Submitted by Inácio de Oliveira Lima Neto (inacio.neto@inpa.gov.br) on 2018-10-22T14:48:18Z No. of bitstreams: 2 0_TESE_COMPLETA_VERSÃO FINAL DOUTORADO.pdf: 3519623 bytes, checksum: 4d37d3db7e4161f2accc7e0917e1fe65 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-22T14:48:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 0_TESE_COMPLETA_VERSÃO FINAL DOUTORADO.pdf: 3519623 bytes, checksum: 4d37d3db7e4161f2accc7e0917e1fe65 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-12-02 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The Amazon manatee is an aquatic mammal that possesses the placenta of the zonary and endotheliochorial type. This placental conformation partially blocks the passage of antibodies, increasing the need for immediate colostrum intake by the offspring. In this context, knowing the biochemical composition properties of the colostrum of this aquatic mammal is very important for the understanding of the physiology of the species and for guiding management measures to guarantee the health of captive T.inunguis in the early stages of development. The objective of this study was to characterize the proteins and amino acid composition in the colostrum of the Amazonian manatee Trichechus inunguis kept in captivity. Two samples of colostrum from a captive female were collected at the Center for the Preservation and Research of Aquatic Mammals, Balbina-AM, on two consecutive days, corresponding to the first 24 and 48 hours after delivery. Protein and free amino acids from "in nature" colostrum were analyzed by High Efficiency Liquid Chromatography by ion exchange. Proteins were determined by means of SDS PAGE followed by MALDI-TOF-MS analysis. The most abundant amino acids in colostrum in the first 24 hours were: glutamic acid (20.4%) and proline (13.7%). The lowest available amino acids were: arginine (0.9%), glycine (1.1%). Aspartic acid and serine were the amino acids that suffered the greatest decreases in their total concentrations between the samples of 24 and 48 hours (reduction of 6.4% and 0.9%, respectively) after delivery. The most abundant free amino acids in colostrum were aspartic acid (18%) and proline (15%). Four major proteins were identified in colostrum (bovine serum albumin, Apolipoprotein E, zinc finger protein and DREBRIN protein) and a polypeptide rich in proline and serine. Colostrum for this species does not appear to be related to the specific function of transmitting immunity but rather to act as a promoter of the infant's immune development by providing necessary subsidies capable of ensuring the synthesis of the infant's own immunity. In addition, the proteins identified in this study suggest preparing the newborn to metabolize mature, lipid-rich milk and providing subsidies for the neonatal development of the newborn / O peixe-boi da Amazônia é um mamífero aquático que possui a placenta do tipo zonária e endotéliocorial. Essa conformação placentária bloqueia parcialmente a passagem de anticorpos aumentando a necessidade de ingestão imediata do colostro pelos filhotes. Neste contexto, conhecer as propriedades da composição bioquímica do colostro deste mamífero aquático é muito importante para a compreensão da fisiologia da espécie e para que sejam orientadas medidas de manejo para garantir a saúde dos T.inunguis em cativeiro nas primeiras fases do desenvolvimento. O objetivo deste estudo foi caracterizar as proteínas e a composição em aminoácidos no colostro do peixe-boi da Amazônia Trichechus inunguis mantido em cativeiro. Foram coletadas, duas amostras de colostro de uma fêmea cativa no Centro de Preservação e Pesquisa de Mamíferos Aquáticos, Balbina-AM, em dois dias consecutivos, correspondendo as primeiras 24 e 48 horas após o parto. Os aminoácidos proteicos e livres do colostro “in natura” foram analisados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência por troca iônica. As proteínas foram determinadas por meio de SDS PAGE seguida por análise MALDI-TOF-MS. Os aminoácidos mais abundantes no colostro nas primeiras 24 horas foram: ácido glutâmico (20,4%) e prolina (13,7%). Os aminoácidos disponíveis em menor quantidade foram: arginina (0,9%), glicina (1,1%). O ácido aspártico e a serina foram os aminoácidos que sofreram os maiores decréscimos em suas concentrações totais entre as amostras de 24 e 48 horas (redução de 6,4% e 0.9% respectivamente) após o parto. Os aminoácidos livres mais abundantes no colostro foram o ácido aspártico (18%) e a prolina (15%). Foram identificadas quatro proteínas majoritárias no colostro (soroalbumina bovina, Apolipoproteina. E, proteína dedo de zinco e a proteína DREBRIN) e um polipeptídio rico em prolina e serina. O colostro para esta espécie não parece estar relacionado com a função específica de transmitir imunidade, mas de atuar como um promotor do desenvolvimento imunológico do filhote fornecendo subsídios necessários capazes de garantir a síntese da própria imunidade do neonato. Além disso, as proteínas identificadas neste trabalho sugerem preparar o recém-nascido para metabolizar leite maduro, rico em lipídeos e fornecendo subsídios para o desenvolvimento neurológico do recém-nascido.

