Memoria para optar el título de Bioquímico / La aparición de vibriosis en los cultivos de peces en Chile ha causado masivas mortalidades de salmónidos cultivados en el sur de nuestro país. Debido a la gran trascendencia económica de esta patología se han estudiado 77 aislados, los cuales han sido identificados a nivel de especie y caracterizados genética, molecular y antigénicamente con el fin de desarrollar futuras medidas de prevención. El análisis de la secuencia del gen rRNA 16S de todos los aislados, permitió identificarlos dentro de las especies Listonella anguillarum (antes Vibrio anguillarum) y Vibrio ordalii. Trece aislados se relacionaron genéticamente a la especie L. anguillarum y un grupo mayoritario de 61 aislados presentó homología con la secuencia tipo de V. ordalii. Desde el punto de vista genético, molecular y antigénico, las cepas chilenas de V. ordalii constituyen un grupo homogéneo. Por el contrario, las cepas de L. anguillarum son heterogéneas en cada una de las propiedades señaladas anteriormente. De esta forma, mediante la técnica de electroforésis de campo pulsado (PFGE) fue posible observar al menos 3 grupos genéticos dentro de las cepas chilenas de L. anguillarum. Sin embargo, al emplear métodos basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa de elementos repetitivos (PCR-ERIC y PCRREP) fue posible obtener mayores diferencias, las que podrían ser empleadas para el seguimiento de un aislado en particular con fines de llevar a cabo estudios epidemiológicos. Además, se determinó la existencia de dos grupos serológicos mayoritarios dentro de los aislados chilenos de L. anguillarun, los cuales no pertenecen a los serotipos O1 y O2 que comunmente están asociados a la vibriosis clásica que afecta a especies salmónideas. Los estudios de virulencia demostraron que las cepas de L. anguillarum y V. ordalii son capaces de causar mortalidad en peces de la especie salmón del Atlántico (Salmo salar), reproduciendo fielmente los signos característicos de ambas patologías. Esta tesis constituye el primer reporte de L. anguillarum como agente causal de vibriosis en salmónidos en Chile

Memoria para optar al título de Bioquímico / La expresión génica dependiente de manganeso no se comprende del todo en organismos eucariontes. Decidimos intentar comprender de mejor forma este proceso utilizando el basidiomicete Ceriporiopsis subvermispora, ya que el manganeso cumple un rol importante en su metabolismo degradante de lignina. Dado que el genoma de este organismo no se encuentra disponible, utilizamos la técnica de cDNA-AFLP para realizar un estudio global de la expresión génica dependiente de manganeso el cual dio interesantes resultados. De 37 fragmentos derivados de transcriptos (TDFs) secuenciados, 21 fueron analizados, identificados y clasificados en razón a su expresión diferencial en respuesta a manganeso. El análisis de estos resultados nos permitió encontrar varios genes cuya expresión se encuentra regulada por este metal y además postular posibles roles homeostáticos para varios de ellos. Entre los hallazgos más importantes podemos mencionar que el estrés por manganeso produce cambios a nivel celular tales como: (1) un aumento en la actividad traduccional, (2) un aumento en la biosíntesis de membranas celulares para la compartamentalización, almacenamiento y destoxificación del manganeso con la concomitante activación de la vía secretora, y (3) un aumento en la biosíntesis de “núcleos Fe-S”. Además, postulamos que existen dos proteínas que participarían como reguladores de la expresión de factores homeostáticos para el estrés por manganeso. La proteína SSD1 participaría activamente regulando la expresión de factores homeostáticos de forma post-transcripcional en respuesta a concentraciones ascendentes del metal, mientras que la proteína Erd2 tendría la misma función, pero en respuesta a concentraciones descendentes. Estudiamos las regiones reguladoras río arriba del sitio de inicio de la traducción de genes relacionados con la homeostasis de manganeso derivados de este estudio y de la literatura. Esto nos permitió identificar la presencia de sitios de unión para los factores de transcripción ACE1 y HAP1, los cuales podrían mediar un efecto sinérgico en la activación de la transcripción manganeso-dependiente, siendo putativamente ACE1 el factor principal. / Manganese-dependent gene expression is not fully understood in eukaryotic organisms. This study aims to understand this process in a better way utilizing the basidiomycete C. subvermispora, since manganese plays an important role in its lignin degrading metabolism. Since the genome of this organism is not available, we used cDNA-AFLP technique to perform a global manganese-dependent gene expression profiling that yielded interesting results. Out of 37 sequenced transcript derived fragments (TDFs), 21 were further analyzed, identified and classified according to their differential expression profile in response to manganese. The analysis of these results allowed us to find various genes whose expression is regulated by this metal, and also postulate possible homeostatic roles for some of them. Among the most important findings we describe that manganese stress produces changes at the cellular level, such as: (1) increased cellular translational rate, (2) increased biosynthesis of cellular membranes for the compartmentalization, storage and detoxification of manganese with a concomitant increased activity of the secretory pathway, and (3) an increased biosynthesis of Fe-S clusters. Even more, we postulate that there are two proteins that participate as regulators of manganese homeostatic expression of factors in response to manganese stress; SSD1 protein would actively regulate post-transcriptionally the expression of homeostatic factors in response to increasing metal concentration, while Erd2 would have the same function yet in response to decreasing concentrations. We studied upstream regulatory regions of genes related to manganese homeostasis by this study or the literature; this allowed the identification of repetitively found transcription factor binding sites for ACE1 and HAP1, which may mediate a synergic effect on the activation of manganese-dependent gene expression, where ACE1 would be the main putative synergic mediator

