Orientador : Profª. Drª. Maria Rita Sierakowski / Coorientador : Prof. Dr. Rilton Alves de Freitas / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/04/2017 / Inclui referências: 122-134 / Resumo: Novos materiais desenvolvidos a partir de fontes naturais de origem renovável, biocompatíveis e de baixo custo vêm recebendo atenção da academia e da indústria, e duas fontes promissoras são os cristais de celulose (NC) e as xiloglucanas (XG) de sementes de Tamarindus indica. O objetivo desta tese se baseou no desenvolvimento de materiais suportes a base desses polissacarídeos e, de acordo com as publicações geradas, a tese foi dividida em três partes. Na primeira (1), foi realizada a adsorção de XG em camadas de NC com quatro diferentes graus de sulfatação e de potencial zeta [0% SO3 -, isolado com HCl (? -4,8 mV); 0.42% SO3 -, usando uma mistura de HCl e H2SO4 (? -39,6 mV); e 0,65% SO3 -, usando somente H2SO4 (? -45,6 mV)]. A interação foi investigada através de várias técnicas [isotermas de Langmuir, microscopia de força atômica (AFM), ângulo de contato, espalhamento de luz dinâmico, elipsometria e medidas por microbalança de cristal de quartzo (QCM)]. Os experimentos de adsorção em água e por layer by layer (LbL) sugerem que o maior grau de esterificação na superfície de NC (0,65% SO3 -) prejudica a capacidade máxima de adsorção da XG e cria camadas adsorvidas instáveis. Entretanto, para o grupo 0,42% SO3 - não foi verificada alterações significativas na adsorção da XG além de ter uma maior estabilidade coloidal do que o grupo 0% SO3 - e de formar filmes mais estáveis, com menor rugosidade e espessura. Mas, testes iniciais de formação de filmes de XG com NC submetidos a oxidação com o reagente TEMPO apresentaram delaminação e foram descartados para a etapa de produção de biossensores bidimensionais. Na segunda parte (2), sensores piezoelétricos foram revestidos com filmes de NC e em seguida foi imobilizado anticorpos monoclonais IgG específicos para o antígeno NS1 do vírus da dengue. O revestimento do sensor foi acompanhado por AFM, QCM e QCM-D. O sensor desenvolvido foi capaz de detectar o antígeno NS1 em amostras de soros sanguíneos simulados no intervalo de concentração de 0,01 à 10 ?g.mL-1. O revestimento ainda proporcionou a capacidade de reconhecimento de NS1 através de ambos os equipamentos, QCM-D e QCM, com limites de detecção de 0,1 ?g.mL-1 e 0,32 ?g.mL-1, respectivamente. Na terceira parte (3), na tentativa de baratear o sensor desenvolvido na metodologia do artigo anterior, foi proposta a otimização do procedimento de obtenção de NC. Para isso, foi verificada a influência de prétratamentos mecânicos antes do procedimento de hidrólise da celulose. As amostras foram segregadas em relação ao grau de intensidade do tratamento mecânico, sendo: (a) agitação mecânica, (b) trituração, (c) cisalhamento por 20 passagens por moinho e (d) cisalhamento por 40 passagens por moinho. E foram caracterizadas por reologia, AFM, difração de raios-x e rendimento de NC isolados. De acordo com os resultados obtidos, não foi verificada diferença significativa do pré-tratamento para produção de NC. Assim, sugere-se que não é necessário um pré-tratamento mecânico e, com isso, o custo final da obtenção de NC pode ser diminuído. Palavras-chave: Xiloglucana. Nanocristais de celulose. Biossensores. Dengue. Filmes finos. Proteína NS1 / Abstract: Novel materials developed from renewable and natural sources with biocompatibility and low cost have receiving great attention from academia and industry. Two promises sources are cellulose nanocrystals (NC) and xyloglucan (XG) from Tamarindus indica. seeds. At present thesis, the main goal was the development of support materials based on these two polysaccharides. In according to published papers, this thesis was organised in three sections. The first (1), the adsorption behavior of XG on layers of bacterial cellulose nanocrystals (BCN) with four different sulfate content and zeta potential (?) values [0% SO3 -, using only HCl (? -4.8 mV); 0.42% SO3 -, using a mix of HCl and H2SO4 (? -39.6 mV); and 0.65% SO3 -, using only H2SO4 (? -45.6 mV)] was investigated. The adsorption was evaluated by several techniques (Langmuir isotherms, atomic force microscopy, contact angle, dynamic light scattering, ellipsometry and quartz crystal microbalance measurements). The experiments in water suspension and layer by layer (LbL) suggest that high sulfate substitution on BCN surface (0.65% SO3 -) impairs the original interaction with XG, resulting in lower maximum adsorbed amount (Qmax) of XG on BCN and unstable deposited layers with desorption. Therefore, 0.42% SO3 - did not significantly impair XG adsorption, and the greater colloidal stability than 0% SO3 - resulted in higher XG mass adsorption in water suspension and thin films with lower roughness, thickness and without desorption. However, initial test of XG films with NC subjected to oxidation with the TEMPO reagent presented