Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T17:22:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JoseAntonioda_M.pdf: 9541917 bytes, checksum: add850a1bcd914f9e54f920e79088cf3 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Os inibidores foram isolados de TOI em sementes de Copaifera langsorffii, conhecida vulgarmente por Copaíba, uma árvore nativa do Brasil da subfamília Caesalpinoideae da família Leguminosae. A fração TOI foi purificada a partir de precipitação com sulfato de amônio, cromatografia em uma coluna de troca-iônica em OEAE-Sepharose e coluna de afinidade em Sepharose- Trypsina. TOI apresentou-se homogêneo em gel de poliacrilamida-SOS 12,5%, com uma massa molecular aparente de 24 kOa em condições não reduzidas, e 12 kOa em condições reduzidas com OIT. A massa molecular relativa estimada por filtração em gel em uma coluna Superdex-75, sistema FPLC, confirmou os resultados obtidos em PAGE-SOS. TOI tem um Ki de 1,2nM para a enzima tripsina bovina mostrando uma alta afinidade. No entanto, TOI não mostrou atividade inibitória para quimotripsina. O estudo da estequiometria do complexo TOI-tripsina revelou que este inibe tripsina na razão molar de 1: 1. O complexo TripsinaTOI foi eluído na cromatografia de filtração em gel com um tempo de retenção equivalente a uma massa molecular relativa de 39 kOa. Evidenciou-se também que TOI é ativo na sua forma monomérica e não na sua forma dimérica. A Focalização Isoelétrica de TOI revelou a presença de duas bandas de proteínas, ambas coradas para inibidor de tripsina com pls de 6,45 e 7,35, indicando dois inibidores em TO!. Os inibidores de TOI, designadas por TOI-I e TOI-II, foram isoladas em coluna de fase reversa C18 /lBondapack, em Sistema HPLC Walters. Foi observado em gel de Tricina 16,5% uma diferença mínima na massa molecular aparente, sendo aproximadamente 12 e 10 kOa para TOI-I e TOI-1I respectivamente. O sequenciamento N-terminal dos inibidores de TOI revelou a presença da sequência consenso observada nos inibidores de tripsina tipo Kunitz para TOI-I, contudo, pesquisas nos banco de dados de proteínas não revelou nenhuma homologia para TOI-II. TOI mostrou alta estabilidade para diferentes condições de pH, temperatura e concentração de OTT, indicando um possível número elevado de pontes de dissulfeto na estrutura molecular. TOI não foi degradado proteoliticamente na digestibilidade in vitro pelas proteases encontradas no intestino médio do gorgulho Callosobruchus maculatus, e demonstrou um efeito deletério no desenvolvimento dos insetos, sugerindo que TOI atua como um fator antinutritivo e prejudica o desenvolvimento de Callosobruchus maculatus / Abstract: Two inhibitors have been isolated de TOI fraction in seeds of Copaifera langsorffii, ordinarily known as Copaíba, one Brazilian native tree of the Caesalpinoideae subfamily of Leguminosae family. The fraction TOI was purified by ammonium sulfate preeipitation, ion-exehange ehromatography on OEAE-Sepharose and affinity ehromatography on trypsin-Sepharose. TOI presented homogeneity in PAGE-SOS geI12,5%, with apparent moleeular mass of 24 and 12 kOa in non-and reduetion condition, respeetively. The relative moleeular mass determined by FPLC gel filtration on a Superdex 75 eolumn, eonfirmed on the results in PAGE-SOS. TOI have Ki of 1,2nM to bovine trypsin enzyme showing high affinity. However, no inhibition was found for quimotrypsin. The stoiehiometrie study of the trypsin-TOI eomplex evideneed that inhibitor is aetive for trypsin at 1: 1 molar ratio. The trypsin- TOI eomplex was eluted on a gel filtration ehromatography with retention time equivalent a relative moleeular mass of the 39kOa. Evidenced too, that TOI is active on enzyme trypsin on its monomerie form and not dimerie one. The isoelectrie foeusing of TOI demonstrated the presenee of two proteie bands, with isoelectrie point between 6.45 e 7,35, indicating two inhibitors in TOI. These inhibitors of TOI, designated for TOI-I and TOI-II, was isolated by reversed - phase HPLC on a J.L-Bondapaek column (Waters System) and was observed in Trieine-gel 16,5% one minimal differenee on apparent moleeular mass, of approximately 12 and 10 kOa for TOI-I and TOI-1I respectively. N-terminal sequeneing of the inhibitors of TOI, demonstrated the presenee of the eonsensus sequenee present in the soybean Kunitz-Type trypsin inhibitor for TOI-I, however, protein database searehes did not reveal any homology to TOI-II. The TOI showed high stability to pH different eonditions, temperature and amount of OTT, indicating one elevated number of disulfides bonds in a moleeular strueture. The TOI was not proteolytically degraded on a in vitro digestibility by midgut proteinases of the gorgulho Callosobruchus maculatus and demonstrated one deleterious effect on a insect's development, suggesting that TOI acts like toxie factor and deereased survival of Callosobruchus maculatus / Mestrado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T11:17:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mello_GlauciaCoelhode_M.pdf: 8782241 bytes, checksum: b2eab6f44b4a7734dcb76be2f126999a (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Algumas espécies vegetais podem apresentar em suas sementes, agentes bioquímicos que atuam no mecanismo de defesa da planta. Uma grande variedade destes são, na maioria, constituídos de proteínas e carboidratos. Dentre os agentes de origem protéica estão os inibidores de proteinases, que além da sua atuação em plantas, podem ter aplicações no tratamento de patologias, como inflamações, hemorragia e até mesmo o câncer. Neste trabalho, um inibidor de tripsina presente nas sementes de Dimorphandra mollis (Leguminosae-Mimosoideae), conhecida comumente por Faveiro-Doce, foi isolado e purificado a partir de precipitação com sulfato de amônio (30-60%), cromatografias em coluna de exclusão molecular (Sephadex G-75), troca iônica (DEAE-Sepharose) e de afinidade (Sepharose- Tripsina). A pureza do inibidor de D. mollis (DMTI-II) foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida, que revelou uma única banda de proteína, mesmo em condições redutoras (O,IM DTT), indicando que DMTI-II é constituído por uma única cadeia polipeptídica. A massa molecular relativa de 25 kDa foi estimada por gel filtração em coluna de Superdex-75, em sistema FPLC. Uma constate de inibição de Ki de 1,7 x IO-IOM foi obtida para DMTI-II com a enzima tripsina bovina, mostrando portanto uma alta afinidade entre enzima e inibidor. Estudos estequiométricos revelaram que DMTI-II