Pectina, Ácido D-galacturônico, Hidrólise enzimática, Constantes de especificidade, Modelagem matemática. / Abstract: Brazil is the largest producer of orange juice in the world and is expected to process 12.85 million tons of the fruit in the 2016/2017 harvest, which would represent 62% of the world's processing. As a consequence, Brazil is the largest producer of waste citrus, composed of peels, pulp residues and seeds (approximately 50% of fruit mass). Currently, most of the citrus waste is discharged in industrial landfills, which generates economic and environmental burden. In search of the solution, the concept of biorefinery of citrus waste emerged, with the objective of transforming this biomass into energy, biofuels and chemicals. About 25% of the citrus waste is composed of pectin, a structural heteropolysaccharide formed predominantly of D-galacturonic acid, approximately 70% of its monosaccharides. Since pectin has little market demand in relation to its production potential, its hydrolysis to obtain D-galacturonic acid is an alternative to enable biorefinery. D-galacturonic acid is an intermediate for the production of L-galactonic acid, L-ascorbic acid and mucic acid, compounds with application in the food, cosmetic and pharmaceutical industry. The production of D-galacturonic acid depends on the complete hydrolysis of pectic substrates carried out by the action of different enzymes, since the chemical hydrolysis can degrade the monosaccharide of interest. The mathematical modeling of enzymatic hydrolysis is a tool for the design and optimization of this hydrolysis step. However, the current models of complete hydrolysis of pectic substrates are limited tools, since they are too simplified. A useful model as an optimization tool should individualize the action of the different pectinases and predict the concentration of the substrates, intermediates and products over time. In this work, the first steps of the development of this model were taken. Two stochastic models, based on the Monte Carlo method, were developed for the action of crucial enzymes in the production of D-galacturonic acid, endo- and exopoligalacturonases. These models are in accordance with the theory of classical enzymatic kinetics, a fact that does not occur in stochastic models of similar reactions already described in the literature. The kinetic parameters used in the models are the relative specificity constants of the enzyme for each substrate, as well as for each possible reaction with the same substrate. The final step of a saccharification is the hydrolysis of oligosaccharides, and the specificities of the enzymes vary significantly against the size of the oligomer and the cleavage position. To characterize these specificities, the Fingerprinting method was extended in this work to be applied in branched reaction schemes, as is the case of oligosaccharide hydrolysis. This method has advantages over the methods already described in the literature, initial rate assays and bond cleavage frequency method, since all relative specificities can be determined from a single complete reaction profile. In view of the limitations of current mathematical models, this work lays the foundations for the development of a mathematical model of the total hydrolysis of pectic substrates by a consortium of enzymes. Keywords: Biorefinery, Pectin, D-galacturonic acid, Enzymatic hydrolysis, Specificity constants, Mathematical modeling.

Orientador : Prof. Dr. Diogo R. Bazan Ducatti / Co-orientador : Prof. Dr. Alan Guilherme Gonçalves / Co-orientadora : Profª. Drª. Maria Eugênia Duarte Noseda / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 25/03/2015 / Inclui referências / Resumo: Polissacarídeos de algas vermelhas (agaranas e carragenanas) têm atraído muita atenção devido à suas diversas aplicações e abundante estoque marinho. O objetivo deste trabalho foi realizar a modificação seletiva de C6 da unidade de ?-D-Galp para a síntese do derivado amino carboxilado da agarose, através de uma síntese em quatro etapas. Para isso, foi realizada a inserção dos grupamentos tosil, azido, amino e carboxila nesta posição do polissacarídeo gerando derivados da agarose que possuem potencial no desenvolvimento de materiais com aplicação tecnológica e farmacêutica, tais como na área biotecnológica, como suporte para imobilização de enzimas, na indústria química em síntese orgânica e na área biomédica na confecção de biomateriais. Além disso, foi realizada a caracterização química de todos os derivados sintetizados. A primeira reação da síntese foi a reação de tosilação. Esta reação foi realizada em meio básico, assim, primeiramente a agarose foi submetida à reação com NaBH4 para redução de seus terminais redutores. As reações preparativas de tosilação, em condições otimizadas, geraram dois derivados tosil da agarose com grau de substituição por grupo tosila de 0,25 e 0,91 (frações 2a e 2b), respectivamente e rendimentos de 97% para ambos os derivados. O derivado 2b apresentou preferência para a posição C6 da unidade de ?-D-Galp, apresentando um grau de substituição de 0,57 para esta posição. Os derivados azido da agarose foram sintetizados, em escala preparativa, em condições otimizadas, com um rendimento de 84% e 52% (frações 3a e 3b). Para a amostra 3b o grau de substituição pelo grupo azido foi de 0,50 para a posição C6 da unidade de ?-D-Galp. Os derivados amino foram sintetizados através da reação de Staudinger, utilizando trifenilfosfina e água. O derivado amino 4a e o derivado 4b apresentaram um rendimento de 76% e de 52%, respectivamente, após purificação em sohxlet para remoção do excesso trifenilfosfina e do subproduto óxido de trifenilfosfina. O grau de substituição para o grupo amino para o derivado 4b foi de 0,28. Os derivados carboxilados, foram sintetizado com os reagentes TEMPO/TCCA promovendo a oxidação seletiva das hidroxilas de C6 da unidade de ?-D-Galp não substituídas por amino. Os resultados indicaram 100% de oxidação das hidroxilas nas frações 4a e 4b e os rendimentos foram de aproximadamente 50% para ambas as frações. Dessa forma, a rota de síntese utilizada se mostrou eficiente, sendo produzido, na maioria das reações, produtos na escala de gramas e as análises dos espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) indicaram que a substituição do grupo tosila por azido e a redução deste a amino foi preferencial em C6 da unidade de ?