delamination and were discarded for the production stage of twodimensional biosensors. In the second section (2), piezoelectric sensors were previously coated with thin films of bacterial cellulose nanocrystals (CN) to provide a more sensitive and adapted interface for the attachment of monoclonal immunoglobulin G (IgGNS1) and to favor specific detection of non-structural protein 1 (NS1) of dengue fever. The assembly of the immunochip surface was analyzed by atomic force microscopy (AFM) and the NS1 detection was followed by quartz crystal microbalance with (QCM-D) and without energy dissipation monitoring (QCM). The CN surface was able to immobilize IgGNS1, as confirmed by AFM topography and phase images along with QCM-D. The system was able to detect the NS1 protein in serum simulated in the range of 0.01- 10 ?g.mL-1, by both QCM and QCM-D. The limits of detection of the two devices were 0.1 ?g.mL-1 for QCM-D and 0.32 ?g.mL-1 for QCM. At last (3), in order to optimize and reduce the cost of piezoeletric immunochip, was proposed a study to optimize the hydrolysis procedure. For this, the influence of mechanical pretreatment before the hydrolysis procedure was verified on the pristine cellulose submitted to four different mechanical process: (1) magnetic stirring, (2) blender, and milled by (3) 20 and (4) 40 passages in supermasscolloider mill. All the samples were evaluated according to yield, morphology and size (atomic force microscopy), crystallinity (x-ray diffraction). Not all CNC differed in evaluated characteristics suggesting that, intense mechanical pretreatment are not exclusively required, prior to hydrolysis. Key-words: Xyloglucan. Celulose nanocrystals. Biossensors. Dengue. Thin films. NS1 protein.

Orientador : Profª. Drª. Maria Berenice R. Steffens / Coorientador : Profª. Drª. Michelle Zibetti Tadra Sfeir / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 29/09/2016 / Inclui referências : f. 89-116 / Resumo: Herbapirillum seropedicae SmR1 é uma bactéria diazotrófica que coloniza, de forma endofítica, várias plantas de interesse econômico. A identificação e caracterização de RNAs não codificadores (ncRNAs) no gênero Herbaspirillum é uma etapa importante para o estudo da interação dessas moléculas com mRNAs- ou proteínas-alvo, no processo de regulação pós-transcricional. Neste trabalho foi ampliou-se a análise estrutural e funcional de ncRNAs com função regulatória em H. seropedicae SmR1. Além disso, foram preditos ncRNAs em outras bactérias do gênero Herbaspirillum. Utilizando a ferramenta Infernal 1.1.1 foram identificados 55 novos ncRNAs H. seropedicae SmR1, com expressão confirmada, que foram somados aos 173 já relatados por Moreno (2013) e Cirino (2014). Os novos ncRNAs foram classificados de acordo com a sua estrutura, como ncRNA cis-encoded ou ncRNAs trans-encoded. Foram também encontrados riboswitches e um representante da nova classe de RNA, a sequência CRISPR. Utilizando a ferramenta TargetRNA2 foram preditos diversos mRNAs-alvos. Dez ncRNAs de H. seropeddicae SmR1 com expressão confirmada em experimentos de RNAseq foram selecionados e oligonucleotídeos foram desenhados para futura validação por qRT-PCR. Finalmente, estes resultados contribuirão para o entendimento da participação desse tipo de RNA na regulação do metabolismo de bactérias do gênero Herbaspirillum. Palavras-chave: H. seropedicae SmR1; RNA não codificador, ncRNA, cis-encoded ncRNA, trans-encoded ncRNA, riboswitch, CRISPR. / Abstract: Herbaspirillum seropedicae SmR1 is a diazotrophic bacterium that colonizes endophytically several plants of economic interest. The identification and characterization of non-coding RNAs (ncRNAs) in the genus Herbaspirillum is an important step in the study of the interaction of these molecules with mRNAs- or proteins-tragets, in the post-transcriptional regulation process. In this work we continued the study of the structural and functional analysis of ncRNAs with regulatory function in H. seropedicae SmR1. In addition, new ncRNAs were predicted in other bacteria of the genus Herbaspirillum. Using the Infernal 1.1.1 tool, 55 new ncRNAs, with confirmed expression, were identified in the H. seropedicae SmR1 genome. They were added to the 173 ncRNas already reported by Moreno (2013) and Cirino (2014). The new ncRNAs were classified as cis-encoded ncRNAs or trans-encoded ncRNAs. We also found riboswitches and a representative of the new RNA class, the CRISPR sequence. Using the TargetRNA2 tool, several mRNAs-target were predicted. Ten ncRNAs of H. seropedicae SmR1, with confirmed expression in RNAseq experiments, were selected and oligonucleotides were designed for further validation by qRT-PCR. Finally, these results will contribute to the understanding of the participation of this type of RNA in the regulation of the metabolism of bacteria of the genus Herbaspirillum. Key-words: H. seropedicae SmR1; RNA non-coding (ncRNA), ncRNA cis_encoded, trans-encoded, riboswitches, CRISPR, mRNA.