Memoria para optar al título de Bioquímico / La incidencia de infecciones nosocomiales en pacientes oncológicos inmunodeprimidos es entre 2 y 10 veces superior al de otros grupos de pacientes. Entre las infecciones nosocomiales, las bacterias y hongos oportunistas son de particular interés debido a su influencia en la morbilidad, mortalidad y costos terapéuticos asociados a este grupo de pacientes. El tiempo que demora el laboratorio en determinar el agente que causa el cuadro infeccioso es crítico dado que permite un tratamiento específico, y por ende una mayor tasa de éxito. Usando técnicas microbiológicas tradicionales, se detecta el agente infeccioso sólo en el 20- 40% de los casos con procedimientos que requieren de al menos 3 días. Esta memoria propone utilizar la técnica de biología molecular Múltiplex PCR para obtener un diagnóstico concluyente en 5 horas. Nuestro sistema de diagnóstico permite la detección in vitro simultánea y rápida de los patógenos oportunistas que frecuentemente causan estados de neutropenia febril en pacientes oncológicos, por lo que esta memoria evaluará la capacidad del sistema montado para detectar estos patógenos en muestras clínicas. De resultar exitoso este estudio, impactaremos beneficiosamente la rapidez con la que se podrá tomar una decisión terapéutica informada y mejoraremos la expectativa de vida de pacientes inmunodeprimidos / The incidence of nosocomial infections in immunocompromised cancer patients is between 2 and 10 times higher than other groups of patients. Among the nosocomial infections, opportunistic bacteria and fungi are of particular interest because of their impact on morbidity, mortality and treatment costs associated with this group of patients. The time taken for the laboratory to determine the agent causing the infection is critical because it allows a specific treatment and therefore a higher rate of success. Using traditional microbiological techniques, the infectious agent is detected only in 20- 40% of patients with procedures that require at least three days. This thesis proposes to use the technique of molecular biology technique of Multiplex PCR to obtain a conclusive diagnosis in 5 hours. Our diagnostic system allows simultaneous detection and rapid in vitro detection of opportunistic pathogens that frequently cause states of febrile neutropenia in cancer patients. In this work will evaluate the ability of our Multiplex PCR system to detect these pathogens in clinical samples. If this results successful, we will produce a positive impact on the speed with which physicians may take informed treatment decisions and improve the life expectancy of immunosuppressed patients

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Thesis Submitted in Partial Fulfillment for the Requirements to achieve the Degree of PhD in Biochemistry / El genero Salmonella comprende a mas 2,500 serotipos conocidos distribuidos en dos especies: enterica y bongori. Estos serotipos difieren mucho en términos de patogenicidad y especificidad hospedero. Dos serotipos de Salmonella entérica son de especial relevancia: los serotipos Gallinarum y Enteritidis. S. Gallinarum presenta un rango hospedero restringido a aves y causa una severa enfermedad sistémica conocida como tifoidea aviar, la que causa grandes perdidas económicas en la producción aviar en distintas partes del mundo. S. Enteritidis, en cambio, infecta a un amplio rango de hospederos incluyendo humanos, ratones y aves. A diferencia de S. Gallinarum, S. Enteritidis genera una infección subclinica en los pollos, y las aves infectadas pueden convertirse en portadores crónicos, poniendo huevos contaminados por Salmonella. El consumo humano de productos aviares o huevos resulta en un cuadro de gastroenteritis aguda autolimitante, la cual es responsable por ~61% del 1.5 millones de casos de salmonelosis reportados entre los años 1995 y 2008 (WHO Global Foodborne Infections Network Country Databank). Existen pocos trabajos realizados sobre los mecanismos moleculares detrás de la adaptación al hospedero aviar y sobre las implicancias clínicas de las infecciones causadas por los serotipos Enteritidis y Gallinarum, sin embargo evidencia reciente sugiere que estos serotipos poseen factores de virulencia no descritos que pueden ser responsables de estas diferencias. La interación entre las bacterias y sus hospederos es guiada por una comunicación dinámica que busca influenciar la respuesta del hospedero. Dentro de las herramientas utilizadas por las bacterias para influir la respuesta de sus hospederos, las maquinas secretoras que entregan proteínas y toxinas hacia el ambiente intracelular de sus blancos eucariontes son cruciales para la supervivencia y virulencia bacteriana. El Sistema de Secreción Tipo VI (T6SS) es un nuevo mecanismo de translocación de proteínas que existe en la mayoría de bacterias Gram-negativo que se encuentran en contacto íntimo con células eucariontes, incluyendo a aquellas que son patógenos humanos y de plantas. El papel preciso que cumplen estos T6SS todavía es desconocido pero es claro que cumple un papel importante en la virulencia bacteriana. En Salmonella enterica, solo se ha descrito un T6SS el cual esta codificado en la Isla de Patogenicidad 6 de Salmonella (SPI-6). En esta tesis, a través de análisis bioinformaticos y de genomica comparativa se determinó que el genero Salmonella codifica 5 T6SS, distribuidos diferencialmente entre distintos serotipos y con historias evolutivas diferentes. Los nuevos T6SS fueron identificados en islas genómicas designadas SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22. Ademas de la identificación de estas islas, una