Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-16Bitstream added on 2014-06-13T20:59:09Z : No. of bitstreams: 1 altei_wf_me_araiq.pdf: 2709534 bytes, checksum: f938c1fad72974e7f636d0ca3476f37e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este projeto é parte do projeto temático Conservation and Sustainable Use of the Plant Diversity from Cerrado and Atlantic Forest: Chemical Diversity and Prospecting for Potencial Drugs – Biota/FAPESP e descreve o isolamento, purificação e caracterização de peptídeos cíclicos presentes em Jatropha curcas L. Este tema foi proposto para o projeto temático por tratar-se de um assunto atual e inédito no Brasil, sendo importante no que diz respeito da descoberta de novas classes de produtos naturais. A obtenção dos peptídeos foi realizada através da partição do látex com acetato de etila e da aplicação de técnicas cromatográficas para sua purificação. Este procedimento permitiu a obtenção de dois peptídeos cíclicos, posteriormente caracterizados por análise de aminoácidos e espectrometria de massas. O seqüenciamento dessas substâncias foi realizado por Ressonância Magnética Nuclear, e permitiu identificar o peptídeo cíclico Polianina A [c(Pro-Leu- Gly-Val-Leu-Leu-Tyr)], já descrito na literatura, e um peptídeo de estrutura inédita, denominado Jatrofidina I [c(Leu-Leu-Asn-Leu-Trp-Cly-Pro-Gly)]. Análogos lineares e cíclicos desses peptídeos foram obtidos pela metodologia da síntese peptídica em fase sólida, empregando a estratégia Fmoc/tBu. Os análogos obtidos bem como os peptídeos naturais foram submetidos a diversos ensaios biológicos. Por fim, foi feita uma avaliação mensal qualitativa e/ou quantitativa do perfil ciclopeptídico de espécimes cultivadas de Jatropha curcas L.(Euphorbiaceae), gossypifolia, para verificar se ocorrem alterações na produção destas moléculas em função da época do ano. Os resultados mostraram que as 2 espécies produzem os peptídeos cíclicos durante o ano todo. É interessante notar que as descrições de peptídeos cíclicos na literatura foram obtidas de espécies de Jatropha... / This project is part of the thematic project Conservation and Sustainable Use of the Plant Diversity from Cerrado and Atlantic Forest: Chemical Diversity and Prospecting for Potencial Drugs – Biota/FAPESP, and deals with the isolation, purification and characterization of cyclic peptides from Jatropha curcas L. This is a quite new natural product subject in Brazil, which is also important for discovery from our biodiversity. These compounds were obtained through partition of the latex with ethyl acetate, followed of HPLC chromatography for separation and purification. This procedure resulted in two cyclic peptides, which were characterized by amino acid analysis and mass spectrometry. The structures of these compounds were elucidated by 2D Nuclear Magnetic Resonance. One compound was identified as Pohlianin A [c(Pro-Leu-Gly-Val-Leu-Leu-Tyr)], a known cyclic peptide already isolated from XXX, and one novel which was named jatrophidin I [c(Leu-Leu-Asn- Leu-Trp-Cly-Pro-Gly)]. Linear and cyclic analogues of these peptides were obtained through solid phase synthesis methodology by using of Fmoc/tBu reagents. The linear peptides as well as synthetic cyclic peptides were submitted to several biological assays. Finally, the cyclopeptidic profile of Jatropha curcas and gossypifolia was evaluated. The results showed a continuing production of these compounds in both species all over the year. These results can be relevant for further chemotaxonomy and phylogeny studies of Jatropha species that occur in Latin America, and in special Brazil. Previously, all cyclic peptide in the literature search were isolated from African and Asian Jatropha species, and our results can be useful to map the chemical composition of other Brazilian Jatropha species.

Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Coorientador: Carlos Roberto Ceron / Banca: Eduardo Alves Almeida / Banca: Lucilene Regina Maschio / Banca: Lilian Castiglione / Banca: Rogério Pincela Mateus / Resumo: A cada ano, milhares de novos compostos químicos entram no mercado, e um volume enorme de resíduos é gerado pela atividade humana, existindo uma grande preocupação com relação aos seus efeitos a curto e longo prazo sobre a saúde e o ambiente. Um grande número dessas substâncias químicas é potencialmente perigoso e pode acarretar efeitos biológicos deletérios, sendo que mudanças a nível molecular são usualmente as primeiras respostas detectáveis da perturbação ambiental. Para avaliar os efeitos em sistemas biológicos, são utilizados bioindicadores, organismos sensíveis a agentes tóxicos. O presente trabalho teve por objetivo analisar os efeitos do Brometo de Etídio (BE), substância potencialmente mutagênica, na mosca da fruta (Drosophila melanogaster), realizando-se sempre comparações com o controle positivo, etilmetanosulfonato (EMS). Escolhemos o brometo de etídio por se tratar de uma substância usada frequentemente em métodos de biologia molecular, sendo tida como mutagênica, apesar de não constar como carcinogênico nas listagens da Agência Internacional para Pesquisa de Câncer (IARC). A pesquisa foi feita ao longo de 25 gerações, e em seis gerações (1ª, 5ª, 10ª, 15ª, 20ª, 25ª gerações) foram analisados: (1) os efeitos sobre padrões morfológicos, (2) a produtividade diária ao longo de 15 dias. Além disso, foram analisadas também: (3) alterações bioquímicas em enzimas do sistema oxidativo, acarretadas pela exposição a diferentes concentrações de brometo de etídio e EMS, (4) alterações gênicas: em nível de transposição do elemento transponível Bari-1 e na expressão dos genes que codificam as proteínas catalase, hsp 70 (heat shock protein), superóxido dismutase... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Each year thousands of new chemicals enter the market, and an enormous volume of waste is generated by human activity. Accordingly, there is a great concern regarding their short and long term health and environmental effects. A large number of these chemicals is potentially dangerous and can cause harmful biological effects, and changes at the molecular level are usually the first detectable responses of environmental disturbance. To evaluate the effects on biological systems, are used bioindicators, organisms sensitive to toxic agents. This study aimed to analyze the effects of Ethidium Bromide (EB), a potentially mutagenic substance, in the fruit fly (Drosophila melanogaster), comparing with a positive control, ethylmethanesulfonate (EMS). We chose ethidium bromide because it is a chemical frequently used in molecular biology techniques, and considered as a mutagenic although it is not included in the lists of the International Agency for Research on Cancer (IARC). The survey was conducted over 25 generations, and in six generations (1st, 5th, 10th, 15th, 20th, 25th generations) were analyzed: (1) the effects on morphological patterns, (2) the daily productivity over 15 days. In addition, we also analyzed: (3) biochemical changes in enzymes of the oxidative system brought about by exposure to different concentrations of ethidium bromide and EMS, (4) genetic alterations: level of transposition of the transposable element Bari-1 and expression genes that encode proteins catalase, hsp 70 (heat shock protein), superoxide dismutase 1 and esterase-6 and (5) longevity. Concerning daily productivity, five replicates were done, involving negative and positive controls (not exposed to any mutagen and with EMS, respectively), and three groups exposed to 1, 5 and 30 µM of EB. The results show that there were... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Lara Durães Sette / Coorientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: Rubens Monti / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Resumo: Lipases são hidrolases (triacilglicerol acil hidrolases, EC 3.1.1.3) capazes de hidrolisar ésteres carboxílicos de cadeia longa liberando monoacilgliceróis, diacilgliceróis, ácidos graxos e glicerol. Em adição, as lipases são eficientes em reações de síntese como esterificação, glicerólise, aminólise e transesterificação, essa capacidade relacionada ao deslocamento do equilíbrio da reação no sentido de hidrólise ou síntese dependendo da concentração de água presente no meio, característica que as tornam biocatalizadores muito versáteis, com importantes aplicações biotecnológicas, como em indústrias de alimentos, detergentes, farmacêutica, couro, têxtil, cosméticos e papel. O presente trabalho objetivou identificar as seis espécies de fungos lipolíticos, otimizar a produção dessa enzima pela linhagem selecionada, bem como purificar e caracterizar parcialmente a lipase produzida em condição otimizada. A atividade lipase foi determinada após cultivos submersos, objetivando o aumento da produção da enzima. Os fatores avaliados no processo de otimização da produção de lipase foram: meios minerais, tempo de cultivo, fontes de carbono e nitrogênio e suas concentrações, pH e inóculo. A avaliação das melhores condições de cultivo foi realizada pela atividade lipase, determinada pelo íon ρ-nitrofenol (pNP) liberado na hidrólise do substrato sintético ρ-nitrofenil palmitato a 37 °C. O