Orientadora : Profª Drª Joana Léa Meira Silveira / Orientadora : Drª Andrea Caroline Ruthes / Co-orientador : Prof. Dr. Jaime Paba Martinez / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 13/02/2014 / Inclui referências / Resumo: A indústria têxtil representa um importante setor na economia brasileira e mundial que vem crescendo nos últimos anos. No entanto, devido à complexidade dos efluentes eliminados em corpos de água, destaca-se como uma potencial contribuinte à degradação ambiental. Diversos problemas ambientais são inerentes às dificuldades no tratamento dos efluentes têxteis, especialmente em relação à remoção da cor intensa, causada pela presença de corantes oriundos do processo de tingimento de fibras têxteis. Dentre as formas de tratamento de efluentes, o processo de biossorção, através do uso de fungos tem se destacado. Neste processo geralmente a molécula de corante é adsorvida pela parede celular fúngica, composta por lipídeos, proteínas e principalmente polissacarídeos, os quais são frequentemente associados à biossorção. Sendo assim, o fungo Paecilomyces sp. foi avaliado quanto a capacidade biossortiva de seu micélio para processos de descoloração de corantes têxteis. Além disso, foi possível avaliar a relação de polissacarídeos extraídos da parede celular com o processo de biossorção. Entre os resultados obtidos foi observado que o crescimento e a capacidade biossortiva do fungo são alterados pela composição (fontes de carbono, nitrogênio e suplementação) do meio de cultivo. A biomassa micelial de Paecilomyces sp. com o melhor índice de biossortividade foi crescida em meio contendo maltose 15 g/L e tartarato de amônio 100 mM. Cultivado nestas condições, o micélio apresentou capacidade biossortiva para corantes têxteis de diferentes classes e estruturas químicas, sendo que a eficiência de descoloração foi alterada com pré-tratamentos químicos, destacando-se o tratamento com NaOH que aumentou em até 43 % a eficiência de descoloração pela biomassa. Além disso, foi observado que o aumento do tempo de contato entre a biomassa micelial e a solução de corante, e o aumento na concentração de biossorvente proporcionam aumento na eficiência de descoloração. Porém, em diferentes concentrações de NaCl e temperaturas a eficiência de descoloração permanece inalterada. A biomassa micelial também apresentou possibilidade de reuso, pelo processo de dessorção com solução de NaOH 0,1 M. Quanto aos polissacarídeos da parede celular de Paecilomyces sp., foram purificadas cinco frações polissacarídicas, IHW, SFHW, RSFK2, ESFK2 e PDIK2, todas compostas por heteropolissacarídeos com diferentes proporções de manose, galactose e glucose. Dentre as frações polissacarídicas insolúveis, a fração PDIK2 proveniente da extração da fração IK2 com DMSO, apresentou eficiência de descoloração de 86 %. A mesma fração após tratamento com pronase E, manteve a eficiência de descoloração acima de 70 %, sugerindo a isenção da porção proteica da fração no processo de biossorção de corante. No entanto, após o tratamento com glicosidase de Trichoderma harzianum, a fração PDIK2 apresentou diminuição na eficiência de descoloração, sugerindo que a porção polissacarídica seja a principal envolvida na capacidade biossortiva do fungo. Palavras-chave: Biossorção de corantes. Paecilomyces sp. Polissacarídeos de parede celular. Polissacarídeos de fungos filamentosos. / Abstract: The textile industry is an important sector in the Brazilian and world economy and has been growing in recent years. However, due to the complexity of their effluent disposed into water bodies, stands out as a potential contributor to environmental damage. Several environmental problems are inherent to difficulties in treating textile wastewater particularly in relation to the removal of intense color caused by the presence of dyes derived from the dyeing process of textile fibers. Among the forms used in wastewater treatment, the biosorption process using fungi has been outstanding. In this process, the dye molecule is usually adsorbed by the fungal cell wall, composed of lipids, proteins, and especially carbohydrates, which are often associated with the biosorption. Therefore, the fungus Paecilomyces sp. was investigated in this study about its mycelium biosorption capacity for bleaching processes of textile dyes. Moreover, it was possible to evaluate the relationship of polysaccharides extracted from the cell wall with the biosorption process. Among the results was observed that growth and biosorption capacity of the fungus are changed by the composition (sources of carbon, nitrogen and supplementation) of the culture medium. The Paecilomyces sp. mycelial biomass that had the best biosorption capacity was grown in medium containing maltose 15 g/L and 100 mM ammonium tartrate. Mycelium grown under these conditions showed biosorption capacity for different classes of textile dyes and chemical structures, and the efficiency of discoloration was changed by chemical pretreatments, especially with NaOH, which raised up to 43 % biomass efficiency of discoloration. Furthermore, it was observed that increasing the time of contact between the mycelial biomass and the dye solution, and the increase in the concentration of biosorbent