inibiu a tripsina na razão molar de 1:1, sendo a massa molecular do complexo formado de 46 kDa, determinada por cromatografia de filtração em gel, em coluna Superdex-75 (sistema FPLC). A atividade inibitória de DMTI-II mostrou ser altamente estável para diferentes condições de pH e concentrações do agente redutor DTT. A determinação da sequência N-terminal do inibidor que apresentou alto grau de homologia com outros inibi dores da família Kunitz, permitiu confnmar as características e propriedades mostradas durante o decorrer do trabalho. DMTI-II foi também submetido a ensaios de digestibilidade in vitro por pepsina e papaína e por enzimas presentes no intestino médio de larvas de Callosobruchus macu/atus com o intuito de verificar sua provável ação contra esta espécie de inseto. Os resultados mostraram que DMTI-II foi refratário à ação dessas enzimas, sugerindo uma possível aplicação na biotecnologia vegetal / Abstract: Some plants species can have in their seeds biochemical agents that act on their defense mechanism. A great number of them are of proteins or carbohydrates nature. Among the ones with protein origin are the proteinase inhibitors, that can also have a role on the treatment of pathologies, such as inflammation, hemorrhage and even on cancer. In this work, a trypsin inhibitor from Dimorphandra mol/is (Leguminosae Mimosoideae) seeds, commonly known as "Faveiro-Doce", was isolated and purified by ammnium sulfate precipitation (30-60%), gel filtration chromatography (Sephadex G-75), ionexchange chromatography (DEAE-Sepharose) and affinity chromatography (SepharoseTrypsin). D. mollis inhibitor's (DMTI-II) was assayed by polyacrylamide gel electrophoresis, yielding a single protein band, indicating that DMTI-II is constituted by one polypeptide chain. A molecular weight of25 kDa was estimated by gel filtration on Superdex G-75 column (FPLC system). An inhibition constant value of 1.7 x IO-IOM was obtained for DMTI-II with bovine trypsin, showing a high affmity between enzyme and inhibitor. Stoichiometric studies showed that DMTI-II inhibited trypsin in a I: I molar ratio. The molecular weight of the complex was determined as 46 kDa, by gel filtration chromatography in the Superdex G75 column. DMTI-II inhibitory activity was stable in the different pH conditions and reducing agent (DTT) concentration. Determination ofthe inhibitor N-terminal sequence showed a high degree of homology in relation to other inhibitors from the Kunitz fami1y, reinforcing the characteristics and properties found during this work. DMTI-II inhibitor was submitted to digestion assays in vitro by pepsin and papain and by enzymes present in the larvae midgut from Callosobruchus maculatus, to verify its probable _on against this insect specie. The results showed that DMTI-II was refractory to the action of those enzymes, suggesting a possible application on plant biotechnology / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T16:20:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_SilvanaCristina_M.pdf: 4387966 bytes, checksum: 19da59ac17254dba0a8949838880eefc (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: No presente trabalho foi investigado um inibidor de proteinases em sementes da espécie Delonix regia Leguminosae-Caesalpinioideae). As sementes das leguminosas contêm uma alta concentração de proteína em relação aos outros componentes da planta. Dentre essas proteínas, os inibidores de proteinases, particularmente inibidores de enzimas da família das serinoproteinases (que inclui tripsina, quimotripsina e enzimas da coagulação sanguínea), exercem uma importante função na fisiologia da planta. Os inibidores de proteinases têm sido estudados há mais de 50 anos. Eles têm mostrado ser muito importantes no tratamento de disfunções metabólicas associadas às enzimas proteolíticas, tais como em casos de pancreatites, efizemas, alergias, inflamação, hipertensão e câncer. O inibidor de Delonix regia (DrTI) foi isolado em solução salina 10% (p/v), submetido a uma precipitação por acetona 80% (v/v) e purificado através de cromatografias de troca iônica (Sephadex A-50 e DEAE 5PW) e de exclusão molecular (Sephadex G-75). o DrTI inibiu tripsina bovina e porcina e a calicreína plasmática humana. Os valores de Ki encontrados foram 2, 19x1 0-8M, 4,53x10-8M e 5,25x 10-9 M, respectivamente. A pureza do inibidor foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida (10-20%), na presença de 5DS. O inibidor apresentou uma única banda de proteína em condições nativas e reduzidas (0,1 M DTT). Estes resultados indicam que o DrTI é constituído por uma única cadeia polipeptídica. A massa molecular aparente do inibidor foi de 22 kDa, um resultado similar aos inibidores de proteinase do tipo Kunitz. O DrTI foi submetido a estudos cristalográficos e seu modelo permitiu comparação estrutural com o inibidor de tripsina do tipo Kunitz isolado de sementes de Erythrina caffra / Abstract: In the present work, a proteinase inhibitor in seeds of Delonix regia (LeguminosaeCaesalpinioideae) specie, was investigated. The Leguminosae seeds contain a high concentration of protein in relation to the other components of the plant. Among these proteins, the proteinase inhibitors, particularly enzymes inhibitors of serinoproteinases family (that include trypsin, chymotrypsin and blood coagulating enzymes), play an important role in plant physiology. Plant inhibitors have been investigated for more than fifty years ago. They have been shown to be very important in the treatment of metabolic disfunctions associated to proteolytic enzymes, such as in cases of pancreatits, emphyzema, allergy, inflamation and cancers. The Delonix regia inhibitor (DrTI) was isolated in saline solution 10% (p/v), after acetonic precipitation 80% (v/v), and purified through ion exchange chromatography (Sephadex A-50 e DEAE 5PW) and molecular exclusion (Sephadex G-75). DrTI inhibited bovine and porcine trypsin and human plasma kallikrein. The values of Ki found were 2,19 x 10-8M, 4,53 x 10-8M and 5,25 x 10-9M, respectively. Purity of inhibitor was detected by poliacrylamide gel electrophoresis (10-20%) in the presence of SDS. The inhibitor displayed a single protein band, in native and reduced conditions (0,1 M DTT). These results indicate that DrTI is constituted by a single polipeptide chain.The apparent molecular mass of inhibitor was of 22 kDa, a result similar to the proteinase inhibitors of the Kunitz-type. DrTI was submitted to crystallographic studies and its model allowed structural comparison