A zopiclona (ZO) é um fármaco quiral extensivamente metabolizado em N-desmetilzopiclona (N-Des) e zopiclona-N-óxido (N-Ox). A (S)-N-Des apresenta atividade ansiolítica, o que indica que este metabólito possui potencial para ser empregado no tratamento da ansiedade. Uma alternativa para obtenção deste metabólito pode ser a biotransformação empregando fungos como agentes catalisadores. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial de fungos em realizar o metabolismo da ZO em seu metabólito N-Des assim como verificar a enantiosseletividade desse processo. A análise da ZO e seus metabólitos em meio de cultura líquido proveniente do estudo de biotransformação foi realizada por eletroforese capilar (CE) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) foi empregada como técnica de preparo de amostras. As análises por CE foram realizadas empregando uma solução tampão fosfato de sódio 50 mmol L-1 pH 2,5 acrescido de 0,5% (m/v) de carboximetil--cilcodextrina com tensão constante de +25 kV e temperatura do capilar de 20ºC. A condição estabelecida para extração por DLLME foi: 2 mL de meio de cultura líquido Czapek, 2 mL de solução tampão tris-HCl 0,1 mol L-1 pH 9,5, clorofórmio (100 µL) e metanol (300 µL) como solventes extrator e dispersor, respectivamente. Anterior aos estudos de biotransformação, o método foi validado seguindo as exigências do EMA e ANVISA para análise de fármacos em matrizes biológicas. O método foi linear no intervalo de concentração de 90-6000 ng mL-1 para cada enantiômero da ZO (r > 0,999) e 50-1000 ng mL-1 para cada enantiômero da N-Des (r > 0,998); a recuperação absoluta média foi de 52% para N-Des e 83% para ZO. Os demais parâmetros, como precisão, exatidão, seletividade e estabilidade apresentaram-se dentro das normas exigidas. O estudo de biotransformação foi realizado com os fungos Penicillium crustosum, Aspergillus fumigatus, Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason, Fusarium oxysporum, Mucor rouxii, Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Cunninghamella echinulata var elegans ATCC 8688A. Entre esses fungos avaliados, os fungos Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Cunninghamella echinulata var elegans ATCC 8688A foram capazes de biotransformar a ZO para seu metabólito ativo N-Des. Utilizando o fungo Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A, após 360 horas de incubação foi obtida uma concentração máxima de (-)-(R)-N-Des e (+)-(S)-N-Des de 508 ng mL-1 e 221 ng mL-1, respectivamente com excesso enantiomérico de 39%. O fungo Cunninghamella elegans ATCC 10028B formou preferencialmente o metabolito (+)-(S)-N-Des. Após 240 horas de incubação, a concentração dos metabólitos (-)-(R)-N-Des e (+)-(S)-N-Des foi 120 ng mL-1 e 228 ng mL-1, respectivamente com excesso enantiomérico de 35%. / Zopiclone (ZO) is a chiral drug extensively metabolized into N-desmethylzopiclone (N-Des) and zopiclone-N-oxide (N-Ox). Pharmacological studies showed that the metabolite (S)-N-Des presents anxiolytic activity, which indicates that this metabolite has a potential to be used in the treatment of anxiety. An alternative way for obtaining this metabolite may be the biotransformation employing fungi as catalytic agent. Therefore, the aim of this study was to evaluate if fungi are able to biotransform ZO into its active metabolite N-Des and to verify if this process is enantioselective. To perform ZO and its metabolites analysis from liquid culture medium, an enantioselective method by capillary electrophoresis (CE) and dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) was developed. The CE analyses were carried out in 50 mmol L-1 sodium phosphate buffer pH 2.5 containing 0.5% (w/v) carboxymethyl--CD with a constant voltage of +25 kV and capillary temperature of 20ºC. The extraction conditions established for DLLME were: 2 mL of sample (pH adjusted using 2 mL of 0.1 mol L-1 tris-HCl buffer pH 9.5), chloroform (100 µL) and methanol (300 µL) as extraction and disperser solvent, respectively. Before the biotransformation study, the method was validated according to EMA and ANVISA guidelines for analysis of drug and metabolites in biological matrices. The method was linear over a concentration range of 90-6000 ng mL-1 for each ZO enantiomer (r > 0.999) and 50-1000 ng mL-1 for each N-Des enantiomer (r > 0.998); the absolute recovery was 52% for N-Des and 83% for ZO. Other parameters, such as: accuracy, precision, selectivity and stability were all in agreement with guideline. The developed method was employed in biotransformation studies using the following fungi: Penicillium crustosum, Aspergillus fumigatus, Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason, Fusarium oxysporum, Mucor rouxii, Cunninghamella elegans ATCC 10028B and Cunninghamella echinulata var elegans ATCC 8688A. Among all evaluated fungi, Cunninghamella elegans ATCC 10028B and Cunninghamella echinulata var elegans ATCC 8688A were able to biotransform the ZO to its active metabolite N-Des. Using the fungus Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A, after 360 hours of incubation it was obtained a maximum concentration of (-)-(R)-N-Des and (+)-(S)-N-Des of 508 ng mL-1 and 221 ng mL-1, respectively with an enantiomeric excess of 39%. The fungus Cunninghamella elegans ATCC 10028B formed preferentially the metabolite (+)-(S)-N-Des. After 240 hours of incubation, the concentration of metabolites (-)-(R)-N-Des and (+)-(S)-N-Des was 120 ng mL-1 and 228 ng mL-1, respectively with enantiomeric excess of 35%.