provide increased efficiency of discoloration. However, in different concentrations of NaCl and temperatures discoloration efficiency remains unchanged. The mycelial biomass also showed possibility of reuse, by desorption process with NaOH 0.1 M. As to the cell wall polysaccharides of Paecilomyces sp. at least five polysaccharide fractions, IHW, SFHW, RSFK2, ESFK2 and PDIK2 all composed by heteropolysaccharides with different ratios of mannose, galactose and glucose were purified. Among the insoluble polysaccharide fractions, the fraction PDIK2 derived from extraction of fraction IK2 with DMSO showed a discoloration efficiency of 86 %. The same fraction after treatment with proteinase, kept the discoloration efficiency above 70 %, suggesting the exemption of the protein portion in the dye biosorption process. However, after treatment with the glycosidase fraction PDIK2 showed a decrease in the efficiency of discoloration, suggesting that the polysaccharide portion is engaged in the main biosortion capacity. Key-words: Dye biosorption. Paecilomyces sp. Cell wall polysaccharides. Filamentous fungi polysaccharides.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-28Bitstream added on 2014-11-10T11:58:42Z : No. of bitstreams: 1 000789693.pdf: 3140266 bytes, checksum: 8020e0cbe99572a2e4a68115eacf1d3e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Lipases são hidrolases (triacilglicerol acil hidrolases, EC 3.1.1.3) capazes de hidrolisar ésteres carboxílicos de cadeia longa liberando monoacilgliceróis, diacilgliceróis, ácidos graxos e glicerol. Em adição, as lipases são eficientes em reações de síntese como esterificação, glicerólise, aminólise e transesterificação, essa capacidade relacionada ao deslocamento do equilíbrio da reação no sentido de hidrólise ou síntese dependendo da concentração de água presente no meio, característica que as tornam biocatalizadores muito versáteis, com importantes aplicações biotecnológicas, como em indústrias de alimentos, detergentes, farmacêutica, couro, têxtil, cosméticos e papel. O presente trabalho objetivou identificar as seis espécies de fungos lipolíticos, otimizar a produção dessa enzima pela linhagem selecionada, bem como purificar e caracterizar parcialmente a lipase produzida em condição otimizada. A atividade lipase foi determinada após cultivos submersos, objetivando o aumento da produção da enzima. Os fatores avaliados no processo de otimização da produção de lipase foram: meios minerais, tempo de cultivo, fontes de carbono e nitrogênio e suas concentrações, pH e inóculo. A avaliação das melhores condições de cultivo foi realizada pela atividade lipase, determinada pelo íon ρ-nitrofenol (pNP) liberado na hidrólise do substrato sintético ρ-nitrofenil palmitato a 37 °C. O uso de marcadores moleculares permitiu identificar os seis fungos lipolíticos até espécie, exceto para a linhagem Fusarium sp. CBMAI 1227. A metodologia de triagem dos fungos para produção de lipase em meio neutro permitiu a seleção do isolado Trichodemra harzianum CBMAI 1229 como melhor produtor. A melhor condição para produção de lipase (231,58 ± 35,59 U mL-1) foi alcançada após 120 horas de cultivo a 25 °C e 150 rpm de agitação utilizando meio mineral Olson e Johnson (1948), suplementado com óleo... / Lipases are hydrolases (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) capable of hydrolyzing carboxyl esters of long-chain acylglycerol release mono- or diacyglycerol, free glycerol and fatty acid. In addition, the lipases are effective for synthesis reactions such as esterification, glycerolysis, transesterification and aminolysis, this capability related to the displacement of the equilibrium of the reaction towards synthesis or hydrolysis inherent in the concentration of water present in the medium, the characteristic that makes biocatalysts very versatile, with important biotechnological applications. Such as food, detergents, pharmaceutical, textile, leather, paper and cosmetics industries. This work aimed to identify six species of fungi that produce lipase, optimize the production of this enzyme by lineage selected and purify and characterize partially the lipase produced in optimal condition. Enzyme activity was determined after submerged cultures, aiming to increase enzyme production. The factors measured in this optimization process of lipase production were: mineral components, time of cultivation, source of carbon and nitrogen and their concentration, pH and inoculum. The use of molecular markers allowed us to identify the six lipolytic fungi until species, except for strain Fusarium sp. CBMAI 1227. The methodology of screening of fungi for the production of lipase in neutral medium allowed the selection of the isolated Trichodemra harzianum CBMAI 1229 as best producer. The evaluation of improved cultivation conditions was assayed by lipase activity, determined through hydrolysis releasing íon ρ-nitrofenol (pNP) of ρ-nitrophenyl-palmitate (pNPP) as substrate synthetic at 37 °C. The best condition for lipase production (231,58 ± 35,59 U mL-1) was reached after 120 hours of cultivation, 25 °C and 150 rpm in medium mineral Olson & Johnson (1948), suplemented with sunflower oil 3,0% (v/v), peptone 2,0% (w/v), yeast extract 0,2%...