uso de marcadores moleculares permitiu identificar os seis fungos lipolíticos até espécie, exceto para a linhagem Fusarium sp. CBMAI 1227. A metodologia de triagem dos fungos para produção de lipase em meio neutro permitiu a seleção do isolado Trichodemra harzianum CBMAI 1229 como melhor produtor. A melhor condição para produção de lipase (231,58 ± 35,59 U mL-1) foi alcançada após 120 horas de cultivo a 25 °C e 150 rpm de agitação utilizando meio mineral Olson e Johnson (1948), suplementado com óleo... / Abstract: Lipases are hydrolases (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) capable of hydrolyzing carboxyl esters of long-chain acylglycerol release mono- or diacyglycerol, free glycerol and fatty acid. In addition, the lipases are effective for synthesis reactions such as esterification, glycerolysis, transesterification and aminolysis, this capability related to the displacement of the equilibrium of the reaction towards synthesis or hydrolysis inherent in the concentration of water present in the medium, the characteristic that makes biocatalysts very versatile, with important biotechnological applications. Such as food, detergents, pharmaceutical, textile, leather, paper and cosmetics industries. This work aimed to identify six species of fungi that produce lipase, optimize the production of this enzyme by lineage selected and purify and characterize partially the lipase produced in optimal condition. Enzyme activity was determined after submerged cultures, aiming to increase enzyme production. The factors measured in this optimization process of lipase production were: mineral components, time of cultivation, source of carbon and nitrogen and their concentration, pH and inoculum. The use of molecular markers allowed us to identify the six lipolytic fungi until species, except for strain Fusarium sp. CBMAI 1227. The methodology of screening of fungi for the production of lipase in neutral medium allowed the selection of the isolated Trichodemra harzianum CBMAI 1229 as best producer. The evaluation of improved cultivation conditions was assayed by lipase activity, determined through hydrolysis releasing íon ρ-nitrofenol (pNP) of ρ-nitrophenyl-palmitate (pNPP) as substrate synthetic at 37 °C. The best condition for lipase production (231,58 ± 35,59 U mL-1) was reached after 120 hours of cultivation, 25 °C and 150 rpm in medium mineral Olson & Johnson (1948), suplemented with sunflower oil 3,0% (v/v), peptone 2,0% (w/v), yeast extract 0,2%... / Mestre

Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Wilton Rogério Lustri / Banca: Vani Xavier de Oliveira Junior / Banca: Herida Regina Nunes Salgado / Resumo: O sistema ParE-ParD é um sistema toxina-antitoxina bacteriano, sendo ParE a toxina e ParD a antitoxina. ParD é capaz de neutralizar a ação de ParE formando um complexo com o mesmo, o qual é eficaz na autorregulação do operon parDE. Estudos têm mostrado que a atividade tóxica de ParE ocorre inibindo a atividade da DNA girase, mas nenhum efeito desta proteína sobre a atividade da topoisomerase IV foi observado até hoje. Baseando-se na estrutura primária da toxina ParE de Escherichia coli, bem como nos escassos dados em relação a esta toxina, a meta deste trabalho foi a obtenção de peptídeos sintéticos baseados nesta proteína a fim de avaliar as sequências de aminoácidos responsáveis pela interação com as diferentes topoisomerases bacterianas, além de tentar isolar uma sequência polipeptídica com potencial atividade inibitória sobre essas enzimas. Utilizando modelagem molecular por homologia, um modelo tridimensional para toxina ParE de E. coli foi obtido e validado. Com base nos dados estruturais inferidos a partir do modelo da estrutura tridimensional de ParE, 12 peptídeos foram racionalmente desenhados e sintetizados pela metodologia da fase sólida. Ensaios de inibição in vitro da atividade de superenovelamento de DNA pela girase e de relaxamento de DNA pela topoisomerase IV foram realizados e indicaram que os peptídeos ParE3 (ParE 80-100), ParE8 (ParE 61-105), ParE10 (ParE 61-87) e ParE12 (ParE 61-79) atuam como bons inibidores de ambas enzimas. Ensaios de fluorescência intrínseca e anisotropia de fluorescência, empregando peptídeos sintéticos derivados de ParE, evidenciaram que o processo de inibição da atividade da DNA girase pela toxina ParE deve ocorrer por interação com a proteína GyrA da enzima. Foi iniciado neste trabalho os primeiros testes usando lipossomas como veículos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The operon parDE encode a toxin-antitoxin system formed by ParE toxin and its antitoxin ParD. ParD is able to neutralize ParE action and is effective in autoregulation of the operon. Studies have shown that the toxic activity of the ParE occurs by inhibiting the activity of DNA gyrase, but no effect of this protein on the activity of topoisomerase IV has been observed yet. Based on the primary structure of the Escherichia coli ParE toxin, as well as the scarce data of this toxin, the aim of this work was to obtain synthetic peptides based on this protein in order to assess the amino acid sequences responsible for interaction with the bacterial topoisomerases, besides trying to isolate a polypeptide sequence with potential inhibitory activity against these enzymes. Using molecular homology modeling, a three-dimensional model for E. coli ParE toxin was obtained