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Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al Título de Bioquímico / En la actualidad existen mayores posibilidades de desarrollo académico y profesional para las mujeres. Esto, sumado al fácil acceso a métodos para el control de la natalidad, ha llevado a que se postergue la maternidad a edades más tardías. Esta situación se ha convertido en un gran problema para los países por sus consecuencias a nivel económico, social y de salud pública. Por ello, es de suma importancia estudiar los mecanismos involucrados en el proceso de envejecimiento reproductivo. La regulación de la función ovárica se conoce ampliamente desde el punto de vista neuroendocrino, sin embargo, poco se sabe de los mecanismos que la controlan a nivel local. Se cree que un grupo de péptidos, conocidos como kisspeptinas (KISS), cuyos niveles en el ovario varían conforme al progreso del ciclo estral, podrían estar regulando al sistema proteolítico de las metalloproteinasas de matriz extracelular (MMPs) a nivel local, de manera similar a como se ha descrito en otros tejidos. De ser así, KISS podría regular cíclicamente el remodelamiento de la matriz extracelular ovárica controlando los niveles de expresión y/o actividad de las MMPs. Esto cobraría especial importancia en el periodo de subfertilidad, puesto que se ha descrito que los cambios morfológicos asociados al envejecimiento ovárico en la rata van acompañados de un aumento significativo en los niveles de KISS en el ovario. En base a esto, se postuló que “el aumento de kisspeptina endógeno produce la disminución de la expresión del transcrito y/o actividad de las metaloproteinasas de matrizextracelular-2 y -9 en el ovario en el periodo de subfertilidad en ratas”. El objetivo general del trabajo consisitió en caracterizar el patrón de expresión de los mRNAs de Kiss-1, MMP-2 y MMP-9 y los niveles de actividad proteolítica en ovarios de ratas fértiles y subfértiles en diferentes etapas del ciclo estral, y estudiar el efecto de la adición del péptido KP-10 y del bloqueo de su receptor con el antagonista p234 sobre la expresión y actividad de estas MMPs. Para llevar a cabo este objetivo, se obtuvieron ovarios en distintas fases del ciclo estral y, a partir de ellos, se estudiaron los niveles de mRNA de Kiss-1, MMP-2 y MMP-9 mediante RT-qPCR, y los niveles de actividad gelatinásica mediante zimografía. Además, se realizaron incubaciones in vitro de ovarios de ratas de 6, 8 y 10 meses de edad en presencia del péptido KP-10 y de KP-10 + p234 y, a partir de éstos, se estudiaron los niveles de mRNA de MMP-2 y MMP-9 y los niveles de actividad gelatinásica. Los resultados obtenidos en este trabajo mostraron que los niveles de mRNA de las gelatinasas varían de forma opuesta en el ciclo estral, lo que coincide con el rol fisiológico que se ha descrito para cada una de ellas en procesos como ovulación y formación del cuerpo lúteo. Además, se encontró que los niveles del mRNA de MMP-2 disminuyen de forma significativa en el ovario en el periodo de subfertilidad, probablemente como resultado de la disminución en el número de folículos antrales y cuerpos lúteos que se ha descrito a los 10 meses de edad en la rata. Por último, se encontró que los resultados no avalan la hipótesis planteada puesto que el tratamiento de los ovarios con el péptido KP-10 o con KP-10 + p234 no tuvo efecto sobre la expresión de los mRNAs de MMP-2 y MMP-9 en el periodo fértil ni en el subfértil. En el caso de MMP-2, tampoco se observó efecto a nivel de actividad. / There are currently greater possibilities of academic and professional development for women. This, coupled with ease of access to birth control methods, has led women to postpone motherhood to later ages. This situation has become a major problem for countries due to its economic, social, and public health consequences. Therefore, it is important to study the mechanisms involved in the process of reproductive aging. While the regulation of the ovarian function is widely known from the neuroendocrine point of view, little is known about the mechanisms that control it locally. It is believed that a group of peptides, known as kisspeptins (KISS), whose levels vary according to the progress of the estrous cycle, could be regulating the extracellular matrix metalloproteinases (MMPs) proteolytic system locally, similarly to what has been described in other tissues. If so, KISS could be cyclically regulating the ovarian extracellular matrix remodeling by controlling the MMP expression levels and/or activity. This would be especially important in the subfertility period, since it has been described that the morphological changes associated with the ovarian aging in the rat are accompanied with a significative increase in the ovarian KISS levels. Based on this, it was postulated that “the endogenous kisspeptin increase causes a decrease in the transcript expression and/or extracellular matrix metalloproteinases -2 and -9 activity in the ovary on the subfertility period in rats”. The main objective was to characterize the Kiss-1, MMP-2 and MMP-9 expression pattern and the gelatinolitic activity levels in ovaries of fertile and subfertile rats at different stages of the estrous cycle, and to study the effect of an addition of KP-10 peptide and the blocking of its receptor with p234 antagonist over the expression and activity of these MMPs. To carry out this objective, ovaries were obtained in different stages of the estrous cycle and, from them, the Kiss-1, MMP-2 and MMP-9 mRNA`s levels were studied by RT-qPCR, and the gelatinolytic activity levels by zymography. In addition, in vitro incubations of rat ovaries were performed with KP-10 peptide or with KP-10 peptide + p234 and, from these, the mRNA`s levels of MMP-2 and MMP-9 and the gelatinolytic activity levels were studied. The results obtained in this work showed that the gelatinases mRNA levels vary in an opposite way in the estrous cycle, which coincides with the physiological role that has been described for each of them in processes such as ovulation and formation of the corpus luteum. In addition, MMP-2 mRNA levels were found to decrease significantly in the ovary in the subfertile period, probably as a result of the decrease in the number of antral follicles and corpus luteum that has been described at 10 months old in the rat. Finally, it was found that the results do not support the postulated hypothesis since the treatment of the ovaries with the KP-10 peptide or with KP-10 + p234 had no effect on the MMP-2 and MMP-9 mRNA`s expression levels in the fertile or subfertile period. In the case of MMP-2 there was no effect in the activity levels

La búsqueda de nuevas enzimas capaces de ser empleadas en procesos industriales que puedan reemplazar a métodos químicos tradicionales es una actividad constante en la Biotecnología. Una vez detectado el biocatalizador con las propiedades buscadas, debe ser purificado para estudiar sus propiedades más relevantes y los factores que controlan su eficiencia en la aplicación deseada. Si bien la elección de la cepa microbiana adecuada es vital para la producción de dichas enzimas, el proceso de producción también resulta ser de gran importancia a la hora de escalar el proceso de producción. Las enzimas pécticas han sido utilizadas en diversas industrias desde hace más de medio siglo. La industria que más se ha beneficiado de ellas es la industria alimentaria. La mayor aplicación industrial de las pectinasas se encuentra en la industria procesadora de jugos de frutas, ayudando, junto con otro tipo de enzimas a optimizar los procesos de filtración y clarificación. Geotrichum klebahnii es un hongo levaduriforme que crece en medios sintéticos y produce una pectinasa capaz de solubilizar pectina a partir de residuos vegetales.

En Drosophila, el desequilibrio en cuanto al contenido de genes ligados al cromosoma X entre hembras (XX) y machos (XY) es corregido mediante la duplicación de la transcripción del único cromosoma X del macho. Este proceso, llamado compensación de dosis, es mediado por un ensamblaje molecular compuesto por al menos cinco proteínas (MSL1, MSL2, MSL3, MLE y MOF) y dos RNAs largos no codificantes (roX1 y roX2), llamado complejo de compensación de dosis (DCC). La compensación de dosis requiere dos condiciones fundamentales: el reconocimiento específico del cromosoma X por el DCC, y la restricción del proceso a moscas macho. La proteína de unión a RNA Upstream-of-N-Ras (UNR) está implicada en la consecución de ambas condiciones, y aquí hemos estudiado los mecanismos moleculares por los que UNR actúa. Hemos encontrado que, en machos, UNR promueve la compensación de dosis facilitando la asociación de roX2 a MLE, necesaria para una correcta formación del DCC y para su unión al cromosoma X. En hembras, UNR inhibe la compensación de dosis, al menos en parte, promoviendo la unión de SXL al extremo 3’ UTR del mRNA que codifica para msl2, lo que resulta en represión de la traducción de msl2 e inhibición de la formación del DCC. / In Drosophila, the imbalance in X-linked gene content between females (XX) and males (XY) is restored through the 2-fold hypertranscription of the single male X-chromosome. This process, which is called dosage compensation, is mediated by the action of the dosage compensation complex (DCC), a ribonucleoprotein assembly composed of at least five proteins (MSL1, MSL2, MSL3, MLE and MOF) and two long non-coding RNAs (roX1 and roX2). Two features are essential for correct dosage compensation: the specific recognition of the X-chromosome by the DCC and the confinement of the DCC function to the male organism. The RNA binding protein Upstream of N-ras (UNR) is involved in the regulation of these two processes and we have dissected the molecular mechanisms by which this regulation occurs. We have found that, in male flies, UNR promotes dosage compensation by facilitating the association of roX2 with MLE, which is required for correct DCC formation and X-chromosome targeting. In female flies, UNR represses dosage compensation in part by enhancing the binding of SXL to the 3’UTR of msl2 mRNA, thus ensuring tight msl2 translational repression and subsequent inhibition of DCC formation.

Las proantocianidinas ejercen efectos beneficiosos sobre algunos desordenes metabólicos que se consideran factores de riesgo de las enfermedades cardiovasculares. La desregulación del metabolismo lipoproteico juega un papel muy importante en los estados lipídicos alterados. Por lo tanto, los objetivos de esta Tesis fueron: estudiar la contribución del hígado y el intestino en la respuesta hipolipidémica de las proantocianidinas y evaluar los efectos de las proantocianidinas en modelos dislipidémicos nutricionales. Para realizar los experimentos se utilizaron tres modelos experimentales: ratas, ratones y células Caco2. Los resultados obtenidos fueron: que en un test de tolerancia lipídica tanto los quilomicrones como las VLDL contribuyen al efecto hipotrigliceridémico de las proantocianidinas pero su influencia depende del tiempo. Además, las proantocianidinas reprimen la secreción de TG por el hígado in vivo y por el intestino in vitro. ACSL se manifiesta como un gen diana de ellas en las células intestinales. Y finalmente, las proantocianidinas corrigen la dislipidemia pero no contrarrestan la ganancia de peso inducida por la dieta aunque estas tienen un efecto bimodal sobre la retención de energía in vivo. / Proanthocyanidins have been shown to exert advantageous actions on several metabolic disorders that are risk factors of cardiovascular diseases. Lipoprotein metabolism plays an important role in altered lipid states. Therefore, the aims of this Thesis were: To assess the contribution of the liver and the intestine in the hypolipidemic response triggered by proanthocyanidins and to evaluate the short-term effect of an oral intake of proanthocyanidins in dyslipidemic nutritional models. For these purposes, three experimental models have been used: Rats, mice and human Caco2 cells. The obtained results are: In a fat tolerance test, both chylomicrons and VLDL contribute to the hypotriglyceridemic action of proanthocyanidins but their influence depends on time. Moreover, proanthocyanidins repress TG secretion by the liver in vivo and by the intestine in vitro. Furthermore, ACSL manifests as their target gene in intestinal cells. Finally, proanthocyanidins correct dyslipidemia but not the weight gain induced by diet though these have a bimodal effect on energy retention in vivo.

Human color perception is mediated by cone photoreceptor cells which mainly locate on the fovea of the eye. Bright light activates the photosensitive opsin pigments which are embedded in the outer segment membrane discs of cone retinal cells thereby initiating the complex process of photopic vision with a fast response. The cone visual pigments are G-protein coupled receptors which share analogous structure and functional features with rhodopsin, the most thoroughly studied G-protein coupled receptor from rod photoreceptor cells mediating scotopic vision and distributed throughout the retina. These visual pigments modulate spectral tuning of visible light depending on the molecular variance around the protein bound chromophore, 11-cis-retinal, which is a vitamin A derivative acting as an inverse agonist. Various mutations have been clinically identified in the cone opsin genes and associated with visual dysfunction ranging from mild color blindness to severe cone dystrophies. As the crystal structure of the cone pigments is yet to be resolved, identifying key molecular mechanisms that play major roles in optimal functioning of these photoreceptor proteins, should be helpful in providing a deeper understanding of their function and in designing novel therapeutic strategies for congenital retinal cone dysfunction. In order to study such light sensitive, delicate membrane proteins, the human cone opsin genes have been transiently expressed in mammalian cells, regenerated with their natural chromophore and immunopurified in dark conditions. The purified recombinant chromophore-regenerated cone opsins in solution have been characterized in detail by means of biophysical approaches, including spectroscopic, biochemical, and functional analysis, in order to uncover novel properties that help in optimizing the function of these receptors. Site-directed mutagenesis was employed to obtain the clinically identified mutations in cone opsins related to visual disorders and to compare the structure and function of these mutated opsins with the molecular properties of the wild-type cone opsins expressed in the same way. The results of the present study indicate that the cone opsins are less stable in solution and their retinal binding site is more open than rhodopsin. The ligand binding studies using retinal analogs, show that the photoactivated rhodopsin loses its ability to regenerate with its natural chromophore with time but not with an analog, 9-cis-retinal but cone opsin shows regeneration with both retinal analogs under the same experimental conditions. The highly identical red and green cone opsins exhibit different ligand binding modes during regeneration with their natural chromophore, 11-cis-retinal. A secondary retinal uptake, with a slower kinetics, has been also observed with the red and green cone pigments during regeneration with 11-cis-retinal which is altered in the case of blue cone opsin. The role of specific amino acids involved in the regeneration mechanism has also been clarified. Most of the cone opsin mutants studied, associated with visual disorders, fail to regenerate with the ligand due to protein misfolding resulting in aggregation in solution. R330Q green cone opsin mutant show a regeneration ability similar to that of the native pigment but a compromised transducin binding efficiency. Though the N94K deuteranopic mutant apparently aggregates when expressed in mammalian, chromophore binding to opsin would be through an unprotonated Schiff base linkage. Overall, in the present study the molecular properties of cone opsins have been compared among them and with the well-studied rhodopsin. This has led to the proposal of novel molecular mechanisms for cone opsins. The determined structural differences between visual pigments may be linked to their molecular evolution, and the proposal of secondary retinoid binding to visual pigments may function as a regulatory mechanism of dark adaptation. / La percepción del color humano se realiza a través de las células fotorreceptoras de los conos, localizados en la fóvea del ojo. La luz brillante activa los pigmentos fotosensibles que se encuentran en los discos de membrana del segmento externo de estas células iniciando con ello el complejo y rápido proceso de la visión fotópica. Los pigmentos visuales conos son receptores acoplados a proteínas G (GPCR) que comparten estructura análoga y características funcionales a la rodopsina, el GPCR más estudiado y localizado en las células fotorreceptoras de los bastones y responsable de la visión escotópica . Estos pigmentos visuales modulan la sintonización espectral de la luz visible, dependiendo de las diferencias moleculares alrededor del cromóforo ligado a la proteína, 11-cis-retinal, que es un derivado de la vitamina A y que actúa como un agonista inverso. Varias mutaciones han sido identificadas clínicamente en los genes de las opsinas de los conos asociadas a disfunciones visuales; desde la leve ceguera al color a la grave distrofia de las células fotorreceptoras. Como la estructura cristalina de los pigmentos de los conos está todavía por resolver, identificar mecanismos moleculares que juegan un papel importante en el funcionamiento óptimo de estas proteínas, ayudará a obtener una comprensión más profunda de su función y al diseño de nuevas estrategias terapéuticas para la disfunción congénita de los conos. Con el fin de estudiar estas proteínas de membrana sensibles a la luz y delicadas, se han expresado transitoriamente en células de mamífero, regenerado con su cromóforo natural, inmunopurificado en oscuridad y se han caracterizado por medio de técnicas biofísicas, bioquímicas, y funcionales, a fin de descubrir nuevas propiedades que ayuden a la optimización de su función. Mutagénesis dirigida se ha utilizado para obtener las mutaciones clínicamente identificados en opsinas de conos relacionados con los trastornos visuales y comparar la estructura y la función de estas opsinas mutadas con las propiedades moleculares de opsina de conos cono salvaje. Los resultados del presente estudio indican que las opsinas de los conos son menos estables y su sitio de unión al retinal es más abierta que en la rodopsina. Estudios de unión al ligando utilizando análogos del retinal, muestran que la rodopsina fotoactivada pierde su capacidad de regenerarse con su cromóforo natural con el tiempo, aunque la mantiene con el análogo 9-cis-retinal, comparado con la regeneración de los conos, que pueden hacerlo con ambos análogos de retinal. Las altamente idénticas opsinas de conos rojo y verde muestran modos de unión diferente al ligando durante la regeneración con su cromóforo natural, 11-cis retinal. También se ha observado una captación secundaria de retinal, con una cinética más lenta, con los pigmentos de los conos rojos y verdes durante la regeneración con 11-cis-retinal que se altera en el caso de los conos azules. También se discute el papel de los aminoácidos específicos implicados en el mecanismo de la regeneración. La mayoría de los mutantes estudiados, no logran regenerar con el ligando debido al mal plegamiento proteico. El cono verde R330Q muestra una capacidad de regeneración similar a la del pigmento nativo, pero con una baja eficacia de unión a la proteína G, transducina. Aunque inicialmente el mutante N94K parece agregado cuando se expresa en células de mamífero, el cromóforo que se une a la opsina a través de una base de Schiff no protonada. En general, este estudio compara las propiedades moleculares de las opsinas de conos entre ellos y con la rodopsina, proponiendo nuevos mecanismos moleculares para las opsinas de conos. Las diferencias estructurales entre determinados pigmentos visuales pueden estar relacionados con su evolución molecular, y la propuesta de la unión secundaria de retinal a estos pigmentos visuales puede funcionar como un mecanismo de regulación de la adaptación a la oscuridad.

La malaltia del fetge gras no alcohòlic (MFGNA) inclou un espectre histològic que va des de la esteatosi simple (SS) a l'esteatohepatitis no alcohòlica (EHNA), sent aquesta última freqüentment progressiva. Donat que l'acumulació hepàtica de lípids sembla ser un mecanisme crucial en la patogènesi de la MFGNA, una millor comprensió dels mecanismes subjacents que condueixen a l'acumulació inicial de lipíds hepàtics podria ser de gran interès per controlar la progressió de la malaltia. El sistema endocannabinoide (SE), mitjançant principalment els receptors cannabinoides CB1 i CB2, sembla ser que juga un paper important en la patogènesi de la MFGNA modulant el metabolisme lipídic. Així, la hipòtesi establerta és que, en pacients amb MFGNA, l'expressió de gens i factors de transcripció implicats en la regulació del metabolisme lipídic hepàtic, així com l'expressió dels receptors cannabinoides pot estar alterada; i aquesta alteració podria estar relacionada amb l'aparició de dany hepàtic. En conseqüència, vam evaluar l'expressió hepàtica d'alguns gens clau involucrats en la síntesi de novo d'àcids grassos (AG), captació i transport d’AG, oxidació d’AG, inflamació, així com l’expressió de CB1 i CB2 en una extensa cohort de dones obeses mòrbides amb MFGNA segons la seva histologia hepàtica. La principal troballa ha estat que, en el fetge de dones obeses mòrbides amb SS, els gens clau involucrats en la síntesis de novo d’AG presenten una relació inversa amb el grau histològic d’esteatosi, suggerint que la via lipogènica podria estar disminuïda en etapes avançades d’SS. Respecte al SE, els nostres resultats suggereixen un paper perjudicial de CB1 en la MFGNA, mentre que el rol de CB2 no és del tot aclarit. / La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) incluye un espectro histológico que va desde la esteatosis simple (SS) a la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), siendo esta última frecuentemente progresiva. Dado que la acumulación hepática de lípidos parece ser un mecanismo crucial en la patogénesis de la EHGNA, una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes que conducen a la acumulación inicial de lípidos hepáticos podría ser de gran interés para controlar la progresión de la enfermedad. El sistema endocannabinoide (SE), mediado principalmente por los receptores cannabinoides CB1 y CB2, parece juegar un papel importante en la patogénesis de la EHGNA modulando el metabolismo lipídico. Así, la hipótesis establecida es que, en pacientes con EHGNA, la expresión de genes y factores de transcripción implicados en la regulación del metabolismo lipídico hepático, así como la expresión de los receptores cannabinoides puede estar alterada; y esta alteración podría estar relacionada con la aparición de daño hepático. En consecuencia, evaluamos la expresión hepática de algunos genes clave involucrados en la síntesis de novo de ácidos grasos (AG), captación, transporte y oxidación de AG, inflamación, así como la expresión de CB1 y CB2 en una extensa cohorte de mujeres obesas mórbidas con EHGNA según su histología hepática. El principal hallazgo fue que, en el hígado de mujeres obesas mórbidas con SS, los genes clave involucrados en la síntesis de novo de AG presentan una relación inversa con el grado histológico de esteatosis, sugiriendo que la via lipogénica podría estar disminuida en estadios avanzados de esteatosis. Respecto al SE, nuestros resultados sugieren un papel perjudicial de CB1 en la EHGNA, mientras que el papel de CB2 no es del todo esclarecido. / Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) encompasses a histological spectrum from simple steatosis (SS) to non-alcoholic steatohepatitis (NASH), with the latter being more frequently progressive. Due to lipid accumulation in the human liver seems to be a crucial mechanism in the NAFLD pathogenesis, an improved understanding of the underlying mechanisms leading to the initial hepatic lipid accumulation could be of great interest for controlling the progression of NAFLD. It has also been reported that the endocannabinoid (EC) system, mediated mainly by CB1 and CB2 cannabinoid receptors, plays an important role in NAFLD pathogenesis by modulating lipid metabolism. We therefore hypothesized that in patients with NAFLD, the expression of genes and transcription factors involved in the regulation of hepatic lipid metabolism, as well as the expression of cannabinoid receptors could be altered; and this alteration may be related to the onset of liver damage. Consequently, we wished to further investigate the fatty acid (FA) metabolism and the EC system by evaluating the hepatic expression of some key genes involved in de novo synthesis FA, FA uptake and transport, FA oxidation, and inflammation; as well as CB1 and CB2 expression in an extensive cohort of morbidly obese (MO) women according to their liver histology. The major finding is that, in liver of MO women with SS, the key genes related to de novo fatty acid synthesis have an inverse relationship with the histological degree of simple steatosis; suggesting that the lipogenic pathway seems to be down-regulated in advanced stages of SS. Regarding the EC system, our results suggest a deleterious role of CB1 in NAFLD, while the role of CB2 is not fully clarified.

Protein-DNA interactions are indispensable players in the daily activities of cells. DNA-binding proteins regulate gene expression and are responsible of DNA replication, packaging, repair and recombination. Among them, transcription factors activate/repress gene transcription by binding to specific genomic sites. Hence, the characterization of transcription factor binding sites turns out to be crucial in order to understand gene regulation. In this context, the development of computational tools is foremost. Here, I show the prediction of redundant transcription factors in yeast using a combination of homology-based tools and protein-protein interactions. The approach was automated and incorporated into ModLink+, an online and user-friendly tool to infer the fold of remote homologs. Moreover, I describe split-statistical potentials for protein-DNA interactions. Finally, I present SHAITAN, a statistical/homology-based approach that can be used to both predict transcription factor binding sites and infer the more likely transcription factors to bind a DNA sequence of interest. / Les interaccions proteïna-ADN són indispensables en l’activitat diària de les cèl•lules. Les proteïnes que participen en aquestes interaccions s’encarreguen de la regulació de l'expressió gènica i són responsables de la replicació, l'empaquetament, la reparació i la recombinació de l’ADN. Entre aquestes proteïnes, els factors de transcripció activen/reprimeixen la transcripció de gens mitjançant la unió a llocs específics dins el genoma. Per tant, la caracterització dels llocs d'unió dels diferents factors de transcripció és crucial per tal d’entendre com funciona la regulació gènica. En aquest context, desenvolupar eines computacionals és importantíssim. En aquesta tesi predict redundància entre factors de transcripció de llevat eines fent servir eines basades en homologia i interaccions proteïna-proteïna. Aquesta aproximació va ser automatitzada i incorporada a ModLink+, una eina accessible des d’internet i fàcil d'usar per a inferir el plegament de proteïnes a partir d’homòlegs remots. D'altra banda, descric potencials estadístics fraccionats per a interaccions proteïna-ADN. Finalment presento SHAITAN, una aproximació basada en homologia i potencials estadistics que pot ser utilitzada per a predir els llocs d'unió de factors de transcripció així com per saber quins factors de transcripció són més probables que s’uneixin a una determinada seqüència d'ADN.