SOUSA, F. Y. M. Caracterização bioquímica e molecular da oxidase terminal da plastoquinona (PTOX) em Zea mays. 2008. 73 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2008. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-23T21:27:51Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_fymsousa.pdf: 3276367 bytes, checksum: 8879b62998190a8cd28e217ce8a8c994 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-25T21:32:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_fymsousa.pdf: 3276367 bytes, checksum: 8879b62998190a8cd28e217ce8a8c994 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-25T21:32:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_fymsousa.pdf: 3276367 bytes, checksum: 8879b62998190a8cd28e217ce8a8c994 (MD5) Previous issue date: 2008 / The chloroplast is an organelle characteristic of photosynthetic organisms and their role in generating energy from carbon dioxide and water. This organelle may be functionally compromised when subjected to environmental stresses due to the fragility and complexity of the system. To avoid losses caused by stress there are several mechanisms of adaptation and adjustment of the reactions that occur in the chloroplast. Recently characterized most likely of these mechanisms has been called clororespiração. The clororespiração was clarified with the discovery of an enzyme similar to mitochondria that the alternative oxidase is called terminal plastid oxidase (PtOx). The function of chloroplast respiration remains uncertain, but one of the most accepted hypothesis is that the operation of clororespiração could prevent the formation of reactive oxygen species by recycling intermediate reducing the chloroplast. Characterized in this study was the presence of two genes coding for the terminal oxidase in plant plastid of Zea mays. Was also studied the differential expression of both genes in response PtOx or water stress, and the characterization of clororespiração through the activity of the NADH dehydrogenase plastid (NDH) polyacrylamide gel. The molecular characterization of genes PtOx showed homology of 60% when comparing the sequences of genes and 79% when compared to the pre-translated proteins. Genes of this protein have similar structures are composed of eight introns and exons 9. A study of regions of the promoters of the genes showed that there were common elements but the presence of different elements as the cis elements that MBS is responssivo drought, could reveal a differential regulation of genes. The differential response was confirmed by semiquantitative RT-PCR. The gene was called ptox1 stable expression could be considered a constitutive gene, whereas the gene was called ptox2 increased expression proportional to applied stress in both leaves and roots of corn plants. The analysis of the activity of NDH gel (zymogram) revealed the presence of this enzyme in chloroplasts corn confirming the presence of enzymes clororespiração. The phylogenetic analysis of cDNA sequences from databases showed that corn and sorghum in the group of monocots are closely related species which share two of the orthologous genes identified as PtOx ptox1 and ptox2. It appeared that the first time the presence of two genes PtOx into the maize genome, a C4 monocotiledôena metabolism. Genes were named ptox1 and ptox2. They were found in the roots and leaves and only ptox2 gene appeared to be induced in response to osmotic stress. / O cloroplasto é uma organela característica dos organismos fotossintetizantes sendo seu papel primordial na geração de energia a partir de gás carbônico e água. Essa organela pode ter seu funcionamento comprometido quando submetida a estresses ambientais devido a fragilidade e complexidade do sistema. Para evitar perdas provocadas pelo estresse existem vários mecanismos de adaptação e regulação das reações que ocorrem no cloroplasto. Recentemente caracterizou-se mais um desses prováveis mecanismos que foi chamado de clororespiração. A clororespiração foi esclarecida com a descoberta de uma enzima similar a oxidase alternativa da mitocondria que chamou-se de oxidase terminal do plastídeo (PTOX). A função dessa respiração do cloroplasto permanece incerta, mas uma das hipóteses mais aceitas é que o funcionamento da clororespiração poderia prevenir a formação de espécies reativas de oxigênio através da reciclagem dos intermediários redutores do cloroplasto. No presente trabalho foi caracterizado a presença de dois genes que codificam para a oxidase terminal do plastídeo em plantas de Zea mays. Estudou-se também a expressão diferencial de ambos genes da PTOX em resposta ou estresse hídrico, além da caracterização da clororespiração através da atividade da NADH desidrogenase plastidial (NDH) em gel de poliacrilamida. A caracterização molecular dos genes da PTOX mostrou homologia de 60% quando comparadas as sequências dos genes e de 79% quando comparadas as pré-proteínas traduzidas. Os genes dessa proteína têm estruturas similares, sendo compostos por oito introns e 9 éxons. Um estudo das regiões dos promotores dos genes mostrou que existiam elementos comuns porém a presença de elementos diferentes como, o elementos cis MBS que é responssivo à seca, poderia revelar uma regulação diferencial dos genes. A resposta diferencial foi confirmada através de RT-PCR semiquantitativo. O gene chamado de ptox1 teve sua expressão estável, podendo ser considerado um gene constitutivo, enquanto que o gene chamado de ptox2 teve um aumento da expressão proporcional ao estresse aplicado tanto em folhas como em raízes de plantas de milho. A análise da atividade da NDH em gel (zimograma) revelou a presença dessa enzima em cloroplastos de milho confirmando a presença das enzimas da clororespiração. O estudo filogenético de sequencias de cDNA de bancos de dados mostraram que milho e sorgo pertencentes ao grupo das monocotiledôneas, são espécies muito próximas e que compartilham dois genes ortólogos da PTOX identificados como ptox1 e ptox2. Concluiu-se pela primeira vez a presença de dois genes da PTOX no genoma do milho, uma monocotiledôena de metabolismo C4. Os genes foram denominados de ptox1 e ptox2. Eles foram encontrados em raízes e folhas e apenas o gene da ptox2 pareceu ser induzido em resposta ao estresse osmótico.

AGUIAR, Gyselle Viana. Efeito individual e da época do ano sobre a composição do plasma seminal e a qualidade do sêmen caprino resfriado a 4º C por 48 horas no litoral do estado do Ceará. 2008. 139 f. Tese (doutorado em zootecnia)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2008. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-04-07T20:20:24Z No. of bitstreams: 1 2008_tese_gvaguiar.pdf: 668115 bytes, checksum: 6d27199dfe999b7caf4bb93a912e7708 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-25T19:44:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_tese_gvaguiar.pdf: 668115 bytes, checksum: 6d27199dfe999b7caf4bb93a912e7708 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-25T19:44:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_tese_gvaguiar.pdf: 668115 bytes, checksum: 6d27199dfe999b7caf4bb93a912e7708 (MD5) Previous issue date: 2008 / This study aimed to evaluate rainy and dry season effect on plasma seminal composition and semen quality of 17 crossbred male goats raised in tropical region and to investigate if the biochemical composition of seminal plasma (SP) is correlated to semen quality in relation to the season of the year. Other objective of this experiment was to evaluate if the phospholipase A2 (PLA2) activity level in the SP affects the ejaculate and epididymal spermatozoa. This study was divided into three experiments: in the first phase, seventeen male goats were used and then eight animals with low or high PLA2 activity in SP were separated to the second and third phases. In the first experiment, the ejaculates were collected in artificial vagina, weekly, the SP was separated to evaluate the biochemical parameters and biweekly for quality semen determination. The sperm was diluted in coconut water added 2,5% of egg yolk (200 x 106 sperm/mL) and stored at 4 oC for 48 hours. The vigor (0-5) and motility (1-100%) were measured at 2, 24 and 48 hours after cooling by thermoresistance test (TRT). Slides of sperm were made during TRT and 200 cells were classified as normal or abnormal cellular morphology. The fructose, citric acid, total proteins, calcium, phosphorus, magnesium level and the PLA2 activity level in the SP were measured. In the second experiment, eight bucks were separated in two groups according to PLA2 activity level in SP, in group I (<6.7U/mL) and group II (> 11.0 U/mL). The semen was obtained by artificial vagina, diluted and separate in two samples: the first aliquot was the control treatment (nonwashed semen) and the second aliquot was centrifuged at 550 g for 10 minutes to remove the SP (washed semen). In the third experiment, the semen of the eight bucks was collected and the SP obtained by centrifugation. The SP of each buck was added to aliquots of epididymal spermatozoa pool