and validated. Based on structural data inferred from ParE threedimensional model, 12 peptides were rationally designed and synthesized by solid-phase method. Tests of inhibition of the supercoiling reaction of the DNA gyrase and inhibition of DNA relaxation by topoisomerase IV were performed and indicated that the peptides ParE3 (ParE 80-100), ParE8 (ParE 61-105), ParE10 (ParE 61 -87) and ParE12 (ParE 61-79) act as good inhibitors of both enzymes. Intrinsic fluorescence and fluorescence anisotropy assays, using synthetic peptides derived from ParE showed that inhibition process of activity of the DNA gyrase by ParE toxin must occur by interaction with the GyrA protein. In this work was started the first tests using liposomes as carrier vehicles for bioactive peptides derived from ParE. The peptides were efficiently encapsulated in soybean phosphatidyl choline liposomes. It was observed, although reduced, inhibition of bacterial growth when peptides encapsulated in liposomes were... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-03-29T02:01:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000455926-Texto+Completo-0.pdf: 1580649 bytes, checksum: 43ccab4db0f539ea4361b47f57d0cedd (MD5) Previous issue date: 2014 / We assessed the effects of pharmacological spinal inhibition of voltage-gated calcium channels (VGCC) in mouse pruritus. The epidural administration of P/Q-type MVIIC or PhTx3. 3, L-type verapamil, T-type NNC 55-0396 or R-type SNX-482 VGCC blockers failed to alter the scratching behavior caused by the PAR-2 activator trypsin, injected into the mouse nape skin. Otherwise, trypsin-elicited pruritus was markedly reduced by the spinal administration of preferential N-type VGCC inhibitors MVIIA and Phα1β. C. magus-obtained toxin MVIIA displayed significant effects when dosed from 1 to 4 h before trypsin, whereas the effects of P. nigriventer-derived Phα1β remained for up to 12 h. MVIIA or Phα1β also prevented the itching elicited by intradermal (i. d. ) injection of SLIGRL-NH2, compound 48/80 or chloroquine, although they did not affect H2O2-induced itching. Furthermore, the co-administration of MVIIA or Phα1β markedly inhibited the pruritus caused by the spinal injection of gastrin-releasing peptide (GRP), but not morphine. Notably, spinal MVIIA or Phα1β greatly prevented chronic pruritus allied to dry skin. However, either toxin failed to alter the edema formation or neutrophil influx caused by trypsin. In addition, epidural MVIIA or Phα1β did not modify the expression of GRP receptor (GRP-R) in the spinal cord, whilst they brought c-Fos activation to control levels. Finally, the in vitro incubation of MVIIA or Phα1β prevented the calcium influx evoked by the synthetic PAR-2 agonist AC264613 in spinal cord synaptosomes. Data brings novel evidence on itching transmission mechanisms, pointing out the therapeutic relevance of N-type VGCC inhibitors to control refractory pruritus. / Foram avaliados os efeitos da inibição farmacológica dos canais de cálcio voltagem-dependentes (CCVD) no prurido em camundongos. A administração intratecal (i. t. ) dos bloqueadores CCVD do subtipo P/Q (MVIIA ou PhTx3. 3), subtipo L (verapamil), subtipo T (NNC 55-0396) ou do subtipo R (SNX-482) não alterou o comportamento de coçar induzido pela tripsina (agonista do receptor PAR-2), aplicada na região dorsal do pescoço de camundongos. Entretanto, o comportamento de coçar induzido pela tripsina foi significativamente diminuído pela administração i. t. dos bloqueadores de CCVD do subtipo N (MVIIA e Phα1β). A toxina MVIIA, derivada do C. magus, apresentou efeitos significativos quando administrada entre 1 a 4 horas antes da aplicação de tripsina. Por outro lado, a toxina Phα1β derivada do veneno da aranha P. nigriventer demonstrou atividade, quando injetada até 12 h antes da tripsina.O pré-tratamento com MVIIA ou Phα1β foi efetivo em inibir o comportamento de coçar induzido pela aplicação intradérmica (i. d. ) de SLIGRL-NH2, composto 48/80 ou cloroquina; entretanto, as toxinas não inibiram o comportamento de coçar induzido pela injeção i. d. de H2O2. A co-injeção de MVIIA ou Phα1β inibiu o comportamento de coçar induzido pela aplicação i. t. do peptídeo liberador de gastrina (GRP), mas não inibiu o prurido causado pela morfina. Relevantemente, a administração i. t. da toxina MVIIA ou Phα1β inibiu a coceira crônica induzida pelo modelo de pele seca em camundongos. A atividade anti-pruritogênica de ambas as toxinas não parece estar relacionada com a modulação do processo inflamatório na pele, uma vez que as toxinas MVIIA ou Phα1β não foram capazes de inibir o edema e a migração de neutrófilos induzidos pela aplicação i. d. de tripsina.A aplicação i. t. de MVIIA ou Phα1β não modificou a expressão do receptor para o GRP (GRP-R) na medula espinhal. Por outro lado, as duas reduziram a expressão de c-Fos aos níveis do grupo controle, de acordo com a avaliação na medula dos camundongos. Finalmente, a incubação de MVIIA ou Phα1β preveniu o influxo de cálcio estimulado pelo agonista do receptor PAR-2 AC264613 em sinaptossomas de medula de camundongos. Estes resultados trazem uma nova perspectiva acerca dos mecanismos envolvidos na sinalização da coceira, indicando os inibidores de CCVD do subtipo N como possíveis estratégias para o tratamento do prurido, especialmente nas condições onde há ausência de resposta à terapia atual.