to the trypsin inhibitor of the Kunitz-type isolated from Erythrina caffra seeds / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-11-10T03:09:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 335902.pdf: 2687568 bytes, checksum: e03093465c18cbe2c270a6e5604b628f (MD5) Previous issue date: 2015 / Entre as patologias que acometem a articulação temporomandibular (ATM), a doença articular degenerativa, ou osteoartrite (OA), constitui-se a mais comum. Estima-se que 10% da população mundial com idade acima de 60 anos sofre de algum tipo de dor associada à OA, sendo considerada uma doença relacionada à idade. Entre gêneros, sua prevalência apresenta proporções acima de 2:1 para mulheres. Dessa maneira, o presente trabalho teve por objetivo avaliar comportamental e farmacologicamente a eficácia do composto iodoacetato monossódico (MIA) injetado na ATM de ratos. A injeção bilateral (50 µl) de MIA foi aplicada no compartimento superior da ATM dos animais. Para avaliar alterações nociceptivas e funcionais, procederam-se testes de observação comportamental nociceptiva (OCN) e ingesta alimentar (IA). Inicialmente, realizou-se uma curva dose-resposta do MIA (doses de 0,5; 1; 2 e 3 mg) para padronização da dose capaz de reproduzir alterações nociceptivas e funcionais na articulação durante 21 dias. A dose de 0,5 mg de MIA foi a menor dose responsiva capaz de sustentar as alterações durante todo o protocolo e demonstrar características crônicas do modelo. Para validação farmacológica do modelo, tratamentos utilizando fármacos mais comuns para dor da OA temporomandibular foram realizados no sétimo dia após injeção do MIA: dexametasona (2,5; 4 e 6 mg/kg, i.p.); naproxeno (30,9 e 61,8 mg/kg, v.o.); celecoxibe (6,3; 12,6 e 25,1 mg/kg, v.o.); paracetamol (30 e 45 mg/kg, v.o.); morfina (1, 2 e 4 mg/kg, i.p.); amitriptilina (1,5 e 10,8 mg/kg, i.p.). Além destes, como proposta experimental, avaliou-se a tripsina (0,75; 1,5; 2,95 e 6 mg/kg, v.o.). Os mesmos foram testados quanto a sua capacidade analgésica nos testes de OCN e IA. Os fármacos dexametasona (4,6 mg/kg), paracetamol (30 mg/kg), morfina (4 mg/kg), amitriptilina (10,8 mg/kg) e tripsina (1,5 mg/kg) foram capazes de alterar para padrões positivos todos os comportamentos observados (coçar com a pata traseira, chacoalhar de cabeça, repousar/dormir e mastigar). Contudo, os AINES celecoxibe (12,6 mg/kg) e naproxeno (30,9 mg/kg) foram capazes de reduzir apenas o tempo do comportamento de mastigar e o número de chacoalhadas de cabeça. Em relação ao teste de IA, somente a dexametasona e o paracetamol não elevaram a quantidade de ração ingerida pelos animais. Ainda, a vagotomia subdiafragmática foi capaz de inibir a ação da tripsina (1,5 mg/kg, v.o.) sobre os testes nociceptivos, sugerindo uma relação entre nervo vago e a atividade da protease. Em suma, a injeção de MIA na ATM levou a alterações comportamentais nociceptivas, bem como prejuízo funcional da articulação durante 21 dias, além de responder à abordagem farmacológica comum da OA, revelando perfil semelhante à patologia humana e, dessa forma, constituindo-se promissor e consistente modelo para estudo da OA na ATM.<br> / Abstract : The degenerative joint disease, also known as osteoarthritis (OA), is among the most common pathologies affecting the temporomandibular joint (TMJ). Around 10% of worldwide people over 60 years suffer from some pain related to OA and, therefore, it is considered an age-related disease. Among genders, its prevalence shows ratios over 2:1 for women. Therefore, this study aimed to evaluate pharmacological and behaviorally the effectiveness of monosodium iodoacetate compound (MIA) injection into TMJ of rats. Bilateral MIA-injection (50 µl) was applied into the TMJ upper compartment. To assess nociceptive and functional changes, nociceptive behavioral observation (NBO) and food intake (FI) tests were conducted. Initially, to evaluate the lowest dose capable of reproducing joint nociceptive and functional changes, a dose-response curve (0.5, 1, 2 e 3 mg/kg) was performed throughout 21 days. MIA 0.5 mg dose was the lowest responsive dose, holding the changes throughout entire protocol and demonstrating chronic features of the model. Thus, for pharmacological validation of the MIA model as TMJ-OA inducer, the most common drugs to OA pain treatment were assessed on day 7th after MIA injection: dexamethasone (2.5, 4 e 6 mg/kg, i.p.); naproxen (30.9 e 61.8 mg/kg, p.o.); celecoxib (6.3, 12.6 e 25.1 mg/kg, p.o.); paracetamol (30 e 45 mg/kg, p.o.); morphine (1, 2 e 4 mg/kg, i.p.); amitriptyline (1.5 e 10.8 mg/kg, i.p.). Addition to these, as an experimental proposal, trypsin (0.75, 1.5, 2.95 e 6 mg/kg, p.o.) was assayed. The drugs were assessed regarding their analgesic power in the NBO and FI tests. The drugs dexamethasone (4.6 mg/kg) paracetamol (30 mg/kg), morphine (4 mg/kg), amitriptyline (10.8 mg/kg) and trypsin (1.5 mg/kg) were able to change to positive patterns all observed behaviors (scratching, head flinching, rest/sleep and chewing-like). However, NSAID celecoxib (12.6 mg/kg) and naproxen (30.9 mg/kg) were able to reduce only chewing-like behavior and the number of head flinchings. Regarding the FI test, only acetaminophen and dexamethasone did not improve the amount of food taken by animals. Furthermore, the subdiaphragmatic vagotomy was capable of inhibiting the trypsin action on nociceptive tests, suggesting a relationship between vagus nerve and trypsin activity. In summary, TMJ MIA-injection led to nociceptive behavioral changes, as well as joint functional impairment throughout 21 days, besides of answering to common pharmacological approach of OA, revealing similar profile to human pathology and, thereby, becoming a promising and consistent model for TMJ-OA study.

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T02:12:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JoseAntonioda_D.pdf: 21581539 bytes, checksum: 099864fc5149a9352616af17207c291d (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: As técnicas utilizadas no esclarecimento de estruturas macromoleculares estão situadas em campos interdisciplinares, onde os pesquisadores encontram-se unidos por um interesse comum, no sentido de detalhar o entendimento da função biológica e a relação com sua estrutura primária e tridimensional. Os inibidores de sementes de leguminosas são encontrados sob várias isoformas. Alguns métodos, como a espectrometria de massas, determinação da seqüência Nterminal e eletroforese bidimensional, vêm sendo amplamente explorados com o propósito de caracterizar melhor as isoformas presentes em sementes. A eletroforese bidimensional do inibidor de tripsina de Copaíba (CTI) revelou a presença de vários spots na faixa de 11 e 9 kDa. CTI foi resolvido em dois picos (CTI-I e CTI-II) quando submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C18 em sistema HPLC. Esses picos distintos foram submetidos à eletroforese bidimensional sendo três spots observados para CTI-I com pl de 8.0, 8.5 e 9.0 e três spots para CTI-II com pl de 4.7, 4.6 e 4.3. A análise por espectrometria de massa foi realizada para as subunidades CTI-I e CTI-II objetivando determinar as massas moleculares acuradas e prováveis números de isoformas para cada subunidade. Os espectros confirmaram uma heterogeneidade para CTI-I e CTI-II com predominância dos picos de massa 10.719 e 8.244, respectivamente. A impossibilidade em seqüenciar todos os spots para cada subunidade de CTI, norteou a escolha dos spots A e F de forma continuar os estudos de sequenciamento. Os spots A e F foram submetidos a digestões enzimáticas com as proteases tripsina, SV8 e clostripaína. A massa exata dos peptídeos de cada digesto foi determinada por espectrometria de massas utilizando MALDI- TOF. Os peptídeos mais intensos foram purificados e seqüenciados em um HPLC capilar acoplado ao espectrômetro de massas ESI QTOF. A estrutura primária final de CTI, determinada a partir da massa dos peptídeos das digestões enzimáticas e da seqüência obtida por espectrometria de massas indicou 182 resíduos de aminoácidos, apresentando elevado grau de homologia em relação a outros inibidores de tripsina do tipo Kunitz de vegetais; inclusive com o resíduo de arginina na posição do sítio reativo. A estrutura cristalográfica CTI foi resolvida, revelando que este inibidor é composto por duas cadeias polipeptídicas não covalentemente ligadas e possui apenas uma ponte dissulfeto. t de as diferenças estruturais, CTI é um inibidor efetivo de tripsina com uma constante de dissociação de 1,2 nM, da mesma ordem de grandeza que os inibidores padrões como STI, ETI ou WCI. Sua estrutura tridimensional revela que isso se deve ao fato de que as discrepâncias estruturais não afetam a conformação canônica do seu loop reativo. A comparação entre a seqüência deduzida dos mapas experimentais da densidade eletrônica e a seqüência determinada por 2D-PAGE e espectrometria de massas MALDI-TOF e ESI-QTOF, mostra um acordo de aproximadamente 75%, que pode ser devido à presença de várias isoformas que é um aspecto comum das proteínas extraídas de sementes. Experimentos objetivando a determinação dos residuos de aminoácidos importantes na atividade inibitória de CTI foram realizados utilizando reagentes modificadores específicos. O inibidor CTI foi inativado em 48 e 81% por EDC e PGO, respectivamente. Esses compostos atuam em grupos carboxila de Asp e Glu (EDC) e resíduos de arginina (PGO) , indicando funcionalmente a importância do resíduo de arginina na interação do inibidor com a protease. Estudos da estabilidade conformacional em diferentes pHs, temperaturas e agentes caotrópicos fomecem importantes informações sobre a biogênese e estrutura das proteínas. Um estudo verificando o efeito de agentes físico-químicos (pH, temperatura, DTT, uréia e cIoreto de guanidina) na estabilidade conformacional do inibidor de tripsina (CTI) purificado de sementes de Copaifera langsdorffii foi realizado. CTI, um inibidor atípico da família Kunitz, demonstrou ser resistente em sua estabilidade funcional, apesar de sofrer prejuízos na estrutura quatemária após redução em 1 mM DTT como evidenciado por SDS-PAGE, gel filtração em protein-pack, experimentos cinéticos, espectros de fluorescência e de dicroísmo circular. Os experimentos de desnaturação em função dos agentes caotrópicos foram monitorados pela intensidade de fluorescência dos resíduos de triptofano. A desnaturação de CTI na presença de agentes caotrópicos mostrou ser um processo reversível após diálise, para estrutura e função no caso da uréia e do cloreto de guanidina. Os resultados indicaram que a desnaturação de CTI envolve pelo menos dois estágios: nativo e desnaturado. A presença de 3.5 M de uréia ou GdnHCI inibiu 50% e 100% da atividade inibitória, respectivamente. Ambos agentes caotrópicos promoveram um deslocamento do centro de massa. O cálculo da estabilidade conformacional AG (H20) foi feito tomando-se o deslocamento nos comprimentos de onda máxima de emissão de fluorescência como parâmetro. O AG (H2O) em função da concentração de uréia e guanidina foi de 63.0 e 54.0 Kcal mol-1, respectivamente. Os cálculos de centro de massa foram tomados em função da concentração do agente desnaturante em ambos os casos / Abstract: The techniques used in the clarification of macromolecular structures are situated in interdisciplinary fields, where the researchers find themselves united by a common interest in detailing the agreement of the biological function and the relation with its primary and threedimensional structure. The inhibitors of leguminous seeds are found under severa I isoforms. Some methods, as the mass spectrometry, determination of the N-terminal sequence and bidimensional electrophoresis have been widely explored with the purpose of better characterizing these isoforms in seeds. The bidimensional electrophoresis of the Copaiba trypsin inhibitor (CTI) disclosed to the presence of several spots in the 9 and 11 kDa. CTI was resolved in two peaks (CTI-I and CTI-II) when submitted to the reverse phase chromatography in C18 column in HPLC system. These distinct peaks had been submitted to bidimensional electrophorese, 3 spots had been observed for CTI-I with pl of 8.0, 8.5 and 9.0 and three spots for CTI-II with pl of 4.7, 4.6 and 4.3. The analysis for mass spectrometry was carried through for subunits CTI-I and CTI-II objectifying to determine the accurate molecular masses and probable numbers of isoforms for each subunit. The specters had respectively confirmed microheterogeneity for CTI-I and CTI-II with predominance ofthe peaks ofmass 10,719 and 8,244, respectively. The impossibility to sequence ali spots for each subunit of CTI guided the choice of spots more intense (A and F) to continue the sequence studies. Spots A and F had been submitted to the enzymatic digestions with proteases trypsin, SV8 and clostripain. The accurate mass of the peptide of each digest was determined by mass spectrometry using MALDI-TOF MS. The most intense peptides were been purified and sequenced in a LC connected to the