Orientador: Thales Rocha de Mattos Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:18:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barros_PedroPaulo_D.pdf: 3230448 bytes, checksum: 10fc583371ba484a1db78c5f64683737 (MD5) Previous issue date: 1989 / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi verificar a influência da tripsina, quimiotripsina e paracetamol em tecido de granulação induzido pelo implante de esponja de PVC, subcutâneamente, na região dorsal traseira, de ratos. Os animais foram divididos em dois Grupos: Controle e Tratados, onde tiveram seus tecidos de granulação retirados aos 5, 10, 14, 21 e 28 dias após implante da esponja de PVC. Os referidos tecidos foram então encaminhados para confecção de lâminas histopatológicas para coloração com Hematoxilina-Eosina, para estudo morfológico e evolutivo e reação metacromática com Azul de Toluidina pH 4,0, para estudo histofotométrico da síntese de mucopolissacarídeos ácidos (glicosaminoglicanas). Os animais do grupo Tratado, foram por sua vez divididos em três grupos: Grupo Parenzyme 'MARCA REGISTRADA¿, Grupo Parenzyrme Analgésico 'MARCA REGISTRADA¿ e Grupo Eraldor 'MARCA REGISTRADA¿. Os três grupos de animais tratados, receberam peIa via intraperitoneal as respectivas drogas em estudo. A administração das drogas ocorreu nos três últimos dias dos períodos pré-determinados de desenvolvimento do tecido de granulação, a cada 8 horas. Os resultados obtidos, dentro de nossas condições experimentais, mostraram que o Parenzyrme 'MARCA REGISTRADA¿ , o Parenzyme Analgésico 'MARCA REGISTRADA¿ e o Eraldor 'MARCA REGISTRADA¿, interferiram na síntese de mucopolissacarídeos ácidos (glicosaminoglicanas) e colágeno, promovendo inibição do desenvolvimento e da maturação do tecido de granulação notadamente no 10º dia após o implante das esponjas de PVC / Abstract: Not informed. / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Ciências

Orientador: João Alberto Negrão / Coorientador: Maria Regina Barbieri de Carvalho / Banca: José Jurandir Fagliari / Banca: Maria da Graça Pinheiro / Resumo: O sistema imunológico de bezerros consolida-se com a ingestão do colostro, alimento rico em imunoglobulinas que são proteínas responsáveis por transferir imunidade aos bezerros. A eficiência dessa transferência é influenciada por uma série de fatores, dentre eles a integridade das imunoglobulinas a serem absorvidas. No colostro estão naturalmente presentes os inibidores de tripsina, capazes de preservar as imunoglobulinas da ação de enzimas proteolíticas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a potencialidade dos inibidores de tripsina da soja na transmissão da imunidade passiva de bezerras da raça Holandesa, por meio da análise das concentrações de imunoglobulina G (IgG) e proteína total (PT) e atividade da gamaglutamiltransferase (GGT) sérica. Foram utilizadas 18 bezerras recém-nascidas alimentadas com colostro (T1), colostro adicionado de inibidor de tripsina purificado Sigma tipo I-S (50 mg) (T2) e provenientes da fração albumina da soja 1,08 g (T3). As amostras de sangue foram colhidas por venopunção da veia jugular com 1, 12, 24, 36 e 48 h após o nascimento, sendo a primeira colheita realizada antes do fornecimento do colostro. O colostro apresentou teor de gordura de 3,2 a 7,2 %, de proteína total de 14,10 a 19,52 %, representada por 7,84 a 9,44 % pelas proteínas do soro (PS). A atividade dos inibidores de tripsina variou de 0,766 a 0,945 mg de tripsina inibida.mL-1. Não houve influencia dos tratamentos (p>0,05%) para os parâmetros analisados, porém houve efeito (p<0,05%) do período de amostragem, com aumento nas concentrações de IgG, GGT e PT a partir da 0h com respectivos valores médios de 0,68 g.dL-1; 15,17U.L-1, 4,43 g.dL-1, com pico de absorção às 24 h: 3,06 g.dL-1, 2.779 U.L-1 e 7,54 g.dL-1, respectivamente, indicando transmissão adequada de imunidade passiva. A adição dos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The calves' immune system is consolidated by the ingestion of colostrum, which is rich in immunoglobulin, the proteins that are responsible for transfering the immunity to the calves. This transferring efficacy is influenced by a series of facts, among them the immunoglobulin's integrity to be absorbed. Trypsin inhibitors are naturally present on the colostrum and they are able to preserve the immunoglobulin from the proteoclastic enzyme actions. The aim of this work was to evaluate the potentiality of soya Trypsin inhibitor on the passive immunity of the Holstein female calves, by evaluating the concentration of immunoglobulin G (IgG) and total protein (PT) as well as Gammaglutamil transferase (GGT) activity in serum. Eighteen newborn female calves were taken and they were fed with colostrums (T1), colostrums with purified trypsin inhibitor I-S Sigma (50mg), (T2) and colostrums with soya albumin fraction 1.08 g (T3). Blood samples were collected by jugular veined punch within 1, 12, 24, 36 and 48 hours after they were born, the first collection was done before the colostrums was given. Colostrums have presented 3.2% to 7.2 % of fat contents; 14, 10% to 19, 52 % of total protein represented by 7, 84% to 9, 44 % of serum protein (PS). Trypsin inhibitor activities have varied from 0,766 mg to 0,945 mg of inhibited trypsin mL-1. There was no influence of the treatments (p>0,05%) for the analyzed parameters, however, there was (p<0,05%) a significant effect for the period of collection, with an increase on IgG, GGT and, PT concentrations from 0h with the respective medium values of 0,68g.dL- 15,17U.L-1, 4,43 g.dL-1. The absorption pick was at 24 h: with 3,06 g.dL-1, 2.779 U.L-1 and 7,54 g.dL-1 means, respectively for IgG, GGT and PT, indicating an adequate transmission of passive immunity. The addition of soya Trypsin... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3102_1.pdf: 1259276 bytes, checksum: c0878ec8ef24a46259582227748106b4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A protease alcalina extraída do ceco pilórico do pirarucu (Arapaima gigas) foi purificada em quatro etapas: tratamento térmico, precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de gel-filtração em coluna Sephadex® G-75 e cromatografia de afinidade em coluna benzamidina-agarose. Após as etapas de purificação aplicou-se uma amostra da proteina obtida em gel de eletroforese e verificou-se a presença de única banda que apresentou peso molecular aproximado de 28,0 kDa. Desta forma, após purificação, avaliaram-se as propriedades físico-químicas e cinéticas da enzima e o efeito de íons metálicos e de inibidores de proteases na atividade proteolítica da mesma, utilizando-se benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BApNA) como substrato. O pH e a temperatura ótima de reação encontrada foram 9,0 e 65°C, respectivamente. A enzima mostrou-se estável, após 30 min de incubação, em ampla faixa de pH alcalino (pH 6,0 a 11,5). Após 30 minutos de incubação a 60ºC, foi detectada uma perda de 10% da atividade tríptica. Os valores encontrados para os parâmetros cinéticos (Km, Kcat e Kcat/Km) foram: 0,47 ± 0,042 mM, 1,33 s-1 and 2,82 s-1 · mM-1, respectivamente, usando BApNA como substrato. A atividade tríptica mostrou-se sensível a alguns íons metálicos. A atividade tríptica foi inibida, em ordem crescente, pelos íons: Mn2+ > Ca2+ > Li+ > Cd2+ > Cu2+ > Fe2+ > Hg2+ > Zn2+ > Al3+ > Pb2+. Por outro lado, os íons K+, Mg2+ e Ba2+ não promoveram nenhum efeito na atividade da protease. A enzima foi fortemente inibida por inibidores de tripsina. Os ensaios com substrato específico e inibidores de tripsina forneceram evidências de que esta enzima é provavelmente uma tripsina-símile e suas características sugerem um forte potencial para ser utilizada em processos e produtos industriais

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 455926.pdf: 1580649 bytes, checksum: 43ccab4db0f539ea4361b47f57d0cedd (MD5) Previous issue date: 2014-01-24 / We assessed the effects of pharmacological spinal inhibition of voltage-gated calcium channels (VGCC) in mouse pruritus. The epidural administration of P/Q-type MVIIC or PhTx3.3, L-type verapamil, T-type NNC 55-0396 or R-type SNX-482 VGCC blockers failed to alter the scratching behavior caused by the PAR-2 activator trypsin, injected into the mouse nape skin. Otherwise, trypsin-elicited pruritus was markedly reduced by the spinal administration of preferential N-type VGCC inhibitors MVIIA and Ph&#945;1&#946;. C. magus-obtained toxin MVIIA displayed significant effects when dosed from 1 to 4 h before trypsin, whereas the effects of P. nigriventer-derived Ph&#945;1&#946; remained for up to 12 h. MVIIA or Ph&#945;1&#946; also prevented the itching elicited by intradermal (i.d.) injection of SLIGRL-NH2, compound 48/80 or chloroquine, although they did not affect H2O2-induced itching. Furthermore, the co-administration of MVIIA or Ph&#945;1&#946; markedly inhibited the pruritus caused by the spinal injection of gastrin-releasing peptide (GRP), but not morphine. Notably, spinal MVIIA or Ph&#945;1&#946; greatly prevented chronic pruritus allied to dry skin. However, either toxin failed to alter the edema formation or neutrophil influx caused by trypsin. In addition, epidural MVIIA or Ph&#945;1&#946; did not modify the expression of GRP receptor (GRP-R) in the spinal cord, whilst they brought c-Fos activation to control levels. Finally, the in vitro incubation of MVIIA or Ph&#945;1&#946; prevented the calcium influx evoked by the synthetic PAR-2 agonist AC264613 in spinal cord synaptosomes. Data brings novel evidence on itching transmission mechanisms, pointing out the therapeutic relevance of N-type VGCC inhibitors to control refractory pruritus. / Foram avaliados os efeitos da inibi??o farmacol?gica dos canais de c?lcio voltagem-dependentes (CCVD) no prurido em camundongos. A administra??o intratecal (i.t.) dos bloqueadores CCVD do subtipo P/Q (MVIIA ou PhTx3.3), subtipo L (verapamil), subtipo T (NNC 55-0396) ou do subtipo R (SNX-482) n?o alterou o comportamento de co?ar induzido pela tripsina (agonista do receptor PAR-2), aplicada na regi?o dorsal do pesco?o de camundongos. Entretanto, o comportamento de co?ar induzido pela tripsina foi significativamente diminu?do pela administra??o i.t. dos bloqueadores de CCVD do subtipo N (MVIIA e Ph&#945;1&#946;). A toxina MVIIA, derivada do C. magus, apresentou efeitos significativos quando administrada entre 1 a 4 horas antes da aplica??o de tripsina. Por outro lado, a toxina Ph&#945;1&#946; derivada do veneno da aranha P. nigriventer demonstrou atividade, quando injetada at? 12 h antes da tripsina. O pr?