O paradigma do P50 é uma técnica eletrofisiológica útil na investigação da neurobiologia básica subjacente aos defeitos de processamento sensorial que caracterizam algumas doenças mentais, mais tradicionalmente associados à esquizofrenia. Nessa tese replica-se e amplia-se o estudo do filtro sensorial P50 em algumas condições neurológicas e psiquiátricas. Foram replicados os achados de perda de supressão na esquizofrenia, na doença de Parkinson e no transtorno de estresse pós-traumático (avaliando pioneiramente vítimas de violência urbana). O filtro sensorial P50 em populações com transtorno de pânico, com transtorno obsessivo-compulsivo e na doença de Machado-Joseph, uma ataxia cerebelar, foi avaliado pela primeira vez. Em todas estas patologias documentou-se uma perda da supressão do P50. Também se investigou os efeitos da modulação do filtro sensorial por cafeína (a substância psicoativa mais consumida no mundo todo, um antagonista não-seletivo dos receptores de adenosina do tipo A1 e A2A), administrada por via oral a 24 voluntários saudáveis em diferentes doses (100, 200 e 400 mg e placebo). As doses de 200mg e 400 mg reduziram a supressão do P50. O efeito da cafeína foi independente do gênero e do uso habitual de cafeína. Usuários (n=15) mostraram valores basais diferentes quando comparados aos não usuários (n=9), com amplitudes S2 menores. Os resultados obtidos com a teofilina, num estudo prévio, e com a cafeína foram reanalizados, mostrando uma perda transitória de supressão do P50 mais pronunciada à direita, sugerindo uma alteração no padrão de lateralização do filtro sensorial P50 mediada pelo uso de metil-xantinas. Estes achados reforçam a participação da adenosina na modulação do filtro sensorial P50 e indicam que a ingestão de cafeína deva ser controlada neste tipo de estudo. Dessa forma, demonstra-se que uma supressão do P50 alterada é um achado pouco específico. Uma vez que a supressão do P50 pode ser alterada por uma situação habitual como o uso de bebidas que contém cafeína, é possível que a perda da supressão não seja necessáriariamente ruim, mesmo que ela esteja potencialmente associada a uma vulnerabilidade maior para doenças neuropsiquiátricas.

Após a evocação as memórias já consolidadas tornam-se novamente vulneráveis à ação de inibidores de síntese protéica. Isto leva a hipótese de que as memórias são reconsolidadas após sua evocação, e que este processo depende de síntese protéica. Muitas evidências indicam que o hipocampo tem um papel chave na consolidação e na reconsolidação de diferentes memórias. A evocação não reforçada pode causar extinção e/ou reconsolidação, dois processos que afetam a retenção da memória em vias opostas. Usando a tarefa do labirinto aquático de Morris nós demonstramos que a anisomicina, um inibidor de síntese protéica, infundida na região CA1 do hipocampo dorsal imediatamente, mas não 3 e 6 horas após o treino prejudica a consolidação da memória espacial associada ao LAM. Além disso, demonstramos que a expressão repetida e não reforçada da memória espacial causa extinção que não é afetada pela inibição de síntese protéica na região CA1. No entanto, se o número de testes de evocação não reforçados é insuficiente para induzir extinção, ocorre o processo de reconsolidação dependente de síntese protéica hipocampal que recupera a memória original. A inibição da síntese protéica hipocampal após o aprendizado reverso prejudica a retenção da preferência espacial reversa e bloqueia a persistência da memória inicial, sugerindo que o aprendizado reverso envolve antes reconsolidação do que extinção do traço original. Além disso, a D-cicloserina, um parcial agonista do sítio da glicina no receptor NMDA, quando administrada sistemicamente ou na região CA1 após uma sessão de evocação não reforçada, melhora a retenção da memória. Nossos resultados no LAM sugerem a existência de um processo reconsolidatório dependente de síntese protéica hipocampal que opera recuperando e modernizando o traço enfraquecido pela evocação e sugere que, semelhante ao processo de consolidação, o de reconsolidação pode não ser somente bloqueado, mas melhorado por tratamentos farmacológicos apropriados. Até o presente não existem estudos a respeito das conseqüências da inibição da síntese protéica hipocampal no armazenamento e persistência pós-evocação da