collected from another male goat and a ninth aliquot was added only to diluent (control). After that, the final dilution (200 x 106 sperm/mL) was made in all samples. In the second and third experiments, after the treatment and final dilution, the semen samples were stored at 4 oC for 48 hours and an aliquot was incubated at 38 oC and evaluated to vigor and motility at 0, 2, 12, 24 and 48 hours of cooling. Slides of sperm were made during TRT and 200 cells were classified as normal or abnormal morphology. In all experiments, the semen quality decreased with time (p<0,001). In the first experiment, the semen obtained in the rainy season was better quality than semen collected in the dry season of the year. In addition, the fructose, citric acid, total proteins, phosphorus and magnesium levels in the SP were higher in rainy season, while the PLA2 activity was lower in this period. The fructose, citric acid and total proteins concentration showed positive correlations to vigor and motility in both seasons. The total sperm morphology alterations (TSMA) showed negative correlation with fructose level and positive correlations with citric acid, total proteins concentrations and PLA2 activity level. In the second experiment, the treatment (washed semen) improved the seminal quality, mainly in washed semen of the group I. The PLA2 activity level showed no effect on sperm performance in the ejaculate spermatozoa, except at 48h in washed semen and at 24h in the non-washed semen. Finally, in the third experiment, the SP addition on epididymal spermatozoa decreased the seminal parameters and this effect was higher in group II. However, the TSMA were lower when the PLA2 activity was higher. These results indicated that male goats raised in tropical region showed better seminal quality in the rainy season. In addition, the fructose, citric acid, total proteins, phosphorus and magnesium concentration levels in the SP were higher in rainy season, while the PLA2 activity was lower in this period. The correlations between the seminal and biochemical parameters in SP could indicate that the differences in the semen parameters in the rainy and dry season occurred due the biochemical parameter variations. The SP addition during the semen storage at 4 oC decreased the seminal quality. However the PLA2 activity level was not a determinant factor of the seminal quality in the ejaculate spermatozoa. Therefore, it cannot be used as an indicative of the spermatic quality of male goats raised in tropical region. / Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da época chuvosa e seca do ano sobre a composição do plasma seminal (PS) e os parâmetros seminais de 17 caprinos sem padrão racial definido (SPRD), criados em clima tropical, além de avaliar se a composição bioquímica do PS apresenta correlação com os parâmetros seminais, em função da época do ano, assim como, investigar se o nível de atividade da fosfolipase A2 (FLA2) no PS de caprinos pode ser utilizado como indicativo da qualidade espermática e se esse nível exerce influência na preservação dos espermatozóides ejaculados e epididimários quando conservados a 4 ºC, por 48 horas. O estudo foi realizado em três etapas: na primeira foram utilizados dezessete machos caprinos e a partir desta, oito bodes com diferentes níveis de atividade de FLA2 no PS foram selecionados para realização da segunda e terceira etapas. No primeiro experimento durante a época chuvosa e seca, os ejaculados dos animais foram coletados semanalmente, em vagina artificial, para avaliação bioquímica do PS e a cada 14 dias para determinação dos parâmetros seminais. O sêmen foi diluído em água de coco-2,5% gema (200 x 106 sptz/mL), resfriado a 4 ºC por 48 horas e avaliado o vigor e a motilidade às 2, 24 e 48 horas de resfriamento (T2, T24 e T48), pelo teste de termorresistência lento (TTR). Esfregaços do sêmen diluído foram confeccionados durante o TTR e 200 células foram avaliadas e classificadas morfologicamente em normais ou anormais. Determinaram-se ainda as concentrações de frutose, ácido cítrico, proteínas totais, Ca, P, MG e nível de atividade da FLA2. No segundo experimento, oito caprinos divididos, em função do nível de atividade da FLA2 no PS em: grupo I (<6,70 U/mL) e o grupo II (>11,00 U/mL). O sêmen foi coletado, diluído e dividido em duas alíquota : a primeira constituiu o tratamento controle (sêmen não lavado) e a segunda foi centrifugada para remoção do PS (sêmen lavado). No terceiro experimento, o sêmen dos oito animais foi coletado e centrifugado para recuperação do PS e adicionados a alíquotas de um único “pool” de espermatozóides epididimários obtidos de caprinos castrados cirurgicamente. Uma nona alíquota foi adicionada apenas de diluidor (grupo controle). Em seguida, procedeu-se a diluição final em todas as amostras utilizando o mesmo diluidor. No segundo e terceiro experimentos, após a realização dos tratamentos e diluição final, o sêmen foi resfriado a 4 ºC por até 48 horas e amostra de cada tratamento foi avaliada pelo TTR às 0 (fresco), 2, 12, 24 e 48 horas de resfriamento. Esfregaços do sêmen foram confeccionados para avaliação da morfologia espermática. Em todos os experimentos, a qualidade espermática diminuiu à medida que se prolongou o tempo de preservação (p < 0,001). No experimento 1, o sêmen apresentou qualidade superior na época chuvosa e também as concentrações de frutose, ácido cítrico, proteínas totais, P e Mg foram maiores nesta época. A FLA2 apresentou menor atividade na época chuvosa (p < 0,05). A concentração de frutose, ácido cítrico e proteínas totais mostraram correlações positivas com o vigor e a motilidade e negativas com a TDM, nas duas épocas. Em relação às alterações morfológicas totais (AMT), a concentração de frutose mostrou correlações negativas, enquanto as de ácido cítrico, proteínas totais e atividade da FLA2, positivas. Os níveis de fósforo no PS apresentaram correlação com os parâmetros seminais apenas na época seca, sendo negativa para vigor, motilidade e AMT e positiva para TDM. A concentração de Mg correlacionou-se positivamente com a motilidade na época chuvosa e AMT na seca. No segundo experimento, o tratamento influenciou a qualidade seminal principalmente no grupo I, sendo o desempenho espermático superior no sêmen lavado. O nível de atividade da FLA2 não afetou a qualidade dos espermatozóides ejaculados, exceto em T48 do sêmen lavado e T24 do sêmen não lavado. Enquanto no terceiro experimento, a adição do PS aos espermatozóides epididimários diminuiu a qualidade espermática e este efeito foi mais pronunciado quando o nível de atividade de FLA2 foi maior. Contudo, no que se refere e AMT, a adição do PS foi benéfica, reduzindo o número de alterações. Os resultados do presente estudo indicam que caprinos criados em clima tropical apresentam melhor qualidade espermática no período chuvoso, além das concentrações de frutose, acido cítrico, proteínas totais, P e Mg serem mais elevados nesta época, enquanto a atividade da FLA2 foi menor neste período. As correlações entre os parâmetros seminais e a composição bioquímica do PS podem indicar que as diferenças detectadas quanto à qualidade espermática entre as épocas do ano deve-se justamente às variações na concentração destes componentes. A presença do PS durante a conservação do sêmen caprino a 4 ºC reduziu a qualidade espermática, contudo o nível de atividade da FLA2 não foi um fator determinante da qualidade seminal para os espermatozóides ejaculados, por isso, não deve ser utilizado como indicativo de qualidade espermática de caprinos criados em região de clima tropical.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:18:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345981.pdf: 2651499 bytes, checksum: 8d8b26f93655c76e91c63ead4c880b72 (MD5) Previous issue date: 2017 / Existem cada vez mais evidências indicando uma etiopatogenia multifatorial para a doença de Parkinson (DP). Neste estudo, investigou-se os potenciais efeitos neurotóxicos induzidos pela administração de lipopolissacarídeo (LPS) ou pesticida paraquat (PQ) em camundongos, bem como pela interação destes, com ênfase em parâmetros relacionados à DP (alterações comportamentais, neuroquímicas e histológicas). Além disso, investigou-se o efeito "priming" do pré-tratamento com PQ seguido do tratamento com LPS em diferentes tipos de cultivo celular (cultivo primário e linhagem celular de microglia e astrócitos) sobre parâmetros relacionados com a inflamação e viabilidade celular. Nos estudos in vivo, camundongos machos Swiss foram submetidos a injeções intraperitoneais alternadas de LPS (3, 5 e 7 mg/kg/dia) e PQ (5 mg/kg/dia) durante uma semana. Vinte e quatro horas e 60 dias após a última administração, as funções olfativas, cognitivas e motoras dos animais foram avaliadas em testes comportamentais. Posteriormente, o sangue, o estriado e o córtex cerebral foram coletados para análises bioquímicas. A injeção periférica de LPS induziu um aumento transitório na permeabilidade da barreira hemato-encefálica (BHE), o qual durou 5 dias. Notavelmente, a