-tratamento com MVIIA ou Ph&#945;1&#946; foi efetivo em inibir o comportamento de co?ar induzido pela aplica??o intrad?rmica (i.d.) de SLIGRL-NH2, composto 48/80 ou cloroquina; entretanto, as toxinas n?o inibiram o comportamento de co?ar induzido pela inje??o i.d. de H2O2. A co-inje??o de MVIIA ou Ph&#945;1&#946; inibiu o comportamento de co?ar induzido pela aplica??o i.t. do pept?deo liberador de gastrina (GRP), mas n?o inibiu o prurido causado pela morfina. Relevantemente, a administra??o i.t. da toxina MVIIA ou Ph&#945;1&#946; inibiu a coceira cr?nica induzida pelo modelo de pele seca em camundongos. A atividade anti-pruritog?nica de ambas as toxinas n?o parece estar relacionada com a modula??o do processo inflamat?rio na pele, uma vez que as toxinas MVIIA ou Ph&#945;1&#946; n?o foram capazes de inibir o edema e a migra??o de neutr?filos induzidos pela aplica??o i.d. de tripsina. A aplica??o i.t. de MVIIA ou Ph&#945;1&#946; n?o modificou a express?o do receptor para o GRP (GRP-R) na medula espinhal. Por outro lado, as duas reduziram a express?o de c-Fos aos n?veis do grupo controle, de acordo com a avalia??o na medula dos camundongos. Finalmente, a incuba??o de MVIIA ou Ph&#945;1&#946; preveniu o influxo de c?lcio estimulado pelo agonista do receptor PAR-2 AC264613 em sinaptossomas de medula de camundongos. Estes resultados trazem uma nova perspectiva acerca dos mecanismos envolvidos na sinaliza??o da coceira, indicando os inibidores de CCVD do subtipo N como poss?veis estrat?gias para o tratamento do prurido, especialmente nas condi??es onde h? aus?ncia de resposta ? terapia atual.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-03-09T13:28:58Z No. of bitstreams: 1 PDF - Géssica Laize Berto Gomes.pdf: 960450 bytes, checksum: 01f35541007decb425986338cf77d27a (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-21T21:00:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Géssica Laize Berto Gomes.pdf: 960450 bytes, checksum: 01f35541007decb425986338cf77d27a (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-21T21:01:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Géssica Laize Berto Gomes.pdf: 960450 bytes, checksum: 01f35541007decb425986338cf77d27a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-21T21:01:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Géssica Laize Berto Gomes.pdf: 960450 bytes, checksum: 01f35541007decb425986338cf77d27a (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Brazilian production of grains has grown every year, transforming Brazil in one of the main cereals and oilseeds producers. However, the post-harvest losses are huge, causing production loss by the inadequacy of storage, especially in order of pest occurrence. In the case of sesame, there has been a marked occurrence of P. interpuctella, which attack stored grains accompanied by other pests causing economic damage to the crop. With this, the Breeding Program Sesame Embrapa Cotton seeks alternatives to control these pests by genotypes that express high levels of protein inhibitors (PIs) with ability to inhibit proteolytic digestive enzymes of insects. The objective of this study was to detect trypsin inhibitors in genotypes of sesame (S. indicum L.) with potential use in biotechnological applications and programs to improve the species, aiming selection of genotypes resistant to stored grain pests, so we proceeded to study PIs in 10 sesame genotypes belonging to the Active Germplasm Bank at Embrapa Cotton. The total protein extracts of accessions were extracted and tested in vitro with bovine pancreatic trypsin (BPT) and intestinal homogenate of larvae of P. interpuctella. After selection of the most promising genotypes, we proceeded to a protein fractionation with ammonium sulfate. The protein fractions obtained were analyzed for inhibitory activity with BPT and intestinal homogenate of larvae of P. interpuctella, and yet, as the thermal stability and hydrogen ion and bioassays with P. interpuctella. Data were analyzed by Tukey test at 5% of probability. The results showed the presence of trypsin inhibitors in the total protein extracts of 10 sesame genotypes, ranging from 51% to 90% inhibition, among which, the BRS-SEDA, CNPA G3 and CNPA G4 stood out with 87%, 88% and 90% inhibition, respectively. These genotypes inhibitory activity have been demonstrated for the intestinal homogenate of larvae of P. interpuctella, with inhibition between 60% and 76%. The fractions F2 of the three genotypes were relatively stable to changes in temperature and pH. In the bioassay, the larvae of P. interpuctella. were susceptible to protein extracts of the three genotypes of sesame, with a maximum of 83% mortality of larvae in different strengths with total protein extracts and 58% in fractions F2, however, did not observe statistically a significant difference between genotypes. In this regard, BRS-SEDA, CNPA G3 and CNPA G4 have protein inhibitors that can prevent the development of P. interpuctella, suggesting candidates with potent insecticidal properties to control stored grain pests. / A produção brasileira de grãos tem crescido a cada ano levando o Brasil a um dos principais produtores de cereais e oleaginosas. No entanto, as perdas na pós-colheita são enormes provocando uma redução da produção em função do controle inadequado no armazenamento, especialmente em função da ocorrência de pragas. No caso do gergelim, tem havido uma ocorrência acentuada de P. interpuctella, que ataca os grãos armazenados acompanhado de outras pragas, causando danos econômicos à cultura. Com isto, o Programa de Melhoramento Genético de Gergelim da Embrapa Algodão busca alternativas para controlar essas pragas, por meio de genótipos que expressem altos níveis de inibidores proteicos (IPs) com capacidade de inibir enzimas proteolíticas digestivas de insetos. Objetivou-se com este trabalho detectar inibidores de tripsina em genótipos de gergelim (Sesamum indicum L.) com potencial uso na aplicação biotecnológica e no programa de melhoramento da espécie, visando seleção de genótipos resistentes a pragas de grãos armazenados. Assim, procedeu-se o estudo de IPs em 10 genótipos de gergelim, pertencentes ao Banco Ativo de Germoplasma da Embrapa Algodão. Os extratos proteicos totais dos acessos foram extraídos de sementes de gergelim e testados in vitro com tripsina pancreática bovina (TPB) e homogenato intestinal de larvas de P. interpuctella. Após seleção dos genótipos mais promissores, procedeu-se um fracionamento proteico com sulfato de amônia. As frações proteicas obtidas foram analisadas quanto a atividade inibitória com TPB e homogenato intestinal de larvas de P. interpuctella, e ainda, quanto a estabilidade térmica e hidrogeniônica e em bioensaios com P. interpuctella. Os dados foram analisados pelo teste de Tukey a 5% de probalibilidade. Os resultados obtidos mostraram a presença de inibidores de tripsina nos extratos proteicos totais dos 10 genótipos de gergelim, com variação de 51% a 90% de inibição, dentre os quais, o BRS-SEDA, CNPA G3 e CNPA G4 se destacaram com 87%, 88% e 90% de inibição, respectivamente. Nesses genótipos foram evidenciadas atividade inibitória para o homogenato intestinal de larvas de P. interpuctella, com inibição entre 60% e 76%. As frações F2 dos três genótipos foram relativamente estáveis às variações de temperatura e pH. No ensaio biológico, as larvas de P interpuctella mostraram-se suscetíveis aos extratos proteicos dos três genótipos de gergelim, com mortalidade máxima de 83% das larvas em diferentes dosagens com extratos proteicos totais e 58% nas frações F2, contudo, estatisticamente não observou-se diferença significativa entre os genótipos. Neste aspecto, os genótipos BRS-SEDA, CNPA G3 e CNPA G4 possuem inibidores proteicos capazes de impedir o desenvolvimento P. interpuctella, o que sugere potentes candidatos com propriedades inseticidas no controle de pragas de grãos armazenados.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pos-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T20:47:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 275439.pdf: 2261901 bytes, checksum: e2aefcb3dc4f72e77c617b673afe9cc5 (MD5) / O objetivo do presente estudo foi investigar os possíveis mecanismos e mediadores envolvidos no comportamento de coçar causado pela administração intradérmica (i.d.), no dorso de camundongos, de agonistas do receptor ativado por proteinases-2 (PAR-2). Ambos os agonistas do PAR-2, tripsina e SLIGRL-NH2, causaram comportamento de coçar, sugestivo de prurido, de maneira dependente da dose. Esse efeito foi bloqueado pelo co-tratamento com o antagonista seletivo para o receptor PAR-2, FSLLRY-NH2, ou pela dessensibilização prévia deste receptor. A participação do sistema opióide foi verificada pelo tratamento com morfina ou naloxona, agonista e antagonista dos receptores opióides, respectivamente, que inibiram a coceira induzida pela tripsina. Além disso, o comportamento pruriginoso induzido por esta enzima foi previnido pelo tratamento com os antiinflamatórios, celecoxibe (inibidor seletivo para a COX-2) ou dexametasona (corticóide). A participação de mastócitos também foi observada, uma vez que o pré-tratamento com composto 48/80, degranulador de mastócitos, ou com cromoglicato de sódio, estabilizador de mastócitos, reduziu a prurido causado pela tripsina. Ademais, o modelo parece ser dependente da ativação do receptor histaminérgico H4, mas não dos receptores H1, H2 ou H3, ja que o antagonista não-seletivo H3/H4 (tioperamida), mas não os antagonistas seletivos H1 (pirilamina e loratadina), H2 (cimetidina e ranitidina) ou H3 (iodofempropite), bloqueou o efeito pruriginoso da tripsina. O antagonista misto dos receptores histaminérgicos/serotoninérgicos, ciproeptadina, e o inibidor não seletivo de proteases, gabexato mesilato, foram eficazes em reduzir o prurido causado pelos agonistas do PAR-2, sugerindo o envolvimento da serotonina e da liberação de proteases. Interessantemente, o tratamento neonatal com capsaicina, ou o tratamento do adulto com resiníferatoxina, estratégias que promovem desenssibilização e/ou destruição de fibras sensoriais, preveniram o comportamento pruriginoso evocado por ambos os agonistas do PAR-2. Similarmente, o tratamento com o antagonista seletivo para o receptor TRPV1, SB366791, ou a deleção do gene para este receptor, inibiram o prurido induzido pela ativação do PAR-2. Esta reposta também foi dependente dos neuropeptídeos substância P (SP), neurocinina B (NKB) e CGRP, uma vez que o tratamento com os antagonistas seletivos para os receptores NK1 (FK888, para SP), NK3 (SR142801, para NKB), ou CGRP1 (fragmento CGRP8-37, para o CGRP), reduziu a coceira induzida pelos ativadores do PAR-2. Por fim, o prétratamento com antagonistas seletivos para os receptores B2 (Hoe 140 ou FR173657) ou B1 (DALBK ou SSR240612) das cininas, ou a deleção gênica destes receptores, preveniu a coceira induzida por ambos os agonistas do PAR-2. Em conjunto, estes resultados sugerem que a injeção i.d. de agonistas do PAR-2 constitui um modelo experimental reprodutível para o estudo de mecanismos e de possíveis abordagens terapêuticas, relacionados a promoção da coceira mediada pela liberação de proteases e ativação do PAR-2. Diferentes mediadores e tipos celulares liberados ou localizados na pele parecem contribuir para este processo. De relevância, neste sentido ressalta-se o envolvimento de mediadores da inflamação neurogênica, de fibras sensoriais, do receptor TRPV1, e de ambos os receptores B2 e B1 para as cininas. / The aim of this study was to investigate