memória de reconhecimento de objetos. Neste trabalho nós reportamos que a infusão de anisomicina na região CA1 do hipocampo dorsal imediatamente ou 180 min, mas não 6 horas após o treino prejudica a consolidação da memória de reconhecimento de longa duração sem afetar a memória de curta duração, o comportamento exploratório e o estado de ansiedade ou a funcionalidade hipocampal. A anisomicina quando administrada na região CA1 após a reativação da memória na presença de objetos familiares não afeta a posterior retenção do traço mnemônico. No entanto, quando administrada na região CA1 imediatamente após a exposição dos animais a um objeto novo e um familiar, prejudica a retenção da memória de ambos os objetos. O efeito amnésico da anisomicina não ocorreu após a exposição a dois objetos novos ou a exploração ao contexto na ausência de estímulos específicos, sugerindo que é dependente da reativação do traço consolidado na presença de um comportamento relevante e saliente. Os resultados obtidos a partir da tarefa de reconhecimento de objetos indicam que o hipocampo é engajado durante a reconsolidação deste traço, talvez adicionando novas informações à memória original. / Upon retrieval, consolidated memories are rendered again vulnerable to the action of metabolic blockers, notably protein synthesis inhibitors. This has led to the hypothesis that memories are reconsolidated at the time of retrieval, and that this depends on protein synthesis. Ample evidence indicates that the hippocampus plays a key role both in the consolidation and reconsolidation of different memories. Non-reinforced retrieval can cause extinction and/or reconsolidation, two processes that affect subsequent retrieval in opposite ways. Using the Morris water maze task we show that in the rat repeated non-reinforced expression of spatial memory causes extinction which is unaffected by inhibition of protein synthesis within the CA1 region of the dorsal hippocampus. However, if the number of non-reinforced retrieval trials is insufficient to induce long-lasting extinction, then a hippocampal protein synthesis-dependent reconsolidation process recovers the original memory. Inhibition of hippocampal protein synthesis after reversal learning sessions impairs retention of the reversed preference and blocks persistence of the original one suggesting that reversal learning involves reconsolidation rather than extinction of the original memory. In addition, when given systemically or into the CA1 region after non-reinforced retrieval, the partial NMDAr agonist D-cycloserine improves subsequent memory retention. Our results suggest the existence of a hippocampal protein synthesis dependent reconsolidation process that operates to recover or update retrieval-weakened memories from incomplete extinction and suggest that, like consolidation, reconsolidation can be not only blocked but also enhanced by appropriate pharmacological treatments. At present there are no studies about the consequences of hippocampal protein synthesis inhibition in the storage and post-retrieval persistence of object recognition memory. Here we report that infusion of the protein synthesis inhibitor anisomycin in the dorsal CA1 region immediately or 180 min but not 360 min after training impairs consolidation of long-term object recognition memory without affecting short-term memory, exploratory behavior and anxiety state, or hippocampal functionality. When given into CA1 after memory reactivation in the presence of familiar objects ANI did not affect further retention. However, when administered into CA1 immediately after exposing animals to a novel and a familiar object ANI impaired memory of both objects. The amnesic effect of ANI was long-lasting, did not happen either after exposure to two novel objects or following exploration of the context alone or in the absence of specific stimuli suggesting that it was not reversible and contingent on the reactivation of the consolidated trace in the presence of a salient, behavioral relevant novel cue. Our results indicate that hippocampal protein synthesis is required during a limited post training time for consolidation of object recognition memory and show that the hippocampus is engaged during reconsolidation of this type of memory, maybe accruing new information into the original trace.

A enzima -cetoacil-PCA redutase catalisa a redução, dependente de NADPH, de - cetoacil-PCA, a segunda etapa do sistema tipo II de elongação de ácidos graxos em bactérias, plantas e organismos apicomplexos. No presente trabalho, utilizou-se acetoacetil- CoA como substrato para caracterizar cineticamente a reação catalisada pela enzima de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose. O mecanismo cinético da reação foi investigado pela análise de padrões de velocidade inicial, inibição por produtos e efeitos isotópicos primários cinéticos, e os resultados apontam para um mecanismo aleatório em estado estacionário. Efeitos isotópicos cinéticos primários, a-secundários, de solvente e múltiplos, bem como estudos de pH e temperatura, ressonância magnética nuclear e variação dos efeitos isotópicos primários com o pH foram utilizados para determinar o mecanismo químico da reação, e a análise dos resultados sugere que as transferências de hidreto e próton e a re-hibridização dos substratos ocorrem de modo concertado. A interação entre NADPH e enzima foi estudada tanto em condições de equilíbrio quanto em estado pré-estacionário, monitorando-se o aumento na fluorescência do nucleotídeo ao ligar na proteína. Os dados coletados em equilíbrio sugerem a presença de cooperatividade homotrópica positiva entre as subunidades do dímero, e a análise dos dados cinéticos sugere duas formas de enzima livre em solução como base para a cooperatividade. Diálise em equilíbrio foi empregada para caracterizar a ligação de acetoacetil-CoA à enzima, e os resultados indicam que não há cooperatividade na ligação deste substrato. Mecanismos cinético, químico e cooperativo para a reação catalisada pela -cetoacil-PCA redutase de M. tuberculosis são propostos com base nos dados aqui apresentados. / The -ketoacyl-ACP reductase enzyme catalyzes the NADPH-dependent reduction of -ketoacyl-ACP, the second step of type II fatty acid elongation system of bacteria, plants, and apicomplexan organisms. In the present work, acetoacetyl-CoA was utilized as substrate to kinetically characterize the reaction catalyzed by the enzyme of Mycobacterium tuberculosis, the etiogical agent of tuberculosis. The reaction kinetic mechanism was investigated by analyzing initial velocity and product inhibition patterns, and primary kinetic isotope effects, and the results point to a random steady-state mechanism. Primary, a-secondary, solvent, and multiple kinetic isotope effects, as well as pH and temperature studies, nuclear magnetic resonance, and pH variation of primary isotope effects were utilized to determine the reaction chemical mechanism, and analysis of the results suggests that hydride and proton transfer and substrate re-hybridization occur in a concerted fashion. Interaction between NADPH and enzyme was studied both in equilibrium and pre-steadystate conditions, by monitoring the enhancement in nucleotide fluorescence upon its binding to the enzyme. Data collected at equilibrium suggest the presence of positive homotropic cooperativity between subunits of the dimer, and analysis of kinetic data suggests two forms of free enzyme in solution as the basis for cooperativity. Equilibrium dialysis was employed to characterize the binding of acetoacetyl-CoA to the enzyme, and the results indicate there is no cooperativity in the binding of this substrate. Kinetic, chemical, and cooperaive mechanisms for the M. tuberculosis -ketoacyl-ACP reductasecatalyzed reaction are proposed on the basis of the data presented here.

Made available in DSpace on 2018-08-02T00:16:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10756_Tese Vinícius Novo Gama_final.pdf: 2273233 bytes, checksum: cdf5cf49bd7b0281d52620d0a5a1dbd2 (MD5) Previous issue date: 2017-03-03 / Os relatos contraditórios quanto às adaptações funcionais sob irradiância do pau-brasil (Paubrasilia echinata Lam.) podem ter relação com a divergência morfológica refletida por variações genéticas entre populações desta espécie. Este fato dificulta uma classificação precisa deste vegetal para propagação e manutenção de mudas, bem como reintrodução ex situ à floresta atlântica brasileira. Com o intuito de fornecer informações mais precisas para a conservação e promoção de manejos florestais mais adequados com P. echinata, o objetivo deste trabalho foi caracterizar as respostas morfofisiológicas e bioquímicas de três morfotipos de pau-brasil: o pequeno (SV small variant), médio (MV medium variant) e grande (LV large variant), em relação à irradiância. Em um primeiro trabalho realizaram-se medidas de crescimento, trocas gasosas, teores de compostos fenólicos, atividade de enzimas antioxidantes (CAT, APX, POD e PPO) e concentração de auxinas totais dos três morfotipos sob 100% e 15% de irradiância. Registrou-se que o metabolismo secundário, o processo antioxidativo, os parâmetros da fotossíntese e crescimento apontam o LV e o MV como variações morfológicas com tendências para plantas heliófilas. Diferentemente do SV que se apresentou tendente à umbrófila. Essa divergência adaptativa sob a alta irradiância entre os morfotipos de pau-brasil instigaram o desenvolvimento de um segundo trabalho, buscando avaliar os efeitos da suplementação da radiação UV-B incidente a um morfotipo heliófilo, o MV e um umbrófilo, o SV. Para isso, realizaram-se medidas de crescimento, fotossíntese, teores de compostos de absorção do UV, carboidratos estruturais e não estruturais, bem como quantificação de teores de peróxido de hidrogênio e malonaldeído (MDA). O efeito da UV-B mostrou-se positivo no MV, uma vez que melhorou sua eficiência fotoquímica e otimizou suas trocas gasosas e crescimento. A incidência de UV-B causou efeitos adaptativos em MV que se apresentou com alto grau de tolerância a essa radiação. Este fato pode ser explicado pelo comportamento heliófilo deste morfotipo, com tolerância a ambientes com prevalência de alta irradiância ricos em UV. Pro outro lado, a incidência da radiação estimulou efeitos fotoinibitórios no SV, que apresentou menor crescimento, menor taxa fotossintética e alta respiração. O aumento dos teores de peróxido de hidrogênio estimularam danos oxidativos em SV traduzidos visivelmente em áreas cloróticas foliares que evoluíram para necrose e abscisão foliar. Partindo de relatos de trabalhos florísticos já publicados quanto à incidência natural dos morfotipos de P. echinata, observa-se que o SV pode ser encontrado, predominantemente, em matas umbrófilas densas ou matas de tabuleiro com alto sombreamento; enquanto o MV e o LV podem ser encontrados em regiões com prevalência de matas mais abertas, com mais clareiras e maior irradiância. Conclui-se que as diferenças exibidas pelos três morfotipos de pau-brasil quanto à irradiância contrastante e à exposição da radiação ultravioleta-B (UV-B) apresentadas neste trabalho parecem refletir as condições preponderantes de seus centros de origem. Neste sentido, sugere-se a utilização do SV, com características umbrófilas, para recuperação de áreas de mata atlântica mais densa, com prevalência em regiões pluviais e litorâneas úmidas. Já quanto ao MV e ao LV, recomenda-se seus plantios em matas estacionais deciduais e semideciduais da floresta atlântica, com prevalência de clareiras e altas irradiâncias. Palavras-chave: Bioquímica vegetal luminosidade morfofisiologia vegetal pau-brasil ultravioleta-B.

A produção de pectinases por Aspergillus niger LB-02-SF foi estudada, em processo submerso, com o objetivo de avaliar condições de processo de obtenção, caracterizar e utilizar as enzimas produzidas. As condições de processo estudadas foram a composição do meio de cultivo, a adição de pectina (indutor enzimático) ao meio após a fase de intenso crescimento celular, a utilização de inóculo vegetativo e estratégias de controle do pH. Adicionalmente, o extrato enzimático bruto foi caracterizado quanto à temperatura e ao pH de reação e utilizado no tratamento de suco de maçã Gala. Com o meio de cultivo formulado, que não contém glicose na composição, foi verificada a redução do crescimento celular, sem afetar a produção de pectinases e facilitando o controle dos parâmetros de processo. A adição de pectina quando o pH atingiu o valor de 2,7 (22 horas) não influenciou o crescimento fúngico, sendo que a concentração celular máxima (11,0 g/L) e o tempo em que ela ocorreu (48 horas) foram semelhantes aos observados na condição controle, com pectina presente no meio desde o início do processo (11,5 g/L em 41 horas). Nesta condição de adição de indutor enzimático, a produção de pectinases foi favorecida, sendo atingida atividade máxima de 14 U/mL, cerca de 40% superior à da condição controle, no mesmo tempo de cultivo (135 horas). A utilização de inóculo vegetativo levou à redução da fase de adaptação do microrganismo ao meio. Concentrações de 5 e 10% (v/v) favoreceram o crescimento celular; no entanto, foram verificadas atividades enzimáticas máximas de 5,5 e 3,8 U/mL, inferiores à obtida com a inoculação por esporos (6,4 U/mL). Além disso, não foi observada redução dos tempos em que os picos de atividade enzimática ocorreram. No cultivo com a queda natural do pH inicial de 4,0 para o mínimo atingido (pH 2,5) e posterior controle neste valor, foi obtida atividade enzimática máxima de 7,5 U/mL, superior às atingidas no cultivo com controle de pH em mínimo de 2,7 e no cultivo com pH não controlado, de 6,4 e 3,5 U/mL, respectivamente. Nos cultivos em frascos sob agitação, valores iniciais de pH de 2,0, 3,0 e 4,0 foram os que proporcionaram a obtenção de maiores valores de fator de produção específica (YP/X). Em cultivos em biorreator com o pH controlado nestes valores durante todo o processo, verificou-se que o crescimento celular foi favorecido em pH 3,0, com a concentração máxima de biomassa (10,2 g/L) sendo atingida cerca de 90 horas antes do pico observado no cultivo com pH 2,0 constante (7,7 g/L). Por outro lado, a produção de pectinases foi favorecida em pH 2,0, com pico de atividade enzimática de 9,5U/mL, superior aos determinados com pH constante de 3,0 e 4,0, de 4,7 e 2,0 U/mL, respectivamente. A estratégia de condução do cultivo que possibilitou a obtenção da maior atividade enzimática, de 13,2 U/mL, foi em pH inicial de 3,0 e mantido até que fosse atingido no meio a concentração de oxigênio dissolvido de 30%, sendo então reduzido para 2,0 pela adição de H2SO4. Nesta condição, o