Após a evocação as memórias já consolidadas tornam-se novamente vulneráveis à ação de inibidores de síntese protéica. Isto leva a hipótese de que as memórias são reconsolidadas após sua evocação, e que este processo depende de síntese protéica. Muitas evidências indicam que o hipocampo tem um papel chave na consolidação e na reconsolidação de diferentes memórias. A evocação não reforçada pode causar extinção e/ou reconsolidação, dois processos que afetam a retenção da memória em vias opostas. Usando a tarefa do labirinto aquático de Morris nós demonstramos que a anisomicina, um inibidor de síntese protéica, infundida na região CA1 do hipocampo dorsal imediatamente, mas não 3 e 6 horas após o treino prejudica a consolidação da memória espacial associada ao LAM. Além disso, demonstramos que a expressão repetida e não reforçada da memória espacial causa extinção que não é afetada pela inibição de síntese protéica na região CA1. No entanto, se o número de testes de evocação não reforçados é insuficiente para induzir extinção, ocorre o processo de reconsolidação dependente de síntese protéica hipocampal que recupera a memória original. A inibição da síntese protéica hipocampal após o aprendizado reverso prejudica a retenção da preferência espacial reversa e bloqueia a persistência da memória inicial, sugerindo que o aprendizado reverso envolve antes reconsolidação do que extinção do traço original. Além disso, a D-cicloserina, um parcial agonista do sítio da glicina no receptor NMDA, quando administrada sistemicamente ou na região CA1 após uma sessão de evocação não reforçada, melhora a retenção da memória. Nossos resultados no LAM sugerem a existência de um processo reconsolidatório dependente de síntese protéica hipocampal que opera recuperando e modernizando o traço enfraquecido pela evocação e sugere que, semelhante ao processo de consolidação, o de reconsolidação pode não ser somente bloqueado, mas melhorado por tratamentos farmacológicos apropriados. Até o presente não existem estudos a respeito das conseqüências da inibição da síntese protéica hipocampal no armazenamento e persistência pós-evocação da memória de reconhecimento de objetos. Neste trabalho nós reportamos que a infusão de anisomicina na região CA1 do hipocampo dorsal imediatamente ou 180 min, mas não 6 horas após o treino prejudica a consolidação da memória de reconhecimento de longa duração sem afetar a memória de curta duração, o comportamento exploratório e o estado de ansiedade ou a funcionalidade hipocampal. A anisomicina quando administrada na região CA1 após a reativação da memória na presença de objetos familiares não afeta a posterior retenção do traço mnemônico. No entanto, quando administrada na região CA1 imediatamente após a exposição dos animais a um objeto novo e um familiar, prejudica a retenção da memória de ambos os objetos. O efeito amnésico da anisomicina não ocorreu após a exposição a dois objetos novos ou a exploração ao contexto na ausência de estímulos específicos, sugerindo que é dependente da reativação do traço consolidado na presença de um comportamento relevante e saliente. Os resultados obtidos a partir da tarefa de reconhecimento de objetos indicam que o hipocampo é engajado durante a reconsolidação deste traço, talvez adicionando novas informações à memória original. / Upon retrieval, consolidated memories are rendered again vulnerable to the action of metabolic blockers, notably protein synthesis inhibitors. This has led to the hypothesis that memories are reconsolidated at the time of retrieval, and that this depends on protein synthesis. Ample evidence indicates that the hippocampus plays a key role both in the consolidation and reconsolidation of different memories. Non-reinforced retrieval can cause extinction and/or reconsolidation, two processes that affect subsequent retrieval in opposite ways. Using the Morris water maze task we show that in the rat repeated non-reinforced expression of spatial memory causes extinction which is unaffected by inhibition of protein synthesis within the CA1 region of the dorsal hippocampus. However, if the number of non-reinforced retrieval trials is insufficient to induce long-lasting extinction, then a hippocampal protein synthesis-dependent reconsolidation process recovers the original memory. Inhibition of hippocampal protein synthesis after reversal learning sessions impairs retention of the reversed preference and blocks persistence of the original one suggesting that reversal learning involves reconsolidation rather than extinction of the original memory. In addition, when given systemically or into the CA1 region after non-reinforced retrieval, the partial NMDAr agonist D-cycloserine improves subsequent memory retention. Our results suggest the existence of a hippocampal protein synthesis dependent reconsolidation process that operates to recover or update retrieval-weakened memories from incomplete extinction and suggest that, like consolidation, reconsolidation can be not only blocked but also enhanced by appropriate pharmacological treatments. At present there are no studies about the consequences of hippocampal protein synthesis inhibition in the storage and post-retrieval persistence of object recognition memory. Here we report that infusion of the protein synthesis inhibitor anisomycin in the dorsal CA1 region immediately or 180 min but not 360 min after training impairs consolidation of long-term object recognition memory without affecting short-term memory, exploratory behavior and anxiety state, or hippocampal functionality. When given into CA1 after memory reactivation in the presence of familiar objects ANI did not affect further retention. However, when administered into CA1 immediately after exposing animals to a novel and a familiar object ANI impaired memory of both objects. The amnesic effect of ANI was long-lasting, did not happen either after exposure to two novel objects or following exploration of the context alone or in the absence of specific stimuli suggesting that it was not reversible and contingent on the reactivation of the consolidated trace in the presence of a salient, behavioral relevant novel cue. Our results indicate that hippocampal protein synthesis is required during a limited post training time for consolidation of object recognition memory and show that the hippocampus is engaged during reconsolidation of this type of memory, maybe accruing new information into the original trace.