some mechanisms and mediators underlying the scratching behaviour induced by intradermal (i.d.) injection of proteinase activated receptor-2 (PAR-2) agonists on the back of the mouse neck. Both PAR-2 agonists, trypsin and SLIGRL-NH2, were able to evoke a marked and dose-related scratching behaviour in mice. This response was widely reduced by the co-treatment with the selective PAR-2 receptor antagonist, FSLLRY-NH2, or by previous trypsin-induced PAR-2 receptor desensitization. Opioidergic system involvement was evaluated by the treatment with morphine or naloxone, a non-selective opioid receptors agonist and antagonist, respectively, which were both effective against trypsin-induced itch. Moreover, trypsin-induced scratching behaviour was blockaded by the pre-treatment with celecoxib (a selective COX-2 inhibitor) or dexamethasone (a corticoid). Also, contribution of mast cells was evident as the scratching behaviour induced by trypsin was prevented by the pre-treatment with compound 48/80, a mast cell degranulator, or disodium cromoglycate, a mast cell stabilizer. Furthermore, PAR-2 receptor activation-induced scratching behaviour seems to be dependent on histamine H4 receptor activation, but not histamine H1, H2 or H3 receptors, as the pre-treatment with the dual histamine H3/H4 receptors antagonist (thioperamide), but not with the selective histamine H1 (pyrilamine or loratadine), H2 (cimetidine or ranitidine) or H3 (iodophenpropit) receptor antagonists, was able to interfere with trypsin response. Pre-treatment with the mixed serotonergic/histaminergic receptor antagonist, cyproheptadine, or the non-selective protease inhibitor, gabexate mesylate, were capable of inhibiting trypsin-induced pruritus, suggesting the participation of serotoninergic receptors and protease release. Interestingly, both neonatal capsaicin treatment and resiniferatoxin administration to adult mice, to promote sensorial fiber desensitization and/or destruction, were able to suppress the itching response induced by PAR-2 agonists. Similarly, the selective TRPV1 receptor antagonist, SB366791, or the genetic deletion of TRPV1, greatly diminished the PAR-2-induced scratching behaviour. The pruritogenic response induced by PAR-2 agonists in mice is widely dependent on the release of neuropeptides substance P (SP), CGRP and neurokinin B (NKB), as the treatment with the selective NK1 (FK888, for SP), NK3 (SR142801, for NKB) or CGRP1 (fragment CGRP8-37, for CGRP) receptor antagonists caused a marked reduction of PAR-2-induced pruritus. Of note, the pretreatment with both kinin B2 (Hoe 140 or FR173657) and B1 (DALBK or SSR240612) receptor antagonists, or the genetic ablation of kinin receptors, significantly diminished the scratching behaviour evoked by PAR-2 agonists. Take together, the results of the present study suggest that i.d. injection of PAR-2 agonists on the back of the mouse neck seems to be a reproducible model to study the mechanisms and therapeutic strategies, related to itch transmission caused by proteinases release and PAR-2 activation. Besides, this response is widely dependent on mast cell activation and subsequently release of neurokinins, kinins and the TRPV1 receptor activation.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-05T19:57:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 501026 bytes, checksum: bb27e58370f178ed0491cf79c539f207 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-05T19:57:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 501026 bytes, checksum: bb27e58370f178ed0491cf79c539f207 (MD5) Previous issue date: 2001-07-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Com o objetivo de se avaliar a atividade enzimática da tripsina, amilase e lipase no conteúdo intestinal da rã-touro (Rana catesbeiana Shaw, 1802), 320 animais com peso médio de 3,6 gramas foram distribuídos em baias-teste com temperatura e fotoperíodo controlados. As rãs selecionadas na fase pós- metamórfica receberam ração comercial extrusada ad libitum. Durante 87 dias de experimento, foram efetuadas 29 coletas em intervalos variando de 1 a 8 dias. As coletas do conteúdo intestinal foram feitas mediante a insensibilização das rãs em gelo e água e posterior isolamento do intestino delgado das mesmas. Após cada coleta, todo material foi congelado em nitrogênio líquido e armazenado em freezer, para ser liofilizado posteriormente. A determinação da atividade da tripsina foi realizada utilizando-se Benzoil-D, L-Arginina p-nitroanilida (D, L- BApNA) como substrato. Para os testes de atividade da amilase e lipase, foram utilizados KIT's enzimáticos comerciais, correspondentes a cada enzima. A atividade da tripsina foi registrada no primeiro dia de experimento, enquanto para amilase e lipase isto aconteceu a partir do terceiro dia. A fase inicial é marcada pelo aumento da atividade da tripsina e amilase até alcançar estabilidade, quando os animais ainda estavam na fase de imago. Neste mesmo período, a rã-touro ainda possui baixa capacidade de hidrólise para lipase. No período subseqüente até o final do experimento, a manutenção da estabilidade da atividade e atividade específica da tripsina e amilase foi contrastada pelo contínuo aumento destes parâmetros em relação à lipase. Pode-se concluir que a rã-touro apresenta capacidade para digestão de alimentos de origens protéica, amilásica e lipídica, sendo que, na fase inicial, recomenda-se a utilização de ração rica em proteína e, na fase seguinte, uso de maior quantidade de ingredientes contendo amido e lipídio. / With the