administração de LPS ou PQ causou deficiências olfativas e de memória de curto prazo aos 15 e 38 dias, respectivamente. Além disso, PQ e LPS, sozinhos ou em associação, foram capazes de inibir a atividade do complexo mitocondrial I no estriado dos animais. O LPS, sozinho ou em combinação, aumentou os níveis estriatais de 3-nitrotirosina. Em geral, o LPS induziu alterações significativas em diversos parâmetros (atividades estriatais do complexo I e catalase, níveis de 3-nitrotirosina, discriminação olfatória, reconhecimento social e desempenho motor) e estes eventos não foram significativamente alterados pela exposição ao PQ. Em relação aos dados derivados dos estudos in vitro com cultivo celular, houve um aumento significativo nos níveis de TNF-a (3 horas) e de nitrito (24 horas) nas células mesencefálicas pré-tratadas com PQ e tratadas com LPS quando comparados com aquelas tratadas apenas com LPS, sugerindo que o PQ é capaz de desencadear um efeito "priming" em cultivo mesencefálico primário de neurônio-glia. No entanto, não se observou o mesmo efeito em cultivos celulares de micróglia primária, na linhagem de células microgliais (BV-2) e astrocitária (C6). Apesar da existência de estudos anteriores destacando a importância da hipótese de múltiplos hits no desenvolvimento da DP, os presentes achados in vivo não evidenciam a ocorrência de efeitos neurotóxicos sinérgicos ou aditivos de LPS e PQ no desenvolvimento de sintomas relacionados a DP em camundongos. No que se refere aos estudos in vitro, a exposição ao PQ deixa os neurônios dopaminérgicos mais propensos à inflamação e à morte celular.<br> / Abstract : A growing body of evidence indicates a multifactorial etiopathogeny for Parkinson?s disease (PD). In this study, we investigated the potential neurotoxic effects induced by lipopolysaccharide (LPS) or the pesticide paraquat (PQ) in mice, as well as their interaction, with emphasis on PD-related outcomes (behavioral, neurochemical and histological alterations). Besides, it was investigated the priming effect of PQ pre-treatment followed by the treatment with LPS in different cell cultures (primary culture and microglia and astrocytes cells lines) on parameters related to inflammation and cell viability. In vivo studies were performed with Swiss male mice, which were subjected to alternate intraperitoneal injections of LPS (3, 5 and 7 mg/kg/day) and PQ (5 mg/kg/day) during one week. Twenty-four hours and 60 days after the last administration, olfactory, cognitive and motor functions of the animals were addressed in behavioral tasks. Thereafter, blood, striatum and cerebral cortex were collected for biochemical analyses. Peripheral injection of LPS induced a transient increase in blood-brain barrier (BBB) permeability that lasted 5 days. Notably, the administration of PQ or LPS caused marked olfactory and short-term memory impairments at 15 and 38 days, respectively. Besides, PQ and LPS, alone or in association, were able to inhibit mitochondrial complex I activity in the striatum of mice. LPS, alone or in combination, increased the striatal levels of 3-nitrotyrosine. Of note, LPS induced significant alteration in several parameters (striatal activities of complex I and catalase, levels of 3-nitrotyrosine, olfactory discrimination, social recognition and motor performance) and these events were not significantly altered by PQ exposure. Regarding the in vitro studies, there was a significant increase in TNF-a (3 hours) and nitrite content (24 hours) in mesencephalic cultures pre-treated with PQ and treated with LPS when compared with those treated with only LPS, suggesting that PQ is able to trigger a priming effect in primary mesencephalic cell culture. However no priming effect was observed in primary microglia cell culture, microglia cell line (BV-2) and astrocytes cell line (C6). Although the existence of previous studies highlighting the importance of the multiple hit hypothesis to the development of PD, the present in vivo findings do not support the occurrence of synergistic or additive neurotoxic effects of LPS and PQ in the development of PD-related symptoms in mice. In relation to in vitro studies, PQ exposition renders dopaminergic neurons more prone to inflammation and thus to cell death.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:20:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345982.pdf: 1452327 bytes, checksum: d8ebe7044b0f0d5ed2f77874dcef74c9 (MD5) Previous issue date: 2017 / O Metilmercúrio (MeHg) é um poluente ambiental produzido por bactérias redutoras no ambiente aquático e bioacumulado na cadeia alimentar aquática. Logo, a principal fonte de exposição do homem ao MeHg ocorre pela ingestão de peixes e frutos do mar contaminados. Uma vez ingerido, o MeHg é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica e causar efeitos deletérios ao sistema nervoso central (SNC). O SNC em desenvolvimento é mais susceptível às ações deletérias do MeHg em relação ao do adulto; enquanto que no adulto a exposição causa danos a áreas restritas do SNC, a exposição durante o desenvolvimento causa danos neurológicos mais difusos e generalizados e as consequências destes danos podem persistir até a vida adulta. Por outro lado, os pescados representam uma importante fonte de nutrientes, dentre os quais destacam-se os ácidos graxos poli-insaturados (AGPIs) do tipo ?-3, principalmente os ácidos docosahexaenóico (DHA) e o eicosapentaenoico (EPA), importantes constituintes do SNC. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos dos AGPI do tipo ?-3 (DHA e EPA), presentes no óleo de peixe, na modulação da neurotoxicidade induzida pela exposição gestacional e lactacional ao MeHg em filhotes com 22 dias de vida e em adultos com 3 meses de idade. Além disto, investigou-se o efeito de uma segunda exposição ao MeHg em animais adultos expostos ao MeHg e/ou aos AGPIs ?-3 durante o desenvolvimento. Fêmeas prenhas de camundongos Swiss foram divididas em 4 grupos experimentais; o grupo i recebeu água potável e ração controle, o grupo ii recebeu solução de MeHg via água de beber e ração controle, o grupo iii recebeu água potável e ração enriquecida com óleo de peixe e o grupo iv recebeu a ração enriquecida com óleo de peixe e a solução de MeHg via água de beber. Os tratamentos foram veiculados durante os períodos gestacional e de lactação (totalizando 6 semanas). No 21º dia pós-natal (PN 21), os animais foram desmamados e 4 filhotes de cada ninhada foram separados para as análises comportamentais, bioquímicas e morfológicas. A coordenação motora dos animais foi prejudicada e a atividade hipocampal da enzima glutationa peroxidase (GPx) foi diminuida pela exposição ao MeHg e a dieta enriquecida com AGPIs ?-3 não foi capaz de reverter estes danos. O perfil lipídico plasmático e parâmetros de estresse oxidativo não foram afetados pelos tratamentos. A exposição perinatal (período de gestação e lactação) isolada à ração enriquecida com óleo de peixe aumentou a atividade do complexo mitocondrial I, sem alterar a atividade do complexo II. Já o imunoconteúdo de proteínas envolvidas na homeostase sináptica, histogênese e a imunomarcação para proteína fibrilar ácida glial (GFAP-gliose) não mostraram alterações significativas nos filhotes expostos perinatalmente ao MeHg e/ou ração enriquecida com óleo de peixe. O efeito a longo prazo do MeHg e/ou ração enriquecida com óleo de peixe foram avaliados em camundongos machos na vida adulta. Os animais foram alimentados com dieta padrão desde o desmame e, a partir da 10ª semana de vida, foram submetidos a uma segunda exposição ao MeHg via gavagem durante 14 dias. Após 24h do término do tratamento na vida adulta, os camundongos foram avaliados por testes comportamentais e, no dia seguinte, conduzida a eutanásia para coleta de sangue e a dissecção do cerebelo e hipocampo. A exposição perinatal ao MeHg per se causou prejuízo na locomoção e exploração e a dieta enriquecida com óleo de peixe combinada ao MeHg no período perinatal protegeu do dano locomotor em adultos. A exposição ao MeHg na fase adulta prejudicou a coordenação, locomoção e exploração, exceto nos animais que já haviam sido expostos perinatalmente ao MeHg, sugerindo uma possível adaptação a este toxicante. A exposição ao MeHg na vida adulta causou hipercolesterolemia nos animais, exceto nos camundongos expostos perinatalmente aos AGPIs ?-3 via dieta materna, sugerindo um efeito benéfico na vida adulta. Ainda, o tratamento com MeHg na fase adulta diminuiu a atividade da GPx cerebelar nos animais, exceto nos que já haviam sido tratados perinatalmente com MeHg. Por fim, a exposição concomitante ao MeHg e à ração enriquecida com óleo de peixe levou a um maior acúmulo de Hg no cerebelo a longo prazo e a reexposição ao MeHg na fase adulta, exacerbou esta resposta. Em conjunto, estes resultados indicam que a exposição perinatal ao MeHg e aos ácidos graxos ?-3 podem modular respostas a longo prazo e a susceptibilidade frente a uma nova exposição ao MeHg em animais adultos.