Resumo: A falta de um kit otimizado para avaliação da resistência aos inibidores de integrase no Brasil conduziu à necessidade da padronização de uma técnica inhouse para o estudo de mutações no gene da integrase do HIV-1, possibilitando, assim, a avaliação da resistência a esta classe de antirretrovirais recentemente liberada no país. RNA viral plasmático foi utilizado como fonte para amplificação por RT- Nested PCR e sequencimento do gene da integrase do HIV-1 de 60 pacientes para análise do padrão de resistência, o qual foi avaliado utilizando o algoritmo proposto pela Universidade de Stanford. Cinquenta e quatro (90%) amostras obtiveram sucesso na amplificação e sequenciamento, sendo que destas dez foram amplificadas por protocolos alternativos que envolveram a utilização de enhancer, de enzimas com maior especificidade, RT-PCR one-step e alterações nas condições de ciclagem, o que possibilitou com sucesso o estudo da região de interesse e a análise de resistência. A metodologia in-house mostrou ser uma alternativa metodológica viável para avaliação da resistência aos inibidores de integrase, principalmente nos casos em que há falha terapêutica a esta nova classe de medicamento, uma vez que a técnica permite o estudo completo da região de interesse / Abstract: The absence of an optimized kit to evaluate the resistance to integrase inhibitors in Brazil led to the necessity for standardization of an in-house technique to study the mutations in the HIV-1 integrase gene, thus enabling the evaluation of resistance to these novel antiretroviral agents recently released in the country. Plasma viral RNA was obtained from 60 patients and used as source for RT- Nested PCR amplification and automatic sequencing of the HIV-1 IN gene to analysis of the pattern of drug resistance, which was evaluated using the algorithm proposed by Stanford University. Fifty-four (90%) samples were successfully amplified and sequenced, and ten of these samples were amplified using alternative protocols involving the use of enhancers, enzymes with more specificity, RT-PCR one step and changes in the conditions of cycling, which allowed the successful study of the region of interest and analysis of resistance. The in-house methodology showed to be a viable alternative to assess resistance to integrase inhibitors, especially in cases when there is therapeutic failure to this new class of antiretroviral, since the technique allows the complete study of the region of interest / Orientador: Maria Inês de Moura Campos Pardini / Coorientador: Rejane Maria Tommasini Grotto / Banca: Paulo Inácio da Costa / Banca: João Manuel Grisi Candeias / Mestre

Orientador: Olga Maria Mascarenhas de Faria Oliveira / Banca: José Fernando Durigan / Banca: Gláucia Maria Pastore / Resumo: O presente trabalho teve como proposta a caracterização de pectina, proteínas e açúcares de frutas tropicais e exóticas produzidas no Brasil, além do desenvolvimento de método de extração de pectina e estudo de sua viabilidade como ingrediente. A pectina, os açúcares e as proteínas, são biomoléculas de grande relevância no processo de fabricação de alimentos como doces, geléias, polpas, sucos, sorvetes, entre outros. Os frutos podem sofrer a ação de enzimas durante seu amadurecimento e processamento e por isso, o conhecimento e controle dessas proteínas são de fundamental importância para garantir a estabilidade do produto final. Outro ponto de interesse é a quantificação e qualificação dos açúcares presentes, pois suas concentrações em conjunto com os ácidos orgânicos estabelecem a qualidade sensorial harmônica da fruta. O conhecimento dessas concentrações e proporções pode ser determinante na avaliação do padrão de qualidade de uma matéria-prima e no preparo de uma formulação. Assim determinou-se o teor de pectina das frutas in natura, que variou de 10,50% na polpa de mangostão até a ausência de pectina na de massala. Desenvolveu-se, através de planejamento experimental, uma técnica de extração de pectina, em pH 1,6 a 90°C por 50 minutos. Ela levou a um rendimento de 30% e teor de 9% pectina no extrato. Esta técnica foi testada para aquelas frutas que apresentaram bom potencial para extração e se mostrou bastante eficiente para canistel, cajá-manga, goiaba, polpa de abacate, azeitona-do- Ceilão, casca de manga, polpa de fruta-pão e casca de maracujá. Os géis obtidos apresentaram viscosidade variando de 1880cp a 562cp e na maioria dos casos superior à viscosidade dos géis obtidos pela técnica padrão. As frutas apresentaram concentração de açúcares totais variando de 7,69g.ml-1, na bunchosia, a 0,13g.ml-1, na casca de cacau... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This paper has proposed the characterization of pectin, protein and sugar of tropical and exotic fruits produced in Brazil, besides the development of methodology of extraction of pectin and the study of its viability as an ingredient. Pectin, sugars and proteins are biomolecules of great importance in the manufacture of foods such as jams, jellies, fruit pulps, juices, ice creams, among others. The fruits may suffer the action of enzymes during the ripening and processing so the study and control of these proteins is of main importance for the stability of the final product. Another point of interest is the quantification and qualification of the sugars, because their concentrations together with the organic acids provide the harmonic sensory quality of fruit. Knowledge of these concentrations and proportions may be decisive in assessing the quality of a raw material and the preparation of a formulation. Once, it was determined the content of pectin in the fruit in natura, which ranged from 10.50% for the pulp of mangosteen to the absence of pectin in the massala one. It was developed, using experimental design, a technique of extraction of pectin at pH 1.6 and 90°C for 50 minutes. It showed a yield of 30% and content of pectin in the extract of 9%. This technique was tested for those fruits that had good potential for extraction and was very efficient for egg fruit, ambarella, guava, avocado pulp, Ceylon olive, mango peel, bread fruit pulp and passion fruit peel. The gels had viscosity ranging from 1,880cp to 562cp and in most cases higher than the viscosity of the gels obtained by the standard technique. The fruits showed total sugars content varying from 7,69g.ml-1, for bunchosia, to 0,13g.ml-1, for cocoa hulls. On the other side, the content of reducing sugars varied from 3,63g.ml-1, for atemoya pulp, for 0,18g.ml-1, of avocado. Those who had higher reducing sugar content compared... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: A principal meta deste trabalho foi a de realizar estudos com leveduras industriais brasileiras utilizadas em usinas, na tentativa de viabilizar o emprego da Tecnologia de Fermentação de Mostos com Altos Teores de Açúcares Fermentecíveis, na produção de etanol combustível. Inicialmente, foram realizados experimentos para obtenção de informações relativas as linhagens, na fermentação de sacarose, maltose e glicose, em meios contendo uma base nitrogenada e suplementado com fontes de nitrogênio com diferentes complexidades estruturais. Os estudos mostraram que as linhagens industriais apresentam diferentes perfis de crescimento nos meios suplementados com diferentes fontes de nitrogênio, que variaram de um simples sal de amônio, a um hidrolisado ácido de proteínas (casaminoácidos) e hidrolisado enzimático de proteínas (peptona). Entretanto, a maior capacidade de acúmulo de biomassa pode não ter um reflexo direto na capacidade de utilização de açúcares e a consequente produção de etanol pelas leveduras industriais. Além da natureza estrutural da fonte de nitrogênio e do tipo de açúcar, a presença do oxigênio, em maior quantidade nos cultivos agitados, interferiu sobremaneira no desempenho fermentativo das leveduras industriais, e até no acúmulo de trealose. No geral, foi a suplementação com peptona que propiciou maior produção de biomassa, preservação da viabilidade celular e consumo mais eficiente da fonte de carbono, em cultivos agitados e não agitados. Os estudos com alta densidade celular tiveram como objetivo definir condições experimentais para a condução da Fermentação de Mosto com Altos Teores de Açúcares Fermentescíveis, e que pudessem propiciar ao final do processo a completa utilização da sacarose, associada á preservação da viabilidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work studies with Brazilian yeast for ethanol production were conducted in order to verify the possibility of utilization of brazilian yeasts for ethanol production in an industrial process known as Very High Gravity Sucrose Fermentation Technology, to produce wine with high ethanol contends. This technology has the advantage to reduce production costs by increasing fermentation yields. Initially, studies were conducted with sucrose, maltose and glucose fermetation in medium containing YNB, supplemented with a nitrogen source varying from a single ammonium salt (ammonium sulfate) to free amino acids (casamino acids) and peptides (peptone). Data suggest that yeast strains vary in their response to nitrogen source complex structure, kind of sugar and to oxygen availabity. In general, under peptone supplementation all strains, in shaking and static conditions, showed higher biomass accumulation, efficient sugar utilization and yeast viability was preserved. Sugar utilization