-D-Galp da agarose. Palavras-chave: Polissacarídeos. Agarose. Modificação química. Derivados da Agarose. / Abstract: Polysaccharides of red algae (agaranas and carrageenan) have attracted much attention due to its various applications and abundant marine stock. The objective of this work was the selective modification of C6 of ?-D-Galp unit for the synthesis of amino carboxylate of agarose, through a synthesis of four steps. For this, was inserted tosyl, azide, amino and carboxyl groups in this position of the polysaccharide, generating agarose derivatives that show potential in the development of materials technology and pharmaceutical applications, such as in the biotechnology area, as support for the immobilization of enzymes, in chemical industry in organic synthesis and in the biomedical field in the production of biomaterials. Furthermore, was realized the chemical characterization of all synthesized products. The first reaction of the synthesis was the tosylation. This reaction was carried out in basic medium, therefore, it was first performed the reaction of agarose with NaBH4 to reduction the polysaccharide reducing terminals. The preparative tosylation reactions, under optimized conditions, generated two tosyl derivative from agarose with a degree of substitution of tosyl group of 0.25 and 0.91 (fractions 2a and 2b), respectively, and 97% yields for both derivatives. The derivative 2b show preference for the C6 position of the ?-D-Galp unit, having a degree of substitution of 0.57 for this position. The azido derivatives of agarose were synthesized in preparative scale in optimal conditions, with a yield of 84% and 52% (fractions 3a and 3b). For the sample 3b the degree of substitution by azido group was 0.50 for the C6 position of the ?-D-Galp unit. The amino derivatives were synthesized via the Staudinger reaction using triphenylphosphine and water. The amino derivative 4a and 4b show a yield of 76% and 52%, respectively, after purification in sohxlet to remove the excess of triphenylphosphine and triphenylphosphine oxyde byproduct. The degree of substitution for the amino group to the derivative 4b was 0.28. The carboxylated derivatives were synthesized with reagents TEMPO / TCCA promoting the selective oxidation of the C6 hydroxyl of the ?-D-Galp unit unsubstituted amino. The results showed 100% oxidation of the hydroxyl fractions 4a and 4b and the yields were approximately 50% for both fractions. Thus, the synthesis route used is efficient, agarose derivatives was produced in gram scale, in most of the reactions and the analysis by nuclear magnetic resonance (NMR) indicated that the substitution of the tosyl group by azide and reduction of this to amine was preferential in C6 of ?-D-Galp unit of agarose. Keywords: Polysaccharides. Agarose. Chemical modification. Derivatives of Agarose.

Orientador : Profª Drª Nadia Krieger / Co-orientadores : Profª Drª Gisella Maria Zanin / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 04/05/2015 / Inclui referências : f. 140-158 / Resumo: Neste trabalho, uma nova lipase isolada de uma biblioteca metagenômica, LipC12, foi imobilizada e sua aplicação na síntese de ésteres foi estudada. Inicialmente, LipC12, que contém uma cauda composta de 6 histidinas (cauda His) em sua estrutura, foi purificada em coluna de níquel e imobilizada por adsorção em polipropileno em pó (Accurel MP-1000) e em sílica em pó (Celite 545), e por ligação covalente em um copolímero acrílico (Immobead 150) e em uma membrana de polipropileno funcionalizada com glutaraldeído. Preparações com cargas de proteína de 10 mg g-1 (proteína/suporte) foram utilizadas na síntese do oleato de etila em n-hexano, utilizando etanol e ácido oleico numa razão molar (RM) de 3:1. LipC12 imobilizada no Immobead 150 proporcionou uma maior conversão em éster (95% em 4 h). Isto levou à investigação da imobilização de LipC12 diretamente do extrato bruto (EB) no Accurel MP-1000 e Immobead 150. No entanto, Accurel MP-1000 não proporcionou imobilização seletiva de LipC12, sendo a eficiência de imobilização (E) muito baixa (29%), provavelmente devido à imobilização de outras proteínas do EB no suporte. Estudos de saturação do suporte Immobead revelaram que, com carga de proteína de 200 mg g-1 de suporte, o preparado imobilizado (Ibead-EBLipC12) utilizado na síntese do oleato de etila em n-hexano (RM 3:1, 40 °C, 250 rpm) proporcionou conversão em éster de 99% em 60 min. Ibead-EBLipC12 foi reutilizada em 10 ciclos sucessivos de 60 min na mesma reação, obtendo-se conversões acima de 90%. Em seguida, Ibead-EBLipC12 foi utilizada para catalisar reações em sistemas livres de solvente, e na síntese do oleato de etila com RM de 1:1, uma reação modelo para a síntese de ésteres do biodiesel, obteve-se uma conversão de aproximadamente 30%, mas toda a atividade foi perdida em 12 h. No entanto, quando a reação foi repetida com a adição do etanol em seis alíquotas iguais durante a reação, foi encontrada uma conversão em éster de 85% em 48 h. Por outro lado, na síntese do caprilato de etila, um éster de aroma, a conversão foi de apenas 6% após 96 h, mesmo com a adição do etanol em etapas. Na reação de síntese de um lipídio estruturado, utilizando ácido caprílico e azeite de oliva (RM 2:1, 40 °C, 250 rpm) Ibead-LipC12 promoveu a inserção de 23% de ácido caprílico nas posições sn-1 e sn-3 dos triacilgliceróis do azeite de oliva, tornando-o um lipídio estruturado do tipo MLM (ácidos graxos de cadeia média nas posições sn-1,3 e ácido graxo de cadeia longa na posição sn-2). Estes resultados mostram que Ibead-EBLipC12 tem um bom potencial para ser utilizada na síntese enzimática de biodiesel e de lipídios estruturados. Além disso, a possibilidade de imobilizar LipC12 diretamente a partir do extrato bruto de proteínas, evita a necessidade de purificá-la antes da imobilização. Palavras-chave: metagenômica, lipases, LipC12, imobilização, síntese de ésteres, biodiesel, lipídeos estruturados, aromas. / Abstract: In this work, a new metagenomic lipase, LipC12, was immobilized and its characterization and application in the synthesis of esters was studied. Initially, LipC12, which contains a histidine tag (His-tag) in its structure, was purified on a nickel column and immobilized by adsorption on the supports Accurel MP-1000 and Celite 545, and by covalent bonding on Immobead 150 and on a functionalized polypropylene membrane. Preparations obtained with 10 mg of protein per gram of support were compared with respect to the synthesis of ethyl-oleate in n-hexane, using an ethanol to oleic acid molar ratio of 3:1. LipC12 gave a better conversion of oleic acid when immobilized on Immobead 150 (95% in 4 h). This led us to investigate the immobilization of His-tagged LipC12 directly from the crude extract on Immobead 150 and Accurel MP-1000. However, Accurel MP-1000 did not provide selective immobilization of LipC12, and probably due to immobilization of other proteins of the EB in support, the immobilization efficiency (E) was too low. At a protein loading of 200 mg g-1, the immobilized preparation ("Ibead-CELipC12") gave a conversion of oleic acid of 99% in 60 min, for reactions performed in n-hexane (molar ratio 3:1, 40 °C, 250 rpm) and could be reused in successive cycles of 60 min in the same reaction to give conversions above 90%. When Ibead-CELipC12 was used to catalyze the esterification of oleic acid with ethanol in a solvent-free system (standard reaction for the synthesis of esters biodiesel) at an ethanol to oleic acid molar ratio of 1:1, all activity was lost within 12 h, with a conversion of oleic acid of around 30%. However, when the reaction was repeated with the addition of ethanol in six equal aliquots during the course of the reaction, a conversion of oleic acid of 85% in 48 h was achieved. Moreover, in the synthesis of ethyl caprylate, an aroma ester, the conversion was only 6% after 96 h, even with the addition of ethanol in aliquots. In the synthesis of a structured lipid, using caprylic acid and olive oil (molar ratio 2:1, 40 °C, 250 rpm), Ibead-CELipC12 promoted the insertion of 23% of caprylic acid in the sn-1 and sn-3 positions of the triacylglycerols of the olive oil, making it a structured lipid MLM, i.e a triacylglycerol containing medium-chain fatty acids (M) at positions sn-1 and sn-3 and a long-chain fatty acid (L) at position sn-2. These results demonstrate that LipC12 has good potential to be used in the enzymatic synthesis of biodiesel and structured lipids. The results are particularly encouraging because it was possible to immobilize His-tagged LipC12 directly from the crude extract, thereby avoiding the need to purify the enzyme prior to immobilization. Keywords: metagenomic, lipases, LipC12, immobilization, ester synthesis, biodiesel, structured lipids, aroma.

Orientadora : Profa. Dra. Rose Adele Monteiro / Co-orientador : Prof. Dr. Emanuel M. de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 13/12/2013 / Inclui bibliografia / Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma beta-proteobactéria encontrada em associação com várias plantas economicamente importantes e pode promover o aumento do crescimento e produtividade vegetal. Este estímulo efetivo do crescimento vegetal depende de uma colonização eficiente da planta hospedeira. A associação com o hospedeiro inicia-se com a adesão da bactéria à superfície radicular, seguida de colonização de pontos de emergência de raízes secundárias e penetração através de descontinuidades da epiderme. Ocorre então uma rápida ocupação dos espaços intercelulares, procedendo com colonização do xilema e porções aéreas. Entretanto, a natureza molecular da colonização não está claramente compreendida. Nestas associações, o evento chave parece ser a colonização da rizosfera. Portanto, a identificação e análise dos produtos gênicos envolvidos na colonização de bactérias promotoras do crescimento vegetal (PGPRs) como H. seropedicae em plantas tem importância científica e interesse econômico para potencializar sua aplicação. Assim, este trabalho descreve que o lipopolissacarídeo de H. seropedicae atua como molécula de ancoragem em lectinas radiculares durante adesão, e que o exopolissacarídeo atua como matriz na formação de biofilme em superfícies abióticas. Outros fatores moleculares foram também identificados por análise transcriptômica dessa bactéria durante colonização de milho, discriminando as adaptações moleculares de H. seropedicae para perceber o ambiente, aderir à superfície radicular e sobreviver nos primeiros estágios da colonização da rizosfera. / Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a betaproteobacteria found in association with several crops and can promote plant growth and increase productivity. This effective stimulus of plant growth depends on an efficient colonization of the host plant. The association with the host begins with the bacterial attachment onto the root surface, followed by the colonization on points of secondary root emergency and penetration through epidermis discontinuities. A rapid occupation of intercellular spaces then occurs, proceeding with xylem and aerial portions colonization. However, the molecular nature of the colonization is not clearly understood. In these associations, the key event seems to be the rhizosphere colonization. Therefore, the identification and characterization of genic products involved in the plant colonization by plant growth promoting rhizobacteria (PGPRs) such as H. seropedicae has scientific importance and economic interest to potentiate its application. This way, this work describes that the H. seropedicae lipopolysaccharide act as anchoring molecule to radicular lectins during attachment and that the exopolysaccharide act as matrix in biofilm formation on abiotic surfaces. Other molecular factors were also identified by transcriptomic analyses of bacteria during maize colonization, discriminating the molecular adaptations of H. seropedicae when perceiving the environment, attaching onto root surface and surviving in the first stages of rhizosphere colonization.