crescimento celular não foi afetado, resultando em maior fator de produção específica (1,26 U/mg). A ação das enzimas pectinolíticas produzidas em cultivo líquido foi favorecida em pH 4,0 e em temperatura de 50ºC. A estabilidade das enzimas formadas é favorecida em pH 3,0, sendo observada a manutenção de 90% da atividade inicial após 120 horas de exposição. Com a exposição do extrato enzimático às temperaturas de 30, 40 e 50ºC, 100% da atividade enzimática inicial foram preservados por até 180 minutos. Na avaliação da ação do extrato enzimático no tratamento de suco de maçã, os resultados foram estatisticamente semelhantes aos observados após o uso de preparação pectinolítica comercial. Após o tratamento enzimático, foi determinado aumento de clarificação de 79%, com a redução da turbidez e da viscosidade em 98 e 10%, respectivamente. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que as condições avaliadas para o processo submerso influenciam efetivamente na produção de pectinases e que estas enzimas têm potencial para serem utilizadas em formulações para a clarificação de sucos de frutas. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / The production of pectinases by Aspergillus niger LB-02-SF was carried out in submerged process, aiming to evaluate process conditions and to characterize and utilize the produced enzymes. The process conditions evaluated were medium composition, addition of pectin (enzymatic inducer) to the medium after the phase of intense cellular growth, use of vegetative inoculum and strategies to pH control. Additionally, the crude enzyme extract was characterized with respect to temperature and pH of reaction and used in Gala apple juice treatment. By using the cultivation medium formulated, which does not contain glucose, it was verified the decrease of the cellular growth without affecting the pectinase production and facilitating the control of the process parameters. The addition of pectin when the pH reached the value of 2.7 (22 hours) did not influence the fungal growth, noticing that the maximum cellular concentration (11.0 g/L) and the time that it occurred (48 hours) were similar to the ones obtained at the control condition, which had pectin in the medium since the beginning of the process (11.5 g/L at 41 hours). In this condition of enzyme inducer addition, the pectinase production was favored, reaching a maximum activity of 14 U/mL, ca. of 40% superior to that of control condition, at the same cultivation time (135 hours). The use of vegetative inoculum led to a decrease in the adaptation phase of the microorganism to the medium. Concentrations of 5 and 10% (v/v) enhanced the cellular growth; however, maximum enzyme activities of 5.5 and 3.8 U/mL were attained, which are lower than that obtained with spore inoculation (6.4 U/mL). In addition, it was not observed a reduction of the times in which the enzyme activity peaks occurred. In the cultivation with natural decrease of the initial pH 4.0 to the minimum reached (pH 2.5) and further control in this value, it was obtained maximum enzyme activity of 7.5 U/mL, which is higher than the ones obtained in the cultivation with pH controlled at minimum of 2.7 and in the cultivation with no pH control, of 6.4 and 3.5 U/mL, respectively. In shaken flasks cultivations, initial pH values of 2.0, 3.0, and 4.0 resulted in highest values for the specific production factor (YP/X). In bioreactor cultivations with the pH controlled at these values along the process, it was verified that the cellular growth was favored at pH 3.0, with the maximum biomass concentration (10.2 g/L) attained about 90 hours before the peak observed in the run at constant pH 2.0 (7.7 g/L). On the other hand, pectinase production was favored in pH 2.0, with enzyme activity peak of 9.5 U/mL, which is higher than the ones obtained with constant pH of 3.0 and 4.0, of 4.7 and 2.0 U/mL, respectively. The strategy of cultivation conduction that enabled the highest enzyme activity of 13.2 U/mL was the use of initial pH 3.0, its control until the dissolved oxygen concentration in the medium reached 30%, and then decreasing to 2,0 by adding H2SO4. In this condition, the cellular growth was not affected, resulting in high specific production factor (1.26 U/mg). The action of pectinolytic enzymes obtained in liquid cultivation was favored at pH 4.0 and temperature of 50°C. The stability of formed enzymes is favored at pH 3.0, being observed the maintenance of about 90% of the initial activity after 120 min of incubation. At 30, 40 and 50°C, after 180 minutes of exposure, 100% of the initial enzyme activity were maintained. The enzyme extracts obtained were used in enzymatic treatment of Gala apple juice and they had comparable effects to those observed after using commercial pectinolytic preparation. After the enzymatic treatment, it was identified 79% of apple juice clarification, with 98 and 10% of turbidity and viscosity reduction, respectively. The results obtained in this work show that the conditions assessed for submerged process effectively influence pectinase production and that these enzymes have potential to be used in formulations for fruit juices clarification.