objective of evaluating the enzymatic activity of the trypsin, amylase and lipase in the intestinal content of the bullfrog (Rana catesbeiana Shaw, 1802), 320 animals with medium weight of 3.6 grams were distributed in stall-test with temperature and photoperiod controlled. The frogs, selected in the post-metamorphic phase they received commercial extruded diet ad libitum. For 87 days of experiment, 29 collections were made in intervals varying from one to eight days. The collections of the intestinal content were performed by the desensitization of the frogs in ice and water and subsequent isolation of the small intestine of the same ones. After each collection, all material it was frozen in liquid nitrogen and stored in freezer to be later liofilizated. The determination of the activity of the trypsin was accomplished being used benzoil-D, L-arginine p- nitroanilide (D, L-BApNA) as substrate. For the tests of activity of the amylase and lipase commercial enzymatic KIT's were used, corresponding to each enzyme. The activity of the trypsin was registered in the first day of experiment, while for amylase and lipase this happened starting from the third day. The initial ixphase is marked by the increase of the activity of the trypsin and amylase to reach a stability when the animals were still in the imago phase. In this same period, the bullfrog still possesses low hydrolysis capacity for lipase. In the subsequent period until the end of the experiment, the maintenance of the stability of the activity and specific activity of the trypsin and amylase was contrasted by the continuous increase of these parameters in relation to lipase. With these results it can be concluded that to bullfrog presents capacity for digestion of ingredients of protein, starch and lipid origin, and in the initial phase the use of rich diet is recommended in protein and in the following phase it can be opted for the use of larger amount of ingredients containing starch and lipid.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T10:54:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 896783 bytes, checksum: da2d7082fa8f5e79329235b48767490e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T10:54:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 896783 bytes, checksum: da2d7082fa8f5e79329235b48767490e (MD5) Previous issue date: 2002-08-05 / O desdobramento no equilíbrio para a β-tripsina, induzido por desnaturação térmica, foi caracterizado termodinamicamente. O desdobramento foi acompanhado através de absorção no ultravioleta (UV) e espectroscopia de dicroísmo circular (DC) no UV próximo e distante. Além disso, experimentos utilizando a técnica de calorimetria diferencial de varredura (DSC) foram realizados. As curvas de transição térmica foram reversíveis mostrando um desdobramento altamente cooperativo, e os dados experimentais foram bem ajustados à um modelo de transição de dois-estados, para o desdobramento dessa proteína. O gráfico da fração desnaturada versus temperatura, calculado a partir das curvas de desnaturação térmica, em diferentes comprimentos de onda, mostra coincidência dessas curvas. Além disso, a razão entre a entalpia de desnaturação calorimétrica e a entalpia de van ́t Hoff, obtidas por DSC, é próxima à unidade, o que suporta o modelo de dois-estados. O espectro de DC da enzima nativa foi registrado na faixa espectral de 184 a 260 nm e utilizado para se estimar as porcentagens dos elementos da estrutura secundária, pelos métodos VARSCL e SELCON. A estimativa da estrutura secundária, em solução, correspondeu aos resultados de difração de raios-X. As mudanças na estrutura da β-tripsina, resultante de desnaturação por calor e por uréia foram monitoradas por meio de espectroscopia de DC no UV próximo e distante. A quantidade dos vários elementos de estrutura secundária foi estimada para essas mudanças espectrais, através dos espectros no UV distante, utilizando o método CCA (“Convex Constraint Algorithm”). De acordo com as estimativas, os estados desdobrados para essa proteína, ou seja, a 70 o C e em uréia 2,6 M, apresentaram quantidades consideráveis de estrutura secundária regular. Os espectros de fluorescência intrínsica dos resíduos de triptofano, registrados em diferentes concentrações de uréia, mostram a presença de um estado intermediário no equilíbrio, que apresenta grande afinidade pela sonda bis-ANS. Além disso, a ausência de contatos terciários e a presença de estrutura secundária para esse estado, verificados por meio de espectros de DC no UV próximo e distante, são consistentes com as características de um molten globule. As mudanças na atividade da β-tripsina foram observadas em concentrações de uréia nas quais não foram visualizadas nenhuma alteração espectroscópica da estrutura terciária da proteína. Os parâmetros cinéticos, k cat e K M , determinados na ausência e na presença de uréia, mostraram que o decréscimo na atividade da enzima, em baixas concentrações de uréia, foi provavelmente devido à formação do complexo EI, formado entre a β-tripsina e a uréia, um inibidor competitivo dessa enzima. / The unfolding equilibrium of β-trypsin induced by thermal denaturation was thermodynamically characterized. Thermal unfolding equilibrium were monitored using UV absorption and both far- and near-UV CD spectroscopy. In addition, experiments using differential scanning calorimetry (DSC), were performed. Thermal transition curves showed to be reversible and cooperative, and the data could be reasonably fitted using a two-state model for the unfolding