Orientadora : Profa. Glaucia Regina Martines / Co-orientadora : Profa. Sheila M.B. Winnischofer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 24/02/2010 / Bibliografia: fls. 92-102 / As radiações ultravioleta (UV), infravermelha (IR) e visível (Vis) estão presentes na luz solar. Sabe-se que a radiação UV-A (320 – 400 nm) promove a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem gerar danos ao DNA das células da pele. A radiação IR também causa alterações na pele, como o envelhecimento precoce e hiperpigmentação, além disso, tem potencial fotocarcinogênico e estimula a geração de ROS. Estudos mostram que a melanina da pele do ser humano, produzida nos melanócitos e transferida para os queratinócitos, absorve as radiações solares e protege o DNA da luz solar. O uso do laser infravermelho 780nm na pele, como instrumento de tratamento, não está totalmente esclarecido em relação aos seus efeitos sobre células normais e/ou tumorais. Foi mostrado que a radiação IR incidente na pele gera ROS. O principal alvo deste trabalho foi a análise dos efeitos da radiação IR proveniente de um laser 780nm sobre células Melan-a (melanócito murino imortalizado) e B16-F10 (melanoma murino), avaliando parâmetros de morte celular e estresse oxidativo. As células B16-F10 tiveram a melanogênese modulada antes da irradiação. Não foram observadas grandes alterações de viabilidade em função das doses, quantidade de melanina endógena ou dos tempos de recuperação, exceto em duas condições: na linhagem B16-F10 sem estímulo e irradiadas com laser infravermelho de 780nm, 70mW, dose 538,2 J/cm², houve aumento de 38,9% na percentagem das células viáveis em relação ao controle após 24 h e na linhagem Melan-a sem estímulo e irradiadas com laser infravermelho de 780nm, 70mW, dose 89,7 J/cm², que tiveram diminuição de 23% na percentagem das células viáveis em relação ao controle após 48 h. Não foi observada alteração da lipoperoxidação ou fragmentação de DNA em nenhuma das linhagens celulares após irradiação. Usando a sonda DCF-DA, não foi observada a geração de ROS intracelular nas células B16-F10 e Melan-a. A melanina de Sepia officinalis irradiada com Laser IR 780nm em solução aquosa de dimetilsulfóxido promoveu a geração de ROS de forma dependente do pH do meio em que se encontrava no momento da irradiação. Os resultados em conjunto mostraram que não houve uma resposta biológica agressiva para as células B16-F10 e Melan-a quando submetidas a apenas uma aplicação para irradiação nas doses de laser IR 780mn de 89,7 a 538,2 J/cm², e, além disso, a quantidade de melanina endógena não afeta os parâmetros de morte celular e geração de ROS. / Ultraviolet (UV), infrared (IR) and visible (Vis) radiation are present in solar light. It is known that UV-A (320 – 400 nm) promotes the formation of reactive oxygen species (ROS) that can cause DNA damage in skin cells. IR radiation causes skin changes such as premature aging, and hyperpigmetation; furthermore, it has potencial for photocarcinogenicity and stimulates the generation of ROS. Studies show that melanin produced in melanocytes and transferred to keratinocytes in human skin absorbs solar radiation and protects DNA from solar light. The use of 780nm infrared laser on the skin, as a means of treatment, is not fully understood in relation to their effect on normal and/or tumor cells. Several studies show that the IR radiation on skin generates ROS. The main aim of this work was the analysis of IR radiation effects from a 780nm laser on Melan-a (immortalized murine melanocyte) and B16-F10 (murine melanoma) by evaluating cell death and oxidative stress parameters. The B16- F10 cells had the melanogenesis modulated before irradiation. Results did not show any major changes in viability in function of treatments, amount of endogenous melanin or recovery times, except for two conditions: B16-F10 without stimulation and irradiated with infrared laser 780 nm, 70 mW, dose 538,2 J/cm², that had an increase of 38.9% in the percentage of viable cells compared to control after 24h and Melan-a cell line irradiated with infrared laser 780 mn, 70 mW, dose 89,7 J/cm², that had a 23% decrease in the percentage of viable cells compared to control after 48 h. There were no changes in lipid peroxidation or DNA fragmentation in any of the cell lines after irradiation. Using the probe DCF-DA in cells B16-F10 and Melan-a, it was not observed the generation of intracellular ROS. Melanin from Sepia officinalis, irradiated with 780nm IR Laser in aqueous dimethylsulfoxide, promoted the generation of ROS, which was dependent of the pH of the medium at the time of irradiation. The overall results showed that there was not an aggressive biological response in B16-F10 cells and Melan-a when exposed to only one application of irradiation at doses of 780 nm IR laser from 89,7 a 538,2 J/cm² and, moreover, the amount of endogenous melanin did not affect the parameters of cell death and generation of ROS.

Orientadora : Profª. Drª. Guilhermina Rodrigues Noleto / Coorientadora : Profª. Drª. Carmen Lúcia de Oliveira Petkowicz / Coorientadora : Profª. Drª. Silvia Maria Suter Correia Cadena / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 07/07/2017 / Inclui referências: fls. 138-159 / Resumo: Nesse estudo, foi avaliada a toxicidade de preparações de galactomananas isoladas de sementes de Schizolobium amazonicum e de seus complexos com oxovanádio em células HepG2, com enfoque nos efeitos sobre o metabolismo energético. A galactomanana nativa (SAGM) foi obtida do endosperma das sementes de S. amazonicum por extração aquosa a 25 ºC. O polímero nativo foi submetido à hidrólise ácida parcial resultando na fração MSAGM. A comparação dos perfis de eluição por HPSEC/MALLS/RI das galactomananas nativa e modificada confirmou a hidrólise parcial. A massa molecular de MSAGM obtida por MALLS foi de 1,56 x 104 g/mol. A razão Man:Gal de 3,2:1, determidada por GC, não foi alterada em relação a galactomanana nativa. SAGM e MSAGM foram complexadas com oxovanádio, sendo denominadas SAGM:VO e MSAGM:VO, respectivamente. A complexação dos biopolímeros com oxovanádio (IV/V) foi caracterizada por titulação potenciométrica, FT-IR, RMN 51V e 13C. A técnica de absorção atômica foi utilizada para determinar a presença do metal nos complexos. Os valores das constantes de complexação para os equilíbrios químicos foram similares para ambas as preparações, exceto para o equilíbrio [L2(OH)2(VO)2]/[L]2.