Resumo: YacG é uma pequena proteína (65 resíduos de aminoácidos) ligada ao zinco codificada pelo gene yacG de Escherichia coli. Seu papel fisiológico não está bem caracterizado, porém acredita-se que ela exerça ação inibitória sobre a atividade catalítica da DNA girase, enzima responsável por alterações no estado topológico do DNA bacteriano. Com base nas informações da estrutura primária desta proteína, uma série constituída de oito seqüências peptídicas foram projetadas e sintetizadas pela metodologia da fase sólida, objetivando-se avaliar e melhor entender o efeito da coordenação do íon zinco no seu mecanismo de ação. As sequências foram projetadas de maneira a resultar em uma substituição parcial ou integral dos resíduos de cisteína da sequência nativa da YacG, por resíduos de serina, além da variação da carga efetiva da molécula, por amidação ou acetilação das extremidades C e N terminais, respectivamente. Os peptídeos obtidos e purificados foram ensaiados quanto à estequiometria de coordenação empregando titulação com íon cobalto, bem como na capacidade inibitória frente à DNA girase, empregando eletroforese em gel de agarose. YacGAG4, inibiu a atividade de superenovelamento do DNA, catalisada pela girase, somente na ausência de íons zinco em concentrações inferiores a 120 μmol.L-1. Os demais peptídeos não apresentaram capacidade inibitória, tanto na presença quanto na ausência de zinco. Ensaios de susceptibilidade bacteriana, empregando algumas espécies de bactérias da família Enterobacteriaceae, confirmaram os resultados in vitro,com exceção das sequências YacGAG1-AC e YacGAG2-AC que mostraram inibição no crescimento bacteriano, sem porém resultarem em atividade in vitro. Com base nos resultados obtidos, é possível concluir que o domínio estrutural relacionado à coordenação do zinco, bem como a presença... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: YacG is a small protein (65 amino acid residues) bounded to zinc and encoded by the Escherichia coli yacG gene. Its physiological role is not well characterized, but it is believed that YacG is an inhibitor of the catalytic activity of DNA gyrase, an enzyme responsible for changes in the topological state of bacterial DNA. Based on information from the primary structure of this protein, a series of eight peptide sequences were designed and synthesized by solid phase methodology, aiming to evaluate and better understand the effect of zinc coordination of in their mechanism of action. The sequences were designed so as to result in a partial or full replacement of the cysteine residues of the native YacG sequence by serine residues and to change the effective charge of the molecule by amidation or acetylation of C and N terminal ends, respectively. The obtained peptides were purified and tested by titration with cobalt ion (coordination stoichiometry), as well as by inhibitory effect against the DNA gyrase, using agarose gel electrophoresis. YacGAG4 inhibited DNA supercoiling activity catalyzed by gyrase only in the zinc ions absence at concentrations below of 120 μmol.L-1. The other peptides showed no inhibitory effect in both the presence and absence of zinc. Bacterial susceptibility tests, using some species of bacteria of the Enterobacteriaceae, confirmed in vitro results, with the exception of the sequences YacGAG1-AC and YacGAG2-AC that showed inhibition of bacterial growth, but no in vitro activity. Based on these results, we conclude that the structural matters related to the coordination of zinc as well as the presence of this ion, showed no significant importance in the activity of DNA gyrase inhibition. In this case, the inhibition of activity recently proposed, should be linked to any other region of the protein molecule, structurally organized when the zinc ion is bound... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Reinaldo Marchetto / Coorientador: Saulo Santesso Garrido / Banca: Clarice Queico Fujimura Leite / Banca: Vani Xavier de Oliveira Junior / Mestre