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-10T18:47:46Z No. of bitstreams: 1 2009_DanielLimaLogrado.pdf: 4716490 bytes, checksum: 5cc801a6d076dff66b230bb9caddb891 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-11T18:33:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_DanielLimaLogrado.pdf: 4716490 bytes, checksum: 5cc801a6d076dff66b230bb9caddb891 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-11T18:33:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_DanielLimaLogrado.pdf: 4716490 bytes, checksum: 5cc801a6d076dff66b230bb9caddb891 (MD5) Previous issue date: 2009-06 / Visando o desenvolvimento de uma metodologia analítica rápida e econômica orientada para estudos de sistemas moleculares formados por proteínas, o presente trabalho teve como objetivo primordial a associação entre duas poderosas técnicas para análise de proteínas, a microscopia de força atômica (AFM) e a espectrometria de massa (MS). Tendo como perspectiva principal para a associação AFM-MS o estudo do interatoma. A microscopia de força atômica é uma importante técnica para análise de sistemas supramoleculares, dentre outras informações, permite à obtenção da topografia desses sistemas possibilitando que as dimensões das estruturas que o compõe sejam mensuradas, sendo assim, essa ferramenta de análise fornece informações importantes no que diz respeito a estruturas quaternárias formadas por proteínas, sugerindo como as subunidades interagem para formação de complexos moleculares. A determinação precisa da massa molecular por espectrometria de massa possibilita a solução de diversos problemas relacionados às questões bioquímicas, como a determinação direta das estruturas primária e quaternária de proteínas, determinação de modificações pós traducionais, identificação de proteínas e etc. Graças a sua versatilidade e sensibilidade, a espectrometria de massa vem se destacando como ferramenta indispensável para a análise de proteínas. O presente trabalho propõe a associação da microscopia de força atômica com a espectrometria de massa objetivando análises rápidas nas quais uma mesma amostra é submetida às duas ferramentas analíticas, identificando, também, em quais aspectos essas duas técnicas se complementam na investigação de sistemas protéicos. Nos experimentos, proteínas adsorvidas em superfície de mica, suporte frequentemente utilizado nas análises por AFM, tiveram sua morfologia estudada por AFM e, em seguida, foram analisadas por MALDI-MS na mesma superfície, adaptada a placa do MALDI por meio de uma fita dupla face. Em outras circunstâncias, a amostra adsorvida em mica foi submetida a reações para caracterização e identificação das proteínas por MALDI-MS. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Aiming the development of analytical methodology oriented for rapid analysis of protein supramolecular systems, we present in this work the association between two powerful techniques for protein analysis: atomic force microscopy (AFM) and mass spectrometry (MS). The AFM-MS prospects are mainly directed to the interactome study. Atomic force microscopy is a powerful analytical technique for supramolecular systems. Among other information, it provides the system topography and enables the measurement of subunits dimensions. So, it deals about an analytical tool which provides important information regarding the quaternary protein structure, giving a track about how subunits interact to each other in molecular complexes formation. The precise molecular weight determination by mass spectrometry allows the solution of various problems related to biochemical issues, such as determining proteins primary and quaternary structure, characterization of their post-translational modifications, proteins identification and so on. Thanks to its versatility and sensitivity, mass spectrometry has been highlighting as an indispensable analytical tool for protein analysis. This work suggests the association of atomic force microscope and mass spectrometry for rapid analysis of a single sample. We identified the aspects in which these techniques are complementary for investigation of protein systems. For the first time, proteins adsorbed onto mica surface (support often used in AFM analysis) were identified by MALDI-MS, after having their topography examined by AFM. Samples adsorbed on mica were also subjected to reactions for protein characterization and identification by MALDI-MS.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-02-08T13:54:16Z No. of bitstreams: 1 2011_TerezaCristinaVieiraRezende.pdf: 7799530 bytes, checksum: ac6b8b811bee8d8f780e0d60ae6f7bc8 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-02-15T11:45:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_TerezaCristinaVieiraRezende.pdf: 7799530 bytes, checksum: ac6b8b811bee8d8f780e0d60ae6f7bc8 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-15T11:45:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_TerezaCristinaVieiraRezende.pdf: 7799530 bytes, checksum: ac6b8b811bee8d8f780e0d60ae6f7bc8 (MD5) / Dimorfismo é uma característica importante para sobrevivência fúngica em diferentes ambientes e tem sido relacionado com a virulência. O fungo ascomiceto, Paracoccidioides brasiliensis, agente causador da paracoccidioidomicose, pode crescer nas fases de micélio ou de levedura. A patogenicidade do P. brasiliensis é frequentemente associada com a transição