[OH]2.[VO]2 que foi detectado apenas para MSAGM:VO. Para o complexo SAGM:VO o conteúdo de vanádio foi 3,8 vezes maior ao do complexo MSAGM:VO. Dentre os polímeros, SAGM e MSAGM:VO promoveram maior redução (~ 50%) na viabilidade das células HepG2 na concentração de 250 ?g/mL durante 72h de incubação. Nas mesmas condições somente MSAGM:VO (250 ?g/mL) promoveu inibição de ~50% na proliferação destas células. Ambos os polímeros também inibiram todos os estados da respiração (basal: ~70%; desacoplado: ~80%, e leak: ~40%). Este efeito se repetiu também em células permeabilizadas, nas quais foi observada a inibição da respiração em ~50%, que se manteve após a adição de ADP, glutamato/malato e succinato, estes últimos substratos para os complexos I e II, respectivamente. A concentração de lactato das células HepG2 incubadas com SAGM (250 ?g/mL) por 72h aumentou em ~25%, porém para SAGM:VO, MSAGM e MSAGM:VO (250 ?g/mL) houve redução de ~20%. Nas mesmas condições, a presença dos biopolímeros não alterou significativamente a concentração de piruvato. Os níveis de ATP foram reduzidos em ~30% após o tratamento de 72h com 250 ?g/mL com todas as preparações. MSAGM:VO aumentou os níveis de ROS em ~149%, enquanto o potencial transmembrana mitocondrial (??m) foi reduzido em ~47%. A análise da morte celular em condição de normóxia, após 72 h, mostrou que MSAGM:VO (250 ?g/mL) promoveu o aumento da atividade de caspases (3 e 7) envolvidas na morte celular por apoptose e, em menor intensidade, a proteína pro-apoptótica BAX. Porém, em condições de hipóxia, o biopolímero aumentou a expressão das proteínas anti-apoptóticas MCL-1 e BCL-XL. Também nesta condição (hipóxia), o tratamento com MSAGM:VO promoveu aumento das proteínas LC3-II e redução de p62, sugerindo o processo de autofagia. Os níveis de expressão de HIF-1? em condições de hipóxia foram reduzidos após o tratamento com MSAGM:VO (250 ?g/mL e 72h). Esses resultados demonstram que as preparações das galactomananas de S. amazonicum, especialmente, SAGM e MSAGM:VO, tornam as células HepG2 suscetíveis a morte e sugerem que estes polímeros tem potencial atividade antitumoral, motivando estudos futuros que viabilizem sua aplicação terapêutica. Além do estudo realizado com as galactomananas de S. amazonicum, o outro objetivo desse estudo foi avaliar o impacto do silenciamento da enzima glucose - 6 - fosfato isomerase (GPI) em células LS174T. GPI é uma enzima citosólica que realiza a interconversão de glucose - 6 - fosfato em frutose - 6 - fosfato. A interrupção genética desta enzima em células LS174T (GPIKO) foi realizada de forma a desviar o metabolismo dessas células para a via das pentoses fosfato. Após o silenciamento de GPI, em condições de normóxia, foi observado uma redução de glucose e lactato, reprogramando as células GPIKO para a fosforilação oxidativa de forma a elevar os níveis de ATP mitocondrial, mantendo assim a viabilidade. A incubação com fenformina nas células GPIKO, levaram as células a morte, indicando sensibilidade ao inibidor do complexo I da cadeia de transporte de elétrons. Em condições de hipóxia, GPIKO teve seu crescimento celular reduzido, caracterizado pela diminuição da proliferação e respiração celular. Apesar da restrição do crescimento in vitro sob hipóxia, o crescimento tumoral in vivo reduziu moderamente em comparação ao tipo selvagem, o qual não apresentava a mutação. Esses resultados indicam que a utilização exclusiva do metabolismo oxidativo tem a capacidade de fornecer precursores metabólicos para o crescimento tumoral, apontando a plasticidade do metabolismo das células tumorais apresentarem uma forte limitação para estratégias antitumorais. Palavras - chave: galactomananas; oxovanadio (IV/V); células HepG2; células LS174T; GPI; metabolismo; efeitos citotóxicos; antitumoral; hipóxia. / Abstract: The aim of this study, was evaluated the toxicity of galactomannan preparations isolated from seeds of S. amazonicum and its complexes with oxovanadium in HepG2 cells, focusing on effects of energy metabolism. Native galactomannan (SAGM) was obtained from endosperm of S. amazonicum seeds by aqueous extraction at 25 ºC. SAGM was subjected to partial acid hydrolysis resulting in the MSAGM fraction. HPSEC/MALLS/RI elution profiles of native and modified galactomannans confirmed partial hydrolysis. Molecular mass of MSAGM obtained by MALLS was 1.56 × 104 g/mol. The Man: Gal ratio of 3.2:1 determined by GC, was not modified in relation to SAGM. SAGM and its partially hydrolyzed form (MSAGM) were complexed with oxovanadium, and was called SAGM:VO and MSAGM:VO, respectively. The complexation of biopolymers with oxovanadium (IV/ V) was characterized by potentiometric titration, FT-IR, NMR 51V, 13C. Atomic absorption technique was used to determine the presence of the metal in the complexes. The values of the complexation constants for the chemical equilibria were similar for both preparations, except for the equilibrium [L2(OH)2(VO)2]/[L]2.[OH]2.