spectrometer of mass ESI QTOF. The primary structure of CTI, determined trom the mass of the peptide of the enzymatic digestions and the sequence gotten for mass spectrometry indicated 182 residues of amino acids, presenting a raised degree of similarity to other Kunitz-type inhibitors of the plant, also with the residue of arginine in the position of the reactive site. The crystallographic structure of CTI inhibitor was solved and reveals that, CTI is composed by two non-covalently bound polypeptide chains and only one disulfide bridge. In spite of these structural differences, CTI is an effective trypsin inhibitor with a dissociation constant of 1.2 nM, a value comparable to other standard Kunitz-type inhibitors like STI, ETI or WCI. It three-dimensional structure reveals that this is because the structural discrepancies do not affect the canonical conformation of reactive loop of CTI. The comparison between the sequence deduced from the experimental electron density maps and the sequence determined using 2D-PAGE, MALDI- TOF and ESI-QTOF mass spectrometry shows an agreernent of about 75%, which can be due to the presence of various isoforms that is a common aspect of proteins extracted trom seeds. Experiments objectifying the determination of the important amino acid residues in the inhibitory activity of the CTI were perfomed using specific modifying reagents. The CTI inhibitor was inactivated in 48 and 81% for EDC and PGO, respectively. These composites act in carboxyl group of Asp and Glu (EDC) and residues of arginine (PGO), indicating functionally the importance of the arginine residue in the interaction of inhibitor with protease. Studies of the conformacional stability in different pHs, temperatures and chaotropic agents have given a wealth of information on the structure and biogenesis of proteins. A study verifying the effect of physico-chemical agents (pH, temperature, DTT, urea and guanidine hydrochloride) in the conformacional stability of trypsin inhibitor (CTI) purified trom seeds trom Copaifera langsdorffii was carried through. CTI an atypical inhibitor of the Kunitz family demonstrated to be resistant in its functional stability, although suffering trom damages in the quatemary structure with reduction in 1 mM DTT as evidenced for SDS-PAGE, gel filtration in protein-pack, kinetic experiments, spectrum of fluorescence and circular dichroism. The denaturation experiments in function of the chaotropic agents were monitored by the intensity of the fluorescence of tryptofan residues. The CTI denaturation in the presence of chaotropic agents showed to be a reversible process after dialysis, for structure and function in the case of the urea and guanidine chloride. The results had indicated that the denaturation of CTI involves at least two steps: native and denatured. The presence of 3.5 M of urea or GdnHCI inhibited 50% and 100% of the inhibitory activity, respectively. 80th chaotropic agents had promoted a displacernent of the mass center. The conformational stability calculations dG (H2O) were made by taking the wavelengths corresponding to the maximum fluorescence emission as a pararneter. The dG (H2O) value in function of the concentration of urea and guanidine chloride were 63,0 and 54,0 Kcal mol-1, respectively. The calculations of center of mass were taken as a function of the denaturating agent concentration in both cases / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Valdemiro Carlos Sgarbieri / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-21T04:31:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_MariaReginaBarbieriDe_D.pdf: 28183156 bytes, checksum: bf7a539a7aa882bc0e3dbf77dd91a0ab (MD5) Previous issue date: 1996 / Doutorado

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T11:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_LuziaAparecida_D.pdf: 10632318 bytes, checksum: 45612dfee93908b50ef1254a32637591 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: As leguminosas contêm quantidades relativamente grandes de proteínas e dentre essas proteínas destacam-se os inibidores de proteinases e lectinas. O objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito de inibidores de proteinases sobre o desenvolvimento da Diatraea saccharalis e sobre microrganismos fitopatogênicos, assim como caracterizar físico-quimicamente uma lectina de Crota/aria paulina e estudar suas propriedades biológicas. A lectina das sementes de Crota/aria paulina foi purificada por cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE Sepharose Fast Flow e em cromatografia de fase reversa-HPLC. A massa molecular determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições redutoras e não redutoras foi calculada em aproximadamente 30 kDa. A hemaglutinação induzida por CrpL sobre eritrócitos humanos e bovinos é inibida por N-acetil-D-galactosamina, D-galactose e pela glicoproteína asialofetuína. A lectina não requer íons divalentes para sua atividade, pois não é inibida por EDT A. A análise do conteúdo de carboidrato para CrpL indicou que esta lectina contém aproximadamente 6,2% de carboidratos, utilizando galactose e manose como padrões, o que comprova que esta lectina é uma glicoproteína. A composição global de aminoácido mostrou que a lectina é rica em resíduos de aminoácidos prolina, glicina, serina e alanina, e não apresenta resíduos de histidina, arginina, metionina e fenilalanina. A seqüência N-terminal apresentou-se bloqueada e os poucos resíduos obtidos não mostraram qualquer homologia com outras lectinas da família leguminosa. Estudos de agregação plaquetária induzida por ADP com plasma humano até a concentração de 100ug/ml de CrpL, demonstraram não haver modulação significativa sobre plaquetas. O estudo envolvendo CrpL sobre bactérias Xanthomonas campestris pv. phaseoli e Xanthomonas campestris pv. passiflorae, demonstrou que esta lectina afetou o crescimento dessas bactérias. As propriedades antimetabólicas dos inibidores de proteinases (IPs) de soja e feijão, foram determinadas "in vivo" após a incorporação em dieta artificial, com avaliação do potencial de crescimento de populações da broca-da-cana Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Pyralidae). Os inibidores foram incorporados em dieta artificial à base de farelo de soja e levedura de canade-açúcar. O efeito dos inibidores sobre o desenvolvimento das lagartas de D. saccharalis foi avaliado aos 16 dias de idade para os diferentes tratamentos (T1, T2 e T3), através da viabilidade larval; % de eficiência de lagartas aptas; peso das lagartas e peso de pupas com 24 horas. Os inibidores de tripsina de soja e de feijão atrasaram o desenvolvimento das lagartas, além de interferir no peso. Foram analisados também, os inibidores de CpTI, CjTI, CsTI, SBTI e PvTI sobre o crescimento micelial de fungos do gênero Fusarium e Colletotrichum. Os experimentos foram conduzidos sobre placas de Petri, usando meio de BDA para Fusarium sp e meio de aveia para o Coletotrichum, com 10 repetições. Como controle foi usada água esterilizada. As placas foram deixadas á 28°C no escuro. Quando o controle alcançou o diâmetro total da placa, o experimento foi interrompido. Os inibidores mostraram diferentes efeitos sobre o crescimento de Fusarium s p "in vitro". O CpTI não mostrou qualquer efeito em relação ao controle, e o PvTI não teve efeito fungicida mas reduziu a concentração de hifas. Inibidor de CjTI foi capaz de ocasionar mudanças na morfologia do fungo. CjTI and PvTI mostrou efeito fungistático sobre o crescimento de Colletotrichum graminicola, sendo que o inibidor PvTI mostrou-se mais eficaz no controle do crescimento micelial. O SBTI não foi efetivo contra quaisquer espécies de fungos estudados. Estudos envolvendo CpTI e PvTI sobre a germinação de esporos de fungos da espécie Ustilago scitaminia, demonstrou que esses inibidores não têm efeitos sobre esses fungos. Inibidores de CpTI foram capazes de inibir o crescimento de duas espécies de bactérias, assim como BvcTI foi capaz de inibir o crescimento de Xanthomonas sp da cana de açúcar. PvTI não mostrou efeito sobre essas bactérias. Os resultados obtidos sugerem que CrpL, assim como os inibidores de proteinases estudados de várias sementes de leguminosas, podem estar envolvidos no mecanismo de defesa contra microrganismos fitopatogênicos. Os resultados com inibidores de serinoproteinases, de feijão e soja, sugerem, também, a possibilidade desses inibidores serem utilizados como ferramentas no estudo de plantas transgênicas de cana-de-açúcar no controle da broca (Diatraea saccharalis) / Abstract: A naturaly occuring lectin activity was detected in the extract of Crota/aria paulina seeds. The crude lectin extract was prepared by grounding the seeds followed by acid extraction with glycine 0.1 M I NaCI 0.15 buffer, pH 2.6. The lectin from C. paulina was purified by ion-exchange and reverse fase chromatography. The lectin purified was assayed with human (A, S, AS, O) and animal (Cow) erythrocytes and it was nonspecific for any human blood group. This lectin agglutinated native and trypsintreated erythrocytes and it requires no Ca++ or Mg++ for hemagglutination activity. Hemagglutinating inhibitory assay was performed with mono and disaccharides solution (100mM) and it was inhibited by N-acetyl-D-galactosamine, D-galactose and byasialofetuin. Studies performed in SDS-PAGE (12,5%) of purified lectin under non-reducing and reducing conditions showed a single band of 30 kDa. The data obtained for the lectin of Crota/aria paulina, when compared to the one obtained from Crota/aria juncea and Crota/aria striata showed that in spite of belonging to the same genus they possess different agglutination properties and specificity for carbohydrate. On ADPinduced platelet aggregation assay with human plasma up to 100ug/ml of the lectin showed no significant modulation on platelets. Studies of CrpL on Xanthomonas campestris pv. phaseoli and Xanthomonas campestris pv. passiflorae, showed that the lectin was able to inhibit the growth and development these bacteria. The evaluation of proteinaceous inhibitors of proteolytic enzymes as candidates to provide resistance to economically important crops against insect pests is currently attracting much research interest. The antimetabolic properties of the SPI after incorporation into artificial diet, in vivo, and its interference on population increase potential of the pest have been evaluated. The incorporation of SPI into an artificial diet of larvae significantly reduced the growth and development of the insect, reflecting an increase of the instar number and duration, and a significantly lower average weight. It was also observed that the diet nutrition value affects the insect susceptibility to the inhibitor. The effect on growth rates observed in this study resulted in significant differences in mean weights of larvae at the conclusion of the experiment (day 16). Here, the mean weight of larvae fed on control diet was significantly greater than the mean weight of larvae fed diet containing proteinase inhibitors CpTI and SSTI. The study of the effects from CpTI, CsTI, CjTI, SBTI and PVTI on the mycelial growth of the genus Fusarium and Colletotrichum were carried out on Petri slabs, using medium of BOA for Fusarium sp and medium of oat for Colletotrichum graminicola, with 10 repetitions. Sterilized water was used as control. Plates were kept at 28°C in the dark. When the control reached the whole diameter of plate, the experiment was interrupted. Inhibitors showed different effects on the growth of Fusarium sp in vitro. CpTI did not show any effects in relation to the control, and PvTI did not have effects but reduced the concentration of hyphas. CpTI had effect and occasioned a change in the colony morphology. CjTi and PvTI showed antifungal effect on the growth of Colletotrichum graminicola, being that PvTI showed itself quite efficient in the growth control of the colony. CpTI were able to inhibit the bacterial development and growth of the two pathogenic bacteria species of Xanthomonas, Xanthomonas campestris pv. Phaseoli and Xanthomonas campestris pv. passiflorae. BvcTI was also able to inhibit the bacterial growth of Xanthomonas sp. On the other hand, PvTI it was not effective against these bacteria. The results presented here suggest that CrpL and proteinase inhibitors may be involved in the defense mechanism against pathogenic microorganisms. These results suggest also a potential value of SPI for protecting sugarcane plants against damage by Diatraea saccharalis / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-10-05T20:39:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Leydianne Leite de Siqueira Patriota Queiroz.pdf: 1890707 bytes, checksum: 03464b332cc53d519ebcbeca1662febe (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-11-14T20:11:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Leydianne Leite de Siqueira Patriota Queiroz.pdf: 1890707 bytes, checksum: 03464b332cc53d519ebcbeca1662febe (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-14T20:11:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Leydianne