of this protein. Plots of the fraction denatured, calculated from thermal denaturation curves at different wavelengths, versus temperature were coincident. In addition, the ratio of the enthalpy of denaturation obtained by scanning calorimetry to the van ́t Hoff enthalpy was close to one, which supports the two-state model. The dichroism circular (CD) spectrum of the native protein was taken over the wavelength range of 184- 260 nm, and the amount of various secondary structures were estimated using VARSLC and SELCON methods. The CD estimation of secondary strucutre, showed excellent agreement with X-ray results. The CD spectra of β-trypsin, as a function of temperature and urea, were monitored by far- and near-UV CD, and the relative proportions of secondary structures calculated by CCA method. According to CD estimation, although the secondary structure changed upon denaturation, its denatured state still has considerable amounts of ordered structure. The intrinsic fluorescence emission spectra of β-trypsin, at different urea concentration, showed an intermediate equilibrium state, with great affinity by bis-ANS. Besides, the absence of terciary contacts and the presence of secondary structure for this state, are consistent with the molten globule characteristics. Changes on the activity of β-trypsin were observed at urea concentrations in which terciary structure changes were not detected. Kinetic parameters, k cat and K M , determined in the presence and absence of urea, showed that the decreases in enzyme activity, at low concentrations of urea, were probably due to a development of the enzyme-inhibitor complex between β-trypsin and urea, a competitive inhibitor of this enzyme. / Tese importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2015-11-04T13:39:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 geovane_lopes_ioc_mest_2014.pdf: 4146940 bytes, checksum: 332c9cbd56d1a1690235d637c48eaeef (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O objetivo geral do presente trabalho foi caracterizar e identificar peptidases ativas presentes nos intestinos de machos e fêmeas de Anopheles aquasalis bem como identificar as proteínas expressas no intestino e gônadas de fêmeas dessa espécie. Para a caracterização proteolítica foram usadas distintas abordagens bioquímicas que permitiram reunir um grupo importante de informações sobre a expressão de enzimas proteolíticas nesta espécie de mosquito. Usando o substrato fluorogênico Z-Phe-Arg-AMC em solução e a técnica de enzimografia por SDS-PAGE co-polimerizado com gelatina foi possível observar um perfil proteolítico composto por serina peptidases do tipo tripsina no intestino de machos e fêmeas de An. aquasalis. Estas enzimas apresentam maior atividade proteolítica na faixa de pH alcalino e ampla estabilidade térmica, sendo ativas entre 25 °C \2013 80 °C, com maior atividade entre 37 °C \2013 50 °C. Diferenças qualitativas e quantitativas na expressão das peptidases também foram detectadas. Foi observado que o perfil proteolítico difere entre macho e fêmea, sugerindo com isso que a expressão de algumas dessas enzimas é sexo-específica Para análise proteômica do intestino e gônadas de fêmeas alimentadas com açúcar usou-se uma abordagem \201Cbottom-up\201D acoplada à análise bioinformática de dados para identificação das proteínas expressas. A análise do intestino foi feita através de um procedimento de digestão em solução sem pré-fracionamento das proteínas, ao passo que a análise das gônadas foi feita usando um protocolo de digestão em gel após fracionamento das proteínas por SDS-PAGE. Usando estas estratégias, um total de 137 e 995 proteínas foram identificadas no intestino e gônadas, respectivamente. As proteínas foram identificadas usando os programas ProLuCID e/ou PEAKS, e uma base de dados \201Ccustomizada\201D incluindo todas as sequencias de Culicídeos depositadas na base de dados UniProt (81,000 sequencias, em outubro de 2013). As identificações foram posteriormente analisadas com relação ao enriquecimento de termos de ontologia gênica e foram classificadas de acordo com seu processo biológico e função molecular, usando o módulo GeneOntology da plataforma PatternLab. A caracterização proteômica revelou para o intestino (i) a presença de várias serina peptidases do tipo tripsina, corroborando a expressão e atividade das enzimas observadas na enzimografia; (ii) a expressão de vários genes codificantes para quimiotripsina, embora a sua atividade não tenha sido detectada pela enzimografia; e para as gônadas (iii) proteínas associadas à vitelogênese; e (iv) a expressão massiva de proteínas implicadas na preparação do tecido para reprodução Finalmente, até o presente, esta é a primeira caracterização abrangente da atividade proteolítica de machos e fêmeas de An. aquasalis bem como a primeira caracterização proteômica do intestino e gônadas de fêmeas desta espécie alimentadas com açúcar. Os resultados obtidos neste trabalho além de fornecerem informações sobre a localização tecidual de proteínas no mosquito e abrirem diversas vias de estudo da biologia e fisiologia deste vetor, contribuem também para a anotação funcional do genoma desta espécie, visto tratar-se de uma espécie com genoma ainda não concluído / The aim of this study was to characterize and identify active peptidases from the midgut of males and females of Anopheles aquasalis and to identify protein expressed in the midgut and gonads of females of this species. The different bioche mical approaches used for the proteolytic characterization