[VO]2 that was detected only for MSAGM:VO. For SAGM:VO complex the vanadium content was 3.8 fold greater than MSAGM:VO complex. Among the polymers, SAGM and MSAGM:VO promoted a greater reduction (~ 50%) in the viability of HepG2 cells at concentration of 250 ?g/mL during 72h of incubation. Under the same conditions only MSAGM:VO promoted ~ 50% of inhibition in the proliferation of these cells. Both polymers also inhibited all states of respiration (basal: ~ 70%, decoupled: ~ 80%, and leak: ~ 40%). This effect was also repeated in permeabilized cells, in which respiration inhibition was observed in ~ 50%, which was maintained after the addition of ADP, glutamate/malate and succinate (substrates for complexes I and II, respectively). Lactate concentration of HepG2 cells incubated with SAGM (250 ?g/mL) for 72h increased by ~ 25%, but for SAGM:VO, MSAGM and MSAGM:VO, there was a ~ 20% reduction. Under the same conditions, the presence of the biopolymers did not significantly alter the concentration of pyruvate. ATP levels were reduced by ~ 30% after treatment of 72 h at 250 ?g/ml with all preparations. MSAGM:VO increased ROS levels by ~ 149%, while mitochondrial transmembrane potential (??m) was reduced by ~ 47%. The analysis of cell death in normoxic condition, after 72h, showed that MSAGM:VO (250 ?g / mL) promoted an increase of caspase activity (3 and 7) and, to a lesser extent, protein BAX. However, under hypoxia conditions, the biopolymer increased expression of the anti-apoptotic proteins MCL- 1 and BCL-XL. Also in this condition, treatment with MSAGM:VO promoted increase of LC3-II proteins and reduction of p62, suggesting the autophagy process. Expression levels of HIF-1? under hypoxia conditions were reduced after treatment with MSAGM:VO (250 ?g/mL and 72 h). These results demonstrate that the preparations of galactomannans from S. amazonicum, especially SAGM and MSAGM:VO, render HepG2 cells susceptible to death and suggest that these polymers have a potential antitumor activity, motivating future studies that allow their therapeutic application. In addition to the study carried out with galactomannans from S. amazonicum, the other aim of this study was to evaluate the impact of disruption glucose - 6 - phosphate isomerase (GPI) on LS174T cells. GPI is a cytosolic enzyme that performs glucose - 6 - phosphate interconversion to fructose - 6 - phosphate. Genetic disruption of this enzyme in LS174T cells (GPIKO) was performed in a way to divert the metabolism of these cells to the phosphate pentose pathway. After GPI silencing under conditions of normoxia, a reduction of glucose and lactate was observed, reprogramming GPIKO cells for oxidative phosphorylation in order to raise mitochondrial ATP levels, thus maintaining viability. Incubation with phenformin in GPIKO cells led the cells to death, indicating sensitivity to the inhibitor of the complex I of the electron transport chain. Under hypoxia conditions, GPIKO had a reduced cell growth, characterized by decreased proliferation and cellular respiration. Despite in vitro growth restriction under hypoxia, tumor growth in vivo moderately reduced compared to wild type, which did not show the mutation. These results indicate that the exclusive use of oxidative metabolism has the ability to provide metabolic precursors for tumor growth, pointing out that the plasticity of tumor cell metabolism has a strong limitation for antitumor strategies. Key - words: galactomannan; Oxovanadium (IV/V); HepG2 cells; LS174T cells; metabolism; GPI; Cytotoxic effects; Antitumor; Hypoxia.

Orientador : Marcello Iacomini / Co-orientador : Philip A.J. Gorin / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Bioquímica e Biologia Molecular. Defesa: Curitiba, 2005 / Inclui bibliografia / Resumo: As estruturas de polissacarídeos obtidas de 15 espécies de fungos liquenizados (Cladina arbuscula, C. confusa, C. substenius, Dictyonema glabratum, Leptogium azureum, Leptogium sp., Parmotrema austrosinense, P. delicatulum, P. schindlerii, P. mantiqueirense, P. tinctorum, Rimelia cetrata, R. reticulata, Roccella decipiens e Umbilicaria mammulata) foram estudadas. Exceto liquens dos gêneros Roccella, Leptogium e Dictyonema que apresentam a alga Trentepohlia ou cianobactérias dos gêneros Nostoc e Scytonema, respectivamente, como fotobiontes, os demais contêm algas dos gêneros Trebouxia ou Asterochloris, sendo estes os mais estudados. A partir dos talos destes liquens, foram isoladas glucanas, xilanas, mananas, galactomananas, galactoglucomananas, galactomanoglucanas e um heteropolissacarídeo ácido. Os homopolímeros encontrados correspondem a uma ?? -D-glucana contendo ligações glicosídicas alternadas do tipo (1_ 3)- e (1_ 4) (1:1; nigerana), _ -D-glucana contendo ligações do tipo (1_ 3)- e (1_ 4) (1:3.1; liquenana), ?? -glucana (1_ 3) (pseudonigerana), _ -glucana (1_ 3) (laminarana), _ -glucana (1_ 6) (pustulana) podendo conter grupamentos O-acetil, _ -D-xilana linear ligada (1_ 4) e uma _ -Dmanana linear contendo ligações do tipo (1_ 6). As galactomanoglucanas isoladas apresentaram cadeia principal contendo unidades de _ -D-Glcp ligadas (1_ 3) e especialmente substituídas em O-2,6 por cadeias laterais contendo unidades de Galf e Manp. Por outro lado, as galactoglucomananas e a maioria das galactomananas apresentaram uma cadeia principal composta por unidades de ?? -D-Manp contendo ligações glicosídicas do tipo (1_ 6), as quais encontram-se principalmente substituídas em O-2, O-4 e/ou O-2,4 por diferentes cadeias laterais. Além dos polissacarídeos clássicos observados em liquens, foi ainda caracterizada uma galactomanana, obtida de L. azureum, altamente substituída em O-2 por terminais não redutores de ?? -D-Manp e/ou _ -D-Galp. As unidades de _ -D-Galp substituem as unidades de ?? -D-Manp da cadeia principal em O-4 e não em O-2, como geralmente observado. Além destes, foram ainda isolados polissacarídeos contendo estruturas ainda não descritas em liquens, como galactomananas altamente ramificadas de R. decipiens, apresentando uma cadeia principal composta por unidades de ?? -Manp (1_ 4) ligadas, parcialmente substituídas em O-2 por cadeias laterais de unidades de ?? -Manp (1_ 2) e (1_ 6)- ligadas. As duas galactomananas apresentaram conteúdo variável de Galf. Uma das estruturas apresentou as unidades de Galf como terminais não-redutores, substituindo as unidades de Manp das cadeias laterais em O-6, enquanto que, a outra estrutura apresentou uma maior proporção de unidades de Galf como 5-O-, 6-O- e 5,6-di-Osubstituídas. Uma _ -D-manana linear contendo ligações do tipo (1_ 6) e uma pseudonigerana foram caracterizadas de