<br> / Abstract : Methylmercury (MeHg), an organic mercurial, is a well-known toxic compound present in the environment and originated though the methylation of inorganic mercury by sulfate-reducing bacteria in the aquatic environment. MeHg bioaccumulates and biomagnifies in the aquatic food chain; being the fish intake the main source of MeHg exposure. The central nervous system (CNS) is the primary target of MeHg toxicity and the developing brain is highly sensitive to MeHg exposure. Otherwise, fish and shellfish are important sources of several nutrients, such as n-3 fatty acids (PUFAs), particularly the eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) acids, which play important role in the CNS during pre and postnatal development. We investigated the potential neuroprotective effects of an enriched diet with n-3 fatty acids against the neurotoxic effects of prenatal exposure to MeHg. Animals were exposedin utero until postnatal day (PND) 21 to both MeHg and n-3 fatty acids. Moreover, an additional group received a second MeHg-exposure during adulthood (PND 84). Pregnant mice (GD 1) were randomly settled in 4 experimental groups: (i) Control (tap water and standard chow); (ii) MeHg (diluted in the water); (iii) n-3 enriched diet (tap water and a fish oil enriched-chow) and (iv) n-3+MeHg (a fish oil enriched-chow + MeHg diluted in the water). Treatments were performed throughout gestational and lactation periods (GD 1 to PND 21) and offspring were weaned at PND 21. Twenty-four hours after weaning (PN 22), pups were evaluated through behavioral tests, biochemical, histological and immunohistochemical analyzes. Motor coordination and hippocampal glutathione peroxidase (GPx) activity were impaired by MeHg exposure during development and n-3 enriched-diet was not able to protect these alterations. Perinatal exposure to n-3 enriched-diet per se increased the activity of the mitochondrial complex I, but did not change the activity of complex II. To analyze the long-lasting neurotoxic effects of exposure to MeHg during development and to evaluate the second exposure in the adulthood to MeHg an additional group were made. The animals from each litter were fed with standard diet until PND 70, whereas half of the animals were submitted to a second exposure to MeHg via gavage for 14 days (until PN 84). Twenty-four hours after the last gavage, the adult mice were evaluated by behavioral tests and, on the next day, euthanasia was performed for blood collection and the cerebellum and hippocampal structures were removed for biochemical analyses. Exposure to MeHg during development caused a long-lasting impairment in locomotion and exploration and exposure to n-3 enriched-diet prevented these alterations in adult mice. Exposure to MeHg during adulthood impaired coordination, locomotion and exploration, except in animals that had been exposed previously to MeHg during development, suggesting a possible adaptation to this effect. Interesting, acute exposure to MeHg in adult mice caused hypercholesterolemia, except in mice exposed during the development to n-3 acids via maternal diet, suggesting a long-lasting beneficial effect. Moreover, MeHg treatment to mice during adulthood reduced the activity of cerebellar GPx, except in those animals that had already been exposed perinatally to MeHg. Finally, prenatal exposure to MeHg combined with the n-3-enriched diet increased cerebellar Hg accumulation in adult mice and a second exposure to MeHg exacerbated this effect. Taken together, these results indicate that perinatal exposure to MeHg and n-3 fatty acids may promote a long-lasting behavioral and biochemical modulation on responses and susceptibility to an adult exposure to MeHg in adult animals.

Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica y Memoria para optar al Título de Bioquímico / El estrés corresponde a una respuesta del organismo que se desencadena frente a una situación donde el individuo se siente amenazado, que promueve la adaptación y sobrevida del mismo. Esta respuesta es específica, pues involucra la activación de distintos circuitos neuronales y la liberación de mediadores humorales dependiendo del tipo de agente “estresante”. En el caso del estrés psicosocial se liberan principalmente glucocorticoides (hormonas esteroidales) y catecolaminas, provocando cambios en la expresión génica y en la transducción de señales tanto a nivel central como periférico. Las áreas que son blanco de las hormonas del estrés y en especial de los glucocorticoides incluye la formación hipocampal (Cuerno de Ammón, CA y giro dentado) que participa en la memoria declarativa, la amígdala que participa en la respuesta al miedo y la corteza frontal asociada a la memoria de trabajo. Estudios morfológicos y bioquímicos han demostrado que las variaciones en los niveles de glucocorticoides secretados durante el ciclo circadiano y durante el estrés promueve modificaciones neuroplásticas en estas estructuras, especialmente en el hipocampo, y que incluyen cambios morfológicos, modificación en la excitabilidad celular y en la eficacia sináptica. Se ha descrito que el alza en la secreción de glucocorticoides inducido por un estrés agudo (episodio único) puede actuar como un modulador positivo o negativo de los procesos de memoria y aprendizaje relacionados a la formación hipocampal. Sin embargo, se ha visto que una activación excesiva de la respuesta de estrés, así como la imposibilidad de apagarlo pueden ser altamente contraproducentes, al disminuir la capacidad plástica del tejido neural, afectando especialmente las estructuras del sistema límbico y en particular el hipocampo. Entre los múltiples efectos del estrés a nivel central, uno de los más importantes corresponde a los cambios neuroplásticos asociados a la morfología neuronal, atrofia neuronal, en especial de aquellas relacionadas a la neurotransmisión glutamatérgica. Es probable que los mediadores del estrés modifiquen la citoarquitectura neuronal a través de la modulación de cascadas de señalización involucradas en la dinámica de citoesqueleto. Entre éstas, destaca la CRMP2 (del inglés collapsin response mediator protein-2), proteína involucrada en la polimerización de microtúbulos, proceso que determina en etapas temprana del desarrollo la definición axonal. La regulación de esta proteína es diversa e involucra el procesamiento proteolítico dependiente de calcio mediado por calpaínas. La proteína procesada es transportada al núcleo y produce cambios en la sobrevida neuronal por mecanismos no precisados. Adicionalmente, estudios in vitro han demostrado que la CRMP2 pierde la capacidad de unirse a tubulina al ser fosforilada por la GSK3β (Thr-514) produciéndose el colapso del cono de crecimiento neuronal. Los antecedentes descritos sugieren que CRMP2 juega un rol importante en el control de la dinámica del citoesqueleto de microtúbulos, que puede contribuir a mecanismos de plasticidad, y que su acción podría verse afectada por estímulos de diversa naturaleza, como el estrés (agudo y crónico). Sin embargo no existen antecedentes que indiquen el rol ni la localización en neuronas de cerebro adulto y si se regula por fosforilación. En relación a esto último, la sobreactivación de la GSK3β (del inglés glycogen synthase kinase 3β), una serina-treonina quinasa, produce efectos deletéreos asociados a la hiperfosforilación de proteínas asociadas a microtúbulos y factores transcripcionales que regulan la expresión de genes de neuroprotección. La GSK3β se encuentra constitutivamente activa y es regulada en forma negativa por una fosforilación en su extremo N-terminal (Ser-9). Debido a los efectos que se le atribuyen a esta enzima, se sugiere que participaría en las alteraciones observadas en estrés crónico, sin embargo dicha relación no se ha comprobado experimentalmente. Más aún, in vivo no se ha determinado la asociación entre la actividad de la GSK3β y el estado de fosforilación de la CRMP2. En base a estos antecedentes se propuso la siguiente hipótesis: “El estrés agudo por restricción de movimiento produce cambios en el estado de fosforilación, procesamiento y localización de CRMP2 en hipocampo de rata adulta”. Se utilizaron ratas macho adultas y se sometieron a 2,5 horas de estrés de restricción de movimiento y fueron sacrificadas inmediatamente finalizado el estímulo o luego de 1,5; 24 y 48 horas post estrés. La efectividad del estrés se comprobó por el incremento en el número de heces e incremento en el nivel de corticosterona observado por la aplicación de la restricción. A su vez, mediante inmunowestern blot se determinaron en extractos hipocampales los niveles de la proteína Arc (activity-regulated cytoskeleton-associated protein), la que se sintetiza localmente en las dendritas y cuya función es regular la densidad de receptores glutamatérgicos sinápticos. Se observó, luego de 1,5 horas de estrés, una reducción significativa la que se mantuvo luego de 24 horas post estrés; sugiriendo un aumento en la degradación de esta proteína. En contraste, en animales estresados crónicamente durante 14 días y