Memoria para optar el título de Bioquímico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / En el sistema nervioso, la transmisión del impulso nervioso entre neuronas se efectúa a través de la sinapsis. Éstas pueden ser de dos tipo, eléctricas y químicas. En estas últimas existen diversas proteínas que se asocian a los receptores de neurotransmisores, las que intervienen en su biosíntesis, transporte, anclaje y modulación de su actividad. Este trabajo se centró en el estudio de una nueva proteína llama Marlin-2, identificada a través de análisis comparativos entre la estructura primaria de la proteína Marlin-1 y las secuencias depositadas en las bases de datos. Marlin-1 (multiplt alpahelices and RNA linker protein), es una proteína que se asocia directamente a la subunidad R1 del receptor de neurotransmisores GABAB e intervendría en su expresión y función. La hipótesis planteada en este trabajo es la siguiente: la homología entre Marli-1 y Marlin-2 define la relación de esta última con compartimientos subcelulares, dominios neuronales y su interacción con el receptor de GABAB. Para verificar esta hipótesis elegimos una combinación de técnicas bioquímicas y microscópicas en modelos de líneas celulares mamíferas y neuronas de cultivo primario de ratas. Nuestros resultados indican que Marlin-2 y Marlin-1 poseen un alto porcentaje de identidad en sus estructuras primarias y que sus dominios estructurales se encuentran altamente conservados, especialmente los involucrados en interacciones proteicas. Además demostramos que en líneas celulares Marlin-2 se distribuye en núcleo y citoplasma y que presentan un patrón granular, predominantemente citoplasmático. Por otra parte, en neuronas transfectadas con Marlin-2, esta proteína se distribuye en el soma y dendritas proximales, presentado un patrón granular, similar al de Marlin-1 endógena. También hemos demostrado la interacción entre Marlin-1 y Marlin-2 mediante análisis de bioimagen y co-inmunoprecipitación en líneas celulares. En base a estos resultados y a las herramientas desarrolladas en este trabajo, en el futuro se logrará conocer en mayor profundidad el rol de esta proteína en el sistema nervioso

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular. 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-05-14T15:56:45Z No. of bitstreams: 1 2012_DanielAmaroSousa.pdf: 1935481 bytes, checksum: fa30fabb3a2bd819c71f8cf14a323392 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-15T11:52:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_DanielAmaroSousa.pdf: 1935481 bytes, checksum: fa30fabb3a2bd819c71f8cf14a323392 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-15T11:52:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_DanielAmaroSousa.pdf: 1935481 bytes, checksum: fa30fabb3a2bd819c71f8cf14a323392 (MD5) / A escassez de novas ferramentas para controle dos agentes microbianos responsáveis por infecções humanas consiste em um grande desafio nos dias atuais. Muitas pesquisas têm sido focadas na busca e caracterização de peptídeos antimicrobianos, categorizados como modelos promissores de novos fármacos antinfeciosos. Neste sentido as plantas constituem um amplo campo de descoberta para novos peptídeos, que podem ser usados como uma ferramenta para a produção biotecnológica de novos compostos. O peptídeo MBP-1 (Maize Basic Peptide), anteriormente relatado em sementes de milho, faz parte de uma classe de peptídeos antimicrobianos (hairpin-like) que tem chamado atenção devido a um novo tipo de enovelamento descrito, caracterizado pela presença de duas hélices conectadas entre si por duas