D. glabratum. Os liquens do gênero Leptogium apresentaram polissacarídeos com características não usuais, como a presença das unidades de 3-O-Me-Galp e de altos teores de grupamentos ácidos. Os dados obtidos reforçam a utilização dos polissacarídeos como marcadores quimiotaxonômicos e sugerem um possível envolvimento do fotobionte na biossíntese de polissacarídeos liquênicos, uma vez que estruturas não descritas anteriormente foram encontradas em liquens que apresentam as algas Trentepohlia, Nostoc e Scytonema como fotobiontes. / Abstract: The structures of polysaccharides from 15 species of lichenized fungi (Cladina arbuscula, C. confusa, C. substenius, Dictyonema glabratum, Leptogium azureum, Leptogium sp., Parmotrema austrosinense, P. delicatulum, P. schindlerii, P. mantiqueirense, P. tinctorum, Rimelia cetrata, R. reticulata, Roccella decipiens, and Umbilicaria mammulata) were studied. Except for lichens of the genera Roccella, Leptogium, and Dictyonema that contain the algae Trentepohlia, Nostoc and Scytonema as photobionts, the other genera have algae from the well-studied genera Trebouxia and Asterochloris. Glucans, xylans, mannans, galactomannans, galactoglucomannans, galactomannoglucans, and an acidic heteropolysaccharide were isolated from the thalli of the lichens. Characterized homopolymers were an ?? -Dglucan, with alternate (1_ 3)- and (1_ 4)-linkages (1:1; nigeran), a _ -D-glucan with (1_ 3)- and (1_ 4)-linkages (1:3.1; lichenan), a (1_ 3)-linked ?? -glucan (pseudonigeran), a (1_ 3)-linked _ -glucan (laminaran), a (1_ 6)-linked _ -glucan (pustulan) with possible O-acetyl groups, a linear (1_ 4)-linked _ -D-xylan and a (1_ 6)-linked _ -D-mannan. The isolated galactomannoglucans contained a main chain of (1_ 3)-linked _ -D-Glcp units, substituted at O-2,6 by side chains of Galf and Manp units. In contrast, the galactoglucomannans and most of the galactomannans had a main chain of (1_ 6)-linked ?? -D-Manp units, mainly substituted at O-2, O-4 and/or O- 2,4 by various side chains. In addition to well-known lichen polysaccharides, some unusual ones were also characterized, such as a galactomannan from L. azureum, highly substituted at O-2 by non-reducing end units of ?? -D-Manp and/or _ -D-Galp. _ - D-Galp units substituted the ?? -D-Manp units of the main chain at O-4 and not at O-2, as usually observed. Also found were two highly substituted galactomannans from R. decipiens that have not been previously observed. The main chain of these polymers is composed of (1_ 4)-linked ?? -Manp units, partially substituted at O-2 by (1_ 2) and (1_ 6)-linked ?? -Manp side-chains. These galactomannans had different contents of Galf units. One of them had Galf units as non-reducing ends, which substituted Manp units of the side chains at O-6, while the other contained a higher proportion of Galf units as 5-O-, 6-O- e 5,6-di-O- substituted units. A linear (1_ 6)-linked _ -D-mannan and pseudonigeran were also found in D. glabratum. Lichens from the genus Leptogium contained unusual polysaccharides, containing 3-O-methyl-galactopyranose units and high percentage of acidic groups. The data reinforce the use of polysaccharides as a chemotaxonomic tool and suggest an involvement of lichen photobionts in the biosynthesis of polysaccharides since new structures were found in lichens that have the algae Trentepohlia, Nostoc and Scytonema as photobionts.

A produção de pectinases por Aspergillus niger LB-02-SF foi estudada, em processo submerso, com o objetivo de avaliar condições de processo de obtenção, caracterizar e utilizar as enzimas produzidas. As condições de processo estudadas foram a composição do meio de cultivo, a adição de pectina (indutor enzimático) ao meio após a fase de intenso crescimento celular, a utilização de inóculo vegetativo e estratégias de controle do pH. Adicionalmente, o extrato enzimático bruto foi caracterizado quanto à temperatura e ao pH de reação e utilizado no tratamento de suco de maçã Gala. Com o meio de cultivo formulado, que não contém glicose na composição, foi verificada a redução do crescimento celular, sem afetar a produção de pectinases e facilitando o controle dos parâmetros de processo. A adição de pectina quando o pH atingiu o valor de 2,7 (22 horas) não influenciou o crescimento fúngico, sendo que a concentração celular máxima (11,0 g/L) e o tempo em que ela ocorreu (48 horas) foram semelhantes aos observados na condição controle, com pectina presente no meio desde o início do processo (11,5 g/L em 41 horas). Nesta condição de adição de indutor enzimático, a produção de pectinases foi favorecida, sendo atingida atividade máxima de 14 U/mL, cerca de 40% superior à da condição controle, no mesmo tempo de cultivo (135 horas). A utilização de inóculo vegetativo levou à redução da fase de adaptação do microrganismo ao meio. Concentrações de 5 e 10% (v/v) favoreceram o crescimento celular; no entanto, foram verificadas atividades enzimáticas máximas de 5,5 e 3,8 U/mL, inferiores à obtida com a inoculação por esporos (6,4 U/mL). Além disso, não foi observada redução dos tempos em que os picos de atividade enzimática ocorreram. No cultivo com a queda natural do pH inicial de 4,0 para o mínimo atingido (pH 2,5) e posterior controle neste valor, foi obtida atividade enzimática máxima de 7,5 U/mL, superior às atingidas no cultivo com controle de pH em mínimo de 2,7 e no cultivo com pH não controlado, de 6,4 e 3,5 U/mL, respectivamente. Nos cultivos em frascos sob agitação, valores iniciais de pH de 2,0, 3,0 e 4,0 foram os que proporcionaram a obtenção de maiores valores de fator de produção específica (YP/X). Em cultivos em biorreator com o pH controlado nestes valores durante todo o processo, verificou-se que o crescimento celular foi favorecido em pH 3,0, com a concentração máxima de biomassa (10,2 g/L) sendo atingida cerca de 90 horas antes do pico observado no cultivo com pH 2,0 constante (7,7 g/L). Por outro lado, a produção de pectinases foi favorecida em pH 2,0, com pico de atividade enzimática de 