Orientador: Denise Bertoli Braga / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Estudos da Linguagem / Made available in DSpace on 2018-08-03T07:57:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_Valdir_M.pdf: 7210354 bytes, checksum: 3e960169bd45ae5eda4d58748793156a (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A presente pesquisa discute a interação social e as estratégias lingüísticas recorrentes no processo de produção do conhecimento, entre os participantes em uma disciplina de Bioquímica da Nutrição oferecida a distância via Internet na Unicamp. Para tanto, tomo como pressuposto teórico a abordagem sócio-cultural de Vygotsky (1978) e os conceitos de andaime - scaffolding propostos por Wood et al (1976). O corpus de análise do presente estudo é composto por seções de Bate Papo (Discussões Monitoradas e Discussões de Avaliação) que ocorreram durante o oferecimento dessa disciplina. Dessa forma, a pesquisa buscou entender e aprofundar o conhecimento sobre a natureza lingüística das mensagens produzidas nos chats educacionais e como ocorre o processo de interação pedagógica produzida colaborativamente nesse contexto de ensino / Abstract: The present research discusses the social interaction and the linguistic strategies in the process of collaborative production of knowledge. For this reason, it takes as theoretical purpose the socialcultural concept of Vygotsky and the concept of scaffolding proposed by Wood (1976). The corpus o f the present study is composed by different modes o f chats (Monitored Discussions and Evaluation Discussions) applied in a discipline of Biochemistry of the Nutrition, offered through the Internet. This work aims to understand and deepen the knowledge on the linguistic nature of the messages produced in the educational chats and in the pedagogical interaction of the collaborative knowledge produced by the participants / Mestrado / Ensino-Aprendizagem de Segunda Lingua e Lingua Estrangeira / Mestre em Linguística Aplicada

Tese (livre-docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:46:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reis_FranciscodeAssisMachado_LD.pdf: 5004698 bytes, checksum: b883459e0650ad1b2a43bb536cd1456e (MD5) Previous issue date: 1985 / Tese (livre-docencia) - Univer

Diseñador Industrial / El proyecto en sí consta de un sistema que permite al científico documentar proteínas en tres canales de emisión a partir sólo de una membrana. El proyecto, desde la visión macro, es resuelto por un equipo multidisciplinar formado por estudiantes de Bioquímica, Biotecnología y Diseño Industrial, dirigidos por un profesional de la ciencia para su tesis doctoral; teniendo cada uno de los integrantes una misión específica, lo que se describe como visión micro del proyecto (proyectos individuales), con el fin de hacer de las investigaciones y desarrollo realizados, un producto que se acomode a las necesidades de los científicos que trabajan día a día con proteínas, poniendo a su disposición un sistema que permite optimizar su trabajo en términos de tiempo, insumos a utilizar y calidad de resultados.