Leite de Siqueira Patriota Queiroz.pdf: 1890707 bytes, checksum: 03464b332cc53d519ebcbeca1662febe (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / CNPq / Microgramma vacciniifolia (Polypodiaceae, Pteridophyta) é uma planta epífita que possui propriedades medicinais, por exemplo, no tratamento de infecções respiratórias. Lectinas de origem vegetal são capazes de exercer ação imunomoduladora sobre células do sistema imune de mamíferos, através da interação com receptores de superfície celular. Esta dissertação descreve a purificação e caracterização de uma lectina a partir das frondes de M. vacciniifolia (MvFL), assim como a avaliação da sua toxicidade e efeito imunomodulador sobre células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) humano. Extrato proteico foi obtido por homogeneização do pó das frondes secas em NaCl 0,15 M (10%, p/v) por 16 h a 25ºC. MvFL foi isolada a partir do extrato através de cromatografia de gel filtração em coluna de Sephadex G-75 seguida de cromatografia de troca iônica utilizando a matriz DEAE-Sephadex A25. A homogeneidade de MvFL foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) em condições nativas para proteínas básicas ou ácidas. MvFL foi caracterizada quanto a especificidade de ligação a carboidratos, massa molecular nativa, ponto isoelétrico (pI), composição em subunidades, presença de glicosilação e similaridades na sua estrutura primária com outras proteínas vegetais. A estabilidade da lectina em diferentes valores de pH (3,0–9,0) e após aquecimento a diferentes temperaturas (30–100°C) foi avaliada por ensaio de hemaglutinação e espectrometria de fluorescência. Adicionalmente, MvFL foi avaliada quanto à atividade inibitória de tripsina. Citotoxicidade foi investigada através da avaliação da indução de apoptose/necrose em PBMCs tratados com MvFL (6,25–50μg/mL). A atividade imunomoduladora de MvFL (12,5 μg/mL) sobre PBMCs foi avaliada através da determinação dos níveis de citocinas, quimiocinas e óxido nítrico (NO). Diferenciação e ativação de células T também foram investigadas. MvFL foi isolada com elevada atividade hemaglutinante específica (10.240) e elevado fator de purificação (3.413). Ela foi revelada como uma glicoproteína de pI 4,51 e massa molecular nativa de 54 kDa, sendo composta por 3 subunidades distintas. Espectrometria de massas de peptídeos derivados da hidrólise de MvFL por tripsina revelou similaridades (cobertura de sequência de 32%) com a estrutura primária de uma proteína vegetal ligadora de RNA de Theobroma cacao. A atividade hemaglutinante da lectina foi inibida apenas por glicoproteínas (fetuína e ovoalbumina). O aquecimento de MvFL não afetou a atividade hemaglutinante nem promoveu desenovelamento da lectina. Tanto a atividade hemaglutinante quanto a conformação da lectina variaram dependendo do pH do meio, sendo MvFL menos ativa em pH alcalino. A lectina apresentou atividade inibidora de tripsina (3360,1 U/mg) e não apresentou toxicidade para PBMCs nas concentrações de 6,25 a 25 μg/mL. A lectina promoveu um aumento na produção de TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-10 e NO, bem como estimulou a diferenciação e ativação de linfócitos T CD8+. MvFL não alterou a produção das quimiocinas testadas. Em conclusão, as frondes de M. vacciniifolia contêm uma proteína termoestável e multifuncional, com atividades lectínicas e inibidora de tripsina, baixa toxicidade para linfócitos, ação imunomoduladora sobre PBMCs, induzindo predominantemente uma resposta Th1, e capaz de promover ativação e diferenciação de linfócitos humanos. / Microgramma vacciniifolia (Polypodiaceae, Pteridophyta) is an epiphytic plant that has medicinal properties, for example, in the treatment of respiratory infections. Lectins of plant origin are able to exert immunomodulatory action on cells from mammalian immune system by interacting with cell surface receptors. This work describes the purification and characterization of a lectin from the M. vacciniifolia fronds (MvFL), as well as the evaluation of its toxicity and immunomodulatory effect on human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Protein extract was obtained by homogenizing the powder of dried fronds in 0.15 M NaCl (10%, w/v) for 16 h at 25°C. MvFL was isolated from the extract by gel filtration chromatography on Sephadex G-75 column followed by ion exchange chromatography using the DEAE-Sephadex A25 matrix. The homogeneity of MvFL was evaluated by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) under native conditions for basic or acidic proteins. MvFL was characterized in terms of carbohydrate specificity, native molecular mass, isoelectric point (pI), subunit composition, presence of glycosylation and similarities in its primary structure with plant proteins. The stability of the lectin at different pH values (3.0-9.0) and after heating at different temperatures (30-100°C) was evaluated by hemagglutination assay and fluorescence spectrometry. Additionally, MvFL was evaluated for trypsin inhibitory activity. Cytotoxicity was investigated by evaluating the induction of apoptosis/necrosis in PBMCs treated with MvFL (6.25–50 μg/mL). Immunomodulatory activity of MvFL (12.5 μg/mL) on PBMCs was assessed by determining the levels of cytokines, chemokines and nitric oxide (NO). Differentiation and activation of T cells were also investigated. MvFL was isolated with high specific hemagglutinating activity (10,240) and purification factor (3,413). It was revealed as a glycoprotein with pI 4.51 and native molecular weight of 54 kDa, being composed of three distinct subunits. Mass spectrometry of peptides derived from the hydrolysis of MvFL by trypsin revealed similarities (32% sequence coverage) with the primary structure of a RNA-binding protein from Theobroma cacao. The hemagglutinating activity of MvFL was inhibited only by glycoproteins (fetuin and ovalbumin). Heating of MvFL did not affect hemagglutinating activity or promote lectin unfolding. Both the hemagglutinating activity and the conformation of the lectin varied depending on the pH of the medium, with MvFL being less active at alkaline pH. The lectin showed trypsin inhibitory activity (3,360.1 U/mg) and no toxicity to PBMCs at concentrations of 6.25 to 25 μg/mL. The lectin promoted an increase in the production of TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-10 and NO, as well as stimulated the differentiation and activation of T CD8+ lymphocytes. MvFL did not alter the production of the chemokines tested. In conclusion, the fronds of M. vacciniifolia contain a thermostable and multifunctional protein with lectin and trypsin inhibitor activities, low toxicity to lymphocytes, immunomodulatory action on PBMCs, inducing predominantly a Th1 response, as well as able to promote differentiation and activation of human lymphocytes.