by industrial strains not always was directly correlated with higher biomass accumulation. Trehalose accumulation was also influenced by the structural complexity of nitrogen sources, the kind of sugar and the presence of oxygen. Studies with high cell density were conducted to define experimental parameters for Very High Gravity Sucrose Fermentation, in order to induce at the end of process full sugar exhaustion together cell viability preservation. Complete sucrose utilization was detected only in media with 22 and 25% (w/v) sucrose. In the presence of higher sucrose contends (30% (w/v)), total sucrose exhaustion was obtained in a sugar cane based medium, supplemented with 2% (w/v) peptone. The results described in this thesis suggest that industrial yeasts show differing nitrogen demand, and the utilization of Very High Gravity Sucrose Fermentation technology could be carried only after finding the appropriated nutritional and fermentation conditions / Orientador: José Roberto Ernandes / Banca: João Atilio Jorge / Banca: Jonas Contiero / Banca: Sandra Helena da Cruz / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Doutor

Orientador: Sandra Regina Pombeiro Sponchiado / Banca: Carlos Renato Corso / Banca: Meuris Gurgel Carlos da Silva / Resumo: Os metais terras-raras (TRs) apresentam um alto valor agregado, o qual não provém de sua baixa ocorrência mineral, mas sim da dificuldade na separação destes pelos métodos clássicos, uma vez que os elementos desta série apresentam semelhantes comportamentos físico-químicos. Desta maneira, altos custos são despendidos anualmente para a obtenção das TRs na forma pura, sendo esta necessária para as suas aplicações tecnológicas. Uma alternativa a esta problemática é o emprego da biossorção, a qual apresenta potencial aplicação para a extração e separação de metais valiosos, por ter como vantagem uma alta eficiência agregada a um baixo custo. Alguns requisitos são necessários para que o processo de biossorção possa ter competitividade técnica e econômica, tais como, o material biológico empregado deve apresentar um baixo custo, sendo assim necessário estabelecer as condições ótimas de cultivo do micro-organismo para sua produção em larga escala, e também a utilização do biossorvente na forma imobilizada possibilita seu uso como um adsorvente convencional, o qual apresenta tamanho desejado, alta porosidade e um bom desempenho físicoquímico. Por esta razão, o presente trabalho teve como principal objetivo avaliar a potencialidade de utilização da biomassa melanizada (inativa) obtida da linhagem mutante MEL 1 do fungo Aspergillus nidulans, na sua forma livre e imobilizada, no processo de biossorção dos metais terras-raras neodímio, lantânio e cério em soluções monometálicas. Com os resultados obtidos foi possível estabelecer a condição ótima de cultivo da linhagem MEL 1 do A. nidulans que proporcionou uma biomassa mais melanizada, a qual apresentou uma maior capacidade biossortiva. Para tal condição, a massa micelial obtida após o crescimento do fungo por três dias, sob agitação à... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The rare-earth metals (TRs) have a high added value, which does not come from its low mineral occurrence, but the difficulty in separating these by classical methods, since the elements of this series show similar physical and chemical behavior. Thus, high costs are spent annually to obtain the TRs in pure form, which is necessary for their technological applications. An alternative to this problem is the use of biosorption, which has potential application for extraction and separation of valuable metals, having the advantage of a high aggregate efficiency at a low cost of production. Some requirements are necessary for the biosorption process may have technical and economic competitiveness, such as the biological material used must be low cost and it is necessary to establish the optimum conditions for cultivation of the microorganism to its large scale production, and also the use of biosorbent immobilized in the form enables its use as a conventional adsorbent, which has the desired size, high porosity and good physical and chemical performance. For this reason, this study aimed to evaluate the potential use of biomass melanized inactive mutant of the fungus Aspergillus nidulans MEL1 in its free form and immobilized in calcium alginate, in the process of biosorption of neodymium rare-earth metals, lanthanum and cerium. The results concerning the kinetics of biosorption showed that the ability of TRs biosorptive varied between different forms of biomass, and this capacity was higher compared to free biomass immobilized. Regarding the maximum biosorption capacity (Qmax), we observed that the immobilized biomass caused a reduction in Qmax of lanthanum and neodymium in approximately 60 and 33% respectively, have kept their Ce Qmax for both types of biomass (open and immobilized). The affinity of biomass... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Olga Maria Mascarenhas Faria de Oliveira / Coorientador: José Carlos Rebuglio Vellosa / Banca: André Gonzaga dos Santos / Banca: Roni Antonio Mendes / Banca: Flávio Luís Beltrame / Banca: Paulo César Ghedini / Resumo: O excesso na geração de espécies reativas como os radicais livres pode resultar num desequilíbrio que, embora benéfico em casos específicos como no combate a microrganismos patógenos, está implicado na etiologia de diversas patologias crônicas e com o envelhecimento precoce. Muitos pesquisadores indicam o uso de antioxidantes como potenciais para a prevenção destas patologias e inclusive, algumas pesquisas com antioxidantes como a curcumina estão em etapas finais do desenvolvimento de novos medicamentos. Embora atividades biológicas como a antimicrobiana e antioxidante sejam bastante exploradas para várias substâncias, há um grande potencial para a investigação em relação às atividades de duas ou mais substâncias associadas. O ácido ascórbico, por exemplo, possui algumas atividades biológicas semelhantes às da curcumina, entretanto seu uso e custo são mais acessíveis. Deste modo, há perspectivas para investigações sobre os efeitos resultantes da associação entre a curcumina e o ácido ascórbico em relação a algumas atividades biológicas, com destaque para a curcumina. Assim, este trabalho objetivou determinar os efeitos resultantes desta associação em relação ao perfil de atividades antimicrobiana, antioxidante, hemolítica e na estabilidade da curcumina. Foram utilizadas metodologias de análise de atividade antioxidante como os ensaios de ação scavenger do DPPH·, ABTS·+, O2 ·-, HOCl e também por análise do sistema oxidativo catalisado por peroxidase. Em relação às análises celulares e antimicrobianas, foi determinada a toxicidade sobre eritrócitos e a atividade em relação à Sthaphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e Candida krusei. A estabilidade da curcumina foi determinada por espectrofotometria... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The excessive generation of reactive species such as free radicals can result in an imbalance which is implicated in the etiology of various chronic diseases and premature aging, although it is beneficial in specific cases, such as in against microbial pathogens. Many researchers suggest the antioxidants usage to prevent these diseases. Some researches about curcumin and others antioxidants are even in final stages of developing new medicines. Although some biological activities are fully explored for various substances, there is great potential of research about the activities of two or more associated substances. Ascorbic acid, for example, has some biological activities similar to those of curcumin, but its use and cost are more accessible. Thus, there are prospects for research on the effects of the association between these molecules, especially curcumin, in relation to some biological activities. This study aimed to determine the effects of this association on antioxidant, antimicrobial and hemolytic activities of curcumin. Since this association can prevent the oxidative degradation of curcumin, it was also aimed to analyze the effects of ascorbic acid on the curcumin stability. Antioxidant activities were evaluated through DPPH , ABTS +, O2 - and HOCl scavenging assays and guaiacol oxidation catalyzed by peroxidase. Regarding the cellular and microbial analysis, the toxicity was determined on erythrocytes and the antimicrobial activity was studied to Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans and Candida krusei. The stability of curcumin was determined spectrophotometrically. The combination resulted in a increase in antioxidant activity of curcumin against DPPH , ABTS + and HOCl. We were unable to determine the effect of the association against... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Reinaldo Marchetto / Coorientador: Saulo Santesso Garrido / Banca: Marlus Chorilli / Banca: Pietro Ciancaglini / Resumo: Este trabalho descreve a síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS) derivados de toxinas bacterianas, tais como CcdB e ParE, e a produção de sistemas nanoestruturados como lipossomas e microemulsões. As toxinas intracelulares, produzidas por sistemas de morte pós-segregacional (PSK) em bactérias são exemplos recentes de agentes inibidores de enzimas fundamentais para a reprodução do microrganismo. Resultados promissores foram obtidos em relação a inibição da atividade da DNA girase, por derivados peptídicos destas duas proteínas. In vitro, os valores de concentração inibitória têm sido abaixo de 5 μmol.L-1, porém ensaios in vivo não demonstraram reprodutibilidade, basicamente devido à baixa permeabilidade da membrana bacteriana a estes derivados. Desta forma, foram produzidos lipossomas e microemulsões com o objetivo de promover o acesso de moléculas peptídicas sintéticas, derivadas do CcdB e ParE, ao meio intracelular e, conseqüentemente, aos seus alvos: DNA girase ou topoisomerase IV. Lipossomas do tipo SUV (small unilamellar vesicles) foram preparados por extrusão a partir de fosfatidilcolina de soja e estearilamina e mostraram uma eficiência de encapsulação de 77% e inibiram o crescimento tanto de bactéria Gram positiva quanto Gram negativa em 58 e 75%, respectivamente. Sistemas microemulsionados a base de fosfatidilcolina de soja, Tween 20, etanol e ácido oléico apresentaram uma incorporação do peptídeo acima de 90% e a formulação com 15% de ácido oléico e CcdBET2 a 4 μmol.L-1 apresentou uma inibição do crescimento de bactéria Gram negativa de 75,5%. O diâmetro dos lipossomas foi medido por espalhamento dinâmico de luz e as microemulsões foram caracterizadas por microscopia de luz polarizada e sua viscosidade determinada por reologia. Portanto, lipossomas e microemulsões podem ser utilizados como sistemas de drug delivery para análogos peptídicos derivados do CcdB e do ParE / Abstract: This work describes the synthesis of peptides derived from bacterial toxins, such as CcdB and ParE, by solid phase peptide synthesis (SPPS) and the production of nanostructured systems such as liposomes and microemulsions. Intracellular toxins produced by systems of killer post-segregational (PSK) in bacteria are recent examples of inhibitors of key enzymes for the reproduction of the microorganism. Promising results were obtained for the inhibition of DNA gyrase activity by peptide derivatives of these proteins. In vitro, the IC100 values have been below 5 μmol.L-1, but not demonstrated in vivo reproducibility, mainly due to the low permeability of the bacterial cell to these derivatives. Thus, the aim with this work was develop of liposomes and microemulsions to promote access of synthetic peptide molecules derived from the CcdB and ParE, to the intracellular medium and consequently to their targets: DNA gyrase and topoisomerase IV. Liposomes SUV type (small unilamellar vesicles) were prepared by extrusion from soybean phosphatidylcholine and estearilamina and showed an encapsulation efficiency of 77% and inhibited the growth of both Gram positive and Gram negative in 58 and 75% respectively. Microemulsion systems based soybean phosphatidylcholine, Tween 20, ethanol and oleic acid showed an incorporation of the peptide above 90% and the specific formulation with 15% oleic acid and the 4 μmol.L-1 CcdBET2 incorporate showed a growth inhibition of Gram negative of 75.5%. The diameter of liposomes was measured by dynamic light scattering and microemulsions were characterized by polarized light microscopy and its viscosity determined by rheology. Therefore, liposomes and microemulsions may be used as drug delivery systems for peptide analogues derived from the CcdB and ParE / Mestre

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Iran Malavazi / Resumo: O fungo Neurospora crassa é um organismo amplamente utilizado como organismo modelo na compreensão de aspectos fundamentais da biologia dos eucariotos. Nosso laboratório tem utilizado este fungo para estudar os mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos na regulação do metabolismo do glicogênio. A avaliação de uma coleção de linhagens mutantes individualmente nocauteadas em genes que codificam fatores de transcrição permitiu identificar várias proteínas potencialmente envolvidas na regulação do metabolismo do glicogênio neste organismo modelo. As linhagens mutantes selecionadas apresentaram alterações no perfil de acúmulo de glicogênio e expressão do gene que codifica a enzima glicogênio sintase (gsn) durante a situação de estresse térmico. Entre estas, as linhagens mutantes nas ORFS NCU03043, NCU01629 e NCU04731, anotadas como proteínas hipotéticas no banco de dados do genoma do fungo, foram selecionadas para o presente estudo. Através de análises de Blast, a proteína codificada pela ORF NCU04731 mostrou ser homóloga ao grupo de fator de transcrição SREBPs (Sterol Regulatory Element Binding Protein) de mamíferos, que atuam como principal regulador da síntese de colesterol. Estas proteínas possuem domínio transmembrana e são ativadas após clivagem. Uma proteína ortóloga a SREBP (Sre1) foi identificada em Schizosaccharomyces pombe, entretanto, enquanto a habilidade de resposta a esteróis é conservada, as SREBPs de fungo regulam genes envolvidos na resposta transcricional à hipóxia, sendo necessárias para o crescimento em baixas concentrações de oxigênio. A proteína codificada pela ORF NCU03043 mostrou homologia a proteínas FlbC e FLE1 de fungos, as quais estão envolvidas na conidiação e desenvolvimento asexual. A linhagem flbCKO de N. crassa apresentou defeitos na progressão... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The fungus Neurospora crassa has been widely used as a model organism for fundamental aspects of eukaryotic biology. We have been studying the biochemical and molecular mechanisms involved in glycogen metabolism regulation in this fungus. The screening of a set of knocked-out strains in genes encoding transcription factors was previously performed as an attempt to identify transcription factors regulating glycogen metabolism in N. crassa. Mutant strains presenting changes in glycogen accumulation and glycogen synthase gene (gsn) expression under normal growth temperature and under heat shock stress were selected. Among them, the mutant strains in the ORFs NCU03043, NCU01629 and NCU04731, annotated as hypothetical proteins in the fungus genome database were studied in the present work. By Blast analysis, the proteins NCU04731 showed homology to a group of mammalian transcription factors SREBPs (Sterol Regulatory Element Binding Protein), which act as regulators of cholesterol synthesis and requiring cleavage from the membrane for activation. A SREBP orthologue was identified in Schizosaccharomyces pombe (Sre1), however while the ability to respond to sterol is conserved, fungal SREBPs regulates genes involved in the transcriptional response to hypoxia and are required for growth under low-oxygen conditions. The proteins encoded by the ORF NCU03043 showed homology to the fungal proteins FlbC and FLE1 involved in conidiation and asexual development. The N. crassa flbCKO strain presented defects in cell cycle progression and morphology. FLBC protein is necessary for proper induction of conidiation and is important for growth and development in N. crassa. flbC gene expression was highly induced in the early times of conidia germination confirming the importance of this protein to the fungus... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: A metilação de ilhas CpG em regiões regulatórias de vários genes tem sido descrita como um processo importante no silenciamento de genes supressores de tumor e diretamente envolvida no processo de carcinogênese de uma série de tumores. O estudo desses genes afetados pela metilação em tumores visa identificar possíveis marcadores moleculares para o diagnóstico, prognóstico e tratamento de tumores, além de possibilitar a descoberta de fatores importantes no processo biológico do câncer. Neste sentido, ao estudar o perfil diferencial de metilação de genes em carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço, o gene MX1 foi identificado como diferencialmente expresso. Correlação também foi encontrada entre o silenciamento de ADAM23 e estágios tardios da progressão tumoral neste tipo de câncer. Dessa forma, o presente estudo envolveu a identificação de ligantes celulares das proteínas ADAM23 e MX1 por meio de rastreamentos de duplo- híbrido, usando bibliotecas de cDNA de cérebro fetal humano. Inicialmente, foi realizado rastreamento com os domínios desintegrina e rico em cisteína (DIS-ACR) de ADAM23, com um total de 5,1x105 transformantes obtidos, dos quais somente 1 foi confirmado pelo ensaio de "plasmid linkage". O candidato confirmado pelo "plasmid linkage", identificado como SPRY1, foi considerado como falso positivo por ser uma proteína estritamente citoplasmática, não podendo, portanto, interagir fisicamente com os domínios DIS-ACR de ADAM23, que são extracelulares. Ainda, foi realizado rastreamento com a proteína MX1, que resultou em aproximadamente 1,0x106 transformantes, dos quais 74 foram confirmados pelo ensaio de duplo- híbrido e codificam para 9 ligantes já conhecidos e 21 ligantes prováveis de MX1. Entre esses ligantes prováveis estão proteínas que já haviam sido descritas como ligantes de MX1, incluindo a própria proteína MX1, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The methylation of CpG islands at regulatory regions of various genes has been described as an important process for the silencing of tumor suppressor genes and is directly involved in the carcinogenesis of a series of tumors. The study of these methylation-affected genes in tumors aims at identifying possible molecular markers for diagnostic, prognostic and treatment of such tumors, besides making possible the discovery of factors