El síndrome de Sjögren es una enfermedad autoinmune que causa alteraciones en la estructura y función de las glándulas exocrinas debido a la destrucción de la lámina basal de acinos y ductos, y a la degradación de las principales proteínas de matriz extracelular. El progresivo reemplazo de componentes exocrinos por tejido adiposo y fibroso, conduce a la sequedad de mucosas, principalmente oral (xerostomía) y ocular (xeroftalmia), que son los principales síntomas de esta enfermedad. En las glándulas de estos pacientes, también se pueden encontrar focos de infiltrado linfocitario, los que se correlacionan con el progreso de la enfermedad. Sin embargo, cambios importantes en las células epiteliales y la matriz extracelular, darían cuenta del desarrollo de esta enfermedad de manera independiente a la presencia de infiltrado de células mononucleares. A nivel molecular, la degradación de la matriz extracelular es inducida por un desequilibrio entre metaloproteinasas de matriz y sus inhibidores tisulares, favoreciendo la actividad proteolítica. La degradación de componentes de la lámina basal desorganiza la estructura y conduce a la pérdida de anclaje celular a la matriz extracelular. La señalización dependiente de anclaje mantiene la polaridad celular principalmente a través de complejos de adhesión llamados hemidesmosomas. El receptor involucrado en formar estas estructuras es la integrina α6β4, cuyo ligando de mayor afinidad es la laminina-5. Recientemente se ha demostrado que la laminina-5 está sobreexpresada (a nivel de proteínas y mRNA) en glándulas salivales labiales de pacientes con síndrome de Sjögren. Además, análisis de microarreglos de cDNA obtenidos de glándulas salivales labiales de pacientes con síndrome de Sjögren, y comparados con los obtenidos de individuos control, han demostrado que varias proteínas citoplasmáticas normalmente asociadas a la integrina α6β4, por ejemplo BP230 y citoqueratina 8/18, están sobreexpresadas. Las integrinas, además de su papel como mediadores de la interacción célulamatriz, participan en la señalización hacia y desde la célula (señalización bidireccional), la que es importante para regular procesos como proliferación, diferenciación y muerte celular. Por lo tanto, la degradación no regulada de lámina basal, no sólo modifica las propiedades de adhesión de la célula, sino también las señales que estos receptores xiii llevan al interior de la célula, conduciendo a importantes cambios que pueden llevar a la muerte celular. De esta manera, se decidió analizar los niveles de expresión y localización subcelular de la integrina α6β4 en células acinares de pacientes con síndrome de Sjögren e individuos control, y así estudiar si estos se relacionan con los cambios que ocurren en estas glándulas. Se propuso la siguiente hipótesis: “En glándulas salivales de pacientes con síndrome de Sjögren la pérdida de adhesión de células acinares a su lámina basal y la sobreexpresión de laminina-5, se acompañan de una sobreexpresión y/o redistribución de la integrina α6β4” Para evaluar esta hipótesis, se determinaron los niveles de mRNA y de proteínas de las subunidades α6 y β4 en glándulas salivales de pacientes con síndrome de Sjögren y se compararon con los resultados obtenidos de individuos controles. Además, mediante inmunohistoquímica, usando anticuerpos específicos para cada subunidad, se analizó la localización de la integrina α6β4 en la membrana plasmática de células acinares y la de laminina en láminas basales de acinos de glándulas salivales. Los resultados obtenidos no mostraron diferencias significativas en los niveles relativos de mRNA entre pacientes y controles, tanto para la integrina α6 (p = 0,49) como para la integrina β4 (p = 0,71). Al analizar los niveles relativos de proteínas, en el caso de α6, no se encontraron diferencias significativas entre el grupo total de pacientes y el grupo control (p = 0,2), sin embargo, al separar el grupo de pacientes en dos subgrupos de acuerdo a su nivel de expresión, se encontró que el que presentaba niveles menores no tenía diferencias significativas respecto al grupo control (p = 0,296), mientras que el otro, que presentaba niveles relativos mucho más altos, sí mostró diferencias significativas (p = 0,014). En cuanto a la proteína β4, ésta se encontró de manera intacta (200 kDa) y proteolizada (172 y 145 kDa) tanto en pacientes como en controles. De ambas formas, los niveles fueron significativamente menores en pacientes respecto a controles (p = 0,02). En cuanto a la localización subcelular de la integrina, en pacientes se encontró una importante redistribución hacia la superficie lateral de la célula, encontrándose xiv incluso a nivel citoplasmático en los casos de mayor desorganización de la lámina basal. Estos y otros resultados confirman de manera parcial la hipótesis, donde el mecanismo de rescate al desanclaje podría llevarse a cabo a través de la redistribución de la integrina α6β4 a nivel subcelular. Existirían otros mecanismos por los cuales se mantendrían activas algunas de las señales dependientes de anclaje, para completar el sistema de rescate a la muerte celular, y que no pasarían necesariamente por una mayor cantidad de integrina α6β4.