Memoria para optar al título de Bioquímico / El metabolismo y la función fisiológica cardíaca se mantienen gracias a la actividad mitocondrial. Estas últimas son estructuras fundamentales en la fisiología de las células eucariontes dado que participan en una amplia gama de procesos, entre los que se incluyen la generación de energía, tamponamiento del ion Ca+2 y la regulación de la apoptosis. La mitocondria sufre procesos regulados de fusión y fisión, siendo cada uno de estos eventos mediados por complejos de proteínas GTPasas como Fis-1 y la proteína de la familia de las dinaminas Drp-1. Fis-1 se encuentra difusamente asociada a la membrana mitocondrial externa (MME) y recluta a Drp-1 dfesde el citosol a focos específicos de la membrana mitocondrial durante el proceso de fisión. La pérdida del balance entre los procesos de fisión y fusión se asocia a alteraciones en la función mitocondrial y ciertas condiciones patológicas. A nivel celular, la fisión mitocondrial se ha relacionado con la muerte celular por apoptosis, la cual depende a su vez del estímulo utilizado. La pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial y fragmentación de estos organelos ocurren durante la apoptosis, eventos que tienen lugar en forma concomitante con la activación de proteínas pro-apoptóticas de la familia Bcl-2 y caspasas. Sin embargo, existen algunos modelos donde la fisión de la red mitocondrial no se presenta durante el proceso de muerte. La maquinaria de la fisión mitocondrial no ha sido estudiada en cardiomiocitos bajo condiciones de integridad de la red mitocondrial. El objetivo de este trabajo consistió en evaluar los cambios inducidos en las proteínas Fis-1 y Drp-1 al desencadenar la fragmentación de la red mitocondrial por ceramidas en cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas. Nuestros principales resultados mostraron que Drp-1 y Fis-1 están presentes en cardiomiocitos con características similares a otros modelos celulares. C2-ceramida desencadenó un descenso rápido en el potencial mitocondrial de membrana, fragmentación de la red de estos organelos en forma dependiente del tiempo y concentración de C2-ceramida y modificación del patrón de distribución y expresión de las proteínas Drp-1 y Fis-1 alcanzando un 20% de colocalización entre ambas. La exposición de los cardiomiocitos durante 6 h a C2-ceramida 40 μM gatilló la salida del citocromo C desde la mitocondria al citosol y produjo un 35% de muerte. La disminución de los niveles de mitofusina-2 mediante la sobrexpresión de un adenovirus antisentido contra la proteína de la fusión mitocondrial Mfn-2 (AsMfn-2) cambió por si sola la morfología mitocondrial, el patrón de distribución de Drp-1 y Fis-1 y alteró las cinéticas de la caída del potencial de membrana mitocondrial, pero no la salida del citocromo C desencadenada por C2-ceramida. En conclusión, los resultados indican que los componentes de la maquinaria de la fisión mitocondrial se encuentran presentes en cardiomiocitos y que C2-ceramida gatilla su muerte por medio un proceso apoptótico que involucra la disrupción y fisión de la red mitocondrial / Cardiac metabolism and physiological function are supported by mitochondria activity. They are main players in the physiology of eukaryotes; they provide a myriad of services to the cell, including energy production, Ca+2 buffering and regulation of apoptosis. Mitochondria undergo regulated fusion and fission and each of these events are mediated by GTPase protein complexes such as Fis-1 and the dynamin-related protein Drp-1. Fis-1 is diffusely located throughout the outer mitochondrial membrane (OMM) and recruit Drp-1 from the cytoplasm to punctuate foci on the OMM during the fission process. The loss of balance between fusion and fission events has been associated with mitochondria loss of function and pathological conditions. At cellular level, mitochondria fission has been associated with apoptotic cell death in a stimulus dependent manner. Loss of mitochondria integrity and activation of fission proteins occurred concomitant with proapoptotic Bcl-2 and caspase cascade activation, even when there are some models where mitochondria fission is not present in the apoptotic process. Mitochondria fission machinery has not been studied in cardiomyocytes under loss of mitochondria network integrity conditions. We evaluated here Fis-1 and Drp- 1 changes when we induce mitochondrial network fragmentation by ceramides treatment in cultures neonatal cardiomyocytes. The main findings of this work was that Drp-1 and Fis-1 are present in cardiomyocytes with similar distribution pattern that other cell types. C2-ceramides promoted a rapid decrease in mitochondrial membrane potential, mitochondria network fragmentation in a dose and time dependent manner with both Drp-1 and Fis1 modification of expression and distribution pattern reaching a 20% of colocalization between both proteins. We also found that the exposure of cardiac myoctes for 6 h to C2-ceramide 40 μM induced the release of cytocrome C from mitochondria to cytosol and triggered 35% death. The overexpression of AsMfn-2 (mitofusin-2 antisense, a mitochondrial fusion inhibitor) changed mitochondrial cardiomyocyte morphology, the distribution pattern of Drp-1 and Fis-1 and altered the kinetic of the decrease in mitochondrial membrane potential, but not the release of citochrome C promoted by C2-ceramide. In conclusion, the results indicate that the components of fission mitochondrial machinery are in cardiomyocytes and C2-ceramide triggers their death by an apoptotic process that involves the disruption and fission of the mitochondrial network