dimórfica, de saprófita a patogênico, mas os mecanismos que regulam esse processo permanecem obscuros. Uma das maneiras de estudar esse fenômeno seria isolar e caracterizar proteínas que são especificamente expressas em um dos estágios do ciclo de vida e/ou durante a diferenciação. Eletroforese bidimensional (2-DE) foi utilizada para comparar o proteoma de micélio e de levedura do isolado Pb01 e após 22 h de transição de micélio para levedura. Os géis corados pela prata de três replicatas biológicas independentes foram digitalizados e as imagens foram analisadas utilizando-se o software Image Master 2D Platinum 6.0 software (GE Healthcare). A detecção dos spots e o pareamento foram realizados. A intensidade dos spots foi normalizada e as análises estatísticas avaliada por one-way ANOVA. Os spots de interesse obtidos dos géis 2-D foram retirados, digeridos com tripsina e os peptídeos foram então analisados por MS e/ou MS/MS. Um total de 100 proteínas/isoformas foi identificado; 81 foram diferencialmente expressas nas três fases do fungo, enquanto que 19 proteínas/isoformas foram constitutivamente expressas. A expressão de proteínas como superóxido dismutase e peroxiredoxina mitocondrial foi mais abundante na fase miceliana. Nos estágios iniciais da transição (22 h) algumas enzimas envolvidas na glicólise, como enolase e fosfoglicomutase, estão aumentadas. Proteínas de choque térmico e ATP sintase também estão significantemente aumentadas durante o evento de transição. Proteínas preferencialmente expressas na fase leveduriforme foram identificadas. Muitas das enzimas da via glicolítica e algumas enzimas do ciclo do glioxalato e metabolismo de lipídeos foram mais abundantes em levedura. Para validar os resultados dos géis 2-D foi realizado western blotting de seis proteínas diferentes, e os resultados foram confirmados. Os resultados foram validados por RT-PCR em tempo real nas três condições estudadas, incluindo conídio e transição de conídio para levedura. Os resultados demonstram uma mudança no metabolismo durante a transição de micélio para levedura; o mesmo padrão foi evidenciado na transição de conídio para levedura. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fungal dimorphism is important for survival in different environments and has been related to virulence. The ascomycete Paracoccidioides brasiliensis, the causative agent of paracoccidioidomycosis, can grow as mycelia or yeast. The pathogenicity of P. brasiliensis is frequently associated with the dimorphic shift, from a saprobe to a pathogenic lifestyle, but the mechanisms that regulate the process is still poorly understood. One way to study this phenomenon is to isolate and characterize proteins that are specifically expressed in one of the stages of the life cycle and/or during differentiation. Two-dimensional gel electrophoresis we used to investigate the proteins expressed differentially during transition from mycelia to yeast forms of isolate Pb01 after 22 h of temperature shift. Silver-stained gels of three independent biological replicates were digitalized and the images were analyzed using the ImageMaster 2D Platinum 6.0 software (GE Healthcare). Spot detection and matching was performed. Spot intensities were normalized and the statistics analyses were estimated by one-way ANOVA. The spots of interest were excised, in-gel digested with trypsin, and the peptides were then analyzed by MS and/or MS/MS. A total of 100 proteins/isoforms were identified; 81 were differentially expressed in the three phases of the fungus, whereas 19 proteins/isoforms were constitutively expressed. Enzymes such as superoxide dismutase and mitochondrial peroxiredoxin have been detected as abundant in the mycelium phase. After the early stage of transition (22 h) some enzymes involved in glycolysis, such as enolase and phosphoglutomutase, were increased. Heat shock proteins and ATP synthase were also significantly increased in the transition event. Proteins preferentially expressed in the yeast phase were identified. Most of the enzymes of glycolysis, and some of the glyoxylate cycle and lipid metabolism were more abundant in yeast cells. To validate the 2-D gels results we performed western blotting of six different proteins, and the results were confirmed. The results were also validated by real-time RT-PCR in the three studied conditions, including conidia and conidia-yeast transition. The results demonstrated a shift in the metabolism during transition from mycelia to yeast cell; the same patterns were evidenced in the conidia to yeast transition.

A Dieta Cetogênica é caracterizada pelo alto teor de gordura e baixo teor de carboidratos e proteínas, e tem sido proposta como benéfica em crianças com desordens epiléticas que não respondem ao tratamento convencional de drogas anti-epiléticas. O retardo de crescimento é um importante inconveniente desta dieta e as causas metabólicas ainda não estão bem caracterizadas. O objetivo desse estudo é examinar a variação de peso corporal e de tecido adiposo de ratos Wistar tratados com a dieta cetogênica durante 6 semanas, e a atividade da fração citosólica da enzima fosfoenolpiruvato carboxicinase (PEPCK) no tecido adiposo. Os ratos alimentados com a dieta cetogênica apresentaram uma diminuição do peso corporal, mas um significante aumento de tecido adiposo. A razão tecido adiposo/peso corporal apresentou diferenças entre os ratos cetogênicos e os controles já na primeira semana de tratamento, cerca de 2 vezes maior nos ratos cetogênicos. A lipogênese visceral foi mantida por um aumento na atividade da PEPCK, objetivando o fornecimento de glicerol-3- fosfato para a síntese de triacilglicerol e este acúmulo de gordura foi acompanhado por intolerância à glicose. Não foram observadas mudanças na glicemia e lipidemia basais. Estes dados contribuem para o entendimento dos efeitos metabólicos da dieta cetogênica e sugere alguns riscos potenciais desta dieta.