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistémica autoinmune que se caracteriza por la inflamación crónica y progresiva de las articulaciones sinoviales llevando a la destrucción del cartílago y hueso articular. En la AR existe consenso que el proceso autoinmune involucra una presentación anormal de auto-antígenos por parte de células presentadoras de antígeno o células dendríticas (DC), que llevaría a la activación de células T CD4+ auto-reactivas, secretoras de interferón gamma e interleuquina (IL)-17, que inducen en los macrófagos, la secreción de IL-1, IL-6 y factor de necrosis tumoral Durante la última década, el desarrollo de técnicas para generar gran número de DC in vitro junto con el entendimiento del rol de las DC en la tolerancia periférica, han permitido producir DC con propiedades tolerogénicas y reguladoras. En este contexto, en esta Tesis se generaron in vitro DC de pacientes AR a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), mediante el cultivo en presencia de IL-10 se buscó generar DC con propiedades tolerogénicas. Estas células se caracterizaron fenotípicamente mediante citometría de flujo y morfológicamente mediante microscopía confocal, además se caracterizaron en cuanto a expresión de citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias; por último se realizaron ensayos funcionales in vitro de fagocitosis de inhibición de la alo-proliferación. Como resultado, se generaron DC de pacientes AR con características tolerogénicas utilizando IL-10, estas células poseen una menor expresión en superficie celular de los marcadores CD83, CD40 y CD86 y las moléculas MHC clase II con relación a las DC maduras. Expresan en su superficie el receptor de quimioquinas CCR7, lo cual nos indica que son células con capacidad de migración a órganos linfoides secundarios. El uso de IL-10 permite generar DC productoras de TGF e IL-10, con una baja producción de IL-12 en relación a las DC maduras. Por último, estas DC poseen una elevada capacidad endocítica y una disminuida capacidad de inducción de alo-proliferación. También es importante destacar que estas DC no difieren a las generadas a partir de PBMC de individuos normales en cuanto a las características fenotípicas y funcionales ya mencionadas. Por lo tanto, estos resultados sugieren que en los pacientes AR, las DC se pueden modular hacia un fenotipo tolerogénico, lo cual podría transformarse en una estrategia terapéutica a considerar.

La temperatura es uno de los factores ambientales más importantes para la vida, siendo los ambientes fríos los que presentan la mayor distribución en la biosfera. Diferentes organismos han desarrollado diversas estrategias de tolerancia y adaptación al frío, entre ellas la síntesis de enzimas adaptadas/activas a bajas temperaturas. Estas enzimas especializadas se caracterizan por una alta eficiencia catalítica, temperaturas óptimas desplazadas a bajas temperaturas y termolabilidad a temperaturas moderadas. La disponibilidad del krill antártico, pequeño crustáceo explotado con fines comerciales, ha permitido el estudio de sus actividades enzimáticas. En el Centro de Ingeniería Bioquímica y Biotecnología los estudios se han centrado principalmente en la actividad proteasa y lipasa. Las enzimas lipolíticas están involucradas en le metabolismo lipídico, siendo las lipasas responsables de la hidrólisis y síntesis de triacilgliceroles. Basados en estos antecedentes se propone la siguiente hipótesis de trabajo: “el krill antártico Eupausia superba Dana posee enzimas lipolíticas adaptadas al frío, capaces de actuar in vitro a bajas temperaturas”, para el abordaje de esta hipótesis se desarrollaron tres objetivos específicos: (i) separación y obtención de enzimas lipolíticas de krill antártico, (ii) determinación de las características bioquímicas y fisicoquímicas de las enzimas lipolíticas purificadas y (iii) secuenciación y análisis de las secuencias de las enzimas lipolíticas de krill antártico. Se examinaron las condiciones para la obtención de un adecuado extracto enzimático, el procedimiento de autólisis a 40ºC durante 24 h o la homogenización a 8.300 rpm durante 1-2 min a 4ºC, permitió la obtención de un extracto con alta actividad lipasa específica. Se trabajó con dos enzimas lipolíticas de krill antártico, KL1 y KL2. La enzima lipolítica purificad KL1 presentó una masa molecular de 50 kDa y pI de 6,6 con una actividad sobre p-nitrofenilpalmitato (C16) de 2,9*103 U/mg a 20ºC y pH 8, presentó una temperatura óptima de 40ºC y pH óptimo de 9.KL1 exhibió un comportamiento inusual a temperaturas moderadas, sin embargo, a 10ºC retuvo el 23% de su actividad máxima, Se determinó una energía de activación de 24,7 kcal/mol (25-40ºC). Adicionalmente se caracterizó la enzima lipolítica KL2 previamente purificada que presentó una temperatura óptima a 37ºC y pH óptimo de 8, retuvo el 46% de su actividad máxima a 10ºC, Se determinó una energía de activación de 4,9 kcal/mol (10-37ºC). Las características de KL1 indiacarían que corresponde a una enzima mesofílica, en cambio, KL2 presentaría las propiedades de adaptación al frío (baja energía de activación y actividad a bajas temperaturas). El análisis de las secuencias de lipasas eucariontes realizado para el diseño de partidores para la identificación y ampliación PCR de genes de lipasa de krill antártico indicó que las lipasas presentan una baja similitud entre sus secuencias aminoácidos conservados contiguos y la peque ña longitud de las zonas conservadas, El análisis de las secuencias amplificadas por PCR no indicó similitud con lipasas. De igual modo el análisis de la secuencia parcial de KL2 tampoco mostró similitud significativa con lipasas, La ausencia de similitud probablemente se debería a las características antes señaladas de las lipasas, como también la posibilidad que correspondan a nuevas lipasas.