pontes dissulfeto. Desta forma neste trabalho, o peptídeo MBP-1 foi sintetizado quimicamente e sua atividade antimicrobiana avaliada. O mesmo se apresentou efetivo contra as bactérias Gram-negativas patogênicas humanas Escherichia coli, Klebisiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa, mas foi ineficiente contra a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus, assim como contra o fungo Aspergillus fumigatus. O peptídeo apresentou ainda baixa atividade hemolítica nas concentrações testadas. Foram realizados testes com variantes sintéticos do MBP-1 que tiveram suas cisteínas ou triptofano substituídos por alanina a fim de melhor entender seu mecanismo de ação. Este teste demonstrou que a ausência de cisteínas ou triptofano diminui ou anula a atividade do peptídeo, evidenciando assim a importância destes resíduos para atividade. Ao relacionar as atividades de cada peptídeo com os modelos gerados por homologia, pode-se notar que a estabilização das porções terminais das α- hélices por uma ponte dissulfeto parece ser mais importante para atividade bactericida do que estabilizar o interior da molécula. Em geral, estes resultados são úteis para compreensão de algumas características necessárias a atividade do peptídeo MBP-1 e possivelmente dos peptídeos hairpin-like, contribuindo assim com aplicações futuras em ferramentas biotecnológicas que possam ser usadas no tratamento de infecções. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The lack of novel tools for microbial agents control responsible for human infections consists of a great challenge today. Currently, many researches have been focused on the search and characterization of antimicrobial peptides, which have been classified as models for innovative promising anti-infective drugs. In this sense, the plants provide a wide contribution to the field of discovery for unusual peptides that can be used as tools for biotechnological products. The MBP-1 (Maize Basic Peptide), previously reported in corn, is part of a class of antimicrobial peptides (hairpin-like) that has drawn attention due to a new type of folding recently described, characterized by the presence of two -helices connected by two disulfide bonds. Thus, in this work, the MBP-1 was chemically synthesized and its functional characterization activity was further performed. The MBP-1 was active against Gram-negative human pathogenic E. coli, K. pneumoniae and P. aeruginosa but was ineffective against the Gram-positive S. aureus, as well as against the fungus A. fumigatus. The peptide also presented low hemolytic activity at evaluated concentrations. Furthermore, bioassays were performed with MBP-1 synthetic variants that had their cysteines or tryptophan replaced by alanine, in order to better understand the peptide mechanism of action. Those assays demonstrated that the absence of cysteine or tryptophan reduces or suppresses the antimicrobial peptide activity, thus evidencing the importance of these residues for bactericidal activity. By linking the activities of each peptide with the three-dimensional models generated by homology modeling, it can be noted that the stabilization of the terminal portions of α-helices with a disulfide bond seems to be more important for bactericidal activity than to stabilize the interior of the molecule. In general, these results here presented could be useful for a better understanding of some features necessary for activity of MBP-1 and possibly for the hairpin-like peptides, thus contributing to future applications in biotechnology tools that could be used to treat infections.

