Orientador: Glaucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T12:18:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Uenojo_Mariana_D.pdf: 2764894 bytes, checksum: 38b1ea67ce218c94d06430864b61f8fa (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Carotenóides são importantes constituintes dos alimentos, conferem coloração característica, e seus produtos de degradação podem levar à formação de compostos de aromas importantes nos alimentos. Compostos de aromas derivados de carotenóides, pertencentes à classe dos noroisoprenóides, estão amplamente distribuídos na natureza. Devido ao seu alto potencial aromático, são de grande interesse para as indústrias de aromas e fragrâncias. No entanto, a ocorrência de compostos noroisoprenóides nas fontes naturais está restrita a quantidades traços, dificultando a extração, elevando os custos para sua obtenção. Um processo alternativo para se obter compostos de aromas de 13 carbonos derivados de b-caroteno é sua biotransformação utilizando-se microrganismos. Exemplos desses compostos são b-ionona e b-damascenona, responsáveis pelas fragrâncias de algumas flores e constituintes dos aromas de chá, rosas, tabaco e de frutas como uvas, marmelo, carambola e tomate. Neste trabalho, 343 microrganismos previamente isolados foram selecionados pelo método da placa de acordo com sua capacidade de degradar carotenóides presentes no meio sólido; 84 cepas foram selecionadas de acordo com sua capacidade de produção de aromas, e destas, 15 linhagens apresentaram descritores e intensidades de aromas de interesse, segundo um painel não treinado de provadores, sendo selecionadas e submetidas à fermentação submersa para produção de compostos aromas derivados de b-caroteno presente no meio de cultura. Os compostos b-ionona, b-damascona e pseudoionona foram detectados e quantificados. A b-ionona foi o principal produto obtido da degradação de b-caroteno, encontrado em maiores concentrações nas linhagens CS1 e CS13 em 120 h de fermentação em meio de cultura sem pré-inóculo. A linhagem CF9 apresentou a maior concentração do composto em 24 h de fermentação em meio de cultura com pré-inóculo. Compostos como 1,1,6-trimetil-1,2,3,4-tetraidronaftaleno (TTN) e apocarotenóides (aldeídos ou cetonas), formados aparentemente da clivagem da parte central do carotenóide, também foram detectados / Abstract: Carotenoids are important constituents of foods. Due to their color and the fact that their degradation leads to the production of aroma compounds, they play a role in the sensorial properties of foods products. Natural volatile compounds derived from carotenoids are widely distributed. Due to their often low flavor thresholds, many of them are highly potent aroma compounds of great interest for the flavor and fragrance industries. The occurrence of noroisoprenoids in natural sources is restricted to trace amounts and extraction has turned out to be costly. Thus, biotechnological processes have been used. Several compounds with aroma properties have been isolated as result of microbial transformations. Examples are the flowery smelling C13-compounds b-ionone and b-damascenone responsible for the fragrance of some flowers, constituting an essential part of tea, roses, tobacco aromas and fruit as grapes, quince, star fruit and tomato. In this work, 343 microorganisms previously isolated with potential to biotransformation b-carotene presented in the culture medium were selected by plate method; 84 microorganisms presented capacity to produce aroma compounds and 15 strains were selected according to a non-trained panel listing to produce b-carotene derived aroma compounds. b-Ionone, b-damascone, and pseudoionone were detected. The b-ionone was the major compound; it was produced by strains CS1 and CS13 in the highest concentrations at 120 hour-fermentation when cultured in medium without pre-inoculation and the strain CF9 was the main producer of b-ionone in the medium with pre-inoculation at 24 hour-fermentation. Other compounds as 1,1,6-trimethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen (TTN) and irregular terpenoids apparently derived from the central part of the carotenoid chain, were detected / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T19:00:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MadeiraJunior_JoseValdo_D.pdf: 997594 bytes, checksum: 9fe380b24aeba39fd18427a9159f14e1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A tanase, também conhecida como tanino acil hidrolase (EC 3.1.1.20), catalisa principalmente a hidrólise de ligações ésteres de taninos hidrolisáveis, liberando ácido gálico e glicose. Esta enzima tem grande potencial nas indústrias, química, farmacêutica e alimentícia. Para a produção da tanase, a fermentação em estado sólido apresenta vantagens sob a submersa, como maior produção enzimática de forma extracelular, maior produtividade, maior estabilidade de pH e temperatura, e menor custo do produto. Este menor custo se dá, entre outros motivos, pelo uso de resíduos agroindustriais e menor quantidade de água no meio. O grupo de pesquisa do laboratório de Bioquímica de Alimentos (DCA ¿ FEA ¿ UNICAMP) iniciou um estudou da produção da tanase em resíduo de Citrus. Os resultados obtidos mostraram grande potencial da produção enzimática, e simultâneo aumento do potencial antioxidante no resíduo fermentado, que por seguintes trabalhos foram constatados que este potencial se dava pelo aumento da concentração de compostos fenólicos bioativos. Os compostos fenólicos têm sido foco em pesquisas pela sua ação no metabolismo humano, agindo na prevenção de doenças crônicas, sendo portanto, importantes antioxidantes na indústria de alimentos. Com tudo, os processos de obtenção são por síntese química ou extração a partir de fontes vegetais, nos quais são usados ácidos, bases e solventes orgânicos. Estes processos geram grande quantidade de resíduos, degradam os compostos de interesse e diminuem o rendimento. Uma alternativa para minimizar estes problemas são os processos ambientalmente amigáveis, que podem ser por fermentação ou extração enzimática. Este projeto teve como principal objetivo a produção da tanase e compostos fenólicos pelo fungo Paecilomyces variotii, utilizando como substrato resíduo de frutas cítricas. Primeiramente foi realizada a produção da tanase em diferentes condições do processo de fermentação em estado sólido, como granulometria do substrato, hidratação do substrato, adição de indutores, fonte de nitrogênio, temperatura de incubação, entre outros. Em seguida, esta enzima foi semi-purificada e caracterizada bioquimicamente. Após