A Dieta Cetogênica é caracterizada pelo alto teor de gordura e baixo teor de carboidratos e proteínas, e tem sido proposta como benéfica em crianças com desordens epiléticas que não respondem ao tratamento convencional de drogas anti-epiléticas. O retardo de crescimento é um importante inconveniente desta dieta e as causas metabólicas ainda não estão bem caracterizadas. O objetivo desse estudo é examinar a variação de peso corporal e de tecido adiposo de ratos Wistar tratados com a dieta cetogênica durante 6 semanas, e a atividade da fração citosólica da enzima fosfoenolpiruvato carboxicinase (PEPCK) no tecido adiposo. Os ratos alimentados com a dieta cetogênica apresentaram uma diminuição do peso corporal, mas um significante aumento de tecido adiposo. A razão tecido adiposo/peso corporal apresentou diferenças entre os ratos cetogênicos e os controles já na primeira semana de tratamento, cerca de 2 vezes maior nos ratos cetogênicos. A lipogênese visceral foi mantida por um aumento na atividade da PEPCK, objetivando o fornecimento de glicerol-3- fosfato para a síntese de triacilglicerol e este acúmulo de gordura foi acompanhado por intolerância à glicose. Não foram observadas mudanças na glicemia e lipidemia basais. Estes dados contribuem para o entendimento dos efeitos metabólicos da dieta cetogênica e sugere alguns riscos potenciais desta dieta.

A acidemia metilmalônica é uma desordem metabólica hereditária caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA) e clinicamente por deterioração neurológica progressiva e falência renal. Os avanços no tratamento dessa doença alcançados nos últimos anos possibilitaram uma diminuição significativa na mortalidade dos mesmos. Entretanto, a morbidade continua alta, pois a maioria dos pacientes afetados por acidemia metilmalônica, mesmo recebendo o melhor tratamento disponível no momento, apresenta graus variáveis de comprometimento do sistema nervoso central refletido em retardo mental e atraso no desenvolvimento psicomotor. No presente estudo investigamos os efeitos in vivo da administração crônica do MMA em ratos Wistar durante o seu desenvolvimento (do 5º ao 28º dia de vida pós-natal) sobre o comportamento dos mesmos na tarefa do labirinto aquático de Morris. A tarefa foi realizada após um período de recuperação dos animais de 30 dias com o intuito de verificar dano neurológico permanente ou de longa duração nos animais. O labirinto aquático de Morris é uma tarefa bastante útil para a avaliação de aprendizado e memória espaciais. O protocolo da tarefa foi ligeiramente modificado para servir ao propósito de nosso trabalho, ou seja, o de avaliar o efeito da administração crônica de drogas sobre o comportamento de ratos. Verificamos que a administração crônica de MMA não provocou efeito no peso corporal, velocidade de natação e na fase de aquisição da tarefa. Porém, o tratamento prejudicou o desempenho dos animais no treino reverso, o que é condizente com comportamento perseverativo. Também avaliamos o efeito do ácido ascórbico, que foi administrado isoladamente ou em combinação com o MMA para testarmos se o estresse oxidativo poderia estar relacionado com as alterações comportamentais observadas no grupo tratado com MMA. Observamos que este antioxidante preveniu as alterações comportamentais provocadas pelo MMA, indicando que o estresse oxidativo pode estar envolvido com o efeito encontrado. Passamos então a avaliar o efeito in vitro do MMA sobre parâmetros de estresse oxidativo, mais especificamente na técnica de dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), que é um parâmetro de lipoperoxidação, e sobre o potencial antioxidante total do tecido (TRAP) e a reatividade antioxidante do tecido (TAR), que são parâmetros de defesas antioxidantes teciduais. O MMA na concentração de 2,5 mM aumentou a lipoperoxidação in vitro em homogeneizado de estriado e hipocampo de ratos e diminuiu o TRAP e o TAR em homogeneizado de estriado de ratos. Tais resultados indicam fortemente que o MMA induz estresse oxidativo. Finalmente investigamos o efeito in vitro do MMA sobre a atividade enzimática dos complexos da cadeia respiratória em várias estruturas cerebrais e em