A Doença do Xarope do Bordo é uma alteração metabólica hereditária caracterizada bioquimicamente pelo acumulo dos aminoácidos de cadeia ramificada e seus respectivos aminoácidos no sangue e nos tecidos destes pacientes. Os mecanismos patogênicos das alterações neurológicas presentes nos pacientes ainda são pouco conhecidos. Há evidências de que o metabolismo energético esteja alterado no cérebro dos pacientes. A creatinaquinase, enzima chave no metabolismo energético, está envolvida transporte e manutenção da energia cerebral. Neste trabalho investigamos a inibição da creatinaquinase pelos aminoácidos de cadeia ramificada in vitro em cérebro de ratos em desenvolvimento, nas concentrações semelhantes as encontradas no plasma destes pacientes. O mesmo efeito não foi verificado com os cetoácidos de cadeia ramificada. Verificamos ainda que este efeito também ocorreu em ratos tratados com leucina de forma crônica do 60 ao 210 dia, e de forma aguda quando tratados por 12 horas com intervalos de três horas. Os parâmetros cinéticos estudados mostraram um Km baixo (0,8 – 1,4 mM) para a fosfocreatina como substrato, cuja variação no cérebro oscila entre 4 a 8 mM. Assim nas condições fisiopatológicas a enzima estaria saturada em ralação à fosfocreatina, sendo difícil a competição com os aminoácidos de cadeia ramificada, principalmente devido ao alto Ki encontrado (6 a 26 mM), exceto em situações de baixas concentrações deste substrato. Entretanto, o Km encontrado para o ADP como substrato (0,3 ± 0,1 mM) é semelhante à concentração do ADP do cérebro (0,2 – 0.4 mM). Como o Ki encontrado também é alto (14 – 30 mM), é possível que a competição entre o ADP como substrato e os aminoácidos de cadeia ramificada diminua a atividade da enzima alterando a homeostasia energética do cérebro, contribuindo para o dano neurológico encontrado nos pacientes com a Doença do Xarope de Bordo. Os dados deste trabalho propõem um novo mecanismo fisiopatológico para as alterações neurológicas encontradas na Doença do Xarope do Bordo. Os aminoácidos de cadeia ramificada, acumulados no cérebro destes pacientes, ocasionando a inibição da creatinaquinase estariam competindo com o ADP, produzindo deste modo um desequilíbrio energético e conseqüentemente o dano neurológico.

A enzima -cetoacil-PCA redutase catalisa a redução, dependente de NADPH, de - cetoacil-PCA, a segunda etapa do sistema tipo II de elongação de ácidos graxos em bactérias, plantas e organismos apicomplexos. No presente trabalho, utilizou-se acetoacetil- CoA como substrato para caracterizar cineticamente a reação catalisada pela enzima de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose. O mecanismo cinético da reação foi investigado pela análise de padrões de velocidade inicial, inibição por produtos e efeitos isotópicos primários cinéticos, e os resultados apontam para um mecanismo aleatório em estado estacionário. Efeitos isotópicos cinéticos primários, a-secundários, de solvente e múltiplos, bem como estudos de pH e temperatura, ressonância magnética nuclear e variação dos efeitos isotópicos primários com o pH foram utilizados para determinar o mecanismo químico da reação, e a análise dos resultados sugere que as transferências de hidreto e próton e a re-hibridização dos substratos ocorrem de modo concertado. A interação entre NADPH e enzima foi estudada tanto em condições de equilíbrio quanto em estado pré-estacionário, monitorando-se o aumento na fluorescência do nucleotídeo ao ligar na proteína. Os dados coletados em equilíbrio sugerem a presença de cooperatividade homotrópica positiva entre as subunidades do dímero, e a análise dos dados cinéticos sugere duas formas de enzima livre em solução como base para a cooperatividade. Diálise em equilíbrio foi empregada para caracterizar a ligação de acetoacetil-CoA à enzima, e os resultados indicam que não há cooperatividade na ligação deste substrato. Mecanismos cinético, químico e cooperativo para a reação catalisada pela -cetoacil-PCA redutase de M. tuberculosis são propostos com base nos dados aqui apresentados. / The -ketoacyl-ACP reductase enzyme catalyzes the NADPH-dependent reduction of -ketoacyl-ACP, the second step of type II fatty acid elongation system of bacteria, plants, and apicomplexan organisms. In the present work, acetoacetyl-CoA was utilized as substrate to kinetically characterize the reaction catalyzed by the enzyme of Mycobacterium tuberculosis, the etiogical agent of tuberculosis. The reaction kinetic mechanism was investigated by analyzing initial velocity and product inhibition patterns, and primary kinetic isotope effects, and the results point to a random steady-state mechanism. Primary, a-secondary, solvent, and multiple kinetic isotope effects, as well as pH and temperature studies, nuclear magnetic resonance, and pH variation of primary isotope effects were utilized to determine the reaction chemical mechanism, and analysis of the results suggests that hydride and proton transfer and substrate re-hybridization occur in a concerted fashion. Interaction between NADPH and enzyme was studied both in equilibrium and pre-steadystate conditions, by monitoring the enhancement in nucleotide fluorescence upon its binding to the enzyme. Data collected at equilibrium suggest the presence of positive homotropic cooperativity between subunits of the dimer, and analysis of kinetic data suggests two forms of free enzyme in solution as the basis for cooperativity. Equilibrium dialysis was employed to characterize the binding of acetoacetyl-CoA to the enzyme, and the results indicate there is no cooperativity in the binding of this substrate. Kinetic, chemical, and cooperaive mechanisms for the M. tuberculosis -ketoacyl-ACP reductasecatalyzed reaction are proposed on the basis of the data presented here.