esta etapa, foram realizados dois processos de obtenção de compostos fenólicos, via fermentativa e enzimática: para o primeiro processo foram avaliadas as condições da temperatura de incubação, hidratação do substrato e granulometria do resíduo; para o segundo, as condições testadas foram as atividades enzimáticas da pectinase, celulase e tanase (produzida neste trabalho). Após os processos de biotransformação, os extratos de compostos fenólicos bioativos obtidos foram avaliados quanto sua atividade antioxidante e anti-proliferação celular tumoral do tipo cólon-retal (células HT29) / Abstract: Tannase, also known as tannin acyl hydrolase (EC 3.1.1.20) catalyzes the hydrolysis of ester bonds of hydrolysable tannins, releasing gallic acid and glucose. This enzyme has great potential in chemical, pharmaceutical and food industries. For tannase production, the solid-state fermentation has advantages over submerged, such as great production in extracellular enzyme form, higher productivity, greater stability of pH and temperature, and lower product cost. This low cost occurs, among other reasons, by the use of agro-industrial residues and low water added in the medium. The research group of Laboratory of Food Biochemistry (DCA - FEA - UNICAMP) initiated a studied of tannase production in Citrus residues. The results showed great potential of enzyme production, and simultaneous increased the antioxidant potential in fermented Citrus residue, which others works published that potential was occurred by increasing the concentration of bioactive phenolic compounds. Phenolic compounds have been the focus in research for its action in human metabolism, acting in the prevention of chronic diseases, and therefore, important antioxidants in the food industry. However, the processes of obtaintion are by chemical synthesis or extraction from plant sources, which acids, bases and organic solvents are used. These processes generate large amounts of waste, degrade the compounds of interest and reduce the yield. An alternative to minimize these problems, environmentally friendly processes may be realized, such as by fermentation or enzymatic extraction. This project aimed to the production of tannase and phenolic compounds by the fungus Paecilomyces variotii, using as substrate Citrus residues. Firstly, the tannase production was carried out under different conditions of the solid-state fermentation process, such as particle substrate size, moisture of substrate, inductor compounds, nitrogen source, temperature of incubation, others. After that, the enzyme produced was semi-purified and biochemically characterized. The second part, two biotransformation processes for phenolic compounds obtainment were carried out, by fermentation and enzymatic reaction: for fermentation process, temperature of incubation, moisture of substrate and substrate particle size were evaluated; for enzymatic process, the conditions tested were the enzymatic activity of the pectinase, cellulase and tannase (produced in this work). After the biotransformation processes, the extracts of Citrus residues biotransformed were evaluated for antioxidant activity and tumor cell anti-proliferation type colorectal (HT29 cells) / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Gláucia Maria Pastore / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:20:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pimentel_MarianaRecco_M.pdf: 2621314 bytes, checksum: d6872d6164557c38b2fa7e53bccaddf0 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O aroma é responsável por grande parte do sabor de um alimento, e considerado um dos atributos mais importantes na aceitação do produto pelo consumidor. A preferência dos consumidores por produtos naturais tem incentivado o desenvolvimento de novos processos biotecnológicos para a produção de compostos de aroma naturais. A biotransformação de terpenos é uma alternativa promissora para a produção de aromas, visto que pode contornar alguns problemas associados a síntese química como a baixa geração de resíduos tóxicos e alta regio- e estéreo-seletividade das reações. Ademais, segundo a legislação brasileira, produtos obtidos por métodos microbiológicos podem ser rotulados como 'naturais' (ANVISA, Resolução nº 104, de 14 de maio de 1999). Os processos de biotransformação de monoterpenos frequentemente utilizam bactérias do gênero Pseudomonas como biocatalisadores por se adaptarem facilmente a diferentes substratos e condições extremas devido a sua elevada versatilidade metabólica e sistema enzimático complexo. Assim, o presente trabalho visou a utilização de monoterpenos (limoneno, a-pineno e citronelol) como substratos em processos de biotransformação por micro-organismos do gênero Pseudomonas. O Capítulo 1 apresenta um artigo de revisão atualizado sobre o potencial biotecnológico de micro-organismos do gênero Pseudomonas como biocatalisadores em processos de biotransformação. O Capítulo 2 refere-se aos resultados obtidos pelos experimentos que contemplam o isolamento de bactérias em meio seletivo e diferencial para Pseudomonas, e sua aplicação em processos de biotransformação de monoterpenos (R-(+)-limoneno, a-pineno, citronelol). Das 34 linhagens selecionadas, 9 bactérias foram capazes de biotransformar pelo menos um dos substratos em compostos de aroma de maior valor agregado. R-(+)-limoneno foi convertido a cis- e trans-carveol e carvona por 7 linhagens, atingindo concentrações de até 412 mg/L, 275 mg/L e 209 mg/L, respectivamente. a-Pineno, por sua vez, foi usado como fonte de carbono e energia por 7 linhagens e foi convertido principalmente em cis-verbenol e verbenona a baixas concentrações por 5 linhagens. Outros compostos como limoneno, mirtenol e ß-pineno, também foram identificados como produtos principais da conversão do a-pineno por 2 linhagens. Por outro lado, apenas 3 linhagens foram capazes de metabolizar citronelol em outros compostos derivados, como óxidos de rosa e isopulegol. O efeito da variação do pH do meio de biotransformação e da indução das linhagens, através da pré-exposição do micro-organismo ao substrato, no crescimento celular e formação de produtos de bioconversão foram avaliados com o intuito de otimizar o processo de biotransformação. A produção de óxido de rosa a partir de citronelol foi estudada e detalhada no capítulo final, que configurou um artigo publicado na revista Chemical Engineering Transactions. Em testes de citotoxicidade, a linhagem mostrou alta resistência a maiores concentrações de terpeno, revelando grande potencial para posterior otimização do processo. Os compostos derivados mais notáveis foram destacados no presente trabalho pela alta qualidade sensorial e alto valor agregado. Além das notas sensoriais altamente relevantes industrialmente, a carvona e o carveol são ainda reconhecidos por apresentar algumas funções biológicas. A verbenona e verbenol se destacam pelo alto custo e vasta aplicação nas áreas alimentícia, da agricultura, e da medicina. O óxido de rosa é um dos componentes mais importantes na criação de composições florais em perfumaria, além de possuir um baixo threshold. Sendo assim, a biotransformação de precursores de baixo custo em compostos de alto valor agregado pode ser considerado uma estratégia vantajosa e econômica / Abstract: Aroma compounds influence greatly the flavor of food products and govern their acceptance by consumers and market success. The increasing consumer preference for natural products has encouraged remarkable efforts towards the development of biotechnological processes for the production of natural flavor compounds. Biotransformation of terpenes represents a very promising alternative for production of aromas, since overcome the problems associated with chemical synthesis such as the low generation of toxic waste and high regio-and stereo-selectivity reactions. In addition, products obtained by microbiological methods can be labeled 'natural' under Brazilian law (ANVISA Resolution No. 104 dated May 14, 1999). Studies on monoterpene bioconversion frequently use bacteria from the genus Pseudomonas as biocatalysts since they adapt easily to different substracts and extreme conditions thanks to their high metabolic versatility and complex enzyme system. Therefore, the present work aims to use monoterpenes, such as limonene, a-pinene and citronellol, as substrate for the biotransformation processes by microorganisms from the genus Pseudomonas. The Chapter 1 presents a current review on the biotechnological potencial of microorganisms from the genus Pseudomonas. Chapter 2 refers to the results obtained from laboratory experiments which include the isolation of bacteria in selective and differential medium for Pseudomonas and their application in monoterpene biotransformation processes ((R-(+)-limonene, a-pinene, citronellol). Among 32 selected strains for investigation of biotransformation capability, 9 bacteria were able to biotransform one of the substrates on value-added flavor compounds. R-(+)-limonene was converted to cis- and trans-carveol and carvone by 7 strains, at concentrations of 412 mg/L, 275 mg/L e 209 mg/L, respectively. a-Pinene, in turn, was used as sole carbon and energy source for 7 strains, and yielded especially cis-verbenol and verbenone at low concentrations by 5 strains. Other compounds such as limonene, myrtenol and ß-pinene have also been identified as major products from the conversion of a-pinene by 2 strains. On the other hand, only 3 strains were able to metabolize citronelol on other derivative compounds, such as rose oxides and isopulegol. The effects of different pHof biotransformation medium and induction phase on cell growth and product concentration were evaluated in order to optimize the biotransformation process. The production of rose oxides by strain L1B2P was studied and detailed separately in the third chapter, set as a published article at Chemical Engineering Transactions. In citotoxicity tests, the strain showed impressive terpene resistance, revealing great potential for further process optimization. Most notable compound derivatives were highlighted in the present work due to their high sensory quality and added value. Besides highly industrially relevant sensory notes, carvone and carveol are also recognized by pursuing some biological functions. The verbenone and verbenol stand by the high cost and wide application in food, agriculture, and medicine fields. Rose oxide, in turn, is one of the most important components in creating floral compositions in perfumery, besides its low threshold. Thus, biotransformation of inexpensive precursors into high value added compounds can be considered an economical and advantageous strategy / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-12T12:12:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Mestrado_JulianaScanoni_Corrigido_19.11.pdf: 2056204 bytes, checksum: 8a5314fcf4ab820bdedd049620355c53 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-12T12:12:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Mestrado_JulianaScanoni_Corrigido_19.11.pdf: 2056204 bytes, checksum: 8a5314fcf4ab820bdedd049620355c53 (MD5) Previous issue date: 2015-07-28 / CAPEs / Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são compostos derivados de petróleo conhecidos por seu potencial de toxicidade a organismos aquáticos. Regiões estuarinas são frequentemente contaminadas por HPAs em decorrência de processos de urbanização e atividades industriais, incluindo a cadeia produtiva do petróleo. O trabalho teve o objetivo de avaliar a bioconcentração e efeitos bioquímicos de HPAs em Eugerres brasilianus coletados em quatro estuários no litoral sul de Pernambuco, a fim de obter um diagnóstico da poluição por estes contaminantes nestas regiões. As coletas foram realizadas no rio Ariquindá, sistema estuarino do rio Formoso (AR-SERF), no rio Massangana, no complexo estuarino de Suape (MA-CES), no sistema estuarino de Barra de Jangada (SEBJ), e no complexo estuarino da bacia do Pina (CEBP). A bile dos peixes foi analisada por Fluorescência Fixa para estimar a concentração em equivalentes dos HPAs naftaleno, fenantreno e criseno. Amostras de fígado foram utilizadas para análise de biomarcadores enzimáticos de fase I (etoxiresorufina orto-deetilase, EROD), fase II (glutationa S-transferase, GST), e defesa antioxidante (catalase, CAT, e glutationa redutase, GR). A análise de HPAs na bile e atividades enzimáticas em peixes coletados num ciclo anual em MA-CES e AR-SERF indicou uma semelhança na contaminação por HPAs na bile e nos níveis de atividades enzimáticas dos biomarcadores avaliados entre estes estuários, apesar da diferença do padrão de atividades antrópicas destas regiões. O CES comporta um complexo portuário com alta atividade industrial enquanto o SERF possui baixa densidade populacional e atividades turísticas. Os peixes coletados em SEBJ e CEBP apresentaram bile com concentrações do HPA criseno entre 13 x e 19 x maiores que AR-SERF, respectivamente. Foi detectado aumento das atividades da EROD, GST e CAT das regiões do SEBJ e CEBP, chegando a 30 x para a EROD, e aproximadamente 2 x para GST e CAT em comparação com AR-SERF. A maior bioconcentração de HPAs na bile e maior indução enzimática nos peixes E. brasilianus do SEBJ e CEBP indicam que estes estão dispendendo energia para tentar se adaptar a esta contaminação, o que pode ter consequências para o seu crescimento e sobrevivência nestas regiões. Os resultados indicam que SEBJ e CEBP recebem um maior aporte de HPAs, associado a maior densidade populacional e atividades antrópicas nas bacias desses rios. Os parâmetros utilizados serão úteis para o monitoramento destes sistemas estuarinos, em especial do CES, em franco processo de urbanização e industrialização. / Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are oil derived compounds known for their toxicity potential towards aquatic organisms. Estuarine regions are frequently contaminated with PAHs as a result of urbanization processes and industrial activities, including the oil productive chain. The work aimed to evaluate the bioconcentration and the biochemical effects of PAHs in Eugerres brasilianus sampled from four estuaries in the south coast of Pernambuco, in order to obtain a pollution diagnosis by these contaminants in such regions. The data collection was made in the Aquirindá river, Rio Formoso estuarine system (AR-RFES), in the Massangana river, in the Suape’s estuarine complex (MA-SEC), in the Barra de Jangada estuarine system (BJES) and in the Bacia do Pina estuarine complex (BPEC). The fish’s bile were analyzed using fixed fluorescence to estimate the equivalent concentrations of the PAHs naphthalene, phenanthrene and chrysene. Liver samples were used for phase 1 enzymatic biomarkers analysis (Ethoxyresorufin-O-deethylase, EROD), phase II (glutathione S-transferase, GST) and antioxidant defense (catalase, CAT, and glutathione reductase, GR). The analyzes of PAHs in bile and enzymatic activity in fish that were sampled in an annual cycle in MA-SEC and AR-RFES indicated a similarity between PAHs contamination in bile and the enzymatic activity levels of the biomarkers evaluated among these estuaries, despite the different anthropogenic activity patterns. The SEC comprises a port complex with high industrial activity, while the RFES has low population density and touristic activities. The bile of the fish sampled in BJES and BPEC showed chrysene concentration between 13 x and 19 x higher than AR-RFEC, respectively. An increase in EROD, GST and CAT activities was detected in the regions of BJES and BPEC, reaching 30 x for EROD, and approximately 2 x for GST and CAT. The high PAHs bioconcentration in the bile and the high enzymatic induction in E. brasilianus fish from BJES and BPEC indicate that these fish are wasting energy to try to become adapted to this contamination, which may have consequences to their growth and survival in such regions. The results indicate that BJES and BPEC receive a greater input of PAHs, associated with the higher population density and anthropogenic activities in these rivers’ basins. The parameters used will be useful for the monitoring of these estuarine systems, especially in SEC, which suffers with a rapid urbanization and industrialization process.

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-27T13:41:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_FabiolaAliagade_D.pdf: 3830264 bytes, checksum: c4a5b890059ac6893391ad89b28572c4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os ácidos fenólicos possuem propriedades biológicas que desempenham ação antioxidante, anti-inflamatória, antiproliferativa e antimicrobiana. Porém, esses fenólicos de cereais integrais podem ser difíceis de serem absorvidos totalmente pelo organismo, pois estão ligados a outros componentes da parede celular do vegetal ou a um antinutriente (taninos). O zinco, ferro e fósforo de grãos integrais são importantes para o desenvolvimento e manutenção do organismo. No entanto, os cereais ricos em fitato podem apresentar esses minerais complexados ao antinutriente e se tornarem indisponíveis para a absorção. Uma alternativa para melhorar a disponibilidade de ácidos fenólicos e minerais de cereais integrais é o tratamento enzimático. A tanase, tanino acil hidrolase (EC 3.1.1.20), é uma enzima com habilidade de atuar em ligações éster e depsídicas de taninos hidrolisáveis e já foi descrita como capaz de hidrolisar outros fenólicos como ácido tânico, ácido clorogênico, epigalocatequina, dentre outros. A fitase microbiana atua na desfitinização de cereais ricos em fitatos e sua ação melhora a bioacessibilidade de ferro e zinco na formulação infantil. A bioacessibilidade é uma alternativa aos ensaios 'in vivo' que apresentam alto custo de experimental, e pode ser medida pelo modelo de digestão 'in vitro'/absorção pelas células Caco-2. O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito de tanase de 'Paecilomyces variotii' e fitase comercial, adicionadas à farinha de centeio, quanto ao teor de fenólicos totais e à identificação e quantificação por CLAE-DAD dos ácidos fenólicos; à capacidade antioxidante (DPPH, ORAC e FRAP); à disponibilidade de minerais (zinco e ferro); ao teor de antinutrientes (tanino hidrolisável e fitato); e à bioacessibilidade dos ácidos fenólicos da farinha. A tanase adicionada à farinha foi capaz de reduzir o teor de tanino hidrolisável, aumentar os fenólicos totais e potencializar a capacidade antioxidante. A farinha tratada com fitase apresentou menor teor de fitato e aumento no conteúdo de fósforo inorgânico proveniente da degradação enzimática. A disponibilidade de zinco e ferro, medida pela razão molar entre os minerais e o fitato foi melhorada após o tratamento da farinha com fitase. Foram identificados os ácidos ferúlico, sinápico e vanílico da farinha de centeio, que após o tratamento com a tanase apresentou aumento no teor de ácido ferúlico em cinco vezes em relação à farinha não tratada. Esse resultado evidencia a ação inédita da tanase de 'P. variotii' como possível feruloil esterase. A farinha biotransformada com tanase apresentou maior teor dos ácidos vanílico, ferúlico e sinápico, porém ao se avaliar a bioacessibilidade houve menor eficiência de transporte desses ácidos quando comparada à farinha controle. Provavelmente, a farinha biotransformada apresentou saturação desses fenólicos sobre a porção apical das células Caco-2 que reduziu a capacidade do transportador de ácidos monocarboxílicos (MCT1) nas duas horas de incubação. Isso corrobora com os resultados obtidos da exposição das células Caco-2 aos padrões de ácidos ferúlico e vanílico na concentração de 50 µl.ml-1 que apresentaram inibição da expressão gênica do MCT1. Contudo, o uso de enzimas como fitase e tanase na farinha de centeio é interessante, pois potencializa sua ação antioxidante, aumenta o teor de fenólicos, aumenta a disponibilidade de zinco e ferro, aumenta o conteúdo de fósforo e reduz os antinutrientes. Para trabalhos futuros seria relevante estudar o tempo de residência de ácidos fenólicos da farinha de centeio no ensaio de transporte celular, pois duas horas de incubação pode ter sido insuficiente para verificar todo o potencial da farinha tratada com tanase / Abstract: Phenolic acids have biological properties that perform antioxidant, anti-inflammatory, antiproliferative and antimicrobial. However, these phenolic of whole grains may be difficult to be completely absorbed by the body because they are connected to other cell wall components of plant or an antinutrient (tannins). Zinc, iron and phosphorus of whole grains are important for the development and maintenance of the organism. However, cereals rich in phytate may have these minerals complexed to antinutrient and become unavailable for absorption. An alternative to improve the availability of phenolic acids and minerals of whole grains is the enzymatic treatment. Tannase, tannin acyl hydrolase (EC 3.1.1.20) is an enzyme with the ability to act on ester bonds and depside bonds of hydrolysable tannins and has been described as capable of hydrolyzing tannic acid, chlorogenic acid, epigallocatechin, among others. Microbial phytase acts on dephytinization of cereals rich in phytate and its action improves the bioaccessibility of iron and zinc in infant formulation. Bioaccessibility is an alternative to in vivo tests that has expensive experimental cost, and can be measured by 'in vitro' model of digestion / absorption by the Caco-2 cells. The aim of this study was to investigate the effect of tannase Paecilomyces variotii and of commercial phytase added to rye flour, as to the total phenolic content and the identification and quantification by HPLC-DAD of phenolic acids; to the antioxidant capacity (DPPH, ORAC and FRAP); to the availability of minerals (zinc and iron); to the antinutrients content (phytate and hydrolyzable tannin); and as to bioaccessibility of phenolic acids of the flour. Tannase added to flour was able to reduce the hydrolyzable tannin content, increase total phenolic and enhance the antioxidant capacity. Flour rye treated with phytase decreased phytate content and increased content of inorganic phosphorus from enzymatic degradation. Availability of zinc and iron of the flour after treatment with phytase was improved, it was measured by the molar ratio between the mineral and phytate. Acids ferulic, sinapic and vanillic were identified and quantified of the rye flour, which after treatment with tannase showed an increase in ferulic acid content in five times bigger that the untreated flour. This result shows the tanase being an original action of 'P. variotii' as possible feruloyl esterase. Biotransformed flour rye with tannase showed a higher content of vanillic acid, ferulic and sinapic, however, when assessing the bioaccessibility was lower transport efficiency of these acids when compared to the control flour. Probably the biotransformed flour showed saturation of these phenolics about the apical portion of Caco-2 cells, they reduced the capacity of the monocarboxylic acids transporter (MCT1) within two hours of incubation. This corroborates the results of exposure of Caco-2 cells to standards of ferulic acid and vanillic at concentration of 50 ?l.mL-1, that showed inhibition of gene expression MCT1. However, the use of enzymes such as phytase and tannase in rye flour is interesting because it enhances antioxidant capacity, it phenolic content is incremented, availability of zinc and iron is bettered, increases the phosphorus content and reduces antinutrients. For further work, would be relevant the study of the residence time of the phenolic acids of rye flour on the cell transport assay, since two hours of incubation may have been insufficient to verify the full potential of flour treated with tannase / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutora em Ciência de Alimentos

O hipoestrogenismo decorrente da menopausa acelera o envelhecimento da pele. Apesar de possuir efeitos positivos na pele, dois grandes estudos apontaram para os efeitos adversos da TH (terapêutica hormonal) estroprogestiva. Os fitoestrógenos são utilizados como terapia alternativa para mulheres com contraindicação à TH clássica. Dentre os fitoestrógenos, as isoflavonas daidzeína (D) e genisteína (G) são encontradas em pequenas quantidades na soja e possuem capacidade de promover efeitos benéficos na pele quando administradas por via oral e subcutânea. Entretanto, nenhum estudo investigou se estas isoflavonas podem aumentar o colágeno da pele quando administradas por via tópica, e se este efeito está relacionado com os receptores de estrógeno. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver formulações cosméticas contendo extrato de soja biotransformado pelo fungo Aspergillus awamori e analisar o potencial estrogênico deste extrato na produção de colágeno. Para contemplar nosso objetivo, foram produzidos quatro diferentes tipos de extrato de soja biotransformado, e após definir qual o extrato com maior concentração das isoflavonas (D e G), este extrato (ESBE) foi submetido a testes de citotoxicidade em células L929 (mouse fibroblast cell line - clone 929 da cepa L) e HDFa (Human Dermal Fibroblast, adult). Na segunda etapa foram desenvolvidas formulações cosméticas do tipo gel, creme e gel-creme incorporadas com ESBE, as quais foram utilizadas na realização de testes de estabilidade preliminar e em ensaio de permeação e retenção cutânea. Finalmente, foi realizado teste de eficácia para avaliar a produção de colágeno após tratamento com ESBE em cultura de fibroblastos humanos primários (HDFa). Os resultados demonstraram que a biotransformação é um processo eficaz para aumentar a concentração de D e G; o ESBE não demonstrou citotoxicidade em células L929 e HDFa; as formulações incorporadas com ESBE demonstraram possuir estabilidade preliminar; a formulação do tipo gel demonstrou ser a melhor opção para incorporação do ESBE visto que facilitou a retenção das isoflavonas na pele sem permitir a permeação de compostos para o líquido receptor; e finalmente, o ESBE é capaz de estimular a produção de colágeno em fibroblastos primários nas concentrações de 59 e 1,33?g/mL. Concluímos que o ESBE estimula a produção de colágeno, principalmente na concentração de 1,33?g/mL. Sugerimos que o mecanismo responsável for este efeito pode envolver a ligação da genisteína aos receptores de estrógeno, entretanto, outros mecanismos de ação das isoflavonas de soja como proteção contra stress oxidativo, indução da expressão de enzimas antioxidantes e a presença de proteínas inibidoras de proteases (BBI e STI) devem ser levadas em consideração. / Hypoestrogenism that occurs during menopause accelerates skin aging.Despite having positive effects on the skin, two large studies have pointed to the adverse effects of estroprogestative HT (hormonal therapeutic). Phytoestrogens are used as an alternative therapy for women with contraindications to classical HRT. The isoflavones daidzein and genistein are phytoestrogens found in small amounts in soybean grains and with ability to promote beneficial effects on the skin when administered orally and subcutaneously. However, no studies have investigated whether these isoflavones may increase skin collagen content when administered topically, and if this effect is associated with the estrogen receptors. Thus, the aim of this study was to develop cosmetic formulations containing soybean extract biotransformed by the fungus Aspergillus awamori and analyze the estrogenic potential of this extract on the production of collagen. To achieve our purpose, four different types of biotransformed soybean extract were produced, and after define which extract has the highest concentration of isoflavones (D and G), this extract (ESBE) was subjected to cytotoxicity tests in L929 (mouse fibroblast cell line - strain L) and HDFa cells (Human Dermal Fibroblasts , adult) . In the second stage cosmetic formulations type gel, cream and gel-cream incorporated with ESBE were developed. These formulations were used in preliminary stability tests and assays to analyze permeation and retention of compounds on the skin. Finally, efficacy test evaluated the production of collagen after treatment of primary human fibroblasts with ESBE. The results showed that the biotransformation is an effective method for increasing the concentration of D and G; ESBE did not show cytotoxicity in L929 and HDFa cells; the cosmetic formulations incorporated with ESBE shown to have preliminary stability; gel-type formulation proved to be the best option for incorporation of ESBE because it was able to facilitate the retention of the isoflavones in the skin without allowing the permeation of compounds into the liquid receiver; And finally, the ESBE was able to stimulate collagen production in primary fibroblasts at concentrations of 59 and 1,33 ?g / mL. We conclude that the ESBE can stimulate collagen production, mainly in the concentration of 1,33?g / mL. We suggest that the mechanism responsible for this effect may involve genistein binding to estrogen receptors, however, other mechanisms of action of soy isoflavones, as protection against oxidative stress, induction of expression of antioxidant enzymes and the presence of protease inhibitors proteins (BBI and STI) must be taken into account.

Os diterpenos labdanos ácidos ent-poliáltico (AP) e ent-diidroagático (ADA) são metabólitos secundários amplamente distribuídos em diversas espécies vegetais, sendo particularmente comuns nos exsudatos extraídos dos troncos das árvores do gênero Copaifera (Leguminosae- Caesalpinioideae). Estas oleorresinas apresentam diversas atividades biológicas e são utilizadas na medicina popular desde a época dos índios pré-colombianos. Apesar de sua ampla utilização, não há estudos acerca de seu metabolismo. Estudos de biotransformação com constituintes bioativos como o AP e ADA podem contribuir para o entendimento de reações metabólicas in vivo das oleorresinas. Além de indispensáveis na fase pré-clinica de desenvolvimento e otimização de fármacos, os estudos de biotransformação in vitro também podem propiciar a obtenção de novas estruturas químicas farmacologicamente ativas. Assim, os diterpenos AP e ADA foram submetidos a estudos de biotransformação com diferentes tipos de biocatalisadores: fungos filamentosos, micro-organismos do trato gastrointestinal e microssomas hepáticos humanos. Foram obtidos quinze metabólitos de biotransformação com os fungos Cunninghamella elegans, Cunninghamella echinulata e Aspergillus brasiliensis, sendo treze estruturas ainda não descritas na literatura. A reação enzimática mais comum promovida pelos fungos sobre os diterpenoides foi a hidroxilação, porém isomerização da ligação dupla e acetilação também foram identificadas. Apesar de terem sido detectadas diminuições acentuadas nas concentrações dos diterpenos nas culturas com os microorganismos do trato gastrointestinal, os rendimentos dos processos de biotransformação na escala de produção desenvolvida não propiciaram metabólitos em concentrações satisfatórias para isolamento. Apesar dos baixos rendimentos, foi possível propor através de espectrometria de massas a estrutura de quatro derivados oxidados e/ou metilados do ADA após incubação com Saccharomyces boulardii, Lactobacillus fermentum, Escherichia coli, cultura mista com probióticos do gênero Lactobacillus e cultura mista com os probióticos do gênero Bifidobacterium. O ácido ent-agático foi identificado entre os metabólitos propostos, indicando a necessidade de mais estudos acerca do metabolismo dos constituintes das oleorresinas de Copaifera, uma vez que o ácido agático já foi reportado na literatura como abortivo em mamíferos. Para os metabólitos obtidos com microssomas hepáticos humanos foram propostas quatro estruturas oxidadas no metabolismo de fase I e quatro estruturas conjugadas com ácido glucurônico no metabolismo de fase II e fase I e II combinados. Os precursores e os derivados majoritários de biotransformação foram submetidos a ensaios de citotoxidade com células tumorais das linhagens Caco-2, HeLa e MCF-7, além da linhagem normal MCF-10A. As mudanças químicas promovidas pelos fungos na estrutura do ADA não acarretaram mudanças significativas em sua atividade biológica, enquanto a maioria dos derivados do AP apresentou menor efeito citotóxico. Apenas o metabólito P06(AP) apresentou atividade cerca de quatro vezes maior (IC50 = 62,6 ?M) que o precursor, sugerindo que a migração da dupla e a introdução de grupo acetato na estrutura do AP pode ser uma estratégia para obtenção de derivados mais ativos frente a linhagem HeLa. De modo geral, os resultados obtidos neste estudo reforçam a importância da biotransformação como estratégia para obtenção de novas estruturas químicas e contribuem para o entendimento do metabolismo de constituintes bioativos das oleorresinas medicinais de Copaifera / The labdane diterpenes ent-polyalthic (AP) and ent-dihydroagathic (ADA) acids are secondary metabolites widely spread in several plants. Both diterpenes are particularly common in the oleoresins extracted from the tree trunks of Copaifera sp. (Leguminosae- Caesalpinioideae). These oleoresins have several biological activities and have been used in folk medicine since the pre-Columbian Indians times. Despite their wide use, research on the metabolism of the oleoresins is lacking. Biotransformation studies with their bioactive constituents such as AP and ADA may contribute to the understanding of in vivo metabolic reactions. In vitro biotransformation studies are mandatory in the preclinical stage of drug development and optimization and can also provide new pharmacologically active derivatives. Given that, the diterpenes AP and ADA were submitted to biotransformation studies with different types of biocatalysts: filamentous fungi, microorganisms from the gastrointestinal tract and human liver microsomes. The biotransformation with the fungi Cunninghamella elegans, Cunninghamella echinulata and Aspergillus brasiliensis afforded two known structures and thirteen new metabolites. The most common enzymatic reaction by the fungi was hydroxylation, but isomerization of the double bond and acetylation were also detected. Although the microorganisms from the gut microbiota were able to reduce the concentration of the diterpenes in the cultures, the biotransformation yields of the processes were not enough for metabolite isolation. Despite the low yields, four oxygenated and/or methylated metabolites were proposed by mass spectrometry, after incubation of ADA with Saccharomyces boulardii, Lactobacillus fermentum, Escherichia coli, mixed culture with Lactobacillus sp. probiotics and mixed culture with Bifidobacterium sp. probiotics. The diterpene ent-agathic acid was identified among the metabolites, indicating the need for further studies on the metabolism of Copaifera oleoresin constituents, since agathic acid has already been reported as abortive in mammals. Four oxygenated structures and four metabolites conjugated with glucuronic acid were proposed for the phase I and phase II metabolism with human liver microsomes, respectively. The antiproliferative effects of the diterpenes and their major biotransformation derivatives were evaluated against the cancer cell lines Caco-2, HeLa and MCF-7 and the normal cell line MCF-10A. The chemical changes promoted by the fungi in the structure of ADA resulted in no significant changes in its biological activity. Most AP\'s derivatives displayed lower cytotoxic effects, except for the metabolite P06(AP), which showed to be four times more active (IC50 = 62.6 ?M) than its precursor. The migration of the double bond and the introduction of the acetate group in AP\'s skeleton were associated with the greater biological activity. The results obtained herein reinforce the use of biotransformation as a strategy to obtain new chemical structures and contribute to the understanding of the metabolic pathways of bioactive constituents of Copaifera medicinal oleoresins.

A piplartina é um alcaloide natural conhecido por apresentar diversas atividades biológicas, onde se destaca a ação anticancerígena. Esse produto natural apresentou atividade seletiva frente a vários tipos de células cancerígenas, sendo assim considerado promissor para o desenvolvimento de fármacos. O conhecimento do metabolismo de produtos naturais bioativos é uma importante e necessária etapa para avaliar a eficácia e segurança dessas substâncias. Os micro-organismos são amplamente utilizados em estudos de metabolismo, uma vez que catalisam reações quimio-, régio-, e estereoespecíficas, que muitas vezes são semelhantes às catalisadas pelos seres humanos. Nesse contexto, esse trabalho teve o objetivo de estudar o metabolismo microbiano da piplartina pelos fungos endofíticos Papulaspora immersa SS13 e Penicillium crustosum VR4, de solo Mucor rouxii NRRL 1894, e de coleção comercial Cunninghamella echinulata ATCC 8688a e Beauveria bassiana ATCC 7159. Os experimentos de biotransformação foram monitorados por UPLC-DAD-MS e UPLC-DAD-MS/MS. Todos os fungos utilizados biotransformaram a piplartina, sendo que 14 substâncias majoritárias foram identificadas como produtos de biotransformação nos experimentos em pequena escala. A piplartina e seus derivados apresentaram fragmentações características em IES-EM/EM que foram explicadas utilizando cálculos computacionais. O estudo dessas fragmentações permitiu a identificação e proposição das alterações estruturais que ocorreram nos metabólitos formados. Os fungos P. crustosum VR4 e B. bassiana ATCC 7159 foram selecionados para realizar os experimentos de biotransformação em escala ampliada, pois foram capazes de formar a maior diversidade de derivados da piplartina. Cinco substâncias foram isoladas e identificadas por RMN de 1H, RMN de 13C, HMQC, HMBC, COSY e HRESIMS. Essas substâncias não tinham sido obtidas por biotransformação microbiana anteriormente, sendo que uma ainda não foi descrita na literatura. Foram identificados principalmente produtos formados a partir de reações semelhantes às do metabolismo humano de fase I, como reduções, hidroxilações e hidrólises. Dessa forma, podemos concluir que as culturas microbianas são uma ferramenta útil para estudos preliminares de metabolismo, e para obter padrões de metabólitos que podem ser formados pelo metabolismo humano. / Piplartine is a natural alkaloid recognized by its biological properties, especially the anticancer activity. This natural product showed selective activity against several cancer cells lines, thus being considered a promising hit for drug development. Studies of bioactive natural products metabolism are an important and necessary step for the evaluation of their efficacy and safety. Microorganisms have been widely employed in metabolism studies, since they may catalyze chemo-, regio- and stereospecific reactions that are similar to human metabolism. This work aimed to study the microbial metabolism of piplartine by different fungal strains: the endophytes Penicillium crustosum VR4 and Papulaspora immersa SS13, the soil strain Mucor rouxii NRRL 1894, and the commercial collection strains Cunninghamella echinulata ATCC 8688a and Beauveria bassiana ATCC 7159. Biotransformation experiments were monitored by UPLC-DAD-MS and UPLC-DADMS/ MS. All the screened fungi were able to biotransform piplartine, and 14 compounds were identified as major biotransformation products in the small scale experiments. Piplartine and its derivatives showed characteristics fragmentations on ESI-MS/MS, which were explained using computer calculations. These fragmentation studies allowed the identification and structural proposition of piplartine metabolites. The fungi P. crustosum VR4 and B. bassiana ATCC 7159 were selected to perform the large scale biotransformation experiments, since they were capable to produce a large diversity of piplartine derivatives. Five compounds were isolated and identified by 1H NMR, 13C NMR, HMQC, HMBC, COSY and HRESIMS data. The isolated products had never been previously identified by microbial biotransformation, and one of them was found to be novel in the literature. All the identified and isolated compounds have been produced by reactions similar to those that occur in phase I of human metabolism, such as reduction, hydroxylation and hydrolysis reactions. Thus, we can conclude that the microbial cultures are useful tools for preliminary metabolism studies, and to obtain chemical standards similar to those produced by human metabolism

Este trabalho teve por finalidade o desenvolvimento e validação de métodos para análise estereosseletiva de alguns fármacos e metabólitos, bem como a aplicação desses métodos na avaliação do potencial de fungos, principalmente endofíticos, em processos de biotransformação. Os seguintes fármacos foram selecionados para esse estudo: fluoxetina, propranolol, omeprazol, oxibutinina e ibuprofeno. Para determinação simultânea dos enantiômeros da fluoxetina (FLX) e norfluoxetina (NFLX) em meios de cultura de fungos endofíticos, empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por absorção no ultravioleta, em um sistema com duas colunas em série, sendo uma de fase reversa (C18) e outra com fase estacionária quiral (Chirobiotic® V). A fase móvel foi composta por etanol: tampão acetato de amônio 15 mmol L-1, pH 5,90: acetonitrila (77,5: 17,5: 5, v/v/v) e a detecção foi realizada em 227 nm. A extração líquido-líquido foi empregada na preparação das amostras. As curvas analíticas foram lineares no intervalo de concentração de 12,5 a 3750 ng mL-1 (r 0,996) para todos os enantiômeros analisados. Os coeficientes de variação e erros relativos obtidos nos estudos de precisão e exatidão foram inferiores a 10%. Nas condições empregadas, os cinco fungos endofíticos estudados não foram capazes de promover a biotransformação da FLX (reação de demetilação). A eletroforese capilar foi empregada para análise enantiosseletiva do propranolol (PROP) e 4-hidroxipropranolol (4-OHPROP). A melhor condição de resolução dos enantiômeros foi encontrada com a aplicação de um planejamento experimental de Box-Behnken: solução de eletrólitos composta por tampão trietilamina / ácido fosfórico (TEA/H3PO4), 25 mmol L-1, pH 9,00, carboximetil--ciclodextrina 4% (m/v) como seletor quiral e análise realizada na voltagem de 17 kV. O método de extração líquido-líquido também foi empregado para preparação das amostras. As curvas analíticas foram lineares no intervalo de concentração de 0,25 a 10,0 g mL-1 para 4-OHPROP e de 0,10 a 10,0 g mL-1 para PROP, apresentando coeficientes de correlação (r) 0,995 para todos os enantiômeros analisados. Os coeficientes de variação e erros relativos obtidos nos estudos de precisão e exatidão foram inferiores a 15%. Os cinco fungos endofíticos em estudo se mostraram eficientes na biotransformação estereosseletiva do PROP, com maior formação do metabólito (-)-(S)-4-OHPROP. O fungo Glomerella cingulata (VA1), em especial, apresentou uma concentração de 1,745 g mL-1 do enantiômero (-)-(S)-4-OHPROP depois de 72 horas de incubação, ao passo que a formação do enantiômero (+)-(R)-4-OHPROP não foi observada. A utilização deste fungo em escalas ampliadas pode ser uma fonte promissora de obtenção do metabólito 4-OHPROP na forma enantiomericamente pura. A determinação simultânea de omeprazol (OMZ), 5-hidroxiomeprazol (5-HOMZ) e omeprazol sulfona (OMZ SUL) em meio de cultura Czapek Dox modificado ii tamponado foi realizada empregando um método rápido de análise por cromatografia líquida de ultra eficiência com detector por arranjo de diodos (UPLC / DAD), usando coluna monolítica de fase reversa e eluição por gradiente. OMZ, 5-HOMZ e OMZ SUL foram extraídos das amostras utilizando uma mistura de acetato de etila: t-butil metil éter (9: 1, v/v). A separação foi obtida empregando uma coluna RP 18 Chromolith Fast Gradient endcapped e fase móvel constituída por 0,15% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) em água (solvente A) e 0,15% (v/v) de TFA em acetonitrila (solvente B). Os tempos de retenção foram de 0,70 min para 5-HOMZ, 0,74 min para OMZ, 0,77 min para OMZ SUL e 0,91 min para o padrão interno (bupropiona, BUP). O método foi linear no intervalo de 0,2 a 10,0 g mL-1 (r 0,995) para todos os analitos. O processo de biotransformação foi realizado durante apenas 24 horas de incubação, por causa de problemas de estabilidade do OMZ. Por esse mesmo motivo, a biotransformação estereosseletiva não foi avaliada. Apenas três fungos apresentaram formação do metabólito 5-HOMZ, e dentre estes, apenas o fungo Botritis cinerea (BC) produziu esse metabólito em concentração superior ao limite de quantificação do método. A formação do metabólito OMZ SUL foi observada para todos os fungos, exceto para Glomerella cingulata (VA1) e Guignardia mangiferae (VA15). Esses fungos podem ser úteis para a obtenção dos metabólitos do OMZ, mas estudos detalhados do comportamento do fármaco nas condições de cultivo são necessários, uma vez que este substrato pode sofrer degradação em meio ácido e na presença de luz. A análise simultânea dos enantiômeros da oxibutinina (OXY) e da N-desetiloxibutinina (DEOB) em meio de cultura Czapek foi obtida empregando a cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV (HPLC/UV). Os analitos foram separados usando coluna quiral Chiralpak AD e fase móvel constituída por hexano: isopropanol: etanol: dietilamina (94: 4: 2: 0,05, v/v/v/v) e detectados em 210 nm. Um estudo piloto de biotransformação empregando os mesmos fungos e as condições de biotransformação utilizadas para os demais fármacos mostrou que não houve a formação do metabólito de interesse. Além disso, não houve uma diminuição significativa da concentração de OXY durante o período de incubação, o que poderia ser um indicativo da formação de outros metabólitos não monitorados nas condições de análise. Como a reação de desetilação da OXY para formar a DEOB não foi observada nos experimentos, não foi necessário realizar a validação do método analítico. A separação simultânea do ibuprofeno (IBP), dos enantiômeros do 2-hidroxi-ibuprofeno (2-OH-