nueva proteína VgrG “evolucionada” con un dominio del tipo S-Piocina fue identificado en SPI-21. La presencia de este dominio sugirió por primera vez un papel de los T6SS en muerte bacteriana, abriendo un nuevo capitulo en el estudio de T6SS y su papel en relaciones interbacterianas. El T6SS de SPI-19 fue de especial relevancia debido a su amplia distribución dentro de serotipos virulentos de Salmonella y porque análisis bioinformaticos mostraron que mientras Gallinarum codifica un T6SS completo, el serotipo Enteritidis solo codifica para remanentes de este sistema. A pesar de estar estrechamente relacionados, los serotipos Gallinarum y Enteritidis presentan diferencias profundas en su rango de hospederos y patogenicidad. Por lo tanto, es posible especular que la presencia de un T6SS activo esta relacionada de alguna manera con las diferencias en especificidad hospedero y patogenicidad presentada por estos dos serotipos. Para resolver esta hipótesis y determinar la contribución de SPI-19 a la patogenicidad de Salmonella, el objetivo de esta tesis fue determinar si la isla genomica SPI-19 codifica un T6SS funcional que contribuye a la patogenicidad de Gallinarum y Enteritidis en el hospedero aviar. De manera de caracterizar el T6SS de SPI-19, fusiones génicas y de operon fueron construidas y la expresión, producción y secreción de componentes del T6SS fueron evaluadas bajo diferentes condiciones de crecimiento in vitro. El análisis mostro que la mayoría de los componentes se mantienen reprimidos bajo las condiciones analizadas. Infección de macrófagos murinos con una cepa de Gallinarum con una fusión entre el componente estructural/secretado VgrG al reportero GFP, mostró que los componentes del T6SS son preferencialmente producidos al interior de células infectadas. Mutantes por deleción no polares de la isla SPI-19 y componentes específicos del T6SS reveló que este T6SS es necesario para la supervivencia de Salmonella Gallinarum al interior de macrófagos a tiempos tardios de infección. Sin embargo, el T6SS de SPI-19 no pudo ser asociado muerte celular o citotoxicidad de macrófagos inducida por Salmonella. Para determinar la contribución del T6SS de SPI-19 a la patogenicidad de Salmonella, mutantes del T6SS fueron analizadas en ensayos de competencia contra la cepa silvestre de Gallinarum. Infección oral de pollos White Leghorn de cuatro días de edad, reveló que las mutantes del T6SS colonizaron pobremente el ileo, ciego, hígado y bazo comparado a la cepa silvestre. Restitución de SPI-19 a la mutante SPI- 19, utilizando el sistema VEX-Capture, complementó este defecto en colonización. Para analizar el impacto de poseer un T6SS completo en la habilidad de S. Enteritidis para colonizar al hospedero aviar, la SPI-19 de Gallinarum fue transferida a Enteritidis. Experimentos in vivo mostraron que la presencia de una SPI-19 completa aumento significatvamente la habilidad de Enteritidis para colonizar el ileo, hígado y bazo de pollos infectados al dia 1 post-infección. Sin embargo, esa ventaja en la colonización no fue duradera ya que esta cepa mostró un fuerte defecto en la colonización desde el día 3 post-infección hasta el final de los experimentos. Estos resultados sugieren que transferencia de SPI-19 desde S. Gallinarum tiene un impacto negativo en la habilidad de S. Enteritidis para colonizar el hospedero aviar. De esta forma podemos especular que perdida del T6SS de SPI-19 corresponde a un evento patoadaptativo durante la evolución de S. Enteritidis. Del mismo modo, este es el primer trabajo en el que se utiliza el método VEX-Capture para determinar el efecto de la transferencia de islas genómicas en un modelo animal de infección bacteriana. El reciente descubrimiento de Sistemas de Secreción Tipo VI (T6SS) ha abierto un nuevo capitulo en el estudio de la adaptación de Salmonella hacia sus hospederos y el medio ambiente. Si Salmonella codifica T6SS y si aquellos pueden ser considerados eventos evolutivos cuanticos, fueron algunas de las preguntas que el descubrimiento de los T6SS en los genomas bacterianos generó. En esta tesis, hemos expandido el actual conocimiento sobre los T6SS bacterianos y el potencial patogénico de Salmonella mediante: i) la identificación y descripción de 4 nuevas Islas de Patogenicidad de Salmonella (SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22) que codifican para T6SS filogenéticamente distintos, ii) el descubrimiento de una nueva “VgrG” evolucionada que sugirió por primera vez un papel de los T6SS en relaciones interbacterianas, iii) identificando que el T6SS de SPI-19 contribuye a la supervivencia intracelular de Salmonella en macrófagos y iv) determinando que el T6SS de SPI-19 contribuye a la colonización de pollos por S. Gallinarum. / The Salmonella genus includes over 2,500 known serotypes distributed between the two species: enterica and bongori. These serotypes differ greatly in terms of pathogenicity and host specificity. Two Salmonella enterica serotypes are of significant relevance: serotypes Gallinarum and Enteritidis. S. Gallinarum has a host range restricted to birds and causes a severe systemic disease called fowl typhoid, which causes major economic losses in poultry production in several parts of the world. S. Enteritidis on the other hand, infects a broad range of hosts including humans, mice and avian species. In contrast to S. Gallinarum, S. Enteritidis generates a subclinical infection in poultry, and infected hens can become chronic carriers laying Salmonella contaminated eggs. Human consumption of contaminated poultry or egg products results in an acute self-limiting gastroenteritis, being responsible for ~61% of the estimated 1.5 million human salmonellosis cases reported between 1995 and 2008 (WHO Global Foodborne Infections Network Country Databank). There is little work done on the molecular mechanisms behind the differential host-adaptation and clinical outcomes of infections caused by serotypes Enteritidis and Gallinarum in their