allowed gather ing a group of important information about the expression of proteolytic enzymes in this mosquito species. Using the fluorogenic substrate Z - Phe - Arg - AMC for in - solution enzymatic assays and by zymographic analyses (SDS - PAGE co - polymerized with gelatin) it was possible to observe a proteolytic profile composed of trypsin - like serine peptidases in the midgut of male and female A n . aquasalis . These pepti dases exhibit high proteolytic activity at a w ide range of alkaline pH and thermal stability, being active between 25° C - 80 ° C, with more activity between 37° C - 50° C. Qualitative and quantitative differences in the expression of peptidases were also detected. It was observed that proteolytic profile differs between males and females, thereby suggesting that the expression of some of these enzymes is sex - specific. For proteomic analysis of the midgut and gonads of females fed on sugar it was used a "bo ttom - up" proteomic approach coupled with bioinformatic s data analysis to identify tissue - specific expressed protein s . The midgut analysis was taken through an in - solution digestion procedure without pre - fractionation of the proteins, while the analysis of gonads was made using an in - gel digestion protocol after fractionation of proteins by SDS - PAGE. Using these strategies, a total of 137 and 995 proteins were identified in the midgut and gonads, respectively. Proteins were identified using the ProLuCID and/ or PEAKS software , and a customized database including all Culicidae protein sequences deposited at the UniProt database (81,000 sequences, in October 2013). Protein identifications were further analyzed for the enrichment of gene ontology terms and were c lassified according to their biological process and molecular function using the GeneOntology module of the PatternLab platform. The proteomic characterization of midgut revealed (i) the presence of various t rypsin - like serine peptidases , confirming the ex pression and activity of these enzymes observed by zymography, (ii) the expression of several chymotrypsin coding genes, although its activity was not detected by zymography . Proteomics of gonads from female fed with sugar revealed (iii) the expression of proteins associated with vitellogenesis and (iv) the massive expression of proteins involved in tissue preparation for reproduction process. F inally, to the present , t his is the first characterization of the proteolytic activity of males and females midgut s of An. aquasalis well as the first proteomic characterization of the midgut and gonads of A n . aquasalis females fed with sugar. The results obtained in this work in addition to providing information about the cellular localization of proteins in the mosq uito , open several avenues of study of the biology and physiology of this vector, and also contribute to the functional annotation of the genome of this species with genome not yet completed

Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2016-04-18T19:53:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Lacerda CD.pdf: 1763421 bytes, checksum: 9db822a6306602d4f7c830ea507fcc4a (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2016-06-27T18:49:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Lacerda CD.pdf: 1763421 bytes, checksum: 9db822a6306602d4f7c830ea507fcc4a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T18:49:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Lacerda CD.pdf: 1763421 bytes, checksum: 9db822a6306602d4f7c830ea507fcc4a (MD5) / Uma nova isoforma tripsina bovina foi purificada a partir de amostras comerciais por cromatografia de troca iônica por Sephadex SP C50®. A nova isoforma contém, além da perda do hexapeptídeo N-terminal (como encontrado na molécula progenitora β-tripsina) uma clivagem intra-cadeia entre o Lys-155 e Ser-156. A nova enzima denominada -tripsina mostrou propriedades similares com a isoforma α-tripsina que contém o mesmo número de cadeia polipeptídica (duas cadeias), massa molecular (23312 Da), estrutura secundária, volume hidrodinâmico e outros. Apesar das semelhanças estruturais e enzimáticas dessas duas isoformas, -tripsina tem uma taxa de formação inferior a partir da β-tripsina, carga superficial inferior, mas a -tripsina tem estabilidade térmica mais elevada do que a α-tripsina. Devido à facilidade de purificação das isoformas a partir de tripsina bovina de fonte comercial, e as propriedades descritas acima, esta enzima tornar-se uma alternativa interessante para a indústria de alimentos e de detergente, bem como para pesquisa de biocatalisadores. / A novel bovine trypsin isoform was purified from commercial sample by ion exchange chromatography by Sephadex SP C50®. New isoform contain in addition of loss of N- terminus hexapeptide (as found in parent molecule β-trypsin) an intra-chain split between Lys-155 and Ser-156. The novel enzyme denominate gamma-trypsin showed similar properties with α-trypsin isoform in: polypeptide number chain (two chain), molecular masses (23,312 Da), secondary structure, hydrodynamic radius and others. In spite of enzymatic and structural similarities of both isoforms, -trypsin preferably has a lower rate formation from β-trypsin, a lower surface charge, but the gamma-trypsin has a higher thermal stability than α-trypsin. Due to obtaining facility of purification of bovine trypsin isoforms from commercial font, and properties described above, become this enzyme an interesting alternative for the food industry, detergent and biocatalysis research.