9,5U/mL, superior aos determinados com pH constante de 3,0 e 4,0, de 4,7 e 2,0 U/mL, respectivamente. A estratégia de condução do cultivo que possibilitou a obtenção da maior atividade enzimática, de 13,2 U/mL, foi em pH inicial de 3,0 e mantido até que fosse atingido no meio a concentração de oxigênio dissolvido de 30%, sendo então reduzido para 2,0 pela adição de H2SO4. Nesta condição, o crescimento celular não foi afetado, resultando em maior fator de produção específica (1,26 U/mg). A ação das enzimas pectinolíticas produzidas em cultivo líquido foi favorecida em pH 4,0 e em temperatura de 50ºC. A estabilidade das enzimas formadas é favorecida em pH 3,0, sendo observada a manutenção de 90% da atividade inicial após 120 horas de exposição. Com a exposição do extrato enzimático às temperaturas de 30, 40 e 50ºC, 100% da atividade enzimática inicial foram preservados por até 180 minutos. Na avaliação da ação do extrato enzimático no tratamento de suco de maçã, os resultados foram estatisticamente semelhantes aos observados após o uso de preparação pectinolítica comercial. Após o tratamento enzimático, foi determinado aumento de clarificação de 79%, com a redução da turbidez e da viscosidade em 98 e 10%, respectivamente. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que as condições avaliadas para o processo submerso influenciam efetivamente na produção de pectinases e que estas enzimas têm potencial para serem utilizadas em formulações para a clarificação de sucos de frutas. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2016-05-12T13:50:52Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Caroline Reginatto.pdf: 1099356 bytes, checksum: ed0414191326cd7f7caa74b8ce16cdec (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-12T13:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Caroline Reginatto.pdf: 1099356 bytes, checksum: ed0414191326cd7f7caa74b8ce16cdec (MD5) Previous issue date: 2016-05-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / The production of pectinases by Aspergillus niger LB-02-SF was carried out in submerged process, aiming to evaluate process conditions and to characterize and utilize the produced enzymes. The process conditions evaluated were medium composition, addition of pectin (enzymatic inducer) to the medium after the phase of intense cellular growth, use of vegetative inoculum and strategies to pH control. Additionally, the crude enzyme extract was characterized with respect to temperature and pH of reaction and used in Gala apple juice treatment. By using the cultivation medium formulated, which does not contain glucose, it was verified the decrease of the cellular growth without affecting the pectinase production and facilitating the control of the process parameters. The addition of pectin when the pH reached the value of 2.7 (22 hours) did not influence the fungal growth, noticing that the maximum cellular concentration (11.0 g/L) and the time that it occurred (48 hours) were similar to the ones obtained at the control condition, which had pectin in the medium since the beginning of the process (11.5 g/L at 41 hours). In this condition of enzyme inducer addition, the pectinase production was favored, reaching a maximum activity of 14 U/mL, ca. of 40% superior to that of control condition, at the same cultivation time (135 hours). The use of vegetative inoculum led to a decrease in the adaptation phase of the microorganism to the medium. Concentrations of 5 and 10% (v/v) enhanced the cellular growth; however, maximum enzyme activities of 5.5 and 3.8 U/mL were attained, which are lower than that obtained with spore inoculation (6.4 U/mL). In addition, it was not observed a reduction of the times in which the enzyme activity peaks occurred. In the cultivation with natural decrease of the initial pH 4.0 to the minimum reached (pH 2.5) and further control in this value, it was obtained maximum enzyme activity of 7.5 U/mL, which is higher than the ones obtained in the cultivation with pH controlled at minimum of 2.7 and in the cultivation with no pH control, of 6.4 and 3.5 U/mL, respectively. In shaken flasks cultivations, initial pH values of 2.0, 3.0, and 4.0 resulted in highest values for the specific production factor (YP/X). In bioreactor cultivations with the pH controlled at these values along the process, it was verified that the cellular growth was favored at pH 3.0, with the maximum biomass concentration (10.2 g/L) attained about 90 hours before the peak observed in the run at constant pH 2.0 (7.7 g/L). On the other hand, pectinase production was favored in pH 2.0, with enzyme activity peak of 9.5 U/mL, which is higher than the ones obtained with constant pH of 3.0 and 4.0, of 4.7 and 2.0 U/mL, respectively. The strategy of cultivation conduction that enabled the highest enzyme activity of 13.2 U/mL was the use of initial pH 3.0, its control until the dissolved oxygen concentration in the medium reached 30%, and then decreasing to 2,0 by adding H2SO4. In this condition, the cellular growth was not affected, resulting in high specific production factor (1.26 U/mg). The action of pectinolytic enzymes obtained in liquid cultivation was favored at pH 4.0 and temperature of 50°C. The stability of formed enzymes is favored at pH 3.0, being observed the maintenance of about 90% of the initial activity after 120 min of incubation. At 30, 40 and 50°C, after 180 minutes of exposure, 100% of the initial enzyme activity were maintained. The enzyme extracts obtained were used in enzymatic treatment of Gala apple juice and they had comparable effects to those observed after using commercial pectinolytic preparation. After the enzymatic treatment, it was identified 79% of apple juice clarification, with 98 and 10% of turbidity and viscosity reduction, respectively. The results obtained in this work show that the conditions assessed for submerged process effectively influence pectinase production and that these enzymes have potential to be used in formulations for fruit juices clarification.