susceptible hosts, including birds, but recent evidence suggests that these serotypes might possess undescribed virulence factors that may account for these differences. Interaction between bacteria and hosts is guided by a communication/signaling interplay which aims to influence the host response. Among the tools used by bacteria to influence the host response, secretion machines that deliver proteins and toxins into the environment and within eukaryotic target cells are crucial for bacterial virulence and survival. The Type VI Secretion System (T6SS) is a newly described mechanism for protein translocation that exists in most Gram-negative bacteria that come into close contact with eukaryotic cells, including plant and animal pathogens. The precise role and mode of action of T6SS is still unknown, but it is clear that plays an important role in bacterial virulence. In Salmonella enterica, only one T6SS encoded in Salmonella Pathogenicity Island 6 (SPI-6) has been described. In this thesis, through bioinformatics and comparative genomic analyzes it was determined that the genus Salmonella encodes 5 T6SS loci, differentially distributed among different serotypes and with distinct phylogenetic histories. The novel T6SS loci were identified in genomic islands designated SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22. In addition of the identification of these T6SS loci, a novel “evolved” VgrG protein with a S-Type Pyocin containing-domain, was identified in SPI-21. The presence of this protein domain suggested for the first time a role for T6SSs in bacterial killing opening a new chapter in the study of T6SS and its role in inter-bacterial relationships. The SPI-19 T6SS was of significant relevance due to its wide distribution among virulent Salmonella serotypes and because bioinformatics analyzes showed that while Gallinarum encodes a complete T6SS, serotype Enteritidis only encodes for remnants of this system. Despite being closely related, serotypes Gallinarum and Enteritidis present profound differences in their host-range and pathogenicity. Therefore, it is tempting to speculate that the presence of an active T6SS is somehow related to the host-adaptation and pathogenicity differences presented by these serotypes. To resolve this hypothesis and assess the contribution of SPI-19 to Salmonella pathogenicity, the objective of this thesis was to determine whether the SPI-19 genomic island encodes a functional T6SS contributing to the pathogenicity of Gallinarum and Enteritidis in the avian host. In order to characterize the SPI-19 T6SS, gene and operon fusions were constructed and expression, production and secretion of T6SS components were evaluated under different in vitro growth conditions. The analysis showed that most T6SS components remain repressed under the conditions tested. Infection of murine macrophages with a Gallinarum strain harboring the structural/secreted T6SS component VgrG fused to the GFP reporter showed that T6SS components are preferentially produced inside infected cells. Non-polar deletion mutants of the whole SPI-19 and specific T6SS core components revealed that this T6SS was necessary for Salmonella Gallinarum survival within macrophages at late time points after infection. Furthermore, the SPI-19 T6SS function could not be linked to Salmonella-induced cytotoxicity or cell death of infected macrophages. To determine the contribution of SPI-19 T6SS to Salmonella pathogenesis, T6SS mutants were tested in competitive infection assays against the wild-type Gallinarum parental strain. Oral infection of four-day-old White Leghorn chicks revealed that T6SS mutants colonized the ileum, ceca, liver and spleen poorly compared to the wild-type strain. Restitution of SPI-19 to the ΔSPI-19 mutant, using VEX-Capture, complemented this colonization defect. Altogether, the data indicate that SPI-19 and the T6SS encoded therein contributes to macrophage intracellular survival and colonization of chicks infected by S. Gallinarum. To assess the impact of carrying a complete T6SS locus on the ability of S. Enteritidis to colonize the avian host, the SPI-19 from Gallinarum was transferred to Enteritidis. In vivo experiments showed that presence of a complete SPI-19 significantly increased the ability of Enteritidis to colonize the ileum, liver and spleen of infected chicks by day 1 post-infection. This colonization advantage was not lasting however, as this strain presented a strong colonization defect for each organ analyzed from day 3 post infection to the conclusion of the experiment. These results suggest that transfer of SPI-19 from S. Gallinarum has a negative impact on the ability of S. Enteritidis to colonize the avian host. In this context is tempting to speculate that loss of the SPI-19 T6SS corresponds to a pathoadaptative event during S. Enteritidis evolution. In addition, this is the first report of the use of Vex-Capture method to assess the effect of Genomic Island transfer in an animal model of bacterial infection. The recent discovery of Type VI Secretion Systems (T6SS) has opened a new chapter in the study of Salmonella host and environmental adaptation. Whether Salmonella encodes T6SSs and whether they could be considered as quantum leap evolution events are some of the questions that the discovery of T6SS in bacterial genomes generated. In this thesis, we have expanded the current knowledge on bacterial T6SSs and Salmonella virulence potential by: i) the identification and description of 4 novel Salmonella Pathogenicity Islands (SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22) encoding phylogenetically distinct T6SS loci, ii) the discovery of a novel “evolved” VgrG protein, which suggested for the first time a role for T6SSs in interbacterial relationships, iii) identifying that the SPI-19 T6SS contributes to Salmonella intracellular survival in macrophages and iv) determining that the SPI-19 T6SS contributes to chicken colonization by S. Gallinarum.

Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas son glicoproteínas transportadoras de oxígeno presentes en algunos moluscos y artrópodos. Son conocidas por su poderosa inmunogenicidad en mamíferos, siendo utilizadas como proteínas transportadoras de haptenos para obtener anticuerpos contra haptenos, en vacunas y como inmunoestimulante no específico en el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Para estas aplicaciones la hemocianina más utilizada proviene de la lapa Californiana M. crenulata (KLH). Hemos demostrado que la hemocianina del gastrópodo Chileno C. concholepas (CCH), si bien difiere de KLH en su origen y estructura, posee cualidades inmunomoduladoras equivalentes, incrementando la actividad de células NK, e induciendo respuestas inmunes de tipo Th1. En este trabajo, se estudió el efecto de CCH sobre células dendríticas (DCs) murinas, consideradas las células presentadoras de antígeno por excelencia, y por tanto, las células moduladoras de la respuesta inmune. Postulamos que CCH induce la maduración de DCs, activando la inmunidad innata y adaptativa, vía procesamiento y presentación de CCH a células T naive, generando un ambiente de interleuquinas inmunoestimulante en los tejidos linfoides. En primer lugar, se estudió la cinética de incorporación de CCH in vitro, en DCs aisladas por selección magnética a partir de precursores de médula ósea de ratones de la cepa C57BL/6. Para el análisis, se emplearon diversas técnicas microscópicas de luz y electrónica, y de citometría de flujo; así como CCH marcada con fluorocromos o anticuerpos específicos contra ella. Se encontró que CCH fue incorporada rápidamente por DCs (CD11c+) vía endocitosis mediada por vesículas con clatrina, localizándose posteriormente en lisosomas secundarios. Se determinó el efecto de CCH sobre la maduración de DCs cultivadas in vitro, mediante la expresión de los marcadores de superficie MHCI, MHCII y CD86, y también mediante la secreción de IL12 y la pérdida de la capacidad fagocítica. Como control positivo se utilizó LPS, el cual produjo un aumento significativo de todos los marcadores a las 24 h. Las DCs tratadas con CCH no mostraron diferencias con las DCs control hasta las 72h de cultivo. Sin embargo, a este tiempo, se encontró que por efecto de CCH, las DCs aumentaron la expresión del marcador lisosomal Lamp, sugiriendo que dicha proteína se procesa lentamente. Evidencia adicional mediante Western blot, mostró fragmentos de hemocianina en torno a 50 kDa hasta las 54 h de incubación, no siendo detectados a las 72 h. Resultados diferentes se encontraron cuando las DCs fueron cocultivadas con células NK purificadas, aumentó la expresión de MHCII y CD86 como asimismo, la secreción de IL12 e INFγ por efecto de CCH en asociación al contacto entre las células, confirmando una modulación positiva de la hemocianina en la interacción NK/DC. Al estudiar la importancia del tamaño de CCH y la presencia de azúcares en su estructura sobre su inmunogenicidad, evaluando la respuesta inmune humoral de ratones de dos cepas diferentes (C57BL/6 y C3H/HeJ), se encontró que, ni la pérdida de su estructura cuaternaria ni de sus azúcares disminuyeron la inmunogenicidad de la proteína, por el contrario, se observó que el título de anticuerpos se mantuvo similar o aumentó al inmunizar los ratones con las proteínas desglicosiladas en comparación a las nativas. Sin embargo, estas moléculas no aumentaron la secreción de IL12 en DCs cultivadas in vitro, señalando nuevamente la importancia de las células del sistema inmune innato, como las células NK, en la vía de acción de las hemocianinas. Finalmente, este es el primer trabajo donde se aborda experimentalmente el mecanismo de inmunoestimulación de hemocianinas, estableciéndose que la proteína es procesada lentamente por parte de las DCs, y que en la respuesta de tipo Th1 que ellas modulan, la comunicación NK/DC es fundamental / Hemocyanins are glycoproteins that function as oxygen transporters in some mollusks and arthropods. They are known by their powerful immunogenicity in mammals, and therefore are widely used as hapten-carrier to produce antibodies, in vaccine development, and as non specific inmunoestimulant for the treatment of some types of cancer. The hemocyanin known as KLH obtained from the Californian limpet M. crenulata has been exclusively used for the above purposes. We demonstrated that CCH, the hemocyanin from the Chilean gastropod C. concholepas, although differ in origin and structure; have similar immunomodulatory properties, increasing the activity of NK cells, and inducing a type Th1 immune response. Considering the pivotal role of dendritic cells (DCs) in the modulation of immunity, it is of interest to determine the relationship among the structural features of hemocyanins and their effect on DCs maturation and how they specifically modulate their functions. We postulated that CCH induce DC maturation by activating the innate and adaptive immunity, trough CCH processing and presentation, to specific naïve T lymphocyte, leading to an immunostimulant interleukin environment in lymphoid tissues. First, we analyzed the kinetics of CCH uptake by DCs obtained from bone marrow precursors of C57BL mice, isolated by magnetic sorting and