A Dieta Cetogênica é caracterizada pelo alto teor de gordura e baixo teor de carboidratos e proteínas, e tem sido proposta como benéfica em crianças com desordens epiléticas que não respondem ao tratamento convencional de drogas anti-epiléticas. O retardo de crescimento é um importante inconveniente desta dieta e as causas metabólicas ainda não estão bem caracterizadas. O objetivo desse estudo é examinar a variação de peso corporal e de tecido adiposo de ratos Wistar tratados com a dieta cetogênica durante 6 semanas, e a atividade da fração citosólica da enzima fosfoenolpiruvato carboxicinase (PEPCK) no tecido adiposo. Os ratos alimentados com a dieta cetogênica apresentaram uma diminuição do peso corporal, mas um significante aumento de tecido adiposo. A razão tecido adiposo/peso corporal apresentou diferenças entre os ratos cetogênicos e os controles já na primeira semana de tratamento, cerca de 2 vezes maior nos ratos cetogênicos. A lipogênese visceral foi mantida por um aumento na atividade da PEPCK, objetivando o fornecimento de glicerol-3- fosfato para a síntese de triacilglicerol e este acúmulo de gordura foi acompanhado por intolerância à glicose. Não foram observadas mudanças na glicemia e lipidemia basais. Estes dados contribuem para o entendimento dos efeitos metabólicos da dieta cetogênica e sugere alguns riscos potenciais desta dieta.

A acidemia metilmalônica é uma desordem metabólica hereditária caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA) e clinicamente por deterioração neurológica progressiva e falência renal. Os avanços no tratamento dessa doença alcançados nos últimos anos possibilitaram uma diminuição significativa na mortalidade dos mesmos. Entretanto, a morbidade continua alta, pois a maioria dos pacientes afetados por acidemia metilmalônica, mesmo recebendo o melhor tratamento disponível no momento, apresenta graus variáveis de comprometimento do sistema nervoso central refletido em retardo mental e atraso no desenvolvimento psicomotor. No presente estudo investigamos os efeitos in vivo da administração crônica do MMA em ratos Wistar durante o seu desenvolvimento (do 5º ao 28º dia de vida pós-natal) sobre o comportamento dos mesmos na tarefa do labirinto aquático de Morris. A tarefa foi realizada após um período de recuperação dos animais de 30 dias com o intuito de verificar dano neurológico permanente ou de longa duração nos animais. O labirinto aquático de Morris é uma tarefa bastante útil para a avaliação de aprendizado e memória espaciais. O protocolo da tarefa foi ligeiramente modificado para servir ao propósito de nosso trabalho, ou seja, o de avaliar o efeito da administração crônica de drogas sobre o comportamento de ratos. Verificamos que a administração crônica de MMA não provocou efeito no peso corporal, velocidade de natação e na fase de aquisição da tarefa. Porém, o tratamento prejudicou o desempenho dos animais no treino reverso, o que é condizente com comportamento perseverativo. Também avaliamos o efeito do ácido ascórbico, que foi administrado isoladamente ou em combinação com o MMA para testarmos se o estresse oxidativo poderia estar relacionado com as alterações comportamentais observadas no grupo tratado com MMA. Observamos que este antioxidante preveniu as alterações comportamentais provocadas pelo MMA, indicando que o estresse oxidativo pode estar envolvido com o efeito encontrado. Passamos então a avaliar o efeito in vitro do MMA sobre parâmetros de estresse oxidativo, mais especificamente na técnica de dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), que é um parâmetro de lipoperoxidação, e sobre o potencial antioxidante total do tecido (TRAP) e a reatividade antioxidante do tecido (TAR), que são parâmetros de defesas antioxidantes teciduais. O MMA na concentração de 2,5 mM aumentou a lipoperoxidação in vitro em homogeneizado de estriado e hipocampo de ratos e diminuiu o TRAP e o TAR em homogeneizado de estriado de ratos. Tais resultados indicam fortemente que o MMA induz estresse oxidativo. Finalmente investigamos o efeito in vitro do MMA sobre a atividade enzimática dos complexos da cadeia respiratória em várias estruturas cerebrais e em