órgãos periféricos em ratos de 30 dias de vida no sentido de melhor esclarecer os mecanismos fisiopatológicos dos danos teciduais desta doença. Verificamos que o MMA causou uma inibição significativa da atividade do complexo II da cadeia respiratória em estriado e hipocampo quando baixas concentrações de sucinato foram utilizadas no meio de incubação. Além disso, verificamos que este efeito inibitório do MMA sobre o complexo II ocorreu somente após exposição do homogeneizado ao ácido por pelo menos 10 minutos, além do que esta inibição não foi prevenida pela co-incubação com o inibidor da óxido nítrico sintetase Nω- nitro-L-argininametilester (L-NAME) ou por uma associação de catalase e superóxido dismutase. Estes resultados sugerem que as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio mais comuns não estão envolvidas neste efeito, tornando improvável que a inibição do complexo II da cadeia respiratória seja mediada por estresse oxidativo. O MMA também causou uma inibição do complexo II-III em estriado, hipocampo, rim, fígado e coração; e inibiu o complexo I-III em fígado e rim. O complexo IV não foi afetado pela incubação com o ácido em nenhuma das estruturas testadas. Portanto, tomados em seu conjunto, estes resultados indicam que o MMA bloqueia a cadeia respiratória. Os resultados de nosso trabalho indicam que a administração crônica de MMA em ratos em desenvolvimento provocou alterações comportamentais de longa duração provavelmente mediadas por radicais livres, pois tais alterações foram prevenidas pelo antioxidante ácido ascórbico. O MMA também induziu estresse oxidativo in vitro em estriado e hipocampo e inibiu de forma diferenciada os complexos da cadeia respiratória nos tecidos estudados, sendo que as estruturas mais vulneráveis a esta ação foram o estriado e o hipocampo. Finalmente, nossos resultados sugerem que antioxidantes podem ajudar a prevenir, ou pelo menos atenuar, os danos teciduais provocados pelo MMA na acidemia metilmalônica.

O paradigma do P50 é uma técnica eletrofisiológica útil na investigação da neurobiologia básica subjacente aos defeitos de processamento sensorial que caracterizam algumas doenças mentais, mais tradicionalmente associados à esquizofrenia. Nessa tese replica-se e amplia-se o estudo do filtro sensorial P50 em algumas condições neurológicas e psiquiátricas. Foram replicados os achados de perda de supressão na esquizofrenia, na doença de Parkinson e no transtorno de estresse pós-traumático (avaliando pioneiramente vítimas de violência urbana). O filtro sensorial P50 em populações com transtorno de pânico, com transtorno obsessivo-compulsivo e na doença de Machado-Joseph, uma ataxia cerebelar, foi avaliado pela primeira vez. Em todas estas patologias documentou-se uma perda da supressão do P50. Também se investigou os efeitos da modulação do filtro sensorial por cafeína (a substância psicoativa mais consumida no mundo todo, um antagonista não-seletivo dos receptores de adenosina do tipo A1 e A2A), administrada por via oral a 24 voluntários saudáveis em diferentes doses (100, 200 e 400 mg e placebo). As doses de 200mg e 400 mg reduziram a supressão do P50. O efeito da cafeína foi independente do gênero e do uso habitual de cafeína. Usuários (n=15) mostraram valores basais diferentes quando comparados aos não usuários (n=9), com amplitudes S2 menores. Os resultados obtidos com a teofilina, num estudo prévio, e com a cafeína foram reanalizados, mostrando uma perda transitória de supressão do P50 mais pronunciada à direita, sugerindo uma alteração no padrão de lateralização do filtro sensorial P50 mediada pelo uso de metil-xantinas. Estes achados reforçam a participação da adenosina na modulação do filtro sensorial P50 e indicam que a ingestão de cafeína deva ser controlada neste tipo de estudo. Dessa forma, demonstra-se que uma supressão do P50 alterada é um achado pouco específico. Uma vez que a supressão do P50 pode ser alterada por uma situação habitual como o uso de bebidas que contém cafeína, é possível que a perda da supressão não seja necessáriariamente ruim, mesmo que ela esteja potencialmente associada a uma vulnerabilidade maior para doenças neuropsiquiátricas.

