Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-10-25T03:10:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 342281.pdf: 3917692 bytes, checksum: 553502147fd443b69253761feabb6bab (MD5) Previous issue date: 2016 / Introdução. Evidências indicam um promissor efeito antitumoral das quinonas juglona, fenilaminonaftoquinona-7 (Q7) e fenilaminonaftoquinona-9 (Q9), especialmente quando associadas ao ascorbato. Objetivo. Dar continuidade aos estudos sobre o efeito antitumoral das naftoquinonas juglona, Q7 e Q9 em associação ao ascorbato de sódio, bem como avaliar a melhor associação para o tratamento do câncer a partir dos efeitos obtidos in vitro e in vivo. Metodologia. Foram analisados os efeitos das quinonas juglona, Q7 e Q9 associadas ou não ao ascorbato de sódio sobre o CT-DNA (Calf Thymus-DNA). Em células MCF-7 (carcinoma de mama) foram avaliados a viabilidade celular, os níveis de EROs intracelular, os danos ao DNA e a proliferação celular. Proteínas oriundas dos lisados de células MCF-7 foram utilizados para os ensaios de imunoeletroforese para verificar a integridade da proteína poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), gama-H2AX (?H2AX) e pAkt. A atividade antitumoral in vivo das quinonas associadas ou não ao ascorbato de sódio foi inicialmente analisada através de parâmetros de sobrevida e crescimento tumoral de camundongos portadores do tumor ascítico de Ehrlich. Posteriormente, amostras do tumor foram coletadas e utilizadas para análise de marcadores de estresse oxidativo como: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), proteína carbonilada, glutationa reduzida (GSH), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa-S-transferase (GST). Ainda em amostras do tumor ascítico de Ehrlich foram avaliados danos ao DNA, parada do ciclo celular, influência na captação de glicose e tipo de morte celular induzida pelos tratamentos. As mesmas amostras foram utilizadas para a análise de imunoeletroforese de proteínas envolvidas no dano ao DNA e proliferação celular (?H2AX e pAkt, respectivamente), na progressão do ciclo celular (p53, p16 e ciclina A), na captação de glicose (HIF-1a e GLUT1) e proteínas envolvidas na sinalização da morte celular (PARP, Bax, Bcl-xL). Resultados. As quinonas, quando associadas ao ascorbato, causaram um aumento na intercalação e clivagem oxidativa do CT-DNA. Em células MCF-7, a associação com ascorbato diminuiu significativamente a viabilidade celular. As associações juglona/ascorbato e, principalmente Q7/ascorbato, aumentaram os níveis de EROs intracelulares e os danos ao DNA. As três associações testadas causaram diminuição no número de colônias, porém, juglona/ascorbato e Q7/ascorbato foram capazes de inibir a proteína Akt fosforilada (pAkt). Os resultados in vitro foram reproduzidos in vivo. Juglona/ascorbato e Q7/ascorbato inibiram significativamente o desenvolvimento do tumor e aumentaram o tempo de sobrevida dos animais. Os marcadores de estresse oxidativo foram alterados, indicando uma indução na geração de EROs pelos tratamentos, aumentando assim a peroxidação lipídica e a carbonilação de proteínas, danificando o DNA das células do tumor ascítico de Ehrlich e promovendo também, a parada do ciclo celular em G1/S, redução da captação de glicose e morte celular por apoptose. Conclusão. Os resultados apresentados mostraram que o ascorbato de sódio potencializou o efeito antitumoral das quinonas juglona e, principalmente da Q7, também in vivo, evidenciando que estas associações são promissores agentes para o tratamento do câncer.<br> / Abstract : Introduction. Evidences point to the promising antitumor effect of quinones juglone, phenylaminonaphthoquinone-7 (Q7) and phenylaminonaphthoquinone-9 (Q9), especially when associated to ascorbate. Objective. To continue the studies on the antitumor effect of naphthoquinones juglone, Q7 and Q9 associated with sodium ascorbate, as well as to evaluate the best association for cancer treatment from the effects obtained in vivo and in vitro. Methodology. The effects of quinones juglone, Q7 and Q9 associated or not to sodium ascorbate on Calf Thymus-DNA were analyzed. Cell viability, levels of intracellular ROS, damages on DNA and cell proliferation were evaluated in MCF-7 cells (breast carcinoma). Proteins from MCF-7 cell lysate were used in immunoblotting assays to check the integrity of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), gamma-H2AX (?H2AX) and pAkt. The in vivo antitumor activity of quinones associated or not with sodium ascorbate was firstly analyzed by means of survival parameters and tumor growth of mice carrying Ehrlich ascitic tumor. After that, samples of the tumor were collected and analyzed for oxidative stress markers such as: thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), carbonylation of protein, reduced glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glutathione-S-transferase (GST). Also, of Ehrlich ascitic tumor, DNA damages, cellular cycle arrest, influence in glucose capture and type of cell death induced by the treatments were evaluated. The same samples were used in immunoblotting assays of proteins involved in damage to DNA and cell proliferation (?H2AX and pAkt, respectively), cell cycle progression (p53, p16 and cyclin A) and glucose capture (HIF-1a and GLUT1) and proteins involved in cell death signaling (PARP, Bax, Bcl-xL). Results. When associated to ascorbate, quinones promoted an increase in interleaving and oxidative cleavage of CT-DNA. In MCF-7 cells, the association with ascorbate declined significantly cell viability. The associations juglone/ascorbate and, mainly Q7/ascorbate increased levels of intracellular EROs and damage to DNA. The three assessed associations promoted the decrease in the number of colonies, however, julone/ascorbate and Q7/ascorbate were able to inhibit the protein pAkt. The in vitro results were in vivo reproduced. Juglone/ascorbate and Q7/ascorbate significantly inhibited the growth of the tumor and increased survival time of the animals. The oxidative stress markers were altered pointing to an induction in the generation of ROS by these treatments, thereby increasing lipid peroxidation and protein carbonylation, damaging DNA of cells of Ehrlich ascitic tumor also promoting, cellular cycle arrest in G1/S, reduction of glucose capture and cellular death by apoptosis. Conclusion. The results presented here showed that the sodium ascorbate potentialized the antitumor effect of juglone, especially Q7, also in vivo, evidencing that those associations are promising agents for cancer treatment.