órgãos periféricos em ratos de 30 dias de vida no sentido de melhor esclarecer os mecanismos fisiopatológicos dos danos teciduais desta doença. Verificamos que o MMA causou uma inibição significativa da atividade do complexo II da cadeia respiratória em estriado e hipocampo quando baixas concentrações de sucinato foram utilizadas no meio de incubação. Além disso, verificamos que este efeito inibitório do MMA sobre o complexo II ocorreu somente após exposição do homogeneizado ao ácido por pelo menos 10 minutos, além do que esta inibição não foi prevenida pela co-incubação com o inibidor da óxido nítrico sintetase Nω- nitro-L-argininametilester (L-NAME) ou por uma associação de catalase e superóxido dismutase. Estes resultados sugerem que as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio mais comuns não estão envolvidas neste efeito, tornando improvável que a inibição do complexo II da cadeia respiratória seja mediada por estresse oxidativo. O MMA também causou uma inibição do complexo II-III em estriado, hipocampo, rim, fígado e coração; e inibiu o complexo I-III em fígado e rim. O complexo IV não foi afetado pela incubação com o ácido em nenhuma das estruturas testadas. Portanto, tomados em seu conjunto, estes resultados indicam que o MMA bloqueia a cadeia respiratória. Os resultados de nosso trabalho indicam que a administração crônica de MMA em ratos em desenvolvimento provocou alterações comportamentais de longa duração provavelmente mediadas por radicais livres, pois tais alterações foram prevenidas pelo antioxidante ácido ascórbico. O MMA também induziu estresse oxidativo in vitro em estriado e hipocampo e inibiu de forma diferenciada os complexos da cadeia respiratória nos tecidos estudados, sendo que as estruturas mais vulneráveis a esta ação foram o estriado e o hipocampo. Finalmente, nossos resultados sugerem que antioxidantes podem ajudar a prevenir, ou pelo menos atenuar, os danos teciduais provocados pelo MMA na acidemia metilmalônica.

O paradigma do P50 é uma técnica eletrofisiológica útil na investigação da neurobiologia básica subjacente aos defeitos de processamento sensorial que caracterizam algumas doenças mentais, mais tradicionalmente associados à esquizofrenia. Nessa tese replica-se e amplia-se o estudo do filtro sensorial P50 em algumas condições neurológicas e psiquiátricas. Foram replicados os achados de perda de supressão na esquizofrenia, na doença de Parkinson e no transtorno de estresse pós-traumático (avaliando pioneiramente vítimas de violência urbana). O filtro sensorial P50 em populações com transtorno de pânico, com transtorno obsessivo-compulsivo e na doença de Machado-Joseph, uma ataxia cerebelar, foi avaliado pela primeira vez. Em todas estas patologias documentou-se uma perda da supressão do P50. Também se investigou os efeitos da modulação do filtro sensorial por cafeína (a substância psicoativa mais consumida no mundo todo, um antagonista não-seletivo dos receptores de adenosina do tipo A1 e A2A), administrada por via oral a 24 voluntários saudáveis em diferentes doses (100, 200 e 400 mg e placebo). As doses de 200mg e 400 mg reduziram a supressão do P50. O efeito da cafeína foi independente do gênero e do uso habitual de cafeína. Usuários (n=15) mostraram valores basais diferentes quando comparados aos não usuários (n=9), com amplitudes S2 menores. Os resultados obtidos com a teofilina, num estudo prévio, e com a cafeína foram reanalizados, mostrando uma perda transitória de supressão do P50 mais pronunciada à direita, sugerindo uma alteração no padrão de lateralização do filtro sensorial P50 mediada pelo uso de metil-xantinas. Estes achados reforçam a participação da adenosina na modulação do filtro sensorial P50 e indicam que a ingestão de cafeína deva ser controlada neste tipo de estudo. Dessa forma, demonstra-se que uma supressão do P50 alterada é um achado pouco específico. Uma vez que a supressão do P50 pode ser alterada por uma situação habitual como o uso de bebidas que contém cafeína, é possível que a perda da supressão não seja necessáriariamente ruim, mesmo que ela esteja potencialmente associada a uma vulnerabilidade maior para doenças neuropsiquiátricas.