sacrificados 24 horas post estrés, se observó que los niveles de Arc fueron similares al control, sugiriendo que esta respuesta se adapta ante el estrés crónico. Se determinó mediante inmunowestern blot que el estrés no produjo el procesamiento proteolítico de la CRMP2. Por otra parte, luego de 1,5 horas post estrés se observó una disminución significativa en los niveles de CRMP2-P (Thr-514) la cual se reestablece al valor control luego de 24 horas post estrés. Así mismo, los niveles de GSK3β–P (Ser-9) disminuyeron de manera significativa inmediatamente post estrés que se relaciona a un aumento de la actividad y posteriormente se recuperan al valor control. Estos resultados indican que no existe relación entre la actividad de la quinasa con el estado de fosforilación de la CRMP2 y probablemente los cambios promovidos por el estrés involucran otros actores no considerados en esta tesis como las fosfatasas. Por otra parte en muestras de animales crónicamente estresados y sacrificados 24 horas posterior al tratamiento no presentaron cambios respecto al control. Finalmente se evaluó la localización celular de CRMP2-P mediante inmunohistoquímica en distintas zonas y estratos hipocampales. Se determinó que la inmunoreactividad de CRMP2-P es coincidente con la de un marcador de dendritas maduras (MAP2A) y se observó que existe una acumulación nuclear de CRMP2-P a las 24 horas post estrés en el estrato piramidal CA1 y CA3. Esta tesis demuestra por primera vez que el estrés agudo de restricción de movimiento promueve cambios en el estado de fosforilación de la CRMP2 lo que no se correlaciona con la actividad de la GSK3β. Será muy informativo poder precisar cambios en el estado de fosforilación de estas proteínas durante el estrés con el fin de poder definir nuevos actores en estas respuestas. Como por ejemplo, se debe precisar la contribución de otras quinasas y de fosfatasas en asociación a estos cambios. Por otro lado, se demostró en animal adulto que esta proteína tiene una localización dendrítica lo que hace postular un rol en neuronas adultas. Queda por determinar si efectivamente la CRMP2-P se transporta al núcleo en respuesta al estrés agudo. Así mismo se demostró que el estrés crónico produce una adaptabilidad de la fosforilación de CRMP2-P y GSK3β / Stress is a physiological response that allows adaptation and survival and it triggered when an individual feels threatened. This response is specific and involves the activation of numerous neural circuits and the secretion of different humoral mediators depending on the stressor. In the case of psychosocial stress, glucocorticoids and catecholamines are released into the blood stream, promoting changes on gene expression and signal transduction pathways at a central and peripheral level. The brain areas that are sensitive to stress hormones, especially to glucocorticoids, are the hippocampal formation (Ammon’s Horn, CA and dentate gyrus) involved in declarative memory; the amygdala related to fear response, and the frontal cortex associated to working memory. Morphological and biochemical studies have shown that fluctuation on glucocorticoids levels, due to stress or circadian rhythm, are required to promote changes in neuroplasticity in these brain structures, especially in the hippocampus. These neuroplastic changes include variations in morphology, modification on cellular excitability and synaptic efficiency. It has been reported that an increase on glucocorticoid secretion due to an acute stress (one episode) may act as a positive or a negative modulator of memory and learning processes involving the hippocampus. Nevertheless, an excessive activation of the stress response, as to the inability to terminate it properly, may be highly detrimental due to the negative effect of stress on neuroplasticity, specially the hippocampus. One of the most important effects at a central level associated with stress is the neuroplastic changes on neural morphology, mainly neural atrophy, especially those related with glutamatergic neurotransmission. It is possible that stress mediators promote modification of neural cytoarchitecture through the modulation of signal transduction pathways involved in cytoskeleton dynamics. Among these, we highlight CRMP2 (collapsin response mediator protein 2), whose involved on microtubule polymerization, an event that determinates axon specification at early embryonic stages. This protein is regulated by differents mechanisms involving calcium dependent proteolytic cleavage by calpains. The processed protein translocates to the nucleus and promotes changes in neural survival through mechanisms not full understood. In addition, in vitro studies have demonstrated that CRMP2 loses its tubulin binding ability when phosphorylated by GSK3β (Thr-514), provoking neural growth cone collapse. These evidences suggest that CRMP2 plays a pivotal role on cytoskeleton dynamics and can contribute to plasticity mechanisms. Additionally, its function could be affected by different types of stimuli, including acute and chronic stress. However there is no evidence about its function and location in adult brain neurons and neither if CRMP2 is regulated by phosphorylation. Regarding this event, it is known that the over activation of the serin-threonin kinase GSK3β (glycogen synthase kinase 3β) results in deleterious effects associated with the hyperphosphorylation of microtubule associated proteins and transcription factors involved in gene expression regulation. GSK3β is constitutively active and regulated by an inhibiting phosphorylation in its N-terminal portion (Ser-9). It has been suggested that GSK3β would participate in the alterations observed on chronic stress, based mainly on their targets: Nonetheless, this relationship has not been proved experimentally. Even more, the association between the activity of GSK3β and phosphorylation state of CRMP2 has not been proved in vivo. Based on this evidence the following hypothesis was proposed “acute restraint stress causes changes on the phosphorylation, processing and cellular localization of CRMP2 in adult rat hippocampus” Adult male rat were subjected to a single 2.5 hours restriction stress session and then euthanized immediately after the stimuli or after 1,5; 24 and 48 hours after stress. The effectiveness of the stress model was proved by the increase in the number of feces and corticosterone levels produced by the restriction protocol. Also Arc (activity-regulated cytoskeleton-associated protein) protein levels where determined on hippocampal extract by inmunowestern blot. This protein is locally synthetized on dendrites and regulates the synaptic density of glutamatergic receptors. There was a significant reduction in Arc levels 1.5 hours post stress, which remained until 24 hours post stress, suggesting an increase in its degradation. In contrast, such a decrease was not observed on chronically stressed animals euthanized 24 post stress, suggesting that this response adapts in chronic stress. In addition we determined by inmunowestern blot that acute restraint stress does not promote CRMP2 cleavage. Also we proved by inmunowestern blot that acute restraint stress decreases the levels of CRMP2-P (Thr-514) at 1.5 hours post stress and the level is reestablished at 24 hours post stress. Likewise GSK3β–P (Ser-9) levels decreased immediately after stress which relates with an increase in its activity, and then return to control levels. These results indicate that there is no relation between the kinase activity and CRMP2 phosphorylation status. These results raise the possibility that changes induced by stress can involve other proteins that were not considered in this Thesis, like phosphatases. We also determined GSK3β–P levels on chronic stressed animals euthanized 24 hours after the last stress session and found no significant changes in comparison to control animals. Finally we determined by immunohistochemistry the location CRMP2-P in different hippocampal zones and stratum from animals euthanized at 0, 1.5; and 24 hours post stress. We determined that CRMP2-P immunoreactivity co-localized with a mature dendrite marker (MAP2A). We also observed that there is a nuclear accumulation of CRMP2-P on stratum pyramidale of CA1 and CA3 24 hours after stress. This thesis shows by the first time that acute restriction stress promote changes in the phosphorylation state of CRMP2 that does not correlates with GSK3β activity. It would be very informative to determine the changes in the phosphorylation state of these proteins during stress to elucidate the role of new actors on this response. For example, the contribution of other kinases and phosphatases to these changes must be elucidated. On other aspect, we show that CRMP2 has a dendritic localization in the adult brain, which denotes a function in adult neurons. It remains to be determined if acute stress effectively promotes CRMP2-P nuclear translocation. Also we demonstrated that chronic stress induces adaptability in the phosphorylation of CRMP2 and GSK3β.