cultured in vitro. The uptake of CCH was studied using diverse microscopic techniques and flow cytometry. To track the protein, we used fluorescent conjugates of CCH and specific anti CCH antibodies. We found that CCH is quickly internalized by clathrin-mediated endocytosis vesicles, and after that, it was localized in secondary lysosomes. The effect of CCH on DC maturation, was investigated by the analyses of the expression of surface molecules as MHCI, MHCII and CD86, as well as by IL12 secretion and the lost of fagocitic activity. As a positive control we used DCs treated with LPS, which modify these parameters after 24h of culture. DCs treated with CCH did not show differences up to 72 h with respect to the control DCs. At this time, an increased of the expression of the lysosome membrane glycoprotein Lamp was observed, suggesting that CCH is gradually processed. We found additional evidence for a slow processing by DCs, since, fragments of size around 50 kDa, were detected by Western blot up to 54 h, and disappears at the 72h. In contrast to these results, when DCs were cocultured with purified NK cells in the presence of CCH, an increase in the expression of MHCII and CD86 surface molecules and secretion of IL12 and INFγ was observed. The above effects of CCH were boosted when both cellular types were put in contact, indicating that the NK and DCs contact is necessary for the modulation of DCs by CCH. Next, we studied the influence of the size and the sugar moieties of CCH in their immunostimulatory effect, trough the study of the humoral immune response against deglicosilated subunits of CCH, and native subunits as control. The results showed that the inmunoestimulant capacity was not decreased; on the contrary, the titers of antibodies were higher against the deglicosilated proteins than the native ones. However, the increased immunogenicity of the deglicosilated CCH did not correlate with the secretion of IL12 in isolated DCs cultured in vitro, suggesting again, the importance of cells of the innate immune cells, as NK, in the mechanisms of action of the hemocyanins. In conclusion, this work is the first experimental approached to get inside the fine immunomodulatory mechanism of mollusk hemocyanins, using CCH as model. The main conclusions that can be drawn from this work are that CCH is slowly processed by the DCs, and that the NK/DC interaction is required for the effect on DCs in vitro and in vivo

Salmonella Enteritidis y Salmonella Gallinarum son dos patógenos importantes para el hospedero aviar. El primero causa infecciones silentes en aves de postura, lo que le permite infectar los huevos y tras el consumo de éstos, llegar al hospedero humano. El segundo, causa en el ave un cuadro de gastroenteritis severa y posterior tifoidea aviar, generando graves consecuencias económicas y productivas. Previamente, mediante herramientas bioinformáticas, identificamos una nueva isla de patogenicidad no caracterizada en cuatro serotipos distintos de Salmonella, entre ellos Gallinarum y Enteritidis. Esta fue nombrada isla de patogenicidad 19 de Salmonella (SPI-19), y codificaría para un sistema de secreción tipo VI (T6SS), un sistema de secreción de proteínas el cual se encuentra ampliamente distribuido entre las bacterias Gram negativo. S. Gallinarum posee codificado en la SPI-19 todos los genes esenciales para un T6SS funcional, mientras que S. Enteritidis posee una versión trunca de la isla, y sólo posee algunos genes del T6SS. Este sistema cumpliría una serie de funciones en los procesos patogénicos dependiendo de la bacteria, y hasta el momento se ha descrito su participaciòn en adherencia, invasión, citotoxicidad y proliferación intracelular. Al analizar filogenéticamente el T6SS codificado en SPI-19 se descubrió que se encontraba cercano a los sistemas codificados en bacterias como Vibrio cholerae y Aeromonas hydrophila. En estos patógenos ya se ha descrito un rol del T6SS en la interacción con células del sistema inmune, particularmente en la sobrevida y citotoxicidad en líneas celulares de macrófagos. Debido a que la capacidad de Salmonella para sobrevivir dentro de macrófagos es un proceso fundamental para su diseminación sistémica y colonización de órganos blanco, en esta memoria se propuso determinar el papel que cumple el T6SS codificado en SPI-19 en la interacción con macrófagos murinos. Para esto se estudió la capacidad de sobrevivir al interior de macrófagos RAW 264.7 de mutantes en genes estructurales y efectores del T6SS. A su vez, se analizó la capacidad citotóxica de estas cepas. Los resultados muestran que mutantes de S. Gallinarum presentan una supervivencia menor a tiempos tardíos de infección. En S. Enteritidis la mutante para SPI-19 no presenta una disminución significativa de la sobrevida. En ambos serotipos no se presentan cambios en la citotoxicidad. También se estudió la expresión en la infección de macrófagos del efector VgrG mediante una fusión con el fluoróforo GFP. Esto reveló una rápida expresión de la fusión, lo que sugiere que el contacto bacteria-macrófago gatilla la expresión del efector. Estos resultados demuestran que la isla SPI-19 codifica para un T6SS funcional, que participa en un proceso esencial de la infección por Salmonella.