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3107_1.pdf: 1671474 bytes, checksum: 24bd8cb473e30b625f220e29f8df13a5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Dengue é uma arbovirose transmitida pelo Aedes aegypti e o controle do mosquito é fundamental para reduzir a propagação da doença. As larvas de A. aegypti têm desenvolvido resistência a inseticidas organofosforados. O uso de compostos naturais que promovam mortalidade pode evitar a emergência de larvas resistentes, devido à rotatividade dos inseticidas. Este trabalho relata a atividade larvicida (CL50 de 0.925%, p/v) do extrato de flores de Moringa oleifera sobre o quarto instar larval (L4) de A. aegypti. Inibidor de tripsina de natureza protéica (MoFTI, 169,9 kDa, Ki: 0,38 nM), triterpeno (&#946;-amirina), esteróide (&#946;- sitosterol) e flavonóides (kaempferol e quercetina) foram detectados no extrato; lectina não foi detectada. Tripsina do extrato do intestino de L4 foi inibida por MoFTI (Ki: 0,6 nM); entretanto, a atividade de acetilcolinesterase (AChE) do extrato de L4 inteiras não foi alterada. Ensaio em condições in vivo mostrou que a atividade de tripsina do intestino de L4 tratadas com o extrato de flores de M. oleifera diminuiu ao longo do tempo (0 a 1440 min) e foi fortemente inibida (98,6 %) após 310 min de incubação; a atividade de AChE do extrato de L4 inteiras não foi afetada neste período. O estudo aponta o extrato de flores de M. oleifera como uma ferramenta biodegradável para o controle de larvas de A. aegypti e sugere que o mecanismo larvicida envolve a inibição da tripsina do intestino das L4 por MoFTI

Orientador: Everson Alves Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-25T18:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tamagawa_RosanaEmi_M.pdf: 11882548 bytes, checksum: d2bd23974f6d646f4758b4919437dd5e (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Aprotinina é uma proteína presente em alguns órgãos bovinos (tais como pâncreas, fígado e pulmão). Devido sua propriedade de inibição de serino-proteases possui diversas aplicações, inclusive na área médica. O objetivo deste trabalho foi a recuperação de aprotinina a partir de efluente do processamento industrial de insulina bovina através da técnica IMAC ("Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography"). Uma vez que a aprotinina não possui o requerimento básico para adsorção em matrizes IMAC (resíduos de histidina disponíveis na superfície da molécula) a estratégia deste trabalho baseou-se na formação do complexo do inibidor com tripsina. A primeira etapa do trabalho que consistiu no estudo da adsorção de complexo a partir de solução tampão mostrou a possibilidade do processo utilizando matriz IMAC sílica-EDA-Cu2+. A remoção de complexo a partir de solução tampão não foi influenciada pelo aumento do pH de 7,0 a 8,5. Entretanto, foi significantemente afetada pela força iônica com maiores capacidades de adsorção com o decréscimo da concentração de NaCl de 1,0 para 0,5 M. Capacidades de adsorção de até 20 miligramas de complexo por grama de matriz foram obtidas. A dessorção foi conduzida contactando-se a matriz contendo complexo adsorvido com tampão a baixo pH (2,1). A força iônica teve um efeito significativo nesta etapa: a eficiência de dessorção foi elevada de 40 a cerca de 100% com a adição de 1,0 M de NaCl no tampão de dessorção O segundo estágio deste trabalho foi o estudo da adsorção de complexo a partir do efluente industrial. Primeiramente, a verificação da adsorção de impurezas (proteínas do efluente) sugeriu baixa especificidade na adsorção do complexo devido intensa adsorção destas impurezas. Esta baixa especificidade foi confirmada com a adsorção de complexo a partir do efluente industrial. Alguma seletividade foi alcançada com a dessorção em duas etapas como verificado através de eletroforese SDS-PAGE: numa primeira etapa eluiu-se com tampão a pH baixo principalmente impurezas e nenhum complexo ao passo que, numa segunda etapa da dessorção, obteve-se eluição significativa de complexo com tampão a pH baixo na presença de NaCl a 1,0 M / Aprotinin is a small protein present in some bovine organs (pancreas, liver and lung). It is a serine-protease inhibitor that has medical applications. The objective of this work was to recover aprotinin from industrial insulin production effluent by IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography). Since aprotinin does not have the basic requirements for adsorption onto IMAC matrices (available histidine residues on its surface), the approach used for its recovery was to exploit its complex formation with trypsin. The first stage of this work was the study of adsorption of the aprotinin-trypsin complex from buffer solutions. Stirred tank batch type experiments indicated that the complex could be adsorbed onto an IMAC matrix (silica-IDA-Cu2+). The increase of pH from 7.0 to 8.5 did not affect the uptake of complex from solution. However, adsorption capacity was significantly affected by ionic strength: higher capacity values were obtained as the ionic strength was decreased in the range from 1.0 to 0.5 M NaCl. Adsorption capacities as high as 20 milligram of complex per gram of matrix were achieved. Desorption was carried out by contacting the complex containing matrix with a low pH buffer (pH 2.1). The ionic strength had a strong effect in this step: the desorption efficiency increased from 40 to virtually 100% when 1 M of NaCl was added to the desorption buffer. The second stage of the work was complex adsorption out of the industrial effluent. First, evaluation of the adsorption of impurities (effluent proteins) suggested low specificity of complex adsorption due to intense adsorption of these impurities. This low specificity was confirmed with complex adsorption after spiking the effluent with stoichiometric amounts of trypsin and aprotinin Some selectivity was achieved with the desorption step as verified by SDS-PAGE: desorption with buffer at low pH eluted mainly impurities and no complex; addition of 1.0 M NaCl in a second desorption treatment allowed the elution of complex besides some impurities / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química