Tesis Magíster en Bioquímica en el área de especialización de Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Los líquenes son asociaciones simbióticas entre 2 o 3 organismos, entre los cuales hay siempre un hongo o micobionte y uno o dos fotobiontes. El fotobionte puede corresponder a un alga fotosintética o a una cianobacteria, y ambos están presentes en el caso de los líquenes tripartitos, donde el alga es el organismo fotosintético principal. En los cianolíquenes, la cianobacteria aporta los fotosintatos y además, con la fijación de nitrógeno atmosférico. Recientemente se ha descrito que los ensambles microbianos que se desarrollan formando biopelículas sobre el talo del liquen pueden ser considerados un componente adicional en estas simbiosis. Sin embargo, aún no se han definido el o los factores que determinan la estructura de dicha microbiota asociada. En general, los líquenes se caracterizan por poseer un metabolismo secundario muy activo, cuyos productos son principalmente compuestos fenólicos, obtenidos por diversas vías, como las del polimalonato, siquimato y mevalonato. Dada esta alta producción de metabolitos, se propone estudiar si la comunidad bacteriana asociada íntimamente al talo del cianoliquen Peltigera se relaciona con la diversidad de estos compuestos, aunque para este género de líquenes no se ha descrito una elevada producción de los mismos. Además, diversas actividades enzimáticas se han cuantificado en líquenes, y en el caso particular de Peltigera, las fenoloxidasas han sido las más estudiadas. Esta actividad podría estar relacionada con la estructuración de la comunidad bacteriana asociada al talo liquénico, ya que la generación de compuestos oxidantes se sugiere está asociada a defensa contra patógenos y propiedades antibióticas. Las 50 muestras de líquenes del género Peltigera y el sustrato asociado, provienen de dos bosques de la Reserva Nacional Coyhaique. Con el fin de identificar y agrupar filogenéticamente a los simbiontes muestreados, se obtuvieron las secuencias de los genes rRNA 18S y 28S de hongos y del gen del rRNA 16S de cianobacterias, a partir de los cuales se encontraron 6 haplotipos de micobionte y 5 de cianobionte, con los que se definieron las OTUs y 11 muestras compuestas. Por otra parte, los metabolitos de las muestras compuestas se analizaron usando técnicas de cromatografía en placa fina en dos dimensiones (TLC-2D), la actividad fenoloxidasa asociada a cada muestra liquénica compuesta se determinó espectrofotométricamente mediante el monitoreo de la oxidación del ácido 2'2-azino-bis-[3-etilbenzotiazol-6-sulfónico] (ABTS) a 436 nm. Finalmente, la estructura genética de la comunidad bacteriana relacionada a los líquenes y a los sustratos, se determinó mediante el uso de la técnica del polimorfismo en el largo de los fragmentos terminales de restricción (TRFLP), mientras que la estructura metabólica se determinó mediante los perfiles fisiológicos a nivel comunitario (CLPP) a través del uso de placas EcoPlate (BioLog®). Los perfiles genéticos y metabólicos fueron diferentes en su estructura dependiendo de la identidad de los simbiontes y el bosque del que provenían. Se encontraron correlaciones de la diversidad de metabolitos de los líquenes con la estructura genética de las comunidades asociadas a éstos y las presentes en el sustrato, y de la actividad fenoloxidasa de las muestras de líquenes con la estructura metabólica de la comunidad bacteriana obtenida desde el talo. Los resultados de esta tesis sugieren que tanto la producción de metabolitos como la actividad fenoloxidasa, ambos factores atribuibles al liquen, cumplirían un papel en determinar la diversidad genética y metabólica de la comunidad bacteriana asociada al talo de líquenes del género Peltigera y al sustrato donde ellos crecen / Lichens are symbiotic associations between 2 or 3 organisms, including a fungus and one or two photobionts. A photosynthetic algae or a cyanobacterium can be the photobiont in these associations, and both are present in tripartite lichens, where the algae is the main photosynthetic organism. In cyanolichens, the cyanobacterium provides with photosynthates and with atmospheric nitrogen fixation. Recently, it has been described that microbial assembles, that develop forming biofilms upon the lichen thallus, can be considered an additional component in these symbioses. However, the factors determining the structure of this associated microbiota have not yet been defined. In general, lichens are characterized by their very active secondary metabolism, whose products are mainly phenolic compounds obtained by different metabolic pathways, such as the polymalonate, shikimic acid and mevalonate ones. Given this high production of metabolites, it is propose to study if the bacterial community intimately associated to Peltigera cyanolichens thallus is related to the diversity of these compounds, even though this particular lichen genera has not been associated with a high production of these compounds. Moreover, different enzymatic activities have been quantified in lichens, and in the Peltigera particular case, phenoloxidases have been the more studied enzymes. This activity could be related with the structuration of lichen thallus associated bacterial community, because the production of oxidant compounds has been related to defense against pathogens and to antibiotic activities. The 50 lichen samples of the genus Peltigera and their corresponding associated substrates derived from two forests of the Coyhaique National Reserve. With the aim of identifying and phylogenetically grouping the sampled symbionts, sequences of fungal 18S and 28S rRNA and cyanobacterial 16S rRNA genes were obtained, from which 6 mycobiont and 5 cyanobiont haplotypes were found, defining the corresponding OTUs and 11 composite samples. On the other hand, metabolites of composite samples were analyzed using bi-dimensional thin layer chromatography (TLC-2D), whilst phenoloxidase activity of each lichen composite sample was spectrophotometrically determined by monitoring the oxidation of 2,2'-azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid] (ABTS) at 436 nm. Finally, genetic structures of the bacterial communities, related to lichens and substrates, were determined by terminal restriction fragment length polymorphism (TRFLP), while metabolic structures were determined by community-level physiological profiling, using EcoPlates (Biolog®). Genetic and metabolic profiles were different in structure, depending on the symbiont identity and the forest from where they derived. Correlations were founded between diversity of lichen metabolites and genetic structures of bacterial communities associated to both lichen and substrate, and between lichen

Pinto, Uelinton Manoel / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-11-17T20:33:06Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AtividadeAnti-quorumSensing.pdf: 1331569 bytes, checksum: 1778775cb3f759041b6f51b44493c076 (MD5) / Rejected by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br), reason: adicionar licença on 2015-11-18T12:00:44Z (GMT) / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-11-18T18:03:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AtividadeAnti-quorumSensing.pdf: 1331569 bytes, checksum: 1778775cb3f759041b6f51b44493c076 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-11-19T18:00:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AtividadeAnti-quorumSensing.pdf: 1331569 bytes, checksum: 1778775cb3f759041b6f51b44493c076 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-19T18:00:03Z (GMT). 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Grumixama (Eugenia brasiliensis) e pitanga (Eugenia uniflora L.) são frutas da família das mirtáceas, nativas do Brasil, ricas em compostos fenólicos e apresentam atividade antioxidante e antimicrobiana. Foi objetivo do estudo detectar a atividade anti-quorum sensing dos extratos bruto e fenólico obtidos das frutas grumixama e pitanga em concentrações que não inibem o crescimento microbiano. Os compostos fenólicos das polpas foram extraídos e purificados utilizando extração em fase sólida (mini-coluna C18) e quantificados por espectrofotometria. A atividade anti-quorum sensing dos extratos bruto e fenólico foi avaliada empregando diferentes bactérias e a detecção de diferentes fenótipos. Chromobacterium violaceum foi avaliado pelo ensaio qualitativo de difusão em ágar e pelo teste de quantificação da inibição da produção de violaceína. Em Aeromonas hydrophila e Serratia marcescens foram avaliadas a motilidade tipo swarming e swimming e em C. violaceum, S. marcescens, A. hydrophila e Escherichia coli foi avaliada a formação de biofilme. Os extratos de ambas as frutas apresentaram inibição significativa na produção de violaceína por C. violaceum. Houve também inibição da motilidade bacteriana do tipo swarming e swimming em A. hydrophila e S. marcescens. Os extratos de ambas as frutas aumentaram a formação de biofilme em C. violaceum, A. hydrophila, S. marcescens e E. coli. Esses resultados indicam que os extratos bruto e fenólico de grumixama e pitanga apresentam atividade anti-quorum sensing sugerindo potenciais aplicabilidades nas indústrias alimentícia e farmacêutica, inibindo fenótipos regulados pelo quorum sensing. _________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Many bacteria regulate gene expression in response to diffusible signals produced dependently on cell density, in a process called quorum sensing. This process occurs by means of producing, releasing and detecting signaling molecules. The phenotypes regulated by quorum sensing are involved in processes related to virulence, sporulation, motility, production of enzymes, bioluminescence, production of pigments, among others. Interrupting any stage of the quorum sensing system can cause detrimental effects to