important for cancer biology. On this purpose, the study of differential pattern of gene methylation in head and neck squamous cell carcinoma identified the gene MX1 as differentially methylated. Together with this result, it was found a correlation between ADAM23 silencing and late stages of tumor progression in this type of cancer. In order to identify cellular ligands of ADAM23 and MX1, we performed two-hybrid screenings using fetal brain cDNA libraries. Initially, a screening with the disintegrin and cystein rich (DIS-ACR) domains of ADAM23 was accomplished, with an amount of 5,1x105 transformants obtained, out of which just one was confirmed by plasmid linkage assay and identified as SPRY1. However, it was considered a false positive since this protein is restricted to the cytoplasmatic compartment and, therefore, it may not physically bind the DIS-ACR domains of ADAM23, known to be extracellular. Additionally, a screening with the MX1 protein was performed, resulting in approximately 1.0x106 transformants, out of which 74 were confirmed by two-hybrid assay and revealed 9 already known and 21 putative ligands of MX1. Among the putative ligands there are proteins previously described as MX1 ligands, including MX1 itself, corroborating the results obtained in our screening. Moreover, most of the identified ligands are factors involved in protein SUMOylation, PML-NB assembly and proteins that are related to transcriptional control and apoptosis. The results ... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Sandro Roberto Valentini / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Márcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Eloiza Helena Tajara da Silva / Mestre

Resumo: O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado de arqueas a mamíferos e é essencial para a viabilidade celular. Este fator tem sido associado com o início da tradução, proliferação celular, transporte nucleocitoplasmático e decaimento de mRNA. Estudos recentes associam eIF5A com a elongação, ao invés do inicio da tradução. eIF5A é a única proteína conhecida que contém o aminoácido essencial hipusina, gerado pelas enzimas desoxihipusina sintase e desoxihipusina hidroxilase. O objetivo deste estudo foi a caracterização estrutural e funcional de eIF5A de S. cerevisiae. Primeiramente, a estrutura terciária de eIF5A foi determinada por cristalografia e foi demonstrada a sua dimerização em solução, independentemente do resíduo hipusina. Foram obtidos e caracterizados 40 mutantes novos de eIF5A, dos quais 19 não complementaram o nocaute do gene selvagem, 13 apresentaram fenótipo de termossensibilidade e 8 não apresentaram nenhuma alteração nos fenótipos investigados. A maioria dos mutantes novos tem seus fenótipos resultantes da degradação da proteína eIF5A. Curiosamente, este é o primeiro estudo que sugere que a α-hélice presente no C-terminal de eIF5A é essencial para a manutenção da sua estrutura. Descrevemos também, que a extensão N-terminal de eIF5A, presente apenas em eucariotos, não é essencial para estrutura e função dessa proteína. Além disso, os mutantes contendo substituições na alça onde está localizado o aminoácido hipusina são inviáveis ou termossensíveis. Embora estes mutantes produzam eIF5A, inclusive na temperatura não permissiva, a proteína produzida não é hipusinada. Finalmente, dois mutantes termossensíveis (tif51AK56A e tif51AQ22H/L93F) produzem a proteína eIF5A estável na temperatura não permissiva, no entanto, apresentam... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved from archae to mammals and is essential for cell viability. This factor has been associated with translation initiation, cell proliferation, nucleocytoplasmatic transport and mRNA decay. Recent studies show eIF5A involved in elongation, rather than translation initiation. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid residue hypusine, generated by the enzymes deoxyhypusine synthase and deoxyhypusine hydroxylase. The main goal of this study was the structural and functional characterization of S. cerevisiae eIF5A. First of all, the tertiary structure of eIF5A was determined by crystallography and this protein was defined as a dimer in solution, independently of the hipusine residue. We obtained and characterized 40 new mutants, which 19 cannot complement tif51A knockout cells, 13 are temperature-sensitive and 8 show no detectable phenotype. The phenotypes of most mutantes are caused by protein folding defects. Interestingly, this is the first study suggesting that the C-terminal -helix present in yeast eIF5A may be an essential structural element. Moreover, we describe that the eIF5A N-terminal extension present only in eukaryotic homologues is not essential in yeast. Furthermore, the mutants containing substitutions surrounding the hypusine modification site showed unviable or temperature-sensitive phenotypes. Although these mutant proteins were stable, they were defective in hypusine modification. Finally, two of the temperature-sensitive mutant strains (tif51AK56A and tif51AQ22H/L93F) produced stable eIF5A protein but showed defects in growth and protein synthesis and these mutants revealed polysome profile defect similar to that described for mutations in factors involved in translation... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Sandro Roberto Valentini / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Paulo Sergio Rodrigues Coelho / Banca: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Banca: Beatriz Amaral de Castilho / Doutor

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Julio Cezar Franco de Oliveira / Resumo: Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) é uma bactéria Gram-negativa responsável pelo o cancro cítrico. A doença causada por este fitopatógeno constitui numa das mais graves doenças da citricultura brasileira, cujas medidas de controle capazes de eliminar completamente a doença são ineficientes até o momento. O sequenciamento e anotação do genoma de Xcc juntamente com estudos relacionados à genômica funcional nesta bactéria realizados em nosso laboratório mostraram a existência, na bactéria, de alguns genes (copA e copB) que codificam proteínas envolvidas com o mecanismo de resistência a cobre (CopA e CopB). Os genes que codificam ambas proteínas estão organizados em um operon, cuja transcrição é induzida por cobre e é específica ao metal. Componentes a base de cobre são comumente usados na agricultura como agentes microbicidas a fim de reduzir a severidade desta e também de outras doenças nas plantas. Contudo, a eficácia do cobre está sendo reduzida pelo aparecimento de linhagens de bactérias resistentes a este metal, portanto, estudos visando a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na resistência a cobre em Xcc são de grande importância. Uma pequena ORF (XAC3629) que codifica uma proteína hipotética de 152 aminoácidos e que se localiza upstream aos genes copAB foi identificada. Neste trabalho foi estudado o papel da ORF na regulação do operon copAB. Linhagens mutantes contendo a ORF XAC3629 interrompida por um transposon (XAC3629::Tn), previamente construídas no laboratório, foram avaliadas em relação ao crescimento em meio contendo diferentes concentrações de cobre. Estas linhagens mostraram perda da resistência quando o metal foi adicionado ao meio, mesmo em baixas concentrações (0,25 mM), sugerindo seu envolvimento na regulação do operon de resistência a cobre copAB. Células da linhagem selvagem ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) is a Gram-negative bacterium that causes citrus canker, one of the most serious diseases in Brazilian crops, and the ways to eliminate it are not efficient. After sequencing and annotation of the Xcc genome our laboratory started to perform functional genomic studies in Xcc. Previous studies identified two genes (copA and copB) that encode proteins involved in the copper resistance mechanism (CopA and CopB). The genes are organized in an operon whose transcription is induced and specific to copper. Copper compounds are commonly used in agriculture in order to control plant diseases, however the copper effectiveness is being reduced due to the emergence of copper resistant bacteria strains. Therefore, studies related to copper resistance mechanism in Xcc are very relevant. A short ORF (XAC3629) which encodes an 152 amino acids hypothetical protein was identified upstream the operon copAB. In this work the role of the ORF in the operon regulation was studied. Mutant strains containing the ORF XAC3629 interrupetd by a transposon (XAC3629::Tn) were previously constructed in our laboratory and in this work their growth were evaluated in a medium containing different copper concentration. The mutant strains were unable to grow when the metal was added to the medium, even at low concentration (0.25 mM) suggesting that the ORF XAC3629 may have a role in regulating the operon copAB. Wild type Xcc cells are able to grow up to 1 mM copper concentration. Attempts to construct an ORF XAC3629 knocked out strain were performed but this mutant strain was not obtained. Two XAC3629::Tn mutants strains were transformed with a plasmid construction containing the ORF XAC3629 entire sequence plus its flanking regions. The results did not show functional complementation (recovery of the copper resistance when cells were grown in medium containing ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre