Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al Título de Bioquímico / El poblamiento de la Polinesia corresponde al último proceso de colonización humana del planeta en tierras inhabitadas. Éste es un tema de gran interés debido a que aún existen interrogantes, como por ejemplo: ¿Hubo uno o más eventos colonizadores? y ¿Cuáles fueron las rutas seguidas por los viajeros? Las primeras investigaciones fueron abordadas mediante técnicas arqueológicas y lingüísticas, siendo posteriormente complementadas con el uso de marcadores moleculares. Muchos estudios de poblamiento humano mediante marcadores moleculares están orientados al estudio del ADN humano de poblaciones actuales, sin embargo, en Polinesia las poblaciones fueron severamente diezmadas producto del contacto europeo y los habitantes actuales no necesariamente son representativos de las poblaciones originales. Por esta razón se han buscado alternativas al análisis de muestras humanas, como es el estudio de especies comensales asociadas al hombre. Entre estas especies se encuentra Broussonetia papyrifera, una especie vegetal nativa de Asia, que fue introducida en la Polinesia por los grupos colonizadores dada su importancia como materia prima para la fabricación de textiles. En base a estos antecedentes, se plantea la siguiente hipótesis: “El estudio de polimorfismos genéticos mediante marcadores moleculares de sexo y SSR en individuos de Broussonetia papyrifera provenientes de Asia y distintas islas del Pacífico, permite identificar el sexo de los individuos, así como también identificar poblaciones genéticamente diferentes, que proporcionen información para dilucidar rutas de dispersión por acción antrópica para la comprensión del proceso de colonización de Oceanía Remota”. Los análisis con marcadores moleculares se realizaron con el material genético de un banco de ADN genómico, el cual fue construido durante el desarrollo de esta tesis. Este banco genómico se desarrolló a partir de muestras foliares contemporáneas de 191 individuos diferentes de B. papyrifera, provenientes de 3 países de Asia y 9 islas o grupos de islas, comprendiendo numerosas localidades de Polinesia. Los análisis de la identificación del sexo de las muestras del banco genómico, se realizaron tras la implementación de un método de análisis para la caracterización del sexo de los individuos de B. papyrifera. El diseño de este método incluyó un marcador SCAR desarrollado en esta tesis, el cual identifica a individuos de sexo masculino. Los análisis de identificación de sexo mostraron la presencia exclusiva de individuos femeninos en la totalidad de las localidades de la Polinesia, excepto en Hawái, donde se observó la presencia de individuos de ambos sexos, en una proporción similar a la observada en las localidades asiáticas analizadas. Estos resultados sugieren una historia de colonización o dispersión diferente y más compleja para Hawái, que de las demás localidades analizadas de la Polinesia. La genotipificación de los individuos de Polinesia se realizó con marcadores de microsatélites específicos para B. papyrifera, la mayoría desarrollados en el marco de este trabajo. Se seleccionó una batería de 14 marcadores SSR que se aplicó a los individuos de Asia y Polinesia. En Asia se encontró gran diversidad genética (96,6%), en cambio hay una baja diversidad genética (20,5%) entre las muestras polinésicas analizadas. A pesar de encontrar una diversidad genética reducida, se logró identificar poblaciones diferentes al interior de la Polinesia, demostrando la validez de la hipótesis de este estudio. El análisis de las poblaciones identificadas mediante la genotipificación sirvió para establecer relaciones entre éstas, las cuales permitieron inferir probables rutas de dispersión y poblamiento. Se identificó a la población de Taiwán como posible ancestro de las poblaciones polinésicas, lo cual es concordante con datos de la literatura. Se encontró que las poblaciones provenientes de Polinesia occidental se diferencian de las de Polinesia oriental. Además los individuos de B. papyrifera masculinos encontrados en Hawái presentan una gran distancia genética con las restantes poblaciones polinésicas, sugiriendo un segundo proceso de colonización, sin descartar migraciones en periodos históricos. En resumen, se identificó diversidad genética en poblaciones de B. papyrifera actuales, procedentes de las islas de la Polinesia, validando el uso de los marcadores moleculares propuestos. Aún más importante, es que esta investigación reafirma la utilización de B. papyrifera como un buen modelo comensal para el estudio del poblamiento humano de la Polinesia / The settlement of Polynesia was the last process of human colonization of unhabited lands. This is a topic of great interest as there are still questions such as: Were there one or more colonization events? and What were the routes taken by early settlers? Research in this area was initially addressed by archaeological and linguistic techniques, and later supplemented by the use of molecular markers. At first, molecular marker analyses were oriented towards the study of contemporary human populations. However, due to European contact, populations were severely depleted and the current inhabitants are not necessarily representative of the original populations. For this reason, alternatives to the analysis of human samples, as is the study of commensal species associated with man, have been used. Among these species is Broussonetia papyrifera, a native plant from Asia that was introduced into Polynesia by the early colonizing groups, as a raw material for the manufacture of textiles. Based on this context, the following hypothesis is proposed: "The study of genetic polymorphisms using molecular markers of gender and SSR in individuals of Broussonetia papyrifera from Asia and various Pacific islands identifies the sex of individuals and genetically distinct populations, and provides information to propose possible dispersal routes by human action for understanding the process of colonization of Remote Oceania". The molecular marker analyses were performed with the genetic material of a genomic DNA bank, which was built during this thesis. This genomic DNA bank was developed from contemporary leaf samples of 191 individuals of B. papyrifera, from three Asian countries and nine islands or island groups in Polynesia. Analyses of sex identification were conducted after the implementation of an accurate method for determining the sex of B. papyrifera individuals. The design included a SCAR marker developed in this thesis, which identifies male individuals. Results of sex identification showed the exclusive presence of female individuals in all localities in Polynesia, except in Hawaii, where the presence of individuals of both sexes were observed in a similar proportions, as observed in the Asian locations analyzed in this work. These results suggest a different and more complex dispersal history for B. papyrifera in Hawaii, compared to all other Polynesian locations analyzed. B. papyrifera microsatellite markers were developed within the scope of this project, and were used in conjunction with other specific SSR markers. Genotyping was performed with a set of 14 SSR markers of samples from the Asian and Polynesian regions. Asian samples exhibited high genetic diversity (96,6%), while low genetic diversity (20,5%) was detected among the Polynesian samples. Nonetheless, different populations within Polynesia were identified, providing positive evidence for the hypothesis of this study. Relationships derived from the genotyping analysis of the identified populations, allowed inferring possible dispersal routes of during human settlement. We identified the population of Taiwan as a possible ancestor of the Polynesian samples, which is consistent with the literature. We found that populations from western Polynesia differ from those of Eastern Polynesia. Furthermore, the male individuals of B. papyrifera found in Hawaii are genetically distant from the other Polynesian populations, suggesting a second process of colonization or migration, which may have occurred even during historical periods. To summarize, genetic diversity was identified in contemporary B. papyrifera populations from the islands of Polynesia, validating the use of the proposed molecular markers. Even more importantly, this research strengthens the use of B. papyrifera as a commensal model for the study of human settlement of Polynesia / Proyecto FONDECYT 1120175

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica, área de especialización Proteínas Recombinantes, y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La regulación de la expresión génica es un evento crucial para el músculo esquelético, ya que determina la homeostasis y la plasticidad muscular, permitiendo la remodelación y transformación del músculo para adaptarse a distintos estímulos. La actividad eléctrica regula la expresión de diferentes genes del músculo esquelético por medio de un proceso conocido como “Acoplamiento Excitación-Transcripción”. Se ha demostrado recientemente que el ATP extracelular es un mediador esencial entre la estimulación eléctrica, la liberación transitoria de calcio intracelular y la expresión de genes en el músculo esquelético. Considerando que la regulación de la expresión génica esta mediada por la despolarización de la membrana plasmática, la consecuente liberación de ATP y la activación de vías de señalización intracelulares, este trabajo propone la existencia de un complejo multiproteico en la membrana del túbulo-T, que favorecería la adecuada coordinación entre el sensor de voltaje (Receptor de dihidropiridina, DHPR), el canal Panexina-1 (Panx1, liberador de ATP), receptores purinérgicos (P2Y), otras proteínas de membrana como Distrofina y otras moléculas intracelulares involucradas en la transducción de esta señal, como PI3Kγ. Actualmente se sabe que diversos procesos de señalización celular son regulados por complejos multiproteicos, un conjunto de proteínas asociadas para coordinar los distintos pasos en una vía de transducción de señal. Trabajo previo del laboratorio ha demostrado que DHPR interacciona con el canal de Panx1. El objetivo general de esta tesis fue identificar nuevos componentes del complejo multiproteico que regula el Acoplamiento Excitación-Transcripción, en células de músculo esquelético L6 que expresan el canal Panexina-1 recombinante y en preparación de triadas de músculo esquelético de ratón, mediante experimentos de co-inmunoprecipitación, electroforesis bidimensional BlueNative, inmunofluorescencia indirecta y ensayos de ligación por proximidad in situ. Los resultados obtenidos mostraron que el canal Panx1 interactúa con DHPR y P2Y2 en la membrana del túbulo-T. Además, por medio de co-inmunoprecipitación y ensayos de ligación por proximidad, demostramos que las proteínas Distrofina, Caveolina-3 y PI3Kγ también forman parte del complejo multiproteico que regularía el Acoplamiento Excitación- Transcripción, en mioblastos y miotubos de células L6 que sobre-expresan el canal Panx1 recombinante. Los análisis de colocalización realizados en miotubos de células L6-Panx1 mostraron una asociación entre Panx1-DHPR, Panx1-PI3K y Cav-3-Panx1, considerando coeficientes de Manders superiores al 50% de colocalización. Al resolver triadas de ratón usando la técnica de electroforesis bidimensional BlueNative SDS-PAGE, se demostró la presencia de un complejo multiproteico que contiene a las proteínas Panx1, Cav-3 y DHPR. Además, se logró identificar DHPR a partir de complejos aislados mediante la primera dimensión del BlueNative, mediante espectrometría de masas. Este estudio aporta nueva información respecto de cómo se organizan las proteínas relacionadas con la plasticidad muscular, que participan en el al Acoplamiento Excitación- Transcripción en el músculo esquelético. El entendimiento de este fenómeno tiene importantes implicancias en procesos fisiológicos, como la respuesta del músculo frente al ejercicio, y también con procesos patológicos que afectan al músculo esquelético como la sarcopenia y las distrofias musculares. Los resultados obtenidos en esta Tesis permiten abrir nuevas áreas de investigación relacionadas con el estudio de la relación entre el acoplamiento Excitación-Transcripción y la fisiopatología musculoesquelética / Gene expression regulation is a crucial event for skeletal muscle, because determines muscle homeostasis and plasticity that allows muscle remodeling for adapting to environmental demands. Electrical activity regulates the expression of an important number of skeletal muscle genes in a process known as “Excitation-Transcription Coupling”. We have previously demonstrated that extracellular ATP is a relevant mediator between electrical stimulation, intracellular calcium transients and gene expression in skeletal muscle cells. Considering gene expression regulation is mediated by sarcolemma depolarization, ATP release and specific signaling pathways activation, this work propose the assembly of a multiprotein complex in T-tubules, allowing the proper coordination between the voltage sensor (dihydropyridine receptor, DHPR), the pannexin channel (Panx1; ATP release conduit), the P2Y nucleotide receptors, other membrane proteins such as Dystrophin, and several intracellular molecules involved in signal transduction, such as PI3Kγ. It is currently known that several cell signaling processes are mediated by multiprotein complexes, a cluster of proteins associated to achieve coordinated steps in a transduction pathway. Previous work in our laboratory has shown a likely protein-protein interaction between Panx1 and DHPR. The general aim of this thesis was to identify new molecular components of the multiprotein complex associated to Excitation-Transcription Coupling, in L6 skeletal muscle cells which stably express a recombinant Panx1, and in mouse triads preparation. We used co-immunoprecipitation, two-dimension Blue Native electrophoresis, indirect immunofluorescence and proximity ligation in situ assays. Our results showed a well-defined protein-protein interaction between the Panx1 channel, DHPR and P2Y2 receptor. Moreover, co-immunoprecipitation and Proximity ligation assay results, identified the proteins Dystrophin, Caveolin-3 and PI3Kγ as participants of the multiprotein complex involved in Excitation-Transcription coupling, both in myoblasts and myotubes of L6 skeletal muscle cell line, stably expressing recombinant Panx1 protein. The co-localization assays showed a well-defined association between Panx1-DHPR, Panx1- PI3K and Panx1-Cav-3, considering Manders’s coefficients higher than 50%. Triads samples resolution using BlueNative SDS-PAGE electrophoresis, evidenced a multiprotein complex containing DHPR, Panx1 and Cav-3. Furthermore, we identified DHPR by mass spectrometry, by complex isolation from 1D BlueNative gels. This study provides new information about the organization of the proteins related to muscle plasticity, involved in the Excitation-Transcription Coupling in skeletal muscles. The understanding of this process has relevant implications in physiological processes, such as the muscle response to exercise, and in pathological processes like sarcopenia and muscular dystrophies. Results emanated from this Thesis will allow opening new research areas related to clarify the association between Excitation-Transcription coupling and skeletal muscle physiopathology / Fondecyt Regular Nº 1110467; Fondecyt de Iniciación N° 11100454; Proyecto Anillo ACT N° 1111; Beca CONICYT N°22120686

Memoria para optar el título de Bioquímico / Los organismos regulan su número de células a través de un balance entre la división y muerte celular. Con respecto a este último, existen diversos mecanismos de muerte celular, como la apoptosis, autofagia y necrosis, presentando cada uno características morfológicas y moleculares diferentes. Se ha considerado a la necrosis como un mecanismo de muerte celular “accidental” y, por tanto, menos regulado. Sin embargo existen evidencias de que la necrosis también puede ser considerada un tipo de muerte celular programada. Es así que las ceramidas, precursores de los esfingolípidos eucariontes, han sido reconocidas como importantes segundos mensajeros implicados en el gatillamiento de procesos apoptótico/necróticos en diversos tipos celulares. Recientemente se ha descrito que células de linfoma B humano (línea celular A20) al ser estimuladas con ligando de Fas en presencia de ceramidas van a un destino de muerte necrótico. Además de esto, se ha descrito una relación entre estrés oxidativo y la generación de ceramidas, relación que se encontraría íntimamente ligada a procesos de señalización de muerte celular. Con estos datos se postuló que las ceramidas intervienen en la decisión apoptóticonecrótica en células epiteliales. Utilizando métodos de citometría de flujo y ensayos enzimáticos se encontró que las ceramidas aumentaron la muerte por necrosis en el tiempo tanto para células HeLa como para HTC, este aumento es dosis dependiente. Ácido flufenámico, un inhibidor inespecífico de canales catiónicos no selectivos involucrados en regulación del volumen celular por estrés oxidativo, en conjunto con ceramidas no cambió el porcentaje de muerte por necrosis y aumentó la población apoptótica. Al reemplazar el Na+ extracelular por el catión monovalente NMDG+ no se observó diferencia entre los porcentajes de las distintas poblaciones celulares. La aplicación en conjunto de H2O2 con ceramidas aumentó la muerte celular, pero sólo a altas concentraciones (10 mM). El efecto de ceramidas sobre la apoptosis se ensayó utilizando el inhibidor genérico de caspasas zVAD-fmk. No hubo cambios significativos en los porcentajes de muerte celular. Efectos similares se observaron al depletar los depósitos intracelulares de calcio. Estos resultados permiten concluir que las ceramidas inducen muerte celular necrótica de manera tiempo y dosis dependiente / Organisms regulate their number of cells through fine a balance between cell division and cell death. In respect to cell death, diverse mechanisms exist, such as apoptosis, autophagia and necrosis, presenting each one different morphologic and molecular characteristics. Necrosis has been considered as a mechanism of "accidental" cell death and therefore, less regulated. Nevertheless, evidences exist of which necrosis can be also considered as a type of programmed cell death. For example, ceramides, precursors of sphingolipids in euchariotic cells, have been recognized as important second messengers implicated in the development of apoptotic/necrotic processes in diverse cell types. It has been recentely described that human lymphoma B cells (A20 cell line),upon stimulation with Fas ligand in the presence of ceramides, induce necrotic cell death. Also, it has been described a relationship between oxidative stress and the generation of ceramides which are intimately linked to cell death signaling processes. Based on this information, it was postulated that ceramides take part in the apoptotic-necrotic decision in epithelial cells. Using flow citometry and enzymatic assays we found that ceramides increased cell death by necrosis in HeLa and HTC cells in a dose-dependent manner. Flufenamic acid, a non specific inhibitor of nonselective cation channels involved in regulation of the oxidative stress-dependent cell volume, used in conjunction with ceramides did not produce changes in the percentage of necrotic cell death and increased the population of apoptotic cells. Upon replacement of external Na+ by the monovalent cation NMDG+, the percentage of different cell populations was not altered. The application of ceramides with H2O2 produced an increase in the cell death, but only at high concentrations of H2O2 (10 mM). The effect of ceramides upon apoptosis was assayed using the generic caspase inhibitor zVAD- fmk. No significant changes were observed in the percentage of cell death. Similar effects were observed when depleting the intracellular calcium stores. These results allow us to conclude that ceramides induces necrotic cell death in a time and dose-dependent manner

Orientador: Anibal Eugenio Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-09-11T20:50:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_RicardodeSouza_M.pdf: 4223365 bytes, checksum: 82e5b44995fcdb536317d9e0845feb37 (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: Mitocôndrias do fígado de rato quando acumulam 'CA POT. 2+¿ na presença de um prooxidante como diamida ou t-butilhidroperóxido apresentam um inchamento de grande amplitude e colapso do potencial de menbrana ('delta¿'psi¿). trifluoperazina, um neuroléptico da classe dos fenotiazínicos, em concentrações (15 ¿ 45 'um¿M) as quais não inibem a respiração ou o influxo de 'CA POT. 2+¿ para a mitocôndria, protege significativamente esta organela contra os efeitos deletérios do cátion mais um prooxidante. Em contraste a isto, em concentrações mais altas do que que 100 'um¿M a droga potencializa estes efeitos deletérios do cálcio e prooxidantes e tem efeito de danificar per se a membrana mitocondrial interna. É proposto que a proteção conferida pela droga é mediada por mudanças na estrutura tridimensional de proteínas de menbrana e que isto acarrete diminuição da produção de agregados protéicos, interligados por pontes dissulfeto, que ocorrem quando suspensões mitocondriais acumulam cálcio sob condições de estresse oxidativo. É proposto também que estes agregados estejam relacionados com o fenômeno de lipoperoxidação, pois é observado que a droga protege contra os efeitos deletérios induzidos pelo complexo citrato-'FE POT. 2+¿. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Isolated rat liver mitochondria undrego extensive swelling and disruption of membrane potencial when they accumulate 'CA POT. 2+¿ in the presence of a prooxidant such as diamide or t-butylhydroperoxide. The phenothiazinic drug trifluoperazine, at concentrations (15-45 'mu¿M) which do not inhibit either respiration or the influx of 'CA POT. 2+¿ into mitochondria, significantly protects mitochondria against the deleterious effects of 'CA POT. 2+¿ and prooxidants and presents a damaging effect per se on the inner mitochondrial membrane. It is prosed that the protection conferred by the drug is mediated by changes in membrane proteins structure that decrease the production of protein thiol cross-linking that occurs when mitochondria accumulate calcium under oxidant stress conditions. It is also proposed that the protein aggregates are correlated with the lipid peroxidation, because it is observed that the drug protects against the deleterious effects induced by citrate-'FE POT. 2+¿ complex. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-23Bitstream added on 2014-06-13T19:40:30Z : No. of bitstreams: 1 marques_mr_dr_rcla.pdf: 786727 bytes, checksum: 5e266ea3b1d0d9113b6398a7289ad107 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Hoje em dia, em todo o mundo, existem algumas doenças responsáveis por uma grande taxa de mortalidade em humanos. Dentre essas doenças, pode-se destacar a tuberculose, infecção provocada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, que é a principal causa de morte em humanos devido a um único agente infeccioso. Dentre as prioridades para o combate à tuberculose, o desenvolvimento de novas drogas é premente para o desenvolvimento de um tratamento quimioterápico eficaz. Sob este aspecto, as enzimas da via do ácido chiquímico, representam bons exemplos da utilidade de tal abordagem aplicada a constituintes enzimáticos de uma rota metabólica. A via do ácido chiquímico é responsável pela síntese dos aminoácidos aromáticos, do ácido p-aminobenzóico e outros metabólitos essenciais, tais como ubiquinona, menaquinona e vitamina K. A via do chiquimato, encontrada em plantas, algas, fungos e bactérias, foi também encontrada recentemente em vários parasitas apicomplexos (Roberts et al.; 1998); entretanto, essa via metabólica não é encontrada em mamíferos. As enzimas Chiquimato Quinase e 5-Enolpiruvilchiquimato-3-Fosfato Sintase (EPSPS), a quinta e a sexta enzimas, respectivamente, nessa via metabólica, têm sido reconhecidas como alvos importantes para o desenvolvimento de herbicidas e drogas antibióticas. No presente estudo, a troca isotópica Hidrogênio / Deutério e a espectrometria de massas com ionização electrospray foram usadas para examinar as mudanças conformacionais em solução, sofridas pelas enzimas Chiquimato Quinase e 5- Enolpiruvilchiquimato-3-Fosfato Sintase (EPSPS) de Mycobacterium tuberculosis, tanto na presença como na ausência de alguns de seus ligantes. A incorporação de deutério foi observada para ambas as enzimas. Para a EPSPS, a apoenzima foi a forma que mais incorporou deutério... / Nowadays all around the world there are some diseases that cause a high index of human lethality. Among these it should be highlighted the infectious disease tuberculosis, which is the top deadly disease caused by only one agent, the bacteria Mycobacterium tuberculosis. As the currently available drugs are not suitable for the control of tuberculosis, it became vital the development of novel drugs for this purpose. Useful drugs are being developed to inhibit some enzymes of the shikimic acid pathway. This via is responsible for the synthesis of aromatic amino acids, such as the p-aminobenzoic acid and other essential metabolites, such as ubiquinone, menaquinone and K vitamin. The shikimate pathway exists in plants, algae, fungi, bacteria and was also found in some apicomplex parasites; however, it is not present in mammals. The Shikimate Kinase and 5-Enol-Pyruvyl-Shikimate-3-Phosphate Synthase (EPSPS), the fifth and sixth enzymes, respectively, present in this pathway, have been considered as important targets to development of herbicides and antibiotic drugs. In the present work the isotopic change Hydrogen/Deuterium and the electrospray ionization mass spectrometry were used to investigate the occurrence of conformational in both enzymes, in presence and absence of some of their ligands (substrates /inhibitors). The deuterium incorporation was observed in both enzymes. The apoenzyme of EPSPS, incorporated more deuterium then the enzyme complexed to phosphoenolpiruvate, which in turn incorporated more deuterium than the enzyme compled to glyphosate. The apoenzyme of Shikimate Kinase also incorporated more deuterium than the complexed form with magnesium chloride-shiquimic acid-ADP. In both enzymes, the regions less dynamics were those containing the amino acids residues of the binding sites of substrates and/or inhibitors... (Complete abstract click eletronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-11-26Bitstream added on 2014-06-13T19:19:50Z : No. of bitstreams: 1 gregio_apb_dr_arafcf.pdf: 2113336 bytes, checksum: b9ebdb1987717c610b020ac89d1288cf (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O provável fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado de arqueas a mamíferos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial, em que uma lisina específica é convertida em um resíduo de hipusina. Este fator já foi relacionado a início de tradução, transporte nucleocitoplasmático, decaimento de mRNA e proliferação celular, mas a função crítica de eIF5A na célula ainda não foi totalmente esclarecida. Ainda que o papel de eIF5A na tradução geral tenha sido questionado, dados recentes de nosso laboratório, incluindo os resultados deste trabalho, restabelecem uma função para eIF5A na tradução e evidenciam a sua atuação na etapa de elongação ao invés de início. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi ampliar os estudos do papel de eIF5A na síntese proteica. Para isso, foram realizadas análises de interação genética e de perfil polissomal de linhagens que combinam o alelo mutante de eIF5A, tif51A-3, e de fatores envolvidos na etapa de início (eIF4E, eIF3 e eIF5B) ou elongação (eEF2) da tradução. As análises de perfil polissomal utilizando mutantes duplos de eIF5A e de fatores de início de tradução mostram uma diminuição do efeito de perda de polissomos característico de mutantes de início de tradução. Além disso, o perfil polissomal de mutantes de eIF5A é bastante semelhante ao do mutante de elongação. Foi também observado que a depleção de eIF5A provoca uma diminuição significativa na síntese proteica total e um aumento no tempo de trânsito ribossomal, confirmando os resultados obtidos nas análises de perfil polissomal. Também foi avaliada a influência de eIF5A no processo de elongação da tradução utilizando-se repórteres contendo a IRES do vírus CrPV, a qual é independente de todos os fatores de início de tradução conhecidos. Foi observada uma diminuição... / The putative eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved from archaea to mammals, essential for cell viability and it is the only cellular protein known to contain the essential amino acid hypusine. eIF5A has also been involved with nucleocitoplasmatic transport, mRNA decay and cell proliferation, however its critical function in the cell is not completely understood. Although a role for eIF5A in general translation has been questioned, our recent findings, including those described in this study, showed that eIF5A has a function in protein synthesis and it is related with the elongation step of translation instead of initiation. Therefore, the aim of this study was to investigate the role of eIF5A in protein synthesis. For this purpose, we tested genetic interactions and performed polysomal profile analysis of yeast strains that combine the eIF5A mutant tif51A-3 with translation initiation (eIF4E, eIF3 and eIF5B) or elongation (eEF2) mutants. The polysome profile analysis of the double mutants of eIF5A and canonical initiation mutants showed a decrease in polysome run-off. In addition, the polysome profile of eIF5A mutant is quite similar to that of the eEF2 mutant. Also, we observed that the depletion of eIF5A causes a significant decrease in total protein synthesis and an increase of the average ribosomal transit time. These results are in agreement with the polysome profile data. The influence of eIF5A in translation elongation was also evaluated using reporters containing the CrPV IRES, which is independent of all factors known to be involved in translation initiation. We observed a decrease in IRES activity in the eIF5A and eEF2 mutants, when compared to the wild type. In addition, two other conditional eIF5A mutants (tif51AK56A and tif51AQ22H/L93F) which produce stable eIF5A at the restrictive temperature were also analyzed... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-15Bitstream added on 2014-06-13T19:01:10Z : No. of bitstreams: 1 barbosa_lcb_dr_araiq.pdf: 1542454 bytes, checksum: 327a840d830dd6df24f9ee9a47d53cff (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O sistema ParE-ParD é um sistema toxina-antitoxina bacteriano, sendo ParE a toxina e ParD a antitoxina. ParD é capaz de neutralizar a ação de ParE formando um complexo com o mesmo, o qual é eficaz na autorregulação do operon parDE. Estudos têm mostrado que a atividade tóxica de ParE ocorre inibindo a atividade da DNA girase, mas nenhum efeito desta proteína sobre a atividade da topoisomerase IV foi observado até hoje. Baseando-se na estrutura primária da toxina ParE de Escherichia coli, bem como nos escassos dados em relação a esta toxina, a meta deste trabalho foi a obtenção de peptídeos sintéticos baseados nesta proteína a fim de avaliar as sequências de aminoácidos responsáveis pela interação com as diferentes topoisomerases bacterianas, além de tentar isolar uma sequência polipeptídica com potencial atividade inibitória sobre essas enzimas. Utilizando modelagem molecular por homologia, um modelo tridimensional para toxina ParE de E. coli foi obtido e validado. Com base nos dados estruturais inferidos a partir do modelo da estrutura tridimensional de ParE, 12 peptídeos foram racionalmente desenhados e sintetizados pela metodologia da fase sólida. Ensaios de inibição in vitro da atividade de superenovelamento de DNA pela girase e de relaxamento de DNA pela topoisomerase IV foram realizados e indicaram que os peptídeos ParE3 (ParE 80-100), ParE8 (ParE 61-105), ParE10 (ParE 61-87) e ParE12 (ParE 61-79) atuam como bons inibidores de ambas enzimas. Ensaios de fluorescência intrínseca e anisotropia de fluorescência, empregando peptídeos sintéticos derivados de ParE, evidenciaram que o processo de inibição da atividade da DNA girase pela toxina ParE deve ocorrer por interação com a proteína GyrA da enzima. Foi iniciado neste trabalho os primeiros testes usando lipossomas como veículos... / The operon parDE encode a toxin-antitoxin system formed by ParE toxin and its antitoxin ParD. ParD is able to neutralize ParE action and is effective in autoregulation of the operon. Studies have shown that the toxic activity of the ParE occurs by inhibiting the activity of DNA gyrase, but no effect of this protein on the activity of topoisomerase IV has been observed yet. Based on the primary structure of the Escherichia coli ParE toxin, as well as the scarce data of this toxin, the aim of this work was to obtain synthetic peptides based on this protein in order to assess the amino acid sequences responsible for interaction with the bacterial topoisomerases, besides trying to isolate a polypeptide sequence with potential inhibitory activity against these enzymes. Using molecular homology modeling, a three-dimensional model for E. coli ParE toxin was obtained and validated. Based on structural data inferred from ParE threedimensional model, 12 peptides were rationally designed and synthesized by solid-phase method. Tests of inhibition of the supercoiling reaction of the DNA gyrase and inhibition of DNA relaxation by topoisomerase IV were performed and indicated that the peptides ParE3 (ParE 80-100), ParE8 (ParE 61-105), ParE10 (ParE 61 -87) and ParE12 (ParE 61-79) act as good inhibitors of both enzymes. Intrinsic fluorescence and fluorescence anisotropy assays, using synthetic peptides derived from ParE showed that inhibition process of activity of the DNA gyrase by ParE toxin must occur by interaction with the GyrA protein. In this work was started the first tests using liposomes as carrier vehicles for bioactive peptides derived from ParE. The peptides were efficiently encapsulated in soybean phosphatidyl choline liposomes. It was observed, although reduced, inhibition of bacterial growth when peptides encapsulated in liposomes were... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-30Bitstream added on 2014-06-13T20:41:05Z : No. of bitstreams: 1 apponi_lh_dr_araiq.pdf: 2630425 bytes, checksum: bd39235826e1f6c4a56f84fffab81fff (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A expressão gênica pode ser regulada em eucariotos em diversas etapas dometabolismo de mRNA, como transcrição, processamento, tradução e degradação. A estabilidade de mRNA é modulada por elementos presentes no transcrito e por proteínas ligantes de RNA associadas a esses elementos. Pub1 de S. cerevisiae é uma proteína citoplasmática capaz de estabilizar transcritos contendo elementos ricos em AU (ARE e ARE-like) ou elementos estabilizadores (STE). O presente trabalho identificou num rastreamento de duplo-híbrido a proteína Nab2 como ligante de Pub1. Nab2 é uma proteína nucleocitoplasmática essencial que regula o comprimento da cauda poli(A) e a exportação nuclear de mRNA. A interação entre Pub1 e Nab2 foi confirmada por co-purificação e ensaio de interação in vitro. Foi demonstrado também que essa interação é mediada pelo domínio de dedos de zinco presente na região C-terminal de Nab2. A análise da relação funcional entre essas duas proteínas revelou que Nab2, assim como Pub1, é capaz de modular a estabilidade de mRNA. A estabilidade do transcrito de RPS16B, mensageiro contendo sequência ARE-like e regulado por Pub1, é diminuída nos mutantes nab2- 1 e nab2-67. No entanto, a estabilidade do transcrito de GCN4, mensageiro contendo STE e também regulado por Pub1, não é afetada nos mesmos mutantes. Resultados semelhantes foram observados para outros transcritos contendo sequências ARE-like ou STE. Ainda, dados obtidos com um mutante da via NMD (?upf1) mostraram que esta via de decaimento não está envolvida com o mecanismo de estabilização de RPS16B mediada por Pub1 e Nab2. Uma análise mais profunda mostrou que a sequência ARE-like presente no mensageiro de RPS16B é necessária para a estabilização mediada por Nab2. A proteína Pub1 e seus domínios isolados foram produzidos e purificados, mas não foi possível a obtenção de cristais para... / Regulation of gene expression can occur at different levels of mRNA life cycle, including transcription, processing, translation and degradation. mRNA stability is modulated by elements in the mRNA transcript and their cognate RNA-binding proteins. Poly(U)-binding protein 1 (Pub1) is a cytoplasmic S. cerevisiae mRNA binding protein that stabilizes transcripts containing AU-Rich Elements (ARE and ARE-like) or Stabilizer Elements (STE). In a yeast two-hybrid screen, we identified Nuclear poly(A)-binding protein 2 (Nab2) as a Pub1-interacting protein. Nab2 is an essential nucleocytoplasmic shuttling mRNA binding protein that regulates poly(A) tail length and mRNA export. The interaction between Pub1 and Nab2 was confirmed by co-purification and in vitro binding assays. The interaction is mediated by the Nab2 zinc finger domain. Analysis of the functional link between these proteins reveals that Nab2, like Pub1, can modulate the stability of specific target mRNA transcripts. We find that the half-life of the RPS16B transcript, an ARE-likecontaining Pub1 target, is decreased in both nab2-1 and nab2-67 mutants. In contrast, GCN4, an STE-containing Pub1 target, is not affected. Similar results were obtained with other ARE- and STE-containing Pub1 target transcripts. Additionally, results obtained with a mutant of the NMD pathway (?upf1) showed that this pathway is not involved in the mechanism of RPS16B stabilization mediated by Pub1 and Nab2. Further analysis reveals that the ARE-like sequence is necessary for Nab2- mediated transcript stabilization. Full-length Pub1 and isolated domains were produced and purified, however, it was not possible to obtain protein crystals for tertiary structure determination. Taken together, these results suggest that Nab2 acts together with Pub1 to modulate mRNA stability and strengthen a model where nuclear events involved in mRNA biogenesis...(Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-27Bitstream added on 2014-06-13T20:01:23Z : No. of bitstreams: 1 frigieri_mc_dr_araiq.pdf: 1480583 bytes, checksum: 81dab6a7f6da1d10c98a3b59c3b167fd (MD5) / O Poli ácido glutâmico (PAG) é um poliaminoácido sintético formado por unidades repetitivas de glutamato, que apresentam grupos carboxilas ao longo de sua cadeia principal. A preparação de eletrodos de carbono vítreo modificados com filmes de PAG foi investigada utilizando-se três diferentes procedimentos: eletropolimerização do ácido glutâmico (MONO); deposição direta de poli ácido glutâmico (PAG) e poli ácido glutâmico:glutaraldeído (PAG:GLU) seguida de secagem a temperatura ambiente. Após secagem, o eletrodo modificado foi submetido a ciclos sucessivos entre -0,8 a +2,0 V sob velocidade de varredura de 100 mV s-1. O ácido ascórbico foi usado como composto modelo para os eletrodos modificados, os quais apresentaram um efeito eletrocatalítico na oxidação do mesmo. Os eletrodos modificados foram caracterizados por microscopia de força atômica (AFM) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS). O recobrimento sobre a superfície pela adição de PAG apresentou a melhor performance exibindo filmes nanoestruturados e uniformes com baixa resistência à transferência de carga. Os eletrodos modificados por filmes PAG foram usados para estudar a oxidação do flavonóide rutina. Os resultados mostraram um par de picos redox em +0,46/+0,43 V, usado para a pré-concentração da rutina. Uma curva analítica foi obtida no intervalo de 0,9 a 9,0 μmol L-1 e o método proposto foi aplicado para análise do antioxidante em formulação farmacêutica. Os eletrodos modificados por filmes PAG foram também usados para determinação de ácido cafêico. Um par de pico redox reversível em +0,42/+0,45 V foi obtido para o ácido cafêico em tampão B-R pH 3,5. O método foi aplicado para a determinação de ácido cafêico em amostra de vinho tinto, detectando nível de concentração de 34,8μg mL-1 sem tratamento prévio da amostra. Os filmes de PAG:GLU foram... / The poly glutamic acid (PAG) is a syntetic poliamonacid composed by repetitive glutamate units that shows carboxylic groups in the long of the principal chain. Films of PAG on the glassy carbon electrode was investigated by three diferents procedures: glutamic acid eletropomelimerization (MONO), direct deposition of the poly glutamic acid (PAG) and poly glutamic acid:glutaraldehyde (PAG:GLU), followed by drying at room temperature. After solvent evaporation, the modified electrode was submitted by cycles sucessives from -0.8 to +2.0 V at scan rate of 100 mV s-1. The ascorbic acid was used as a model compound in the modified electrodes, which presented an electrocatitic effect in the oxidation of the ascorbic acid. The modified electrodes were characterized by atomic force microscopy (AFM) and electrochemistry impedance spectroscopy (EIS). Coantings by poly glutamic acid onto the surface presented best performance by addition of PAG films that exhibits films nanostructured and uniforms with lower resistance to charge transfer. The modified electrode by PAG films were investigated to oxidation of rutin flavonoid. The results showed a redox pair of peaks at +0.46/+0.43 V, and linear analytical curve at 0.9 to 9.0 x 10-6 mol L-1. The method proposed was successful applied for rutin determination in pharmaceutical formulation. The modified electrode by PAG films was also used to determine cafeic acid. A reversible redox peak pair at +0.42/+0.45 V was obtained for cafeic acid at B-R buffer pH 3,5. The method was applied for cafeic acid determination in the red wine, where the concentration of the 34,8 μg mL-1 was obtained, without any pre-treatment of the sample. The PAG:GLU films onto the glass carbon electrode were also efficient to pre-concetrate and to determine amoxycilin (AMX) and doxorubicin (DXR) in human urine sample. Linear calibration graphs were obtained from 2,0 a 25,0 x 10-6 mol L-1...(Complete abstract click electronic access below)

A Doença do Xarope do Bordo é uma alteração metabólica hereditária caracterizada bioquimicamente pelo acumulo dos aminoácidos de cadeia ramificada e seus respectivos aminoácidos no sangue e nos tecidos destes pacientes. Os mecanismos patogênicos das alterações neurológicas presentes nos pacientes ainda são pouco conhecidos. Há evidências de que o metabolismo energético esteja alterado no cérebro dos pacientes. A creatinaquinase, enzima chave no metabolismo energético, está envolvida transporte e manutenção da energia cerebral. Neste trabalho investigamos a inibição da creatinaquinase pelos aminoácidos de cadeia ramificada in vitro em cérebro de ratos em desenvolvimento, nas concentrações semelhantes as encontradas no plasma destes pacientes. O mesmo efeito não foi verificado com os cetoácidos de cadeia ramificada. Verificamos ainda que este efeito também ocorreu em ratos tratados com leucina de forma crônica do 60 ao 210 dia, e de forma aguda quando tratados por 12 horas com intervalos de três horas. Os parâmetros cinéticos estudados mostraram um Km baixo (0,8 – 1,4 mM) para a fosfocreatina como substrato, cuja variação no cérebro oscila entre 4 a 8 mM. Assim nas condições fisiopatológicas a enzima estaria saturada em ralação à fosfocreatina, sendo difícil a competição com os aminoácidos de cadeia ramificada, principalmente devido ao alto Ki encontrado (6 a 26 mM), exceto em situações de baixas concentrações deste substrato. Entretanto, o Km encontrado para o ADP como substrato (0,3 ± 0,1 mM) é semelhante à concentração do ADP do cérebro (0,2 – 0.4 mM). Como o Ki encontrado também é alto (14 – 30 mM), é possível que a competição entre o ADP como substrato e os aminoácidos de cadeia ramificada diminua a atividade da enzima alterando a homeostasia energética do cérebro, contribuindo para o dano neurológico encontrado nos pacientes com a Doença do Xarope de Bordo. Os dados deste trabalho propõem um novo mecanismo fisiopatológico para as alterações neurológicas encontradas na Doença do Xarope do Bordo. Os aminoácidos de cadeia ramificada, acumulados no cérebro destes pacientes, ocasionando a inibição da creatinaquinase estariam competindo com o ADP, produzindo deste modo um desequilíbrio energético e conseqüentemente o dano neurológico.