Orientador: Nora Marcela Haun Quiros / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T22:40:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_MaristelaFreitas_M.pdf: 5394098 bytes, checksum: 196918fd6013613b4ad87f3241daf8bf (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: A Doença de Chagas é uma infecção parasitária que afeta milhões de latino-americanos, causando nas ares endêmicas, uma entre 10 mortes nos indivíduos de 25 a 64 anos de idade. A quimioterapia da doença é baseada principalmente no uso de dois medicamentos, Nifurtimox (Bay 2502 : Lampit) e Benznidazole (Ro 7-1051 ; Radanil, Rochagan). Ambas as drogas possuem atividade genotóxica comprovada tanto in vitro, quanto in vivo. Assim sendo, resolvemos investigar os efeitos citóxicos do pigmento biossintético de Chromobacterium violaceum (Cepa BB-78), o 1,3-dihidro-2H-inol-2 ona, comumente denominado como Violaceína, bem como de seus derivados, Bromo-Violaceína e Matilol-Violaceína, já que este composto apresentou um perfil biológico interessante, mostrando-se com baixo poder hemolítico, ação microbiana e o mais importante, atividade tripanocida in vitro. Entretanto, Violaceína exibiu uma alta toxidade para células V79/M8, assim como Bromo-Violaceína. Já o derivado Metilol-Violaceína exibiu uma citotoxidade baixa em relação aos outros 2 compostos. A atividade citotóxica de Nifrutimox e Benznidaole também foi testada em células V79/M8. Entretanto, estes 2 compostos se comportaramde maneira similar ao Metilol-Violaceína, tanto na sobrevivência celular, quanto para a inibição da síntese de DNA. Sabe-se no entanto, que os efeitos tóxicos dos medicamentos são devidos à sua biotransformação niotrorredutiva para radicais que possam reagir com constituintes celulares, causando efeitos deletérios. Dosagens preliminares realizadas durante o tratamento das células com Violaceína, indicaram a presença de 'H IND. 2¿'O IND. 2¿ no meio reacional, apontando assim, para uma possibilidade de ser uma espécie pesponsável pelos efeitos cito e genotóxicos encontrados nestes estudos. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Chagas¿Disease is a parasitic infection that effects million of Latinamericans, inducing in endemic areas one in ten deaths in humans between 25 to 64 years old. Disease¿s chemotherapy is based on the use of two drugs, Nifurtimox (Bay 2502 : Lampit) and Benznidazole (Ro 7-1051 ; Radanil : Rochagen). Both drugs have a confirmed genotoxic activities in vitro and in vivo. We decided to test the cytotoxic effects of the biosynthetic pigment of Chromobacterium violaceum (strain BB-78), usually knowm as Violacein. This last compound has interesting biological profiles as low hemolytic effect, microbian action and principally in vivo trypanocide activity. Violacein and Br-Violacein exhibited a high toxity in V79/M8 cell. The Methhyl-Violacein derivative showed a low cytotoxicity compared to the other two compounds. Nifurtimox and Benznidazole cytotoxic activity was also tested in V79/m8 cells. However, the profile of both was similar to Methyl-Violacein in cellular survival and DNA inhibition synthesis experiments. It is known that the toxic effects of those drugs are due to their nitroreductive biotransformation to reactive free radicals, interacting with cellular constituents causing the deleterious effects. On prelimary studies using incubation medium of Violacein treatments in V79/M8 cells we observed 'H IND. 2¿'O IND. 2¿ formation, a reactive species that may be responsible for the detected cyto and genotoxic effects. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:04:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8863_1.pdf: 1763640 bytes, checksum: 7b32db97a866891f8efc3a4388ffcf78 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / A deficiência de vitamina A (VAD) é um grave problema de saúde pública em países onde representa uma das maiores causas de cegueira evitável em crianças. Diversos marcadores bioquímicos são correntemente recomendados para definir a VAD como um problema de saúde pública: retinol sérico e hepático, resposta relativa a dose (RDR), resposta sérica de 30 dias (S30DR), MRDR entre outros. A VAD subclínica é detectada com o uso de marcadores envolvidos no metabolismo do retinol. Nosso objetivo foi comparar a prevalência de VAD subclínica em função de alguns marcadores bioquímicos para promover a intervalidação entre eles. Amostras de plasma de crianças com idade variando de 2 a 141 meses foi coletado com o objetivo de analisar a concentração de retinol sérico, RDR, S30DR. Fígado de crianças necropsiadas foi usado para analisar o retinol hepático. A prevalência de crianças na forma subclínica da deficiência foi obtida e seus valores analisados. Os resultados obtidos foram 39%, 34%, 39% e 53% para retinol sérico e hepático, RDR e S30DR, respectivamente. Os marcadores subclínicos foram intervalidados por revelarem os mesmos níveis de importância na definição da VAD a ser monitorado para avaliar os programas de intervenção, a fim de melhorar o status de vitamina A da população. Entre os marcadores analisados, o retinol sérico com ponto de corte <1.5 µmol/L é sugerido como eleito em função de ser metodologicamente mais viável