A acidemia metilmalônica é uma desordem metabólica hereditária caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA) e clinicamente por deterioração neurológica progressiva e falência renal. Os avanços no tratamento dessa doença alcançados nos últimos anos possibilitaram uma diminuição significativa na mortalidade dos mesmos. Entretanto, a morbidade continua alta, pois a maioria dos pacientes afetados por acidemia metilmalônica, mesmo recebendo o melhor tratamento disponível no momento, apresenta graus variáveis de comprometimento do sistema nervoso central refletido em retardo mental e atraso no desenvolvimento psicomotor. No presente estudo investigamos os efeitos in vivo da administração crônica do MMA em ratos Wistar durante o seu desenvolvimento (do 5º ao 28º dia de vida pós-natal) sobre o comportamento dos mesmos na tarefa do labirinto aquático de Morris. A tarefa foi realizada após um período de recuperação dos animais de 30 dias com o intuito de verificar dano neurológico permanente ou de longa duração nos animais. O labirinto aquático de Morris é uma tarefa bastante útil para a avaliação de aprendizado e memória espaciais. O protocolo da tarefa foi ligeiramente modificado para servir ao propósito de nosso trabalho, ou seja, o de avaliar o efeito da administração crônica de drogas sobre o comportamento de ratos. Verificamos que a administração crônica de MMA não provocou efeito no peso corporal, velocidade de natação e na fase de aquisição da tarefa. Porém, o tratamento prejudicou o desempenho dos animais no treino reverso, o que é condizente com comportamento perseverativo. Também avaliamos o efeito do ácido ascórbico, que foi administrado isoladamente ou em combinação com o MMA para testarmos se o estresse oxidativo poderia estar relacionado com as alterações comportamentais observadas no grupo tratado com MMA. Observamos que este antioxidante preveniu as alterações comportamentais provocadas pelo MMA, indicando que o estresse oxidativo pode estar envolvido com o efeito encontrado. Passamos então a avaliar o efeito in vitro do MMA sobre parâmetros de estresse oxidativo, mais especificamente na técnica de dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), que é um parâmetro de lipoperoxidação, e sobre o potencial antioxidante total do tecido (TRAP) e a reatividade antioxidante do tecido (TAR), que são parâmetros de defesas antioxidantes teciduais. O MMA na concentração de 2,5 mM aumentou a lipoperoxidação in vitro em homogeneizado de estriado e hipocampo de ratos e diminuiu o TRAP e o TAR em homogeneizado de estriado de ratos. Tais resultados indicam fortemente que o MMA induz estresse oxidativo. Finalmente investigamos o efeito in vitro do MMA sobre a atividade enzimática dos complexos da cadeia respiratória em várias estruturas cerebrais e em órgãos periféricos em ratos de 30 dias de vida no sentido de melhor esclarecer os mecanismos fisiopatológicos dos danos teciduais desta doença. Verificamos que o MMA causou uma inibição significativa da atividade do complexo II da cadeia respiratória em estriado e hipocampo quando baixas concentrações de sucinato foram utilizadas no meio de incubação. Além disso, verificamos que este efeito inibitório do MMA sobre o complexo II ocorreu somente após exposição do homogeneizado ao ácido por pelo menos 10 minutos, além do que esta inibição não foi prevenida pela co-incubação com o inibidor da óxido nítrico sintetase Nω- nitro-L-argininametilester (L-NAME) ou por uma associação de catalase e superóxido dismutase. Estes resultados sugerem que as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio mais comuns não estão envolvidas neste efeito, tornando improvável que a inibição do complexo II da cadeia respiratória seja mediada por estresse oxidativo. O MMA também causou uma inibição do complexo II-III em estriado, hipocampo, rim, fígado e coração; e inibiu o complexo I-III em fígado e rim. O complexo IV não foi afetado pela incubação com o ácido em nenhuma das estruturas testadas. Portanto, tomados em seu conjunto, estes resultados indicam que o MMA bloqueia a cadeia respiratória. Os resultados de nosso trabalho indicam que a administração crônica de MMA em ratos em desenvolvimento provocou alterações comportamentais de longa duração provavelmente mediadas por radicais livres, pois tais alterações foram prevenidas pelo antioxidante ácido ascórbico. O MMA também induziu estresse oxidativo in vitro em estriado e hipocampo e inibiu de forma diferenciada os complexos da cadeia respiratória nos tecidos estudados, sendo que as estruturas mais vulneráveis a esta ação foram o estriado e o hipocampo. Finalmente, nossos resultados sugerem que antioxidantes podem ajudar a prevenir, ou pelo menos atenuar, os danos teciduais provocados pelo MMA na acidemia metilmalônica.