Após a evocação as memórias já consolidadas tornam-se novamente vulneráveis à ação de inibidores de síntese protéica. Isto leva a hipótese de que as memórias são reconsolidadas após sua evocação, e que este processo depende de síntese protéica. Muitas evidências indicam que o hipocampo tem um papel chave na consolidação e na reconsolidação de diferentes memórias. A evocação não reforçada pode causar extinção e/ou reconsolidação, dois processos que afetam a retenção da memória em vias opostas. Usando a tarefa do labirinto aquático de Morris nós demonstramos que a anisomicina, um inibidor de síntese protéica, infundida na região CA1 do hipocampo dorsal imediatamente, mas não 3 e 6 horas após o treino prejudica a consolidação da memória espacial associada ao LAM. Além disso, demonstramos que a expressão repetida e não reforçada da memória espacial causa extinção que não é afetada pela inibição de síntese protéica na região CA1. No entanto, se o número de testes de evocação não reforçados é insuficiente para induzir extinção, ocorre o processo de reconsolidação dependente de síntese protéica hipocampal que recupera a memória original. A inibição da síntese protéica hipocampal após o aprendizado reverso prejudica a retenção da preferência espacial reversa e bloqueia a persistência da memória inicial, sugerindo que o aprendizado reverso envolve antes reconsolidação do que extinção do traço original. Além disso, a D-cicloserina, um parcial agonista do sítio da glicina no receptor NMDA, quando administrada sistemicamente ou na região CA1 após uma sessão de evocação não reforçada, melhora a retenção da memória. Nossos resultados no LAM sugerem a existência de um processo reconsolidatório dependente de síntese protéica hipocampal que opera recuperando e modernizando o traço enfraquecido pela evocação e sugere que, semelhante ao processo de consolidação, o de reconsolidação pode não ser somente bloqueado, mas melhorado por tratamentos farmacológicos apropriados. Até o presente não existem estudos a respeito das conseqüências da inibição da síntese protéica hipocampal no armazenamento e persistência pós-evocação da memória de reconhecimento de objetos. Neste trabalho nós reportamos que a infusão de anisomicina na região CA1 do hipocampo dorsal imediatamente ou 180 min, mas não 6 horas após o treino prejudica a consolidação da memória de reconhecimento de longa duração sem afetar a memória de curta duração, o comportamento exploratório e o estado de ansiedade ou a funcionalidade hipocampal. A anisomicina quando administrada na região CA1 após a reativação da memória na presença de objetos familiares não afeta a posterior retenção do traço mnemônico. No entanto, quando administrada na região CA1 imediatamente após a exposição dos animais a um objeto novo e um familiar, prejudica a retenção da memória de ambos os objetos. O efeito amnésico da anisomicina não ocorreu após a exposição a dois objetos novos ou a exploração ao contexto na ausência de estímulos específicos, sugerindo que é dependente da reativação do traço consolidado na presença de um comportamento relevante e saliente. Os resultados obtidos a partir da tarefa de reconhecimento de objetos indicam que o hipocampo é engajado durante a reconsolidação deste traço, talvez adicionando novas informações à memória original. / Upon retrieval, consolidated memories are rendered again vulnerable to the action of metabolic blockers, notably protein synthesis inhibitors. This has led to the hypothesis that memories are reconsolidated at the time of retrieval, and that this depends on protein synthesis. Ample evidence indicates that the hippocampus plays a key role both in the consolidation and reconsolidation of different memories. Non-reinforced retrieval can cause extinction and/or reconsolidation, two processes that affect subsequent retrieval in opposite ways. Using the Morris water maze task we show that in the rat repeated non-reinforced expression of spatial memory causes extinction which is unaffected by inhibition of protein synthesis within the CA1 region of the dorsal hippocampus. However, if the number of non-reinforced retrieval trials is insufficient to induce long-lasting extinction, then a hippocampal protein synthesis-dependent reconsolidation process recovers the original memory. Inhibition of hippocampal protein synthesis after reversal learning sessions impairs retention of the reversed preference and blocks persistence of the original one suggesting that reversal learning involves reconsolidation rather than extinction of the original memory. In addition, when given systemically or into the CA1 region after non-reinforced retrieval, the partial NMDAr agonist D-cycloserine improves subsequent memory retention. Our results suggest the existence of a hippocampal protein synthesis dependent reconsolidation process that operates to recover or update retrieval-weakened memories from incomplete extinction and suggest that, like consolidation, reconsolidation can be not only blocked but also enhanced by appropriate pharmacological treatments. At present there are no studies about the consequences of hippocampal protein synthesis inhibition in the storage and post-retrieval persistence of object recognition memory. Here we report that infusion of the protein synthesis inhibitor anisomycin in the dorsal CA1 region immediately or 180 min but not 360 min after training impairs consolidation of long-term object recognition memory without affecting short-term memory, exploratory behavior and anxiety state, or hippocampal functionality. When given into CA1 after memory reactivation in the presence of familiar objects ANI did not affect further retention. However, when administered into CA1 immediately after exposing animals to a novel and a familiar object ANI impaired memory of both objects. The amnesic effect of ANI was long-lasting, did not happen either after exposure to two novel objects or following exploration of the context alone or in the absence of specific stimuli suggesting that it was not reversible and contingent on the reactivation of the consolidated trace in the presence of a salient, behavioral relevant novel cue. Our results indicate that hippocampal protein synthesis is required during a limited post training time for consolidation of object recognition memory and show that the hippocampus is engaged during reconsolidation of this type of memory, maybe accruing new information into the original trace.