A oxibutinina é um fármaco quiral empregado na forma de racemato que, após administração por via oral, sofre biotranformação hepática pronunciada levando à formação de N-desetiloxibutinina. Este metabólito apresenta atividade anticolinérgica semelhante a da oxibutinina, contribuindo com o efeito farmacológico e, também, com os efeitos adversos. Em relação às propriedades farmacocinéticas, alguns estudos prévios indicam que a biotransformação é estereosseletiva. Assim, propôs-se o desenvolvimento e validação de um método para análise dos enantiômeros do fármaco e seu metabólito em fração microssomal de fígado de ratos. O método foi desenvolvido empregando a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção em 262 nm; a separação dos enantiômeros do fármaco e metabólito foi efetuada em uma coluna Chiralpak AD, empregando hexano: isopropanol: etanol (95:4:1, v/v/v) com 0,3% de dietilamina como fase móvel, na vazão de 0,9 mL min-1. A microextração em fase líquida (LPME) foi empregada como técnica de preparação das amostras e o método foi otimizado empregando planejamento fatorial. A seguinte condição final de extração foi selecionada: tempo de extração de 45 min, nenhuma adição de metanol ou NaCl, agitação da amostra a 4500 rpm, membrana de 6 cm de comprimento, fase doadora em pH 8,0 e ácido trifluoracético 0,1 mol L-1 como fase aceptora. O método mostrou ser linear na faixa de concentração de 312 - 5000 ng mL-1 para os enantiômeros da oxibutinina e 250 - 5000 ng mL-1 para os enantiômeros do metabólito. As recuperações foram de 61 e 55% para a (R)-oxibutinina e (S)-oxibutinina, respectivamente e de 70 e 72% para a (R)-N-desetiloxibutinina e (S)-N-desetiloxibutinina, respectivamente Obteve-se precisão com coeficientes de variação inferiores a 15% e exatidão com erros relativos menores que 15%. O método foi aplicado em um estudo de biotransformação in vitro empregando a fração microssomal de fígado de ratos. As constantes cinéticas foram determinadas e verificou-se uma pequena diferença de afinidade da enzima pelos enantiômeros da oxibutinina (Km= 9,3 nmol L-1 e 7,9 nmol L-1 para a (R)-oxibuinina e a (S)-oxibutinina, respectivamente), com maior afinidade à (S)-oxibutinina em função do menor valor de Km. / Oxybutynin is a chiral drug used as a racemate which, after oral administration, suffers pronounced liver biotransformation leading to the formation of N-desethyloxybutynin. This metabolite shows anticholinergic activity similar to the oxybutynin, contributing to the pharmacological effect and also with the adverse effects. Regarding the pharmacokinetic properties, some studies indicate the stereoselective biotransformation. Thus, it was proposed the development and validation of an enantioselective method for analysis of oxybutynin and its metabolite in rat liver microsomal fraction. The method was developed using high-performance liquid chromatography with detection at 262 nm; the separation of drug and metabolite enantiomers was performed on a Chiralpak AD column employing hexane: isopropanol: ethanol (95:4:1, v/v/v) plus 0.3 % diethylamine as the mobile phase, at a flow rate 0.9 mL min-1. Liquid phase microextraction was used for preparation of the samples and the method was optimized using factorial design; the following condition was established: extraction time of 45 min, no methanol and NaCl in donor phase, agitation of the sample at 4500 rpm, membrane of 6 cm in length, donor phase pH 8.0 and trifluoracetic acid 0.1 mol L-1 as aceptor phase. The method was linear over the range of 312 - 5000 ng mL-1 for oxybutynin enantiomers and over the range of 250 - 5000 ng mL-1 for the metabolite enantiomers. The recoveries were 61 and 55% for (R)-oxybutynin and (S)-oxybutynin, respectively and, for (R)-N-desethyloxybutynin and (S)- N-desethyloxybutynin 70 and 72%, respectively. Within-day and between-day assay precision and accuracy were lower than 15%. The method was applied to an in vitro biotransformation study using rat liver microsomal fraction. The kinetic constants were determined and there was a small difference in affinity of the enzyme for oxybutynin enantiomers (Km=9.3 nmol L-1 and 7.9 nmol L-1 for (R)-oxybutynin and (S)-oxybutynin, respectively), with higher affinity to the (S)-oxybutynin according to the lower value of Km

O estudo foi dividido em capítulos que incluíram diversos aspectos da ecologia química de insetos e espécies de Piperaceae como se seguem: O Capítulo 1 descreve as informações taxonômicas, a história natural dos insetos, as observações de campo e a organização das espécies hospedeiras de Piperaceae segundo as preferências alimentares dos insetos. Observou-se forte especificidade química de espécies de Coleoptera (Naupactus bipes) e Homoptera (Membracis foliata, Callocanophora sp., e Aethalium reticulatum) por Piper aduncum, P. gaudichaudianum, P. arboreum e P. hispidum que possuem ácidos benzóicos prenilados como produtos predominantes. As Lepidoptera (Quadrus u-lucida, Heraclydes brasiliensis e H. helicorides) constituíram-se num segundo grupo de insetos para o qual constatou-se forte especificidade. Nesse caso as espécies de Piperaceae, P. regnellii e P. solmsianum, são nitidamente acumuladores de neolignanas e/ou lignanas. Os Capítulos 2 e 3 (coleópteros - besouros e lepidópteros - borboletas, respectivamente) descrevem os resultados relacionados aos estudos das reações que ocorreram durante o processo de digestão de folhas de espécies de Piper, seqüestros de metabólitos secundários pelos insetos. O estudo de possíveis fatores atrativos presentes em óleos essenciais foram investigados mediante o uso de ensaios eletrofisiológicos. Foram observadas reações de desmetilações em lignanas tetraidrofurânicas, esterificação de ácidos benzóicos, hidrólise de amidas, reação do tipo ozonólise de lignanas, neolignanas e fenilpropanóides durante o processo digestivo das borboletas (larvas) e dos besouros adultos. Foram observados seqüestros de neolignanas das folhas e raízes de P. regnellii pelas larvas da borboleta Heraclides hectorides e ácidos benzóicos prenilados das raízes de P. gaudichaudianum pelas larvas do besouro Naupactus bipes. Os experimentos de EAG com antenas do besouro N. bipes indicou que os óleos de P. gaudichaudianum, P. regnellii e P. hispidum foram ativos, e tal comportamento foi confirmado por observações em campo, sendo que as respostas mais intensas foram observadas para as fêmeas em relação às respostas para os machos. A análise de GC/EM-EAD permitiu a determinação dos compostos bioativos como os monoterpenos α- pineno, ß-pineno e ß-mirceno. O Capítulo 4 descreve as espécies de homópteros que têm especificidade por P. gaudichaudianum, P. arboreum e P. aduncum que são acumuladoras de ácidos benzóicos 7 prenilados. Outros possíveis fatores determinantes para tal especificidade foram atribuídos ao baixo teor de metabólitos secundários nas seivas, alto teor de micronutrientes, baixo teor de macronutrientes, ausência de lignanas ou neolignanas nas seivas, lignificação com predominância de resíduo siringila (S). O Capítulo 5 descreve a determinação e caracterização estrutural dos 49 metabólitos secundários envolvidos neste estudo. O Capítulo 6 descreve o estudo da estabilidade de lignanas tetraidrofurânicas realizado em função da rara ocorrência na natureza de isômeros com a configuração toda cis. O estudo da estabilidade para os dez possíveis estereoisômeros para a lignana tetraidrofurânica através do cálculo do funcional de densidade, B3LYP, com a base 6- 316(dp) mostrou que a configuração toda cis é de fato menos estável do que a toda trans. / The study was presented in six chapters that included several aspects of chemical ecology of insects and Piperaceae species as following: The Chapter 1 describes taxonomical aspects, natural history of the insects and field observation and the organization of hosts Piperaceae according to the observed feeding preferences of the associated insects. It was observed strong chemical specificity of Coleoptera and Homoptera species by Piper aduncum, P. gaudichaudianum, P. arboreum and P. hispidum which contain prenylated benzoic acids. The Lepidoptera showed preference for species containing neolignanas and/or lignanas such P. regnellii and P. solmsianum. The Chapters 2 and 3 (coleopterous - beetles and lepdopterous-butterflies, respectively), were addressed for the studies of biotransformation reactions, sequestration and attractive assays. The study of possible factors present attractions in essential oils was investigated by the use of electrophysiological essays. It were observed several reactions as esterification, hydrolyses and ozonolyse-type for lignans, neolignans, phenylpropanoids and amides occurring in from species of Piperaceae during the digestive process of the butterflies and of beetles. It was observed sequestration of neolignans of P. regnellii by larvae of Heraclides hectorides and prenylated of benzoic acids from roots of P. gaudichaudianum by the larva of the beetle Naupactus bipes. The experiments of EAG using antennas of the beetle N. bipes showed that the oils of P. gaudichaudianum, P. regnellii and P. hispidum were active and such results were in agreement with field observations and the most intense response was observed for the females in relation to the response for the males. The analyses of GC/EM-EAD allowed the determination of the bio-actives compounds as the monoterpenes α-pinene, β-pinene and β-mircene. The Chapter 4 describes the homopteros species that have specificity for the P. gaudichaudianum, P. arboreum and P. aduncum accumulative of prenylated benzoic acids. Further determinant factors for specificity included: low percentage of secondary metabolites in saps, high percentage of micro-nutrients and low percentage of macro-nutrients, absence of lignans or neolignans in the saps, lignifications with predominance of siringyl residues (S) which confer a pattern related to Angiosperms. The Chapter 5 describes the determination and structural characterization of the 49 secondary metabólitos involved in this study. The Chapter 6 shows the study of stability versus natural occurrence of tetrahydrofuran lignans was carried out due to the rare occurrence of all-cis configuration. The study of the stability for the ten possible stereoisomers for the tetrahydrofuran lignans was through the calculation of the functional of density, B3LYP, with the base 6-316(dp), it showed that the all-cis configuration is less stable than the all-trans tetrahydrofuran lignans.

Os flavonoides são um grupo diversificado de compostos polifenólicos que podem ser encontrados na natureza e também sintetizados. A gama de atividades biológicas e o potencial para reduzir o risco de doenças crônicas tem motivado a comunidade científica a desenvolver métodos de síntese de compostos desta classe. Neste sentido, as reações de biotransformação são estratégias interessantes com grande potencial para modificar as estruturas de flavonoides naturais e sintéticos. Este estudo teve como objetivo a biotransformação de derivados de flavonoides por fungos de ambiente marinho. Assim, os derivados de flavonoides 2\'-hidroxichalconas (1a-h), 2\'-hidroxi-diidrochalcona (2a), flavanona (3a) e flavan-4-ol (4a) foram usados como substratos em reações biocatalisadas por células totais de fungos de ambiente marinho. As condições reacionais foram otimizadas variando-se o pH e a composição nutricional do meio reacional. Dessa forma, foi realizada uma triagem com oito fungos derivados de ambiente marinho (Penicillium raistrickii CBMAI 931, Cladosporium sp. CBMAI 1237, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Penicillium oxalicum CBMAI 1996, Penicillium citrinum CBMAI 1186, Mucor racemosus CBMAI 847, Westerdykella sp. CBMAI 1679 e Aspergillus sclerotiorum CBMAI 849) utilizando a 2\'-hidroxichalcona 1a como substrato. A partir da triagem foram selecionados os fungos P. raistrickii CBMAI 931 e A. sydowii CBMAI 935 para serem aplicados com outros derivados de flavonoides. As reações empregando o fungo P. raistrickii CBMAI 931 resultou preferencialmente na hidrogenação da ligação Cα=Cβ das 2\'-hidroxichalconas substituídas (1a-h) com a formação das 2\'-hidroxi-diidrochalconas (2a-h) com conversões que variaram de 25 a 83% em 14 dias de reação. Também foi realizada uma triagem com dez fungos derivados de ambiente marinho (Fusarium sp. CBMAI 1830, Acremonium sp. CBMAI 1676, Aspergillus sp. CBMAI 1829, A. sydowii CBMAI 935, P.oxalicum CBMAI 1996, P. citrinum CBMAI 1186, P. raistrickii CBMAI 931, Cladosporium sp. CBMAI 1237, M. racemosus CBMAI 847 e Westerdykella sp. CBMAI 1679) para a biotransformação da flavanona 3a. A biotransformação da flavanona 3a resultou na formação de produtos de biorredução, hidroxilação e clivagem de anel. As reações empregando os fungos Cladosporium sp. CBMAI 1237, Westerdykella sp. CBMAI 1679 e Acremonium sp. CBMAI 1676 levou preferencialmente a biorredução do grupo cetônico da flavanona 3a para formação do flavan-4-ol 4a correspondente. Os fungos Acremonium sp. CBMAI 1676 e Cladosporium sp. CBMAI 1237 foram então utilizados para reduzir uma série de flavanonas 3b-g meta e para substituídas, onde os flavan-4-ois foram isolados com bons rendimentos (67-87%), porém com baixa seletividade. O fungo P. raistrickii CBMAI 931 também apresentou potencial para obtenção de diidrochalconas a partir de flavanonas, assim como os fungos A. sydowii CBMAI 935 e Fusarium sp. CBMAI que além de produzirem diidrochalconas ainda promoveram a hidroxilação da mesma. Assim, os fungos de ambiente marinho P. raistrickii CBMAI 931 e A. sydowii CBMAI 935 foram eficientes na biotransformação de derivados de flavonoides com controle quimio- e regiosseletivo. Os fungos de ambiente marinhoutilizados mostraram-se como uma fonte de enzimas ene redutases, álcool desidrogenases e monoxigenases ao mediar eficientemente a biotransformação de derivados de flavanoides. / Flavonoids are a diverse group of polyphenolic compounds that can be found in nature and synthesized. The range of biological activities and the potential to reduce the risk of chronic diseases has motivated the scientific community to develop methods of synthesis of compounds of this class. In this sense, biotransformation reactions are interesting strategies with great potential to modify the structures of natural and synthetic flavonoids. This study aimed at the biotransformation of flavonoid derivatives by marine environment fungi. Thus, the flavonoid derivatives 2\'-hydroxychalconas (1a-h), 2\'-hydroxy dihydrochalcone (2a), flavanone (3a) and flavan-4-ol (4a) were used as substrates in biocatalysed reactions by total cells of fungi of marine environment. The reaction conditions were optimized by varying the pH and nutritional composition of the reaction medium. In this way, eight marine-derived fungi (Penicillium raistrickii CBMAI 931, Cladosporium sp. CBMAI 1237, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Penicillium oxalicum CBMAI 1996, Penicillium citrinum CBMAI 1186, Mucor racemosus CBMAI 847, Westerdykella sp. 1679 and Aspergillus sclerotiorum CBMAI 849) were screened to perform the biotransformation of 2\'-hydroxychalcone 1a. From the screening, the fungi P. raistrickii CBMAI 931 and A. sydowii CBMAI 935 were selected for applied with other flavonoid derivatives. The reactions using the fungus P. raistrickii CBMAI 931 resulted preferentially in the hydrogenation of the Cα-Cβ double bond of the substituted 2\'-hydroxychalconas (1a-h) to led formation of 2\'-hydroxy-dihydrochalcones (2a-h) with good conversions (25 to 83%) in 14 days of reaction. It was also carried out a screening with ten fungi derived from marine environment (Fusarium sp. CBMAI 1830, Acremonium sp. CBMAI 1676, Aspergillus sp. CBMAI 1829, A. sydowii CBMAI 935, P. oxalicum CBMAI 1996, P. citrinum CBMAI 1186, P. raistrickii CBMAI 931, Cladosporium sp, CBMAI 1237, M. racemosus CBMAI 847 and Westerdykella sp, CBMAI 1679) for the biotransformation of flavanone 3a. The biotransformation reaction resulted in the biorreduction of flavanona 3a, hydroxylation and ring cleavage of the products. Reactions by Cladosporium sp. CBMAI 1237, Westerdykella sp. CBMAI 1679 and Acremonium sp. CBMAI 1676 preferably led to the reduction of the pro-chiral ketone of flavanone to form the corresponding flavan-4-ol. The fungi Acremonium sp. CBMAI 1676 and Cladosporium sp. CBMAI 1237 were used to reduce a series of substituted flavanones, where flavan-4-ols were isolated in good yields (67-87%), but with low selectivity. The fungus P. raistrickii CBMAI 931 presented potential for produce dihydrochalcones from flavanones, as well as the fungi A. sydowii CBMAI 935 and Fusarium sp. CBMAI that in addition to producing dihydrochalcones still promoted the hydroxylation thereof. Thus, the marine environment fungi P. raistrickii CBMAI 931 and A. sydowii CBMAI 935 were efficient in biotransformation of flavonoid derivatives with chemo- and regioselective control. Marine-derived fungi have been shown to be a source of ene reductase enzymes, alcohol dehydrogenases and monoxigenases by efficiently mediating the biotransformation of flavonoid derivatives.

Enantiômeros podem interagir de maneira diferenciada no organismo, ocasionando efeitos farmacológicos variados. Dessa forma, metodologias para a obtenção de fármacos enantiomericamente puros são importantes para a indústria farmacêutica. Modelos sintéticos empregando reagentes quirais, como complexos de salen e modelos biológicos utilizando fungos estão sendo muito estudados neste contexto. O uso de fungos apresenta como principais vantagens o crescimento rápido, baixo custo e fácil operação, além da produção de metabólitos em grande quantidade. Complexos de salen são eficientes e estáveis, possuindo ampla aplicabilidade e possibilidade de produzir reações enantiosseletivas. O objetivo deste trabalho foi avaliar fungos e complexo de salen como alternativas na produção enantiosseletiva de terbutalina, o metabólito quiral e ativo de seu pró-fármaco, o bmbuterol. A separação enantiosseletiva dos analitos foi realizada empregando a cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV-Vis (LC/UV). A validação da metodologia analítica e os estudos de biotransformação foram executados por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). A resolução do bambuterol e da terbutalina por LC/UV foi realizada utilizando como fase estacionária a coluna Chirobiotic T e como fase móvel acetonitrila:metanol (80:20, v/v) + 0,3% de ácido fórmico e 0,1% de trietilamina, numa vazão de 1,5 mL min-1 e por LC-MS utilizando a mesma fase estacionária e a fase móvel composta por 96% de metanol em água + 0,2% de ácido acético e 0,1% de acetato de amônio na vazão de 1 mL min-1. A extração dos analitos em meio de cultura líquido (Czapek, 2 mL) foi feita empregando a microextração liquido-liquido dispersiva (DLLME), nas condições: solvente dispersor,isopropanol (600 µL); solvente extrator, diclorometano (50 µL); reagente par iônico, di(2-etil-hexil)fosfato (100µL); e solução tampão fosfato de sódio (2 mL, pH 7,6). A recuperação do bambuterol foi de 92% e a da terbutalina foi estimada em 55%. O método foi validado para a análise do bambuterol no meio de cultura e se mostrou linear na faixa de concentração 500 17500 ng mL-1 para cada enantiômero (r > 0.998).O limite de quantificação foi igual a 500 ng mL-1. Dentre os fungos avaliados neste trabalho, nenhum foi capaz de realizar a biotransformação do bambuterol em terbutalina nas condições empregadas. Nos estudos feitos utilizando catálise assimétrica também não foi possível observar esse metabólito. Dada a complexidade do metabolismo do bambuterol (reações de hidrólise e/ou oxidação) e da formação de vários intermediários anterior a etapa de formação da terbutalina, as condições avaliadas nesse estudo não foi capaz de produzir o metabólito ativo do bambuterol, terbutalina. / Enantiomers may interact differently in the organism causing pharmacological sundry effects. For these reason, enantiomeric pure drugs are very important for the pharmaceutical industries. Synthetic models employing chiral reagents, like salen complexes, and biological models using fungi are been very studied in this context. Fungi present as main advantage the fast growing up, low costs and easily application, moreover, their metabolites are produced in huge quantities. Salen complexes are efficient and stable. They have a wide application and the possibility of production of high enantiomeric excess. The aim of this work was to evaluate fungi and salen complex as alternatives to the enantioselective production of terbutaline, the chiral and active metabolite of your prodrug, bambuterol. The analytes enantioselective separation was done employing high performance liquid chromatography with UV-Vis detector (LC/UV). The method validation and the studies of biotransformation were done using high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS). The resolution of bambuterol and terbutaline by LC/UV was accomplished using the Chirobiotic T column and acetonitrile: methanol (80:20, v/v) + 0.3% formic acid and 0.1% triethylamine as mobile phase at a flow rate of 1.5 mL min-1 and by LC-MS employing the same column and the mobile phase was composed by 96% of methanol in water + 0,2% acetic acid and 0,1% ammonium acetate at a flow rate of 0.1 mL min-1. The analytes extraction of the culture medium (Czapek, 2 mL) was done using the dispersive liquid liquid microextraction (DLLME), in the following conditions: dispersive solvent, isopropanol (600 µL); extractor solvent, dichloromethane (50 µL); ionic-pair reagent; di(2-ethylhexyl)phosphate (100 µL); and sodium phosphate buffer (2 mL, pH 7.6). The recoveries were 92% for the bambuterol and estimated in 55% for terbutaline. The method was validated for the analysis of bambuterol in the culture medium and was linear over the concentration range of 500 17500 ng mL-1 for each enantiomer (r > 0.998). The quantification limit was 500 ng mL-1. Among the evaluated fungi, none was able to do the biotransformation process of bambuterol at terbutaline in the employed conditions and so do the studies employing asymmetric catalyses. Because the complexity of bambuterols metabolism for producing terbutaline (hydrolysis and/or oxidation reactions) and the formation of several intermediates before the terbulalines formation step, the evaluated conditions in this study were not able to produce the chiral active metabolite, terbutaline.

Copaifera langsdorffii Desf. é conhecida popularmente como \"copaíba\", sendo encontrada nas regiões norte e nordeste do Brasil. Nesta tese reportam-se o estudo fitoquímico das folhas de C. langsdorffii, por meio do fracionamento de seu extrato hidroalcoólico, o isolamento e a purificação de seus metabólitos secundários majoritários, a biotransformação do epóxido do ácido caurenóico, bem como a avaliação das atividades analgésica e anti-inflamatória do extrato e compostos isolados. Para avaliação do perfil cromatográfico, o extrato hidroalcoólico das folhas (Cop) foi particionado em hexano, diclorometano, acetato de etila, n-butanol e água. Com o uso de filtração em gel, Cromatografia Contra Corrente e CLAE preparativa foram isolados os compostos quercetina-3-O-?-L-ramnopiranosídeo (quercitrina), canferol-3-O-?-L-ramnopiranosídeo (afzelina), bem como os ácidos 4\',4\'\'-dimetóxi-4,5-di-O-galoilquínico e 4-(4\'\'-metóxi galoil)-3,5-di-O-galoilquínico. O ácido caurenóico e o caurenol foram isolados em coluna de gel de sílica a partir da fração em acetato de etila. O ácido caurenóico foi submetido a epoxidação com ácido 3-cloroperbenzóico e foi submetido à biotransformação pelo fungo Beauveria sulfurenscens em meio sintético. A biotransformação do epóxido do ácido caurenóico forneceu o ácido 7?,17-diidroxi-ent-caur-15-en-19-oico, até então desconhecido, bem como o ácido 7?,17-diidroxi-16?-ent-cauran-19-oico, o ácido 7?,17-diidroxi-16?-ent-cauran-19-oico, o ácido 9?,16?,17-triidroxi-ent-cauran-19-oico e o ácido 16?,17-diidroxi-ent-cauran-19-óico. Cop e caurenol reduziram a inflamação induzida por ácido acético com máxima inibição de 40,3 e 53,6%, respectivamente. Na segunda fase do ensaio de formalina foi observada redução de 54,5 e 64,6%, respectivamente. A resposta inflamatória observada por carragenina e dextrana mostrou máxima redução de 52,3 e 43,6% para Cop e de 64,3 e 80% para caurenol, respectivamente. Cop e caurenol reduziram a produção de NO estimulada por LPS e aumentaram a liberação de TNF-?, mas não modularam a expressão de IL-6 e IL-10. Portanto, caurenol está envolvido na atividade antiedematogênica do extrato. Já a quercitrina e a afzelina não foram ativas nos protocolos utilizados. Cop e caurenol não alteraram a primeira fase do ensaio de formalina, a latência em placa quente, o desempenho motor dos animais e a migração celular. Concluiu-se que Cop e caurenol possuem atividade antiedematogênica atuando em sítios periféricos, contudo essa propriedade não está associada com a regulação da migração celular, TNF-?, IL-6 e IL-10. / Copaifera langsdorffii Desf., known as \"copaiba\", is found in the northern and northeastern of Brazil. This thesis reports the phytochemical study of C. langsdorffii leaves, through its hydroalcoholic extract (Cop) fractionation, isolation and purification of its major secondary metabolites, the biotransformation of kaurenoic acid epoxide, as well the evaluation of the analgesic and anti-inflammatory activities of the extract and isolated compounds. For the evaluation of the chromatographic profile, the extract was partitioned into hexane, dichloromethane, ethyl acetate, n-butanol and water fractions. With the use of gel filtration chromatography, counter current chromatography and preparative HPLC, quercetin-3-O-?-L-rhamnopyranoside (quercitrin), kaempferol-3-O-?-L-rhamnopyranoside (afzelin), 4\'- 4\'\'-dimethoxy-4 ,5-di-O-galloylquinic acid and 4-(4-methoxy galloyl\'\')-3,5-di-O-galloylquinic were isolated. The epoxidation of kaurenoic acid was performed with 3-chloroperbenzoic acid and it was submitted to biotransformation by the fungus Beauveria sulfurenscens in synthetic medium. Biotransformation of kaurenoic acid epoxide furnished the unknown compound 7?,17-dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid and the compounds 7?,17-dihydroxy-16?-ent-kauran-19-oic acid, 7?,17-dihydroxy-16?-ent-kauran-19-oic acid, 9?, 16?,17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid and 16?,17-dihydroxy-19-ent-kauran-oic acid. Cop and kaurenol reduced the inflammation induced by acetic acid in mice with a maximal inhibition of 40.3 and 53.6%, respectively. The second phase in the formalin test in mice showed maximal reduction of 54.5 and 64.6%, respectively. The inflammatory responses induced by both carrageenan and dextran in rats showed maximal reduction of 52.3 and 43.6 % for Cop, as well as 64.3% and 80.0% for kaurenol, respectively. Cop and kaurenol reduced the NO production stimulated by LPS in a dose-dependent manner, and increased the release of TNF-?, but did not regulate IL-6 and IL-10. Therefore, kaurenol is involved in the extract antiedematogenic activity of the extract, whereas quercitrin and afzelin were not active in the used protocols. Cop and kaurenol did not alter the formalin first phase, hot-plate latency, motor performance or cell migration. The obtained results show that C. langsdorffi extract and kaurenol possess antiedematogenic properties acting on peripheral sites, but these properties are not associated with cell migration, TNF-?, IL-6 or IL-10 regulation.

A risperidona (RISP) é um fármaco neuroléptico que após sua administração oral é metabolizado resultando em dois metabólitos quirais, a 7-hidroxirisperidona (7- RispOH) e a 9-hidroxirisperidona (9-RispOH). A 9-RispOH é o metabólito majoritário da risperidona a qual é comercializada na forma de racemato com o nome de paliperidona. Esse projeto teve como finalidade avaliar a capacidade dos fungos endofíticos Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globusum (VR10), Aspergillus fumigatus (VR12), Papulaspora immersa Hotson (SS13), Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason (SS67) e Glomerella cingulata (VA1) e do fungo de solo Mucor rouxii em biotransformar a risperidona em seu metabólito ativo 9-RispOH enantiosseletivamente. Foi objeto de estudo também a otimização do processo de biotransformação através do emprego de diferentes meios de cultura (Czapek, Czapek Dox e Koch`s K1) para o cultivo dos fungos utilizados no estudo. O método escolhido para a separação da risperidona e seus metabólitos quirais foi a eletroforese capilar (CE). As separações eletroforéticas dos analitos foram realizadas empregando um capilar de sílica fundida de 40 cm de comprimento e 75 ?m de diâmetro interno, uma solução tampão fosfato de sódio 100 mmol L-1 pH 3,0 contendo CD-?-sulfatada 2,0% (p/v) e carboximetil-?-CD 0,5% (p/v) como seletores quirais. Todos os experimentos no CE foram realizados no modo reverso aplicando uma tensão de -10kV. As amostras foram injetadas aplicando uma pressão 0,5 psi por 8 s. O capilar e as amostras permaneceram na temperatura de 20oC. Para a extração dos analitos do meio de cultura foi utilizado a microextração em fase líquida empregando membranas cilíndricas ocas (HF-LPME). A técnica de preparação de amostra foi realizada no modo de três fases utilizando uma fibra de polipropileno impregnada com n-octanol e preenchida com uma solução de ácido clorídrico 100 mmol L-1 pH 3,0. A fibra foi mergulhada na amostra tamponada com uma solução de fosfato de potássio dibásico 500 mmol L-1 pH 12,0. O método foi validado de acordo com os parâmetros estabelecidos pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) para análise de fármacos em material biológico avaliando os seguintes parâmetros: seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de quantificação e estabilidade. Todos os parâmetros avaliados ficaram dentro dos limites estabelecidos pela ANVISA. Entre os fungos avaliados, apenas o Mucor rouxii foi capaz de biotransformar a risperidona em seu metabólito ativo e quiral 9-RispOH. Nas condições empregadas a razão enantiomérica foi de 79,6%. / Risperidone (RISP) is a neuroleptic drug which after oral administration is metabolized into two chiral metabolites, 7-hydroxyrisperidone (7-RispOH) and 9- hydroxyrisperidone (9-RispOH). 9-RispOH is the major metabolite and it is commercialized under the generic name paliperidone. The objective of this project was to evaluate the capability of the endophytic fungi Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globusum (VR10), Aspergillus fumigatus (VR12), Papulaspora immersa Hotson (SS13), Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason (SS67) and Glomerella cingulata (VA1) and the soil fungus Mucor rouxii to biotransform risperidone into its chiral and active metabolite 9-RispOH, enantioselectively. In addition, it was also optimized the biotransformation process through the use of different culture medium (Czapek, Czapek Dox and Koch`s K1). The chiral analysis was performed by capillary electrophoresis (CE). The electrophoretic separation of the analytes was accomplished in a silica capillary with 40 cm of length and 75 ?m of internal diameter. The background electrolyte was a sodium phosphate 100 mmol L-1 pH 3.0 plus 2.0% (w/v) sulfated-?-CD and 0.5% (w/v) carboxymethyl-?-CD. All experiment on CE was performed in reverse mode by applying a voltage of -10 KV. The samples were injected hydrodynamically by applying a pressure of 0.5 psi for 8 s. The temperature of analysis was 20oC. For the extraction of the analytes from the culture medium it was employed the hollow fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME). The extraction conditions were: n-octanol as organic solvent and a hydrochloridric acid solution of 100 mm L-1 pH 3.0. The pH of the sample was controlled by the addition of potassium phosphate buffer 500 mmol L-1 pH 12.0. The method was validated according to ANVISA guidelines (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) for the analysis of drugs in biological fluids. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, precision, accuracy, limit of quantification and stability. All parameters were in agreement with the established limits by ANVISA. From all the evaluate fungi only Mucor rouxii was able to biotransform risperidone into its chiral and active metabolite 9-RispOH. In the conditions used in these project the enantiomeric ratio was 79.6%.

Fungos endofíticos constituem uma fonte promissora e ainda pouco explorada de novas substâncias potencialmente bioativas, que podem ter aplicações na medicina, agricultura e biologia química. Neste trabalho foram isolados cinco fungos endofíticos das folhas de Tithonia diversifolia, os quais foram cultivados em pequena escala e avaliados em diversos bioensaios. O fungo endofítico Phoma sorghina foi cultivado em escala ampliada, produzindo nove substâncias, sendo três derivados antraquinônicos inéditos na literatura. Três fungos endofíticos associados à Viguiera robusta foram estudados. De Colletotrichum gloeosporioides foram isoladas oito substâncias, sendo um derivado dicetopiperazínico e um derivado aminoaçúcar inéditos na literatura. Diaporthe phaesolorum produziu três derivados dicetopiperazinicos, um inédito na literatura. Chaetomium globosum produziu treze substâncias, sendo oito derivados azaphilônicos inéditos. Algumas linhagens endofíticas foram avaliadas em experimentos de biotransformação de três naftoquinonas e da 1-tetralona, catalisando reações de oxidação e redução. O fungo Diaphorte phaseolorum catalisou uma reação de metilação inédita na literatura de biotransformação. / Endophytic fungi are a promising and untapped source of potential biologically active compounds that might be useful as therapeutic and agrochemical agents, or chemical biology tools. In this thesis five endophytic fungi were isolated from the leaves Tithonia diversifolia. All the strains have been cultivated in small scale and the extracts submitted to bioassays. The culture of the endophyte Phoma sorghina was scaled up, affording six known compounds and three novel anthraquinone derivatives. Three endophytes from Viguiera robusta have also been studied as sources of natural products. Colletotrichum gloeosporioides produced six known compounds, one novel aminosugar and one new diketopiperazine derivative. Diaporthe phaesolorum biosynthesized three diketopiperazine derivatives, one novel in the literature. Five known compounds and eight novel azaphilone derivatives were isolated from Chaetomium globosum. Some endophytic strains have been evaluated in biotransformation experiments of three naphthoquinones and 1-tetralone, catalyzing oxidation and reduction reactions. The endophyte Diaphorte phaseolorum catalyzed a novel methylation reaction in the biotransformation literature.

A fexofenadina (FEX) tem sido o fármaco de primeira escolha no tratamento sintomático de manifestações alérgicas, por ser um anti-histamínico dos receptores H1 de 2ª geração não sedativo. É o metabólito ativo e quiral da terfenadina (TERF), medicamento cuja produção e comercialização foram suspensas em função dos eventos adversos apresentados. Fungos têm se apresentado como uma alternativa promissora na produção de compostos com atividade biológica. Dessa forma, o objetivo desse projeto foi avaliar a capacidade de fungos em biotransformar enantiosseletivamente a terfenadina em seu metabólito ativo, a fexofenadina empregando fungos como agentes catalisadores. Para a análise enantiosseletiva da fexofenadina foi desenvolvido um método de separação cromatográfica empregando a coluna quiral Lux® cellulose-1, fase móvel constituída de água: metanol (35:65, v/v) + 0,3% trietilamina + 0,4% ácido acético, vazão de 0,5 mL min-1, com detecção em 220nm. Duas microtécnicas de preparação de amostras foram avaliadas na extração dos analitos do meio de cultura: a microextração liquido-liquido dispersiva (DLLME) e a microextração em fase liquida empregando membranas cilíndricas ocas (HF-LPME). Entre essas, a DLLME foi a microtécnica de escolha, pois forneceu melhores resultados tais como, maior valor de recuperação, cromatogramas sem picos de possíveis interferentes, maior rapidez e facilidade de preparação das amostras. As condições otimizadas da DLLME foram: clorofórmio (300 ?L) como solvente extrator, isopropanol (300 ?L) como solvente dispersor. Após a formação do ponto nuvem, as amostras foram submetidas à agitação por vórtex durante 15 segundos e centrifugação durante 10 minutos a 3000 rpm. As recuperações foram de 43% para ambos enantiômeros. O método se mostrou linear na faixa de concentração 2.0 - 15.0 ?g mL-1 para cada enantiômero da FEX (r > 0,990). O limite de quantificação foi de 2 ?g mL-1 para os enantiômeros da FEX. Dentre os sete fungos estudados (Papulaspora immersa Hotson SS13, Penicillium crustosum VR4, Mucor rouxii, Nigrospora sphaerica SS67, Fusarium oxysporum SS50, Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A e Cunninghamella elegans NRRL 1393 ATCC 10028B) somente o fungo Fusarium oxysporum SS50 e Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A apresentaram potencial para biotransformação da terfenadina em fexofenadina nas condições de incubação empregadas nesse trabalho. / Fexofenadine (FEX) has been the drug of choice for the symptomatic treatment of allergic manifestations, being an antihistamine H1 receptor 2nd generation non-sedating. It is the active and chiral metabolite of terfenadine (TERF), a drug whose production and marketing was suspended as a result of adverse events. Fungi have been presented as a promising alternative for the production of compounds with biological activity. Thus, the goal of this project was to evaluate the ability of fungi to biotransform asymmetric terfenadine to its active metabolite, fexofenadine using fungi as agents catalysts. For enantioselective analysis of fexofenadine a method for chromatographic separation was developed employing a chiral column Lux® cellulose -1, mobile phase water : methanol (35:65,v/v) + 0.3% triethylamine + 0.4% acetic acid, flow rate of 0.5 mL min-1, with detection at 220nm. Two sample preparation microtechnology were evaluated in the extraction of analytes from the culture medium: the dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) and hollow fiber liquid phase microextraction (HF- LPME). Between the two, the DLLME was the microtechnic chosen because it provided better results such as higher recovery values, chromatograms with no possible interfering peaks, greater speed and ease of sample preparation. The optimized conditions of DLLME were: chloroform (300 ?L) as extractor solvent, isopropanol (300 ?L) as disperser solvent. After the formation of the cloud point, the samples were subjected to agitation by vortexing for 15 seconds and centrifuging for 10 minutes at 3000 rpm. The recoveries were 43 % for both enantiomers. The method was linear in the concentration range from 2.0 -15.0 ?g mL-1 for each enantiomer of FEX (r > 0.990). The limit of quantification was 2 ?g mL-1 for the enantiomers of FEX. Among the seven fungi studied (Papulaspora immersa Hotson SS13, Penicillium crustosum VR4, Mucor rouxii, Nigrospora sphaerica SS67, Fusarium oxysporum SS50, Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A e Cunninghamella elegans NRRL 1393 ATCC 10028B), only the fungi Fusarium oxysporum SS50 e Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A showed potential for biotransformation of terfenadine in fexofenadine in the incubation conditions employed in this work.

O uso de fungos na biotransformação estereosseletiva de fármacos pode constituirse em uma excelente alternativa à síntese assimétrica para obtenção de metabólitos, bem como aos estudos de biotransformação in vivo e in vitro convencionais. Neste trabalho foram empregados fungos isolados de órgãos internos de plantas, classificados como endofíticos, fungos fitopatógenos, bem como, fungos adquiridos de coleções de micro-organismos. Esses fungos foram empregados no estudo da biotransformação estereosseletiva dos fármacos midodrina, bufuralol e donepezila. Estes fármacos foram selecionados por produzirem metabólitos ativos nos processos de biotransformação em humanos. Para o monitoramento da formação dos metabólitos dos fármacos foi necessário desenvolver e validar métodos analíticos com características adequadas para essa aplicação. Para determinação enantiosseletiva da midodrina e seu metabólito empregou-se a eletroforese capilar, enquanto que para a determinação aquiral empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência. Para avaliar a biotransformação estereosseletiva do bufuralol e donepezila foram desenvolvidos métodos empregando a cromatografia líquida de alta eficiência. Os dados referentes ao estudo de cada fármaco são apresentados em quatro capítulos. O primeiro capítulo apresenta os resultados obtidos no desenvolvimento de um método empregando a eletroforese capilar para a determinação enantiosseletiva de midodrina e seu metabólito desglimidodrina (DMAE) em meio de cultura Czapek. As análises foram realizadas em capilar de sílica de 50 ?m de diâmetro interno e com comprimento efetivo de 40 cm, utilizando 30 mmol L-1 de trimetil- -ciclodextrina dissolvida em solução de acetato de sódio 70 mmol L-1, pH 5, como tampão de análise. A técnica de preparação das amostras empregada foi a extração líquidolíquido. O método foi validado, mostrando linearidade na faixa de concentração de 100 - 12000 ng mL-1, com coeficientes de correlação linear 0.9975. Os resultados de precisão e exatidão foram inferiores a 15% e a robustez do método foi avaliada através de um planejamento fatorial fracionário. O método foi aplicado em um estudo de biotransformação usando fungos endofíticos. Foram avaliados oito fungos com destaque para o fungo Papulaspora immersa Hotson (SS13) que biotransformou 21,3% da (+)-midodrina em (+)-DMAE e 2,4% da (-)-midodrina em (-)-DMAE, em 72 h de biotransformação, apresentando um excesso enantiomérico de 79,7%. O segundo capítulo apresenta os resultados obtidos no desenvolvimento de um método cromatográfico para a determinação de midodrina e DMAE em meio de cultura Czapek-Dox. As análises foram realizadas no modo reverso de eluição empregando uma coluna Lichrospher 100 RP 18 e fase móvel composta por acetonitrila:ácido fórmico 40 mmol L-1 (60:40, v/v), vazão de 1,4 mL min-1 e detecção em 290 nm. O preparo de amostras empregado foi a extração líquido-líquido, usando acetato de etila como solvente extrator. O método foi validado na faixa de concentração de 0,4 a 40 ?g mL-1, com coeficientes de correlação linear superiores ii a 0,9997. Este método foi aplicado em um estudo de biotransformação da midodrina empregando o fungo endofítico Papulaspora immersa e duas linhagens do fitopatógeno Botrytis cinerea (UCA 992 e 2100). Entre os fungos estudados, o Botrytis cinerea 2100, em condição de agitação, apresentou o maior percentual de biotransformação da midodrina em DMAE (42,2% em 48 h). Além disso, nos cromatogramas referentes a biotransformação em condição estática, pelos fungos Papulaspora immersa e Botrytis cinerea 2100, foi observada a presença de picos adicionais não observados nos controles realizados. Estes fungos foram submetidos à biotransformação em escala ampliada, em condição estática, a partir das quais foram isolados DMAE de ambos os fungos e um derivado desaminado da midodrina (Botrytis cinerea 2100). No terceiro capítulo são apresentados os resultados obtidos com o desenvolvimento de um método para a determinação estereosseletiva do bufuralol e seus metabólitos 1'-oxobufuralol e 1'-hidroxibufuralol em meio Czapek, usando a coluna Chiralcel OD-H no modo normal de eluição. As demais condições cromatográficas empregadas foram: fase móvel constituída por hexano:isopropanol:metanol (97,5:2,0:0,5; v/v/v) acrescidos de 0,5% de dietilamina, vazão 1,5 mL min-1 e detecção no UV em 248 e 273 nm. A microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca em três fases foi usada como procedimento de preparação das amostras. As condições empregadas na extração foram: fase doadora em pH 13 ajustado com NaOH 2 mol L-1, n-octanol como solvente orgânico, fase aceptora constituída por ácido acético 0,2 mol L-1, tempo de extração de 30 min e velocidade de agitação de 1750 rpm. Os valores de recuperação do método ficaram na faixa de 50 - 69%. O método foi aplicado em um estudo piloto de biotransformação com cinco espécies de fungos endofíticos. Nenhum dos fungos estudados biotransformou o bufuralol em 1'-oxobufuralol e/ou 1'-hidroxibufuralol e, devido a isso, o método desenvolvido não foi validado. O quarto capítulo mostra os resultados obtidos com o desenvolvimento de um método empregando a cromatografia líquida de alta eficiência na determinação enantiosseletiva da donepezila, 5-O-desmetil donepezila e 6-O-desmetil donepezila em meio de cultura Czapek. As análises foram realizadas na coluna Chiralpak AD-H no modo normal de eluição. As demais condições cromatográficas empregadas foram: fase móvel constituída por hexano:etanol:metanol (75:20:5, v/v/v) acrescido de 0,3% de trietilamina, vazão 1,5 mL min-1 e detecção no UV em 270 nm. A técnica de preparação das amostras foi a extração líquido-líquido e o solvente extrator foi o acetato de etila. O método descrito foi validado, mostrando linearidade na faixa de concentração de 100 - 10000 ng mL-1 para os enantiômeros da donepezila (r 0,9985) e 100 - 5000 ng mL-1 para os enantiômeros da 5-O-desmetil donepezila e 6- O-desmetil donepezila (r 0,9951). Os valores de recuperação foram superiores a 90% para todos os analitos. O método foi aplicado em um estudo de biotransformação usando fungos. Foram avaliados cinco fungos endofíticos e os fungos Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Beauveria bassiana ATCC 7159. Os fungos endofíticos não desmetilaram a donepezila nas condições estudadas, entretanto, esta reação foi catalisada pelo fungo B. bassiana que biotransformou predominantemente 8,3% da donepezila em (-)-(R)-5-O-desmetil donepezila (ee, 60,6%), enquanto que o fungo C. elegans apresentou biotransformação enantiosseletiva da donepezila em (-)-(R)-6-O-desmetil donepezila (ee, 100%) com um rendimento de 15,1%. Os dados aqui apresentados demonstram que biotransformações com fungos são uma importante alternativa para mimetizar a biotransformação em mamíferos e para a obtenção de metabólitos de fármacos, especialmente na forma de enantiômeros puros. / Drug biotransformations using fungi are considered an alternative approach to the asymmetric synthesis and conventional in vivo and in vitro metabolism studies. In this work, endophytic fungi isolated from health internal plant organs, phythophatogenic fungi and fungi purchased from ATCC were used to study the stereoselective biotransformation of midodrine, bufuralol and donepezil drugs. These drugs were selected because the biotrasformation process in humans results in active metabolites. To evaluate the metabolite formation during the biotransformation study, suitable analytical methods were required. The midodrine biotransformation was evaluated under chiral and achiral conditions. For the enantiosselective determination of midodrine, a capillary electrophoresis method was used, whereas the achiral determination of this drug and its metabolite was carried out by liquid chromatography. The determination of the other drugs was performed by chiral liquid chromatography.The results of each studied drug are presented in four chapters. In the first chapter, a capillary electrophoresis method was described for the stereoselective determination of midodrine and desglymidodrine (DMAE) in Czapek culture medium to be applied to a stereoselective biotransformation study employing endophytic fungi. The electrophoretic analyses were performed using an uncoated fused-silica capillary and 70 mmol L-1 sodium acetate buffer solution (pH 5.0) containing 30 mmol L-1 heptakis (2, 3, 6-tri-O-methyl)--CD as running electrolyte. The applied voltage and temperature used were 15 kV and 15°C, respectively. The UV detector was set at 200 nm. The sample preparation was carried out by liquid- liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 100 -12000 ng mL-1 for each enantiomer of midodrine and DMAE (r 0.9975). Within-day and between-day precision and accuracy evaluated by RSDs and relative errors, respectively, were lower than 15% for all analytes. The method proved to be robust by a fractional factorial design evaluation. The validated method was used to assess the midodrine biotransformation to DMAE by eight endophytic fungi. The fungus Papulaspora immersa (SS13) showed the best biotransformation results. It biotransformed 21.3% of (+)-midodrine to (+)-DMAE and 2.4% of (-)-midodrine to (-)-DMAE, after 72 hours. The observed enantiomeric excess was 79.7%. The second chapter describes the optimization and validation of a method for the determination of midodrine and DMAE in Czapek-Dox culture medium. The analyses were carried out under reverse elution mode using a Lichrospher 100 RP 18 column and acetonitrile: formic acid solution 40 mmol L-1 (60:40, v/v), as mobile phase, at a flow rate of 1.4 mL min-1 and UV detection at 290 nm. The sample preparation was carried out by liquid-liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 0.4 - 40 ?g mL-1 for each analyte (r 0.9997). This method was applied to evaluate the biotransformation of midodrine by the endophyte Papulaspora immersa and two Botrytis cinerea strains (UCA 992 and 2100). Among the studied fungi, Botrytis v cinerea 2100, at shaken condition, showed the higher percentual of DMAE formation (42.2%, at 48 hours). Moreover, the chromatograms obtained for the biotransformation under static condition, showed additional peaks not detected at performed controls, for both Papulaspora immersa and Botrytis cinerea 2100. Further biotransformation experiments were carried out at large scale on static condition. In addition to DMAE, a deaminated midodrine derivative was isolated from Botrytis cinerea 2100. In the third chapter, a three-phase hollow-fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME) method was used for the sample preparation of bufuralol and its metabolites 1'-oxobufuralol and 1'- hydroxybufuralol in Czapek culture medium. The analysis was carried out by chiral liquid chromatography using a Chiralcel OD-H column with hexane: isopropanol:methanol (97.5:2.0:0.5, v/v/v) plus 0.5% diethylamine as the mobile phase, and UV detection at 248 and 273 nm. The HF-LPME optimized conditions involved the use of n-octanol as the organic solvent, 0.2 mol L-1 acetic acid as the acceptor phase, donor phase pH adjusted to 13, sample agitation at 1750 rpm and extraction for 30 min. By using this extraction procedure, the recovery rates were in the range of 50-69%. The method was used to assess the biotransformation of bufuralol using five endophytic fungi strains. None of the studied fungi biotransformed bufuralol to 1'-oxobufuralol and / or 1'- hidroxybufuralol and because of this, the method developed was not validated. In the fourth chapter a chiral liquid chromatography method was described for the stereoselective determination of donepezil, 5-O-desmethyl donepezil, and 6-Odesmethyl donepezil in Czapek culture medium to be applied to a stereoselective biotransformation study employing fungi. The analysis was carried out using a Chiralpak AD-H column with hexane:ethanol:methanol (75:20:5, v/v/v) plus 0.3% triethylamine as the mobile phase at a flow rate of 1.5 mL min-1 and UV detection at 270 nm. The sample preparation was carried out by liquid-liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 100 -10000 ng mL-1 for each enantiomer of donepezil (r 0.9985) and of 100 - 5000 ng mL-1 for each enantiomer of 5-O-desmethyl donepezil and 6-Odesmethyl donepezil (r 0.9951). Within-day and between-day precision and accuracy evaluated by RSDs and relative errors, respectively, were lower than 15% for all analytes. The recoveries were higher that 90% for all analytes. The validated method was used to assess the donepezil biotransformation by five endophytes and by Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Beauveria bassiana ATCC 7159 fungi. The endophytic fungi do not demethylate donepezil at the studied conditions. On the other hand, Beauveria bassiana ATCC 7159 biotransformed 8.3% of donepezil to (-)- (R)-5-O-desmethyl donepezil (ee, 60.6%), while Cunninghamella elegans ATCC 10028B biotransformed 15.1% of donepezil to (-)-(R)-6-O-desmethyl donepezil (ee, 100%). The data presented here show that the biotransformations with fungi are an important alternative to mimetize biotransformations in mammals and to obtain drug metabolites, especially as pure enantiomers.