bacterial virulence. Some studies have shown that plant based extracts have quorum quenching effects, with possible applications in infection control. Grumixama (Eugenia brasiliensis) and pitanga (Eugenia uniflora L.) are fruits that belong to the family Myrtaceae, native to Brazil, rich in phenolic compounds and have antioxidant and antimicrobial activity. The purpose of this study was to evaluate the quorum quenching activity of crude and phenolic extracts obtained from grumixama (Eugenia brasiliensis) and pitanga (Eugenia uniflora L.) in concentrations that do not inhibit microbial growth. Phenolic compounds from the pulps were extracted and purified using solid-phase extraction (C18 mini-column) and quantified by using spectrophotometry. Quorum quenching activity of crude and phenolic extracts was evaluated using different bacteria and the detection of different phenotypes. For instance, Chromobacterium violaceum was evaluated in agar diffusion assay as well as through the quantification of violacein production; for A. hidropyla and Serratia marcescens, swarming and swimming motilities were tested and for C. violaceum, S. marcescens, A. hydrophila and Escherichia coli biofilm formation was assayed. Extracts from both fruits showed significant inhibition of violacein production by C. violaceum. There was also inhibition of bacterial swarming and swimming motilities for A. hydrophila and S. marcescens. The extracts of both fruits increased biofilm formation in C. violaceum, A. hydrophila, S. marcescens, and E. coli. These results indicate that crude and phenolic extracts from grumixama and pitanga present quorum quenching activity suggesting a potential aplication in the food and pharmaceutical industries inhibiting phenotypes regulated by quorum sensing.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:36:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340833.pdf: 3205840 bytes, checksum: 95520217f8b3b1a98d1f219fc5a34778 (MD5) Previous issue date: 2016 / A atorvastatina é um fármaco da classe das estatinas, utilizado na clínica médica há algumas décadas para o tratamento dos altos níveis de colesterol sérico. Estudos têm demonstrado que além deste efeito primário, a atorvastatina desencadeia efeitos pleiotrópicos. Os efeitos neuroprotetor e tipo-antidepressivo da atorvastatina têm sido demonstrados, no entanto, os mecanismos celulares e moleculares, a participação de vias de sinalização e neurotransmissores, bem como a associação entre esses eventos ainda precisam ser elucidados. Desta forma, investigou-se: i) o envolvimento dos sistemas adenosinérgico, serotonérgico e da via de sinalização PI3K/Akt /GSK-3ß/mTOR no efeito tipo-antidepressivo da atorvastatina e ii) o efeito tipoantidepressivo e neuroprotetor do tratamento repetido com atorvastatina frente as alterações induzidas pelo peptídeo Aß1-40, bem como pela toxicidade induzida por glutamato. Os resultados demonstraram que a atorvastatina desencadeia efeito tipo-antidepressivo que depende da modulação dos receptores A1 de adenosina, mas não dos receptores A2A ou dos níveis de adenosina. O efeito tipo-antidepressivo da atorvastatina também depende da modulação dos receptores de serotonina (5-HT) dos subtipos 5-HT1A e 5-HT2A/C e dos níveis encefálicos de 5-HT. Demonstrou-se que a via de sinalização PI3K/Akt/GSK-3ß/mTOR é crucial para o efeito tipo-antidepressivo da atorvastina, através de testes comportamentais e pelo aumento da fosforilação hipocampal das proteínas Akt, GSK-3ß e mTOR. O efeito tipo-antidepressivo e neuroprotetor da atorvastatina frente às alterações comportamentais e neurotóxicas induzidas pelo peptídeo Aß1-40 dependem do aumento da razão mBDNF/pró-BDNF ocasionado pela clivagem induzida pelas proteases tPA e p11. A atorvastatina previne ainda o aumento hipocampal de óxido nítrico, de espécies reativas de oxigênio, bem como a alteração do potencial de membrana mitocondrial e a perda de viabilidade celular ocasionada pela toxicidade induzida por glutamato in vitro. Resultado similar foi observado para o tratamento com fluoxetina. A associação entre o efeito tipo-antidepressivo e neuroprotetor do tratamento repetido com atorvastatina foi evidenciado, e demonstrou-se que o tratamento agudo com atorvastatina não exerce efeito neuroprotetor frente à toxicidade glutamatérgica. Desta forma, esta tese contribui para demonstrar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no efeito tipo-antidepressivo e neuroprotetor da atorvastatina.<br> / Abstract : Atorvastatin is a drug that belongs to statins group and that is largely used in clinical medicine for the treatment of high serum cholesterol levels. Studies have shown that in addition to this primary effect, atorvastatin also triggers pleiotropic effects. The neuroprotective and antidepressant-like effects of atorvastatin have been demonstrated, however cellular and molecular mechanisms, the involvement of signaling pathways and neurotransmitters, as well as the association between these events remain to be elucidated. Thus we investigated: i) the involvement of adenosinergic and serotonergic systems and the PI3K/Akt/GSK-3ß/mTOR signaling pathway in the antidepressant-like effect of atorvastatin, and ii) the neuroprotective and antidepressant- like effect provided by repeated atorvastatin treatment against Aß1-40- induced alterations or glutamate-induced toxicity. Atorvastatin exerts antidepressant-like effect that depends on the adenosine A1 receptors, but not on adenosine levels or A2A receptors. The atorvastatin antidepressant-like effect also depends on serotonin (5-HT) levels and 5- HT1A and 5-HT2A/C receptors subtypes. We also demonstrated that PI3K/Akt/GSK-3ß/mTOR signaling pathway is critical for atorvastatin antidepressant-like effect, by behavioral tests and increased phosphorylation of Akt, GSK-3ß and mTOR in mice hippocampus. The neuroprotective and antidepressant-like effect of atorvastatin against Aß1-40-induced toxicity depends on the increase in mBDNF/pro-BDNF ratio promoted by tPA and p11 proteases. Atorvastatin also prevents hippocampal increase of nitric oxide, reactive oxygen species and the alteration of mitochondrial membrane potential and cell viability induced by in vitro glutamate challenge. Similar results were observed for fluoxetine treatment. The association between the antidepressant-like and neuroprotective effect of atorvastatin-repeated treatment was shown and acute atorvastatin treatment showed no effect on glutamate-induced toxicity. This study contributed to unravel the cellular and molecular mechanisms involved in the neuroprotective and antidepressant-like effects of atorvastatin.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:39:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340544.pdf: 1497161 bytes, checksum: 9c77c37d0ebba2bc564251627f40d803 (MD5) Previous issue date: 2016 / O Manganês (Mn) é um metal essencial extremamente importante para os sistemas biológicos. Contudo, a exposição excessiva ao Mn causa toxidade a diversos órgãos/sistemas, incluindo o sistema nervosos central (SNC). O excesso de Mn pode levar à síndrome conhecida como manganismo, uma condição neuropatológica em que alguns sintomas se assemelham a aqueles encontrados na doença de Parkinson (DP) idiopática. Apesar das similaridades entre ambas as condições, há eventos específicos relacionados à intoxicação por Mn, dentre os quais destaca-se perda neuronal e gliose no globo pálido (GP) e estriado. O objetivo deste estudo foi investigar os possíveis efeitos neurotóxicos da exposição ao MnC12 em um modelo experimental em ratos Wistar de 3 meses de idade, o qual baseou-se na administração de 4 injeções intraperitoneais de uma solução de MnC12 (dose de 25 mg/kg), sendo administrada uma injeção por dia nos dias 1, 3, 5 e 7. Além disso, objetivou-se avaliar a potencial reversibilidade desta toxicidade através da realização de testes comportamentais, bioquímicos e imunohistoquímicos 24 h imediatamente após a última exposição ao MnC12 (dia 8), assim como depois de um período de latência de 30 dias. Vinte e quatro h após a última exposição ao Mn, observou-se uma significativa redução no número de cruzamentos e levantadas no teste do campo aberto e um significativo aumento no número de resvaladas no teste do beam walking nos ratos tratados como MnC12 quando comparados com animais do grupo controle. Não houve diferença significativa entre os grupos nos níveis estriatais de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), tióis não-proteicos (NPSH), na atividade das enzimas antioxidantes gluationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GPx) e superóxido dismutase (SOD), nem na atividade dos complexos I e II da cadeia respiratória mitocondrial. A imunorreatividade para a enzima tirosina hidroxilase (marcadora de neurônios catecolaminérgicos, TH) diminuiu significativamente no estriado dos animais expostos ao Mn 24 h apóis o tratamento, tendo sido normalizado após à latência de 30 dias. Os níveis da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) foram significativamente aumentados apenas no globo pálido (GP) dos animais expostos ao Mn somente aos 30 dias após o tratamento. Não houve diferença na imunorreatividade para a enzima glutamato descarboxilase (mercadora de neurônios GABAérgicos, GAD 65). A reversão dos danos motores e da imunomarcação da TH revelam que há um potencial reversibilidade que se segue após o término da exposição ao MnC12. Conclui-se que o desenho experimental deste trabalho se mostrou um bom modelo para se estudar os mecanismos que levam ao manganismo, após uma intoxicação aguda por MnC12. Ainda, a gliose reativa (aumento da reatividade da GFAP) observada no GP aos 30 dias após a exposição sugere a existência de um processo reativo/inflamatório tardio, o qual poderia ser responsável por eventos neurodegenerativos tardios decorrentes da exposição ao Mn.