Tesis de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La búsqueda de nuevos métodos de síntesis de quantum dots que permitan generar nanopartículas con nuevas o mejores propiedades o métodos de síntesis mas eficientes a los utilizados actualmente, representa un desafío en materia de investigación. En los últimos años, la síntesis de este tipo de nanopartículas a través del uso de microorganismos ha tomado gran fuerza, lo que se debe principalmente a su alta escalabilidad, a sus bajos costos de producción y a la obtención de nanoparticulas con novedosas propiedades. Uno de los modelos más estudiados, es la síntesis de quantum dots de CdS utilizando Escherichia coli. No obstante, poco se sabe respecto a los procesos metabólicos implicados en la generación de estos nanocristales. Uno de los aspectos claves en estudio, es el rol del metabolismo del azufre en la generación de compuestos sulfurados como componentes de las nanopartículas, siendo la cisteína y el Na2S las fuentes de S más estudiadas. Basados en esto, el uso de fuentes de azufre alternativas abre la puerta a procesos metabólicos distintos, lo que supone la generación de compuestos sulfurados diferentes o una generación más eficiente de los mismos compuestos generados a partir de cisteína o Na2S durante la síntesis de quantum dots. Finalmente, en los últimos años, se ha relacionado el uso de taurina, una fuente no convencional de S, con la respuesta al estrés por cadmio en cultivos de E. coli (Helbig y cols. 2008). En este contexto, la presente Tesis se centró en el estudio del papel del metabolismo de la taurina en la tolerancia de E. coli a Cd2+ y en la biosíntesis de nanopartículas fluorescentes de CdS. Para ello, se evaluó la capacidad de E. coli de sintetizar quantum dots al ser expuesta a una sal de cadmio y utilizando taurina como única fuente de S. Bajo estas condiciones, se analizó la respuesta de la bacteria ante el metal mediante curvas de crecimiento y distribución de flujos metabólicos. Se identificó la generación de compuestos sulfurados (H2S y distintos COSVs) y finalmente se purificó y caracterizó las nanopartículas. Los resultados permitieron concluir que E. coli es capaz de sintetizar nanopartículas fluorescentes, las que en tamaño y características espectroscópicas se relacionan con quantum dots de CdS. La síntesis aparentemente, al utilizar taurina, no depende de H2S, otorgándole un rol no descrito en literatura a los COSVs, específicamente al MeSH, durante la síntesis de quantum dots de CdS y en la respuesta de E. coli a cadmio / The search for novel or more efficientes methods for quantum dots synthesis allowing the generation of nanoparticles with new or better properties, represent a great challange in nanotechnology research. In the last years, the synthesis of quantum dots by microorganisms has generated big expectations, mainly due of the high scalability, low production costs and the generation of nanoparticles with novel properties. The biosynthesis of CdS quantum dots using Escherichia coli is one of the most studied models. Nevertheless, little is known about the metabolic process implicated in nanocrystals generation. A relevant aspect which is currently under study, is the role of S metabolism in the generation of sulfured compounds as key components of nanoparticles structure, being cysteine and Na2S the most studied S sources. Based on this, the use of non-conventional S sources leads to unknown metabolic processes, which implicates the generation of different sulfured compounds or more efficient process for the generation of the same quantum dots production using cysteine or Na2S. Helbig et al. 2008 related a non-conventional S source such as taurine with the response of E. coli to cadmium stress. In this context, the present thesis focuses on the role of taurine metabolism in the tolerance of E. coli to Cd2+ and the role of taurine metabolism in the biosynthesis of fluorescent CdS nanoparticles. In order to achive this, the synthesis of quantum dots by E. coli cultures exposed to a cadmium salt and using taurine as the main sulfur source was evaluated. Under the same conditions, the bacterial reponse to the metal measured through growth curves and metabolic flux distributions was analyzed. Finally, the identification of sulfur compounds (H2S and different COSVs) and the purification with the respective characterization of produced nanoparticles was carried out. The results obtained allow to conclude that E. coli is able to synthesize fluorescent nanoparticles, related in size and spectroscopic characteristic to CdS quantum dots. Apparently, the synthesis using taurine, does not depends on H2S generation by a non-described role of COSVs, specifically MeSH, in the synthesis of CdS quantum dots and also in the E. coli response to cadmium / Fondecyt; Anillo Act 1107