Memoria para optar al título de Bioquímico / El factor de crecimiento nervioso (NGF) es una neurotrofina, que inicialmente fue descrita en el cerebro, y que en los últimos años ha adquirido importancia, debido a que actúa en sitios no-neuronales, entre ellos el ovario, donde se ha encontrado que NGF participa en el desarrollo ovárico, proliferación y diferenciación de células somáticas y en la esteroidogénesis. Una de las etapas importantes que ocurren durante el desarrollo folicular y del cuerpo lúteo es la angiogénesis, una de las moléculas importantes en este proceso es el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF). NGF aumenta la expresión de VEGF en diversos tipos celulares. VEGF es regulado en forma directa por el gen inducible por hipoxia (HIF-1) y en forma indirecta por c-Myc. Además c-Myc, es un gen involucrado en la proliferación celular. En este trabajo se investigó el rol que cumple NGF en la regulación de VEGF y la proliferación celular. Para este fin se utilizaron células de granulosa humana, provenientes de pacientes del programa de fertilización asistida, las cuales se cultivaron por 2, 4, 8 y 18 horas con NGF (50 ng/ml). Se midieron los niveles del ARNm de VEGF, c-Myc e HIF-1 alfa por RT-PCR. En este trabajo el ARNm de las isoformas de VEGF 165 y 121 aumentaron a las 4 y 8 horas respectivamente, los niveles del ARNm de HIF-1 alfa se mantuvieron inalterados a todos los tiempos estudiados. Los niveles de ARNm de c-Myc aumentaron a las 8 y 18 horas por efecto de NGF. Por Inmunocitoquímica se determinó Ki67, un marcador de proliferación celular. La proteína Ki67 aumentó a las 8 y 18 horas por efecto de NGF, concordando con la expresión génica de c-Myc. Los resultados indican que NGF presenta la capacidad de aumentar, tanto la expresión del ARNm de VEGF, como la proliferación en forma independiente, y que este aumento en la proliferación sería en una etapa posterior al alza de VEGF y que probablemente el VEGF expresado en las células de granulosa humana en cultivo, éste involucrado en la proliferación directamente, esto podría suponer que una falla en la producción de NGF por parte del folículo podría llevar a éste a un crecimiento y maduración deficiente, debido a que no ocurriría una angiogénesis y proliferación adecuada / The nerve growth factor (NGF) is a neurothrophin, initially described in the brain, that has acquired importance in the last few years, because it has several functions in non-neuronal tissues. One of these tissues is the ovary, where NGF participates in the ovarian development, proliferation and differentiation of somatic cells and steroidogenesis. Angiogenesis is an essential stage during follicular and luteal development, and one of the most important molecules in this process is the vascular endothelial growth factor (VEGF). NGF increases VEGF expression in different cell types. VEGF is directly regulated by hypoxia inducible factor-1(HIF-1) and indirectly by c-Myc. c-Myc is also a gene involved in cell proliferation. This work investigated the role of NGF in regulating VEGF and cell proliferation. To this aim, granulosa cells obtained from patients undergoing in vitro fertilization were cultured for 2, 4, 8 and 18 hours with NGF (50 ng/ml). The levels of VEGF, c-Myc and HIF-1alpha mRNA were evaluated by RT-PCR. mRNA for VEGF 165 and VEGF 121 isoforms increase at 4 and 8 hours respectively. HIF-1alpha mRNA levels did not change at any time. NGF (50ng/ml) induces c-Myc mRNA increase at 8 and 18 hours. Ki67 protein, a cell proliferation marker, was determined by immunocytochemistry. Ki67 protein increases at 8 and 18 hours with NGF stimulation, and no change was observed at 4 hours, agreeing with the genic expression of c- Myc. The results indicate that NGF is able to increase VEGF mRNA expression and cell proliferation by independent ways, and that the increase in the proliferation would be a later stage to VEGF's rise. It is probable that the VEGF expressed in cultured human granulosa cells acts directly on cell proliferation, suggesting that fails in follicular NGF production might induce a deficient follicular growth and maturation, due to impairment in angiogenesis and cell proliferation