<br> / Abstract : Manganese (Mn) is an essential metal extremely important for biological systems. However, the exposure to excessive Mn causes toxicity to various organ/systems, including the central nervous system (CNS). Importantly, excessive exposure to Mn can lead to the syndrome known as manganism, a neuropathological condition whose symptoms are similar to those found in idiopathic Parkinson's disease (PD). Despite the similarities between both conditions, there are specific events linked only to Mn intoxication such as neuronal loss and gliosis in the globus pallidus (GP) and striatum. The aim of this study was to investigate the potential neurotoxic effects of exposure to MnCl2 in an experimental model with adult (3 months) rats, based on the administration of 4 intraperitoneal injections of MnCl2 (dose of 25 mg/kg), being administered at days 1, 3, 5 e 7. In addition, we aimed to evaluate the potential reversibility of such toxicity by using behavioral, biochemical and immunohistochemical tests 24 hours immediately after the last exposure to MnCl2 (at day 8), as well as after a 30 days latency period . Twenty-four h after the last Mn injection, there was a significant reduction in the number of crossings and rearings in the open field test, as well as a significant increase in footslips in the beam walking test on rats treated with MnCl2 when compared to the control group. There were no significant differences in the striatal levels of thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), nonprotein thiols (NPSH), in the activity of antioxidant enzymes glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD), as well as in the activities of complex I and II of the mitochondrial respiratory chain. Tyrosine hydroxilase (a marker of catecholaminergic neurons, TH) immunoreactivity decreased in the striatum of Mn exposed rats at 24 h after treatment, but it returned to control levels after the latency period. The glial fibrillary acidic protein (GFAP) levels increased only in GP at 30 days after Mn exposure. There was no difference in the immunoreactivity for glutamate decarboxylase (a marker of GABAergic neurons, GAD 65). The absence of the motor impairment and changes in TH immunostaining at 30 days after Mn exposure revealed the reversibility of symptoms triggered by MnCl2 exposure. We conclude that the experimental design of this study represents a useful strategy to study the mechanisms that lead to manganism, especially after an acute exposure to MnCl2. Moreover, the observed reactive gliosis (increased GFAP reactivity) in the GP at 30 days after Mn exposure suggests the occurrence of delayed reactive/inflammatory processes, which could be responsible for neurodegenerative events following Mn exposure.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:52:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 341651.pdf: 2117026 bytes, checksum: 15db0a32fd9c359c17224e5c43117562 (MD5) Previous issue date: 2016 / Biomarcadores são respostas rápidas podendo ser avaliados nos menores níveis de organização biológica, os quais podem detectar sinais precoces de danos a biomoléculas, tecidos, ou órgão, avaliando um determinado processo biológico. O impacto de contaminantes sobre os indivíduos podem ser avaliados, oferecendo, assim, oportunidade para a aplicação de medidas corretivas. Extensas áreas de manguezais em todo o mundo já foram perdidas, particularmente aquelas localizadas em áreas urbanas, as quais estão sob pressão devido a contaminação por efluentes domésticos. Estão presentes no esgoto sanitário metais, cosméticos, hormônios, detergentes, matéria orgânica, entre outros. Em uma primeira etapa desta tese foi estudado o efeito da exposição de ostras nativas Crassostrea brasiliana junto ao Mangue do Itacorubi, Florianópolis, SC, o qual é conhecido por estar moderadamente contaminado com esgoto sanitário. Dessa forma foi avaliada a presença de contaminantes, tais como HPAs, PCBs e LABs. As ostras da espécie C. brasiliana foram transplantadas para o Mangue do Itacorubi, apresentando várias alterações bioquímicas nas brânquias, quando comparadas a ostras transplantadas por 24 ou 96 h para um sítio de referência (Mangue de Ratones). As defesas antioxidantes (catalase, glutationa peroxidase e glutationa) foram diminuídas, apresentando um efeito mais expressivo em 96 h (primavera e outono). Os dados estão de acordo com a ideia de que as brânquias de ostras são especialmente responsivas após uma exposição aguda, neste caso a um mangue contaminado com esgoto sanitário. A contaminação de águas superficiais por cobre ocorre em todo o mundo, usualmente originado de mineração, atividades agriculturais, industriais, comerciais e residenciais. A contaminação de águas superficiais por cobre ocorre em todo o mundo, usualmente originado de mineração, atividades agriculturais, industriais, comerciais e residenciais. Os limites permitidos de cobre são variáveis entre os países, mas geralmente estão na faixa de µg/L. Estes níveis já são capazes de perturbar várias funções de peixes em seus estágios iniciais de desenvolvimento. Em uma segunda etapa da tese foram estudados os efeitos da exposição ao cobre sobre o comportamento de larvas e de indivíduos adultos do peixe paulistinha Danio rerio, além de respostas antioxidantes no peixe adulto. Indivíduos adultos e larvas do peixe paulistinha foram expostos por 96 h ao cobre (concentração nominal: 0, 5, 9, 20 e 60 µg/L; medida: 0.4, 5.7, 7.2 16.6 e 42.3 µg/L). Na concentração de cobre de 60 µg/L, as larvas tiveram uma redução de 5% no comprimento do corpo, e nos adultos prejuízo na memória espacial, decréscimo na atividade glutationa S-transferase. Exposição ao cobre não afetou o comportamento social (agressividade e interação conespecífica), nem a atividade da enzima glutationa redutase. Interessantemente, na concentração nominal de cobre de 9 µg/L a distância e a velocidade de natação das larvas foram aumentadas, e nos adultos a memória de longa duração foi abolida e a atividade da enzima glutationa S-transferase das brânquias foi diminuída. A exposição a concentrações de cobre próximas aos limites permitidos no Brasil foi capaz de alterar o desempenho natatório e perturbar o comportamento dos peixes adultos. Estes dados indicam que, os limites nacionais para o cobre em água doce podem afetar significativamente o desenvolvimento e o comportamento de peixes. Nosso trabalho indica que novos trabalhos precisam ser realizados a fim de confirmar que os níveis de cobre permitidos pela legislação brasileira não são totalmente seguros para peixes de água doce.<br> / Abstract : Biomarkers are quick responses that can be evaluated at lower levels of biological organization, which can detect early signs of damage to biomolecules, tissue, or organ, evaluating a particular biological process. The impact of contaminants on individuals can be evaluated, thus, offering the opportunity for the application of corrective measures. Extensive mangrove areas have been lost around the world, particularly those located in urban areas, which are under pressure due to contamination with domestic effluents. The sewage contains metals, cosmetics, hormones, detergents, organic matter, among others. Sanitary sewage tipically contains metals, cosmetic products, hormones, detergentes, organic mather, among others first part of this study investigated the effect of the exposure of native oyster Crassostrea brasiliana on the Itacorubi mangrove, Florianópolis, SC, which is known to be moderately contaminated with sewage. The presence of contaminants sucha as HPAs, PCBs e LABs was investigated. The Crassostrea brasiliana oysters transplanted to the Itacorubi mangrove presented several biochemical changes in the gills when compared to oysters transplanted for 24 or 96 h to a reference site (Ratones mangrove). Antioxidant defenses (catalase, glutathione peroxidase and glutathione) were decreased, showing a more significant effect in 96 h (spring and fall). The data are consistent with the idea that the oyster gills are especially responsive after acute exposure in a mangrove contaminated with sewage. Contamination of surface waters by copper occurs throughout the world, usually originated from mining, agricultural and industrial activities, as well as commercial and residential activities. Copper limits vary between countries, but generally are in µg/L range. These levels are already able to disrupt several fish functions in its early stages of development. In a second part of this work the effects of copper exposure on the behavior of larvae and adult individuals of zebrafish Danio rerio were investigated, in addition to the antioxidant responses in adult fish. Adult fish and larvae were exposed for 96 h to copper (nominal concentration: 0, 5, 9, 20 and 60 µg/L; measured: 0.4, 5.7, 16.6 7.2 and 42.3 µg/L). At the copper concentration of 60 µg/L, the larvae had a 5% reduction in the body length, and the adult fish had impaired spatial memory and activity of the enzyme glutathione S-transferase decreased. Social behavior (aggression and conespecífic interaction) and the activity of the enzyme glutathione reductase were not affected. Interestingly, at the nominal concentration of 9 µg/L of copper, the distance traveled and the swim speed were increased in the larvae, and in the adults the long-term memory was abolished, and the enzymic activity of glutathione S-transferase was decreased in the gills. Exposure to concentrations of copper close to the allowed limits was able to change the swimming performance and disrupt the behavior of adult fish. These data indicate that the national limits allowed for copper on water can significantly affect the development and the behavior of fish. This study indicates that further work are necessary in order to confirm that allowed copper levels in Brazil totally safy to fishes living in inland waters.