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-01-31T03:14:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343392.pdf: 1319407 bytes, checksum: 24b8974ed11565d9a00fd25cb59af3c1 (MD5) Previous issue date: 2016 / Atualmente, as doenças cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade no mundo. Por sua vez, a aterosclerose, principal causa das doenças cardiovasculares, é uma doença inflamatória crônica e progressiva caracterizada pelo acúmulo de lipídios e elementos celulares na túnica íntima das artérias de médio e grande calibre. A produção anormal de espécies reativas relacionada a diversos fatores de risco para essa patologia, e a consequente modificação oxidativa da lipoproteína de baixa densidade (LDL) desempenham papeis importantes na patogênese dessa condição. Um possível método para prevenir a aterosclerose seria a administração de substancias antioxidantes de maneira a deixar a LDL menos sensível ao processo oxidativo, impedindo ou retardando a progressão da doença. Por esse motivo, a inclusão de antioxidantes dietéticos representa uma alternativa concreta no controle da progressão da aterogênese. A fucoxantina, um carotenóide extraído de algas marrons comestíveis, possui excelentes atividades anti-inflamatórias e antioxidantes já demonstradas em diversos modelos experimentais. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi investigar os potenciais efeitos antioxidante e antiaterogênico do composto fucoxantina sobre a inibição da oxidação da LDL humana isolada, assim como em macrófagos J774 expostos à LDL oxidada (LDLox). Inicialmente, avaliamos os efeitos protetores da fucoxantina frente à oxidação de LDL humana induzida por Cu2+. O composto inibiu de maneira dependente de concentração a lipoperoxidação da LDL. Além disso, a oxidação proteica da LDL humana isolada foi igualmente inibida de forma dependente da concentração. Considerando os efeitos protetores antioxidantes da fucoxantina, e considerando o envolvimento da LDLox na patogênese da aterosclerose, investigamos os efeitos protetores da fucoxantina sobre danos citotóxicos induzidos pela exposição de macrófagos murinos J774 à LDLox. O pré-tratamento por 24 horas com fucoxantina reduziu efeitos citotóxicos causados pela LDLox, i.e., a produção elevada de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs/ERNs), distúrbio na homeostase do .NO, redução dos níveis intracelulares de glutationa reduzida (GSH), comprometimento na bioenergética mitocondrial e formação de células espumosas. O potencial efeito antiaterogênico da fucoxantina foi relacionado à sua capacidade de sequestrar radicais livres, assim como de ativar fatores de transcrição como Nrf-2, e inibir a atividade do NF-?B, já relatadas na literatura. Os resultados indicam um papel benéfico da fucoxantina na aterogênese, impedindo eventos oxidativos que possam contribuir para a progressão da doença.<br> / Abstract : Nowadays, cardiovascular diseases are the leading cause of mortality and morbitidy worldwide. In turn, atherosclerosis, mainly cause of cardiovascular diseases, it?s a inflammatory and chronic pathology characterized by the accumulation of lipids and cellular elements in the intima layer of arteries of medium and large caliber. Abnormal production of reactive species related to several risk factors for this pathology, and consequently the oxidative modification of low density lipoprotein (LDL) play an important role in the pathogenesis of this condition. One possible method to prevent atherosclerotic diseases would be the administration of antioxidant substances thereby making LDL less sensitive to this oxidative process, preventing or delaying the disease progression. For this reason, the inclusion of dietary antioxidants represents a concrete alternative in controlling the progression of atherogenesis. Fucoxanthin, a carotenoid extracted from edible brown seaweed, has excellent anti-inflamatory and antioxidative activities already demonstrated in several experimental models. In this context, the objective of this study was to investigate the potencial antioxidant and antiatherogenic effects of the compound fucoxanthin on the inhibition of human isolated LDL oxidation, as well on macrophages J774 expose to oxidized LDL (oxLDL). Initially, we evaluated the protective effects of fucoxanthin on human Cu2+-induced human LDL oxidation. The compound caused a concentration-dependent inhibition on the LDL lipoperoxidation. Furthermore, the protein moieties oxidation from human isolated LDL was also inhibited in a concentration-dependent manner. Considering the antioxidative protective effects of fucoxanthin, and considering the involvement of oxLDL in the pathogenesis of atherosclerosis, we investigated the protective effects of fucoxanthin on oxLDL-mediated cytotoxic effects in murine macrophage cells. The 24 hours pre-treatment with fucoxanthin reduced the cytotoxic effects caused by oxLDL, including elevated production of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS), disturbance of .NO homeostasis, reduction of intracellular levels of reduced glutathione (GSH), foam cell formation and impairment in mitochondrial bioenergetics. The potential antiatherogenic effect of fucoxanthin was related to its ability of scavenging free radicals, as well as activating transcription factors as Nrf-2, and inhibit the activity of NF-?B, as reported in the literature. The results indicate a beneficial role of fucoxanthin in atherogenesis by preventing oxidative events that may contribute to disease progression.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-11Bitstream added on 2014-06-13T19:42:38Z : No. of bitstreams: 1 takeda_aas_dr_botib_parcial.pdf: 198000 bytes, checksum: dde840aa4960be4dc4599e18c0694b14 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-12-19T18:32:42Z: takeda_aas_dr_botib_parcial.pdf,Bitstream added on 2014-12-19T18:33:33Z : No. of bitstreams: 1 000636567.pdf: 1314615 bytes, checksum: 216d1e404d6340f6787609cd55ed585c (MD5) / A Importina-α (ImpA) participa da via clássica de importação nuclear reconhecendo seqüências de localização nuclear (NLS) presentes em proteínas que apresentam atividades no núcleo. Almejando mais informações a respeito do mecanismo de reconhecimento para importação nuclear, nesse trabalho foram efetuados experimentos de expressão, purificação e cristalografia de raios-X da ImpA de Mus musculus com o peptídeo NLS da proteína de reparo de DNA Ku70 e peptídeos TMNLS, T52NLS, frutos de bibliotecas de peptídeos NLS específicos para isoformas da ImpA de Mus musculus e Homo sapiens, respectivamente. O peptídeo TMNLS, conforme esperado, ligou-se à ImpA de maneira similar ao NLS do antígeno T da SV40. Já o peptídeo não clássico T52NLS, obtido de uma biblioteca de peptídeos NLS para a isoforma 5 de Homo sapiens, acomodou-se ao sítio principal da ImpA de maneira satisfatória, indicando que essa seqüência também apresenta afinidade à isoforma de Mus musculus. Complementar à esse resultado, foi constatada a ligação do T52NLS ao sítio secundário da ImpA e, pela primeira vez, foi observada a ligação de um peptídeo monopartido de maneira alternativa, paralela à ImpA, ao contrário da posição anti-paralela, convencional. Surpreendentemente, resultados do complexo ImpA-NLS de Ku70 indicaramno como monopartido, e ligando-se a ImpA de maneira similar à versão fosforilada do peptídeo NLS do antígeno T da SV40. Posições específicas nos sítios de ligação foram confirmadas como essenciais, bem como resíduos da ImpA conservados nessas regiões, indicando a importância das interações intermoleculares nesses sítios. Adicionalmente foram obtidas informações relevantes, como a importância de resíduos de prolina nos NLSs e a não obrigatoriedade de regiões altamente básicas para o reconhecimento de um NLS pela ImpA / The Importin-α (ImpA) plays a role in the classic nuclear import pathway, recognizing proteins that contain nuclear localization sequences (NLS), which have activities in the nucleus. Aiming additional information about the mechanism of nuclear import recognition, in this work, the expression, purification and X-ray crystallography experiments were performed with ImpA from Mus musculus and NLS peptides from the DNA repair protein Ku70 and the peptides TMNLS and T52NLS obtained from NLS peptide libraries specific for ImpA isoforms of Mus musculus e Homo sapiens, respectively. The peptide TMNLS, as expected, bound to the ImpA in a similar way to SV40 antigen T NLS. However, the non classical peptide T52NLS, obtained from a NLS peptide library for isoform 5 of Homo sapiens, which accomodation into the major site of ImpA was acceptable, showed that this sequence has affinity to the Mus musculus isoform. There was also the binding of T52NLS in the minor site of ImpA and for the first time the binding of a monopartite peptide in an alternative way was observed. It was parallel to the ImpA in spite of the conventional nonparallel position. Surprisingly the results of the ImpA- Ku70NLS complex indicated the peptide as monopartite and bounded to the ImpA similarly to the phosphorilated version of the SV40 antigen T NLS. Specific positions in the binding sites were confirmed as essentials, and conserved residues of ImpA in these regions were highlighted, indicating the importance of intermolecular interactions in these sites. Additional information was obtained like the importance of proline residues in NLS sequences and the non-mandatory highly basic regions for a NLS recognizing by ImpA. Keywords: Importin-!, nuclear import, NLS, X-ray crystallography, Ku70, TMNLS, T52NLS

Orientador : Prof. Dr. Fabio Souza Nunes / Co-orientador : Prof. Dr. Ronny Rocha Ribeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Exatas, Programa de Pós-Graduação em Química. Defesa: Curitiba, 17/06/2013 / Inclui referências / Resumo: Mesmo com os avanços na área de química de materiais, os compostos de coordenação continuam sendo atrativos do ponto de vista da compreensão de fenômenos químicos e físicos fundamentais da matéria em nível molecular. Ligantes polidentados, como os ligantes macrocíclicos associados, à ciano-complexos vêm se mostrando interessantes para o controle da dimensionalidade do sistema e obtenção de espécies polinucleares com propriedades magnéticas interessantes. O uso do ligante tetraiminodifenólico se justifica pela possibilidade de acomodação de até dois metais em diversos estados de oxidação. Com o objetivo de sintetizar espécies polinucleares mediadas por ponte cianeto, foram preparados os complexos binucleares de manganês Mn2(tidf)(OAc)(ClO4)(MeOH) (4) e Mn2(tidf)Br3(H2O)2 (5), sendo o último uma espécie de valência mista. Também são apresentadas a tentativas de preparação de espécies heterometálicas do tipo [CuM(tidf)]2+, onde M = Mn, composto (8), ou Zn, composto (10). Os compostos foram caracterizados por análise elementar, medidas magnéticas, por espectroscopia eletrônica, vibracional e de EPR, voltametria cíclica e sempre que possível por DRX de monocristal. O complexo Mn2(tidf)(OAc)(ClO4)(MeOH) (4) foi devidamente caracterizado como uma espécie binuclear de manganês(II), com acoplamento antiferromagnético fraco (J = -1,59 cm-1). As medidas eletroquímicas do composto (4) mostraram um par de ondas quase-reversíveis atribuídas ao par redox MnII/MnIII. O estudo espectroeletroquímico no UV-Vis reforça o resultado eletroquímico, com o surgimento de uma banda em 570 nm, atribuída ao centro de MnIII, quando da varredura anódica. A espécie de valência mista foi parcialmente caracterizada. Os dados magnéticos indicam uma pequena quantidade de impurezas paramagnéticas. A espectroscopia de EPR mostra o espectro de um centro de MnII desacoplado compatível com o comportamento ?valence trapping" relatado na literatura para esta classe de compostos. O estudo espectroeletroquímico de EPR da espécie Mn2(tidf)(OAc)(ClO4)(MeOH) (4) corrobora a atribuição do espectro de EPR para a espécie de valência mista. Os complexos (8) e (10) foram caracterizados por DRX de monocristal como sendo compostos de co-cristalização homonucleares do tipo [Cu2(tidf)(ClO4)2(H2O)2] [M2(tidf)(ClO4)2(H2O)2] onde M = Mn, composto (8), ou Zn, composto (10). As medidas magnéticas se somam, em parte, a esta atribuição: para o composto (8) os cálculos indicam 50 % de espécies CuIIMnII no material amorfo; para o composto (10) a distribuição das espécies no material cristalino é 10 % CuIIZnII, 15 % CuIICuII e o restante espécies diamagnéticas ZnIIZnII. A interpretação dos espectros de EPR e os dados de simulação conflitam com as medidas magnéticas e cristalográficas para o composto (10). Para o composto (8) os espectros de EPR indicam a existência de uma espécie magneticamente acoplada distinta das espécies homometálicas CuIICuII e MnIIMnII. São apresentadas também duas novas estruturas cristalográficas: um composto trinuclear de valência mista MnIIMnIIIMnII gerada durante uma tentativa de cristalização do composto Mn2(tidf)(OAc)(ClO4)(MeOH) (4) e o polímero [{Cu2(tidf)(?-NO3)}?]ClO4. As duas espécies cristalizam em célula unitária triclínica grupo espacial P-1. Palavras-chave: complexos polinucleares, ligante macrocíclico tetraiminodifenólico. / Abstract: Despite the advance in materials science, coordination compounds are still atractive towards the understanding of chemical and physical phenomena of the matter in the molecular level. Combination of multifuncional ligands such as macrocycles and cyanometalates have proven adequate to control molecular dimensions of coordination polymers and/or polynuclear complexes with interesting magnetic properties. Our interest in the tetraiminodiphenolate (tidf) is justified its capacity to bind to two metal ions in different oxidation states. In this work we describe two binuclear manganese complexes, Mn2(tidf)(OAc)(ClO4)(MeOH) (4) and Mn2(tidf)Br3(H2O)2 (5) that were prepared and further used in attempts to synthesize polynuclear complexes, with emphasis in the heterometallic compounds. In this pursuit complexes [CuM(tidf)]2+, where M = Mn in (8) and Zn in (10) where prepared. Characterizations were carried out by elemental analysis, temperature dependent magnetic measurements, electronic, vibrational, NMR and EPR spectroscopies, cyclic voltammetry, spectroeletrochemistry and single-crystal X ray diffraction analysis. Complex Mn2(tidf)(OAc)(ClO4)(MeOH) (4) exhibited a weak antiferromagnetic coupling behavior (J = -1.59 cm-1) and redox behavior consistent with a MnII/MnIII reversible electron transfer. Spectroelectrochemistry of (4) is also in accordance by showing a typical MnIII ligand-field transition at 570 nm. The mixed valence complex Mn2(tidf)Br3(H2O)2 (5) was partially characterized and its magnetism supports the presence of small amounts of paramagnetic impurities. Its EPR spectrum shows a valence trapped decoupled MnII as seen in the literature for similar compounds and the spectroelectrochemical response accords with the mixed valence composition as well. Complexes [Cu2(tidf)(ClO4)2(H2O)2] (8) and [M2(tidf)(ClO4)2(H2O)2] (10) had their molecular structure solved by X ray diffraction. The single-crystals were produced from the heterobimetallic parents CuIIMnII and CuIIZnII by "metal scrambling" during the crystallization procedure. Magnetic measurements agree with this interpretation and showed the presence of the heterometallic species CuIIMnII and CuIIZnII in 50% and 10%, respectively, of the analyzed materials. In addition, the results showed the presence of 15% of CuIICuII and remaining diamagnetic ZnIIZnII complexes. In contrast, the EPR spectrum and related simulations is not consistent with the presence of CuIICuII in complex (10). In (8), the EPR spectrum suggests the presence of a coupled magnetic species, which is different from CuIICuII e MnIIMnII . Furthermore, herein we present two new molecular structures: a) a trinuclear mixed valence MnIIMnIIIMnII isolated from an attempt to crystallize Mn2(tidf)(OAc)(ClO4)(MeOH) (4) and b) the polimer [{Cu2(tidf)(?-NO3)} ?]ClO4. Key-words: polinuclear complexes, tetraiminodiphenolate macrocycle ligand

Orientadora : Profª Joana Léa Meira Silveira / Co-orientador : Prof. Rilton Alves de Freitas / Co-orientadora : Drª Heidegrid Koop / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 10/03/2014 / Inclui referências / Resumo: A interação binária entre xantana e galactomananas de guapuruvu [G - relação manose:galactose (Man:Gal) 2,5:1] e bracatinga (B - Man:Gal 1,1:1) vem sendo bastante estudada. O mecanismo de interação entre esses polissacarídeos envolve a ligação de hidrogênio formada entre o oxigênio do hemiacetal da manose interna do trissacarídeo de xantana, com o hidrogênio da hidroxila ligada a C-2 da manose livre da cadeia principal da galactomanana, entretanto, pouco se sabe sobre a influência dos contraíons nesta interação, visto que os estudos realizados até hoje utilizam a xantana em seu estado sódico. A xantana pode assumir duas conformações estruturais de acordo com sua composição iônica, sendo hélice simples e hélice dupla (sódica). O presente trabalho possui duas frentes, sendo a primeira delas a purificação da xantana através de um protocolo envolvendo autoclave e diálises exaustivas contra água ultra pura (tipo I), visando obter xantana em hélice simples, e a segunda avaliar, utilizando técnicas reológicas, a interação com as galactomananas B e G em água e adicionando sal à solução. Foi observado o comportamento da xantana em hélice simples pela metodologia em tempo real de mistura automática contínua acoplada a detectores de espalhamento de luz laser, índice de refração e viscosimétrico, e pôde-se concluir que mesmo após a redisponibilização de NaCl, a molécula de xantana purificada não torna a formar hélice dupla. Quanto a interação binária entre os polissacarídeos, concluo-se que a xantana em hélice simples não é capaz de interagir tão fortemente com as galactomananas a ponto de formar um gel forte, como acontece com a xantana em hélice dupla quando misturada com galactomananas. Palavras chave: Xantana, Galactomanana, Influência iônica, conformação macromolecular, interação sinérgica. / Abstract: The binary interaction between xanthan and galactomannans from guapuruvu [G - mannose:galactose ratio (Man:Gal ) 2.5:1 ] and bracatinga (B - Man:Gal 1.1:1 ) has been extensively studied. The mechanism of interaction between these polysaccharides involves the hydrogen bond formed between the hemiacetal oxygen in the internal mannose unit of the trisaccharide portion of xanthan with the hydroxyl hydrogen attached to C-2 of the free mannose main chain of galactomannan. However, little is known about the influence of the counterions in this interaction, as most studies conducted to the present time use xanthan in its sodium state. Xanthan can take two structural conformations according to their ionic composition: single stranded and double stranded (sodium). This study has two fronts, the first one being the purification of xanthan by a protocol involving autoclaving and exhaustive dialysis against Type I-ultra pure water to obtain single stranded xanthan, and the second part, using rheological techniques to evaluate xanthan interaction with galactomannans (B and G) in water and saline solutions. It was observed that the behavior of single stranded xanthan by using real-time automatic continuous mixing coupled to laser light scattering, refractive index and viscometric detectors, and concluded that even after adding NaCl, purified xanthan molecules cannot form double helix structures. Regarding the binary interaction between both polysaccharides, we concluded that single stranded xanthan is not able to make strong interactions with galactomannans, so as to form a strong gel, as double helix xanthan is. Key words: Xanthan, Galactomannan, Ionic influence, macromolecular conformation, sinergic interaction.

O corpo de frutificação do basidiomiceto Ganoderma multiplicatum seco, moído e deslipidificado foi submetido a extrações aquosas e alcalinas (KOH a 2, 10, 20 e 30%). O extrato aquoso foi primeiramente submetido a precipitação com etanol, enquanto que os extratos alcalinos foram submetidos a precipitação com adição de ácido acético até ~ pH 5,0. Os extratos obtidos foram submetidos aos processos de purificação por congelamento e degelo, precipitação com solução de Fehling e por ultrafiltração e diálise em membranas de diferentes porosidades, respectivamente. A partir destes processos foram purificadas e caracterizadas diferentes estruturas. As frações 10ESFW e 10RSFW, obtidas por extração aquosa, apresentaram-se homogêneas quando analisadas por HPSEC e compostas principalmente por glucose. O espectro de RMN- ¹³C apresentou sinais na região anomérica em d 102,7 e 102,3 correspondentes ao C-1 sugerindo configuração glicosídica do tipo b. Além destes, também foi observado sinais pouco intensos em d 100,3 e 97,7 correspondentes ao C-1, provavelmente, em configuração do tipo a. Estes dados sugerem a presença de uma glucana apresentando unidades em a e b configuração. A fração eluída (30EPFW) e a fração retida (30RPFW) apresentaram fucose, xilose e manose como principais monossacarídeos, sugerindo tratar-se de uma fucoxilomanana. As frações 10ESFK2 e 10RSFK2, obtidas a partir do sobrenadante de Fehling (SFK2) da extração com KOH 2%, apresentaram-se homogêneas e glucose como principal monossacarídeo. Os dados obtidos por RMN- ¹³C, DEPT e análise de metilação sugerem a presença de uma b-glucana ramificada contendo, principalmente, ligações do tipo (1 - 3) e (1 - 6). Também pode ser observado unidades ligadas (1 - 4). A partir da extração com KOH 10% foi isolada uma xilomanana (30RPFP5 e 30EPFP5). As análises de metilação, juntamente com os dados de RMN-¹³C, sugerem um heteropolissacarídeo ramificado contendo uma cadeia principal formada por unidades de a-D-Manp ligadas (1 - 4) e parcialmente substituída em O-3 por terminais não redutores de b-Xylp. Uma glucana linear com ligações do tipo b-(1 - 3), denominada de laminarana, foi obtida por extração com KOH 20%. Além destas estruturas, foi isolada, da extração com KOH 30%, uma b-glucana ramificada contendo uma cadeia principal com ligações do tipo (1 - 3) a qual encontra-se substituída em O-6 apenas por unidades de b-Glcp-(1 - 4)- ligadas. Estes dados foram confirmados por análises de metilação, degradação controlada de Smith e RMN-¹³C

Orientadora : Profª Drª Sheila M.B. Winnischofer / Coorientador : Prof. Dr. Marina Trombetta Lima / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/03/2017 / Inclui referências : f. 69-75 / Resumo: Gliomas são os tumores mais comuns derivados do Sistema Nervoso Central. Dentre seus tipos, o glioblastoma (GBM) é o mais agressivo e que apresenta pior prognóstico, com tempo de sobrevida dos pacientes que varia de 12 a 15 meses. O tratamento para GBM consiste na retirada cirúrgica da massa tumoral, seguida de radioterapia e quimioterapia, sendo a temozolomida (TMZ) a droga padrão utilizada. No entanto, apesar das estratégias terapêuticas atuais, esse tipo de tumor frequentemente se mostra resistente, apresentando altas taxas de recorrência. Um dos motivos dessa recidiva justifica-se pela presença das CSCs (Cancer Stem Cells). Essas células possuem propriedades características de células tronco, como a capacidade de crescer in vitro como agregados celulares, através do cultivo em substratos não aderentes, meios de cultura definidos, crescimento em constante movimento e ainda por meio das hanging drops. A técnica de hanging drop baseia-se no cultivo das células que ficam suspensas em uma tampa de placa de cultura devido à tensão superficial, então a gravidade induz a agregação de células. Hipóteses atuais sugerem que as CSCs seriam as responsáveis pela recidiva da massa tumoral, mesmo após o tratamento, já que esse é direcionado às células tumorais já diferenciadas. Nesse sentido, a procura por terapias combinadas que atinjam tanto as células diferenciadas quanto as CSCs torna-se uma alternativa interessante aos tratamentos atuais. Dados na literatura mostram uma correlação entre o uso das estatinas e uma menor incidência de gliomas. Os efeitos anti-tumorais da sinvastatina (SVA) tem sido investigados, no entanto ainda não se sabe qual sua ação em células tronco tumorais. Sendo assim, os objetivos desse trabalho foram: padronizar condições de cultivo de CSCs e investigar quais os efeitos do tratamento conjunto de TMZ e SVA nessa subpopulação de GBM. Primeiramente, foi demonstrado que o cultivo das células U87MG por 3 dias em hanging drop e 5 dias em substrato não aderente foi capaz de enriquecer a neuroesfera em CSCs, através da presença do marcador CD133 em microscopia confocal e aumento da expressão de CD133, CD15 e Sox-2, por q-PCR. Essas esferas enriquecidas, quando tratadas com a combinação de fármacos, não sofreram diminuição de tamanho, porém tiveram sua morfologia alterada após tratamento com SVA e TMZ+SVA. Ainda, o uso da SVA e a combinação de TMZ e SVA foi capaz de impedir a formação das esferas quando adicionados durante o período de 72h em hanging drop. Em paralelo, foi realizado o cultivo de CSCs de GBM com o meio definido NSC e foram também avaliados os efeitos da combinação dos fármacos nas esferas formadas. Foi visto um padrão de diminuição no número e no tamanho das esferas formadas, aumento da dupla marcação de anexina e PI e diminuição da expressão de CD133, CD15 e Sox-2 após tratamento conjunto TMZ e SVA. Nossos resultados mostram a efetiva padronização da metodologia de hanging drop e substrato não aderente para o cultivo das CSCs de GBM e também a potencialização do efeito citotóxico da TMZ quando em conjunto com a SVA nas neuroesferas de GBM. Palavras-chave: Glioblastoma. Células tronco tumorais. Neuroesferas. / Abstract: Gliomas are the most common tumors derived from the Central Nervous System. Among its types, glioblastoma (GBM) is the most aggressive, with median survival ranging from 12 to 15 months. Treatment for GBM consists of maximal surgical resection followed by radiotherapy and chemotherapy, with temozolomide (TMZ). However, despite current therapeutic strategies, this type of tumor is often resistant, presenting high rates of recurrence. One of the reasons for this recurrence is justified by the presence of CSCs (Cancer Stem Cells). These cells present properties of stem cells, such as the ability to grow in vitro as cell aggregates, through non-adherent substrates culture, defined culture media, growth in constant movement and through hanging drops. The hanging drop technique is based on culturing cells suspended in a plate cap due to surface tension, and then gravity induces cell aggregation. Current hypotheses suggest that CSCs are responsible for restructuring tumor mass, even after treatment, since current therapies are directed to already differentiated tumor cells. In this sense, the search for combined therapies that aim differentiated and non-differentiated tumor cells become an interesting alternative to current treatments. Some studies show a correlation between the use of statins and a lower incidence of gliomas. The antitumor effects of simvastatin (SVA) have been investigated, however it is not yet known what are their action on tumor stem cells. Therefore, this work's objectives were to standardize conditions for CSC culture and investigate the effects of the combined treatment of TMZ and SVA in CSCs of GBM. First, U87MG cells were cultured for 3 days in hanging drop and 5 days on non-adherent substrate, this protocol was shown to enrich the neurosphere in CSCs by the presence of CD133 marker in confocal microscopy and increased expression of CD133, CD15 and Sox-2, by q-PCR. These enriched spheres were treated with the combination of drugs, but did not showed decrease in their size. However, their morphology was altered when treated with SVA and TMZ + SVA. Also, the SVA and the combination of TMZ and SVA was able to inhibit the formation of spheres when plated in hanging drop. In parallel, culture of GBM CSCs with the defined medium NSC was performed and the effects of the combination of both drugs on the spheres formed were evaluated. A decreasing pattern in the number and size of spheres formed was observed, with an increase in the levels of annexin and PI, and a decrease on CD133, CD15 and Sox-2 mRNA expression after TMZ and SVA treatment. Our results show the effective standardization of the hanging drop and non-adherent substrate technique for GBM CSCs culture and also the potentiation of the cytotoxic effect of TMZ when combined with SVA in GBM neurospheres. Key-words: Glioblastoma. Cancer Stem Cells. Neurospheres.

Orientadora : Profª Drª Emanuel Maltempi de Souza, Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo / Co-orientadores : Dr.Helisson Faoro / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2014 / Inclui referências / Resumo: Celulases apresentam diversas utilidades industriais, desde uso em etapas de polimento de tecidos até produção de biocombustíveis, especialmente de bioetanol de 2ª geração. Na busca por novas celulases, a prospecção em bactérias colonizadoras de plantas pode levar a identificação de enzimas particulares. Este trabalho teve como objetivo identificar, expressar e caracterizar genes de possíveis celulases e hemicelulases presentes no genoma de Azospirillum brasilense, uma bactéria colonizadora de rizosfera de gramíneas. Genes codificando glicosil-hidrolases foram identificados por comparação de sequências. Os genes identificados foram posteriormente clonados e expressos em E. coli. Dos 10 genes codificando prováveis glicosil hidrolases, 4 foram clonados em vetor de expressão. Dois dos plasmídeos obtidos, contendo genes de uma celulase e uma hemicelulase, permitiram superexpressar as proteínas recombinantes em E.coli que foram purificadas com sucesso. Porém, as 4 enzimas não demonstraram atividade de degradação celulolítica ou hemicelulolítica. Com a finalidade de se identificar se realmente há enzimas com atividade de degradação de celulose ou xilana em A. brasilense, a bactéria foi cultivada em meios específicos contendo apenas celulose ou xilana como fonte de carbono. Evidência de crescimento foi observada apenas na presença de xilana, o que leva a crer que há maquinaria ativa capaz de degradar este polímero em A. brasilense estirpe FP2. Palavras-chave: celulases, xilanases, Azospirillum brasilense. / Abstract: Cellulases have many industrials uses, from polishing fabrics to biofuel production, especially second generation bioethanol. Searching for new cellulases, bioprospection in plant-root-colonizing bacteria could lead to discover novel enzymes. This study aimed to identify and characterize possible cellulolytic and hemicellulolytic enzymes in genome of Azospirillum brasilense. Sequence comparison was used for identification of glycosyl hydrolases (cellulases and xylanases) in the A. brasilense draft genome. Four out of 10 selected genes were cloned and overexpressed in E. coli. Of these four, a probable cellulase and a hemicellulase were purified successfully. However, the four enzymes had no degradation activity. In order to determine if A. brasilense is capable of degrading cellulose or xylan, the bacterium was grown in media containing either cellulose or xylan as sole carbon source. Only xylan sustained A. brasilense growth, suggesting the presence of active machinery capable for degrading this polymer in A. brasilense strain FP2. Key-words: cellulases, xylanases, Azospirillum brasilense.

Orientadora : Profª Drª Emanuel M. de Souza / Coorientador : Prof. Dr. Vivian Rotuno Moure / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 25/05/2017 / Inclui referências : f. 86-97 / Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é catalisada pelo complexo enzimático nitrogenase. Este complexo contém duas metaloproteínas: as proteínas Fe e MoFe. Em Azospirillum brasilense, objeto deste estudo, a regulação pós-traducional envolve a modificação covalente de uma das subunidades da proteína Fe por ADP-ribosilação. Esta ADPribosilação inativa reversivelmente a proteína Fe e é catalisada pela dinitrogenase redutase ADP-ribosiltransferase (DraT) em resposta ao aumento de íons amônio ou depleção da energia celular. O grupo ADP-ribosil é removido pela dinitrogenase redutase glicohidrolase (DraG), promovendo reativação da proteína Fe e consequentemente, da nitrogenase. Em resposta ao aumento de íons amônio, as proteínas PII, assim como a proteína de membrana AmtB, estão envolvidas no sistema de regulação atuando principalmente por interação direta com proteínas alvo. No caso de A. brasilense, as proteínas PII são denominadas de GlnB e GlnZ e interagem com DraT e DraG, respectivamente, regulando suas atividades. Porém o mecanismo pelo qual estas enzimas são reguladas pelos níveis energéticos celulares não é totalmente conhecido. O objetivo deste trabalho foi contribuir para elucidação do mecanismo da regulação póstraducional da nitrogenase em condições de anaerobiose. Vários aspectos da regulação do metabolismo energético nesta bactéria foram estudados. Para avaliar o envolvimento de AmtB e GlnZ de A. brasilense na regulação da nitrogenase, foi realizado um ensaio de desligamento / religamento da nitrogenase por anaerobiose em mutantes nos respectivos genes. Os resultados mostraram que as proteínas GlnZ e AmtB não participam diretamente da regulação por ADP-ribosilação da nitrogenase. Análises de LC-MS dos níveis de ATP e ADP indicaram redução substancial quando a cultura foi exposta à anaerobiose. Além disso, a adição do desacoplador CCCP, que diminui o ATP intracelular, causou desligamento e ADP-ribosilação da nitrogenase. Portanto, razão ATP/ADP pode estar relacionada ao mecanismo de regulação da atividade da nitrogenase nessas condições. Análise das frações celulares mostrou que, diferentemente da regulação por íons amônio, as proteínas PII não vão para a membrana durante a ADP-ribosilação da nitrogenase. O mesmo ocorre com DraG que permanece no citoplasma. Os resultados sugerem a existência de diferentes vias para o controle da atividade da nitrogenase, que depende do estímulo ao qual as células são submetidas. Palavras-chave: Azospirillum brasilense, regulação pós-traducional, ADP-ribosilação da proteína Fe, sistema DraT/DraG, anaerobiose. / Abstract: The biological nitrogen fixation is catalyzed by a nitrogenase enzymatic complex. This complex contains two metalloproteins: the Fe and MoFe proteins and undergoes to post-translational modification. In Azospirillum brasilense, object of this study, this posttranslational regulation involves the covalent modification in one of the subunits of Fe protein by ADP-ribosylation. This ADP-ribosylation reversibly inactivates the Fe protein and is catalyzed by dinitrogenase reductase ADP-ribosyltransferase (DraT) in response to an increase of ammonium concentration or decrease of cellular energy. The ADP-ribosyl group is removed by dinitrogenase reductase glycohydrolase (DraG), promoting Fe protein and, consequently, nitrogenase re-activation. In response to increased ammonium ions, the PII proteins, as well as the NH3 - channel AmtB, are involved in the regulatory system acting primarily by direct interaction with the target proteins. In A. brasilense, the PII proteins are denominated GlnB and GlnZ and interact with DraT and DraG, respectively, regulating DraT and DraG activities. However, the mechanism by which these enzymes are regulated by cellular energy levels is not fully known. The goal of this study was to contribute to the elucidation of the mechanism of post-translational nitrogenase regulation under anaerobic conditions. Several aspects of energy metabolism regulation in this bacterium were studied. To evaluate the involvement of A. brasilense AmtB and GlnZ in the regulation system, switch-off / on assays of nitrogenase by anaerobiosis were performed. The results confirmed that GlnZ and AmtB proteins do not directly participate in ADP- ribosylation of nitrogenase. LC-MS analysis of ATP and ADP levels showed a marked reduction when the culture was exposed to anaerobic conditions. Furthermore, addition of CCCP, which decreases intracellular ATP, caused switch-off and ADP-ribosylation of nitrogenase. Therefore, the ATP / ADP ratio, lead nitrogenase switch-off. Analysis of the cellular fractions, showed that, unlike the regulation by ammonium ions, the PII proteins did not migrate to the membrane during nitrogenase switch-off, and DraG also remained in the cytoplasm. The results suggest distinct pathway for the control of nitrogenase activity depending on which stimulus the cells are submitted to. Key words: Azospirillum brasilense, post-translational regulation, ADP-ribosylation, DraT / DraG system, anaerobiosis.

Orientador : Prof. Dr. Marcelo Muller dos Santos / Coorientadora : Profa. Dra. Leda Satie Shubatsu / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 20/03/2017 / Inclui referências : f. 89-89 / Resumo: O acumulo de rejeitos plásticos no mundo representa na atualidade um dos maiores problemas ambientais. Os "bioplásticos" são compostos com propriedades muito similares aos plásticos que sintetizados por numerosos organismos. Os polihidroxialcanoatos são um tipo de bioplásticos produzidos por diversos grupos de bactérias como estoque de carbono e energia, possuem propriedades termoplásticas, elastoméricas e são resistentes a ruptura. Herbaspirillum seropedicae é uma betaproteobactéria fixadora de nitrogênio também capaz de produzir polihidroxibutirato (PHB). Foram identificados vários genes implicados na biossintesse e formação do grânulo de PHB dentro de bactéria, além dos genes das fasinas phaP, phaP2, encontrou-se o gene phaR que codifica para uma proteína reguladora PhaR, a qual se liga ao DNA na região de vários genes implicados na biossíntese de PHB. Em estudos prévios feitos pelo grupo de Fixação Biológica de Nitrogênio da Universidade Federal do Paraná foi gerado o mutante ?phaR derivado da estirpe parental SmR1 que apresentou uma dinâmica de produção de PHB diferente na estirpe selvagem SmR1, neste projeto foi estudado o perfil transcriptómico do mutante ?phaR de H. seropedicae comparando os níveis de expressão dos genes com a estirpe selvagem propondo uma possível via de regulação da proteína repressora PhaR, também foi avaliado o crescimento do mutante em diferentes fontes de carbono e a produção de PHB. O mutante ?phaR apresentou uma diminuição na produção de PHB e diferenças no perfil de crescimento em meio com galactose respeito à estirpe parental SmR1. Na avaliação transcriptômica foram encontrados sobre expressos genes envolvidos na síntese de ácidos graxos assim enquanto transportadores de aminoácidos ramificados e acetaldeído desidrogenase tiveram a sua expressão diminuida; revelando um possível redirecionamento do Acetil-coA que não está sendo empregado na síntese de PHB. Além disso, foi encontrado sobre expresso um gene que codifica para uma proteína envolvida no estresse oxidativo enquanto genes que codificam para o complexo IV da cadeia respiratória tiveram a sua expressão diminuída, indicando uma possível resposta ao estresse gerado pelo acumulo de fatores redutores como NADH. Genes envolvidos no metabolismo de galactose tiveram a sua expressão aumentada, enquanto vários reguladores transcricionais, entre eles um envolvido no metabolismo de arabinose araC, tiveram expressão diminuída. Foi demostrado também o papel de PhaR como regulador de fasinas já que ambos genes tiveram a sua expressão aumentada. Palavras chave: Polihidroxibutirato, Transcriptoma, Herbaspirillum seropedicae, repressor, expressão genética. / Abstract: Worldwide plastic waste accumulation is one of the main issues to address today, current alternatives are based on the development of new materials that can be easily degraded biologically in short periods without any contamination. "Bioplastics" are compounds whose properties are very similar to oil derived plastics but they are synthetized by living organisms. Polyhydroxyalkanoates are compounds related to bioplastics produced by several bacteria as an energy and carbon storage. They have good thermoplastics and elastomeric properties and are resistant to break. Herbaspirillum seropedicae it's a nitrogen fixating betaproteobacteria, also able to produce Polyhydroxybatyrate (PHB). There were identified several genes involved in PHB synthesis and granule formation, besides the phasins genes phaP1, phaP2, there was found the phaR gene that codifies a regulatory protein PhaR, wich is able to bind DNA in several regions of genes involved in PHB synthesis. In previous studies developed by the Nitrogen Fixation Group of the Universidade Federal do Paraná the ?phaR mutant was constructed from the parental strain SmR1, this mutant showed differences in the PHB production when compared to the wild type SmR1, in this work the transcriptomic profile of the ?phaR mutant was studied and the levels of expression compared with the wild type SmR1, a possible regulation pathway of the PhaR protein was proposed, also the growth dynamics in different carbon sources and PHB production was assayed. The ?phaR mutant showed a decreased in PHB production, and differences in growth patterns when grown in galactose. The transcriptomic profile showed an over expression of genes involved in fatty acid biosynthesis whereas there was a decrease on the expression of branched chain aminoacids and acetaldehyde dehydrogenase genes, this shows a possible path for redirecting Acetil-coA surplus because of low PHB production. Besides, there were found over expressed genes involved in oxidative stress whereas transcription of genes responsible for the synthesis of complex IV of the respiratory chain were decreased, indicating a possible response to stress generated for excess of NADH. Genes involved in galactose metabolism had an augmented expression in the ?phaR mutant whereas genes involved in transcription regulation included araC, a regulator of the arabinose metabolism presented a decrease on its transcription. It was demonstrated also the role of PhaR as a phasin regulator since both phasins presented an augmented transcription. Keywords: Polyhydroxibutyrate, Transcriptome, Herbaspirillum seropedice, repressor, gene expression.