Orientador: Lucia Pereira da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T11:58:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nepomuceno_MariadeFatima_D.pdf: 6284886 bytes, checksum: c85da90c368d47232e46f8882bc4484f (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: É geralmente aceito que o processo de peroxidação lipídica causa distúrbios nas funções mitocondriais (Vladimirov et alii, 1980) e que tal processo é desencadeado pelo ataque de espécies ativas de oxigênio aos lipídeos de membrana (Bindoli, 1988; Carbonera e Azzone, 1988). A geração de espécies ativas na mitocondria a nível de cadeia respiratória, leva a formação da espécie ativa de oxigênio mais agressiva, o radical hidroxila, de vida extremamente curta e que reage praticamente com todos os compostos orgânicos, oxidando grupos sulfidrílicos, degradandoDNA e causando peroxidação lipídica(Halliwell e Gutteridge, 1988). Por outro lado, o aumento na permeabilidade da membrana mitocondrial, conhecido como transição de permeabilidade, pode ser induzido por vários agentes, entre eles Ca2+ e Pi ou Ca2+ e hidroperóxidos, sendo que estes últimos podem conduzir a um aumento na geração de espécies ativas causando danos à membrana mitocondrial interna devido ao ataque dessas espécies aos lipídios e proteínas componentes de membrana. Neste trabalho estudamos o possível envolvimento do processo de peroxidação lipídica com alterações na permeabilidade da membrana mitocondrial interna e subseqüente liberação de íons e moléculas de baixa massa molecular. Nossos resultados mostraram claramente a independência entre esses mecanismos, pois em condições onde a transição de permeabilidade foi prevenida pela presença de inibidores específicos, mesmo assim foi possível observar ocorrência de peroxidação lipídica. Embora ambos os processos mostrassem ser dependentes de Ca2+, nossos resultados mostraram que a transição de permeabilidade pode ser revertida pela simples remoção do íon pelo quelante EGTA porém a peroxidação lipídica, uma vez iniciada, não sofreu interrupção com a remoção do Ca2+.Também a trifluoperazina e a ciclosporina A, conhecidos inibidores da transição de permeabilidade não impediram ou bloquearam ocorrência de peroxidação lipídica. Por outro lado, alterações na fluidez de membrana só foram detectada quando o processo oxidativo foi provocado por FeSO4 , um clássico indutor da peroxidação lipídica. E interessante ressaltar que este modelo oxidativo mostrou-se ineficaz na indução de transição de permeabilidade, mesmo observando-se a formação de altos níveis de TBARS. Este conjunto de resultados permitiu-nos descartar uma correlação direta entre a peroxidação lipídica e a transição de permeabilidade. o mecanimo do processo peroxidativo parece ocorrer após a transição de permeabilidade (decorrente da abertura de um poro protéico dependente de Ca2+) em situação onde a geração de espécies ativas de oxigênio supera a capacidade dos mecanismos de defesa / Abstract: It is generally accepted that lipid peroxidation leads to mitochondrial disfunction (Vladimirov et alii, 1980) and that this process is triggered by oxygen reactive species on membrane lipids (Bindoli, 1988;Carbonera e Azzone, 1988). The generation of such reactive species, at the level of respiratory chain, leads to formation of radicals among which the hydroxyl radical, a short-lived but extremely reactive one. This radical reacts with nearly all organic compounds, oxidizing sulphydryl groups, breaking DNA and casing lipid peroxidation ( Halliwell and Gutteridge, 1988). On the other hand, mitochondrial permeabilization can be induced by several agents, as Ca2+ and inorganic phosphate (Pi) Of Ca2+ and hydroperoxides. This later condition would increase the generation of oxygen reactive species, leading to damage at the mitochondrial inner membrane level, due to the attack of these species to lipids and proteins of this membrane. We studied the involvement of the lipid peroxidation process with alterations on the mitochondrial inner membrane permeability and, as consequence, the release of ions and low molecular mass compounds, Our results clearly showed that these two processes are independent. Since under conditions where the permeability transition process was. Prevented by specific inhibitors, it was observed the occurrence of lipid peroxidation. Although both processes were dependent on the presence of Ca2+, our reults showed that the permeability transition could be reverted by Ca2+ Chelation with EGTA, but the lipoperoxidation, once initiated , was not stopped by EGTA addition. Two other drugs, cyclosporin A and trifluoperazine, well known permeability transition inhibitors were inefficient in preventing or stopping the lipid peroxidation process. On the other hand, membrane fluidity alteratians evaluated by changes an the sparameter arder, were only detected when the oxidative process was greater, as that induced by a FeS04. lnterestingly this condition did not Ied to permeability transition, even when very high levels of TBARS were observed. These data allowed to discard any direct correlation between lipid peroxidation and permeability transition. The first process seems to occur after the later one, and is probably consequence of the opening of a Ca2+ dependent pore, under conditions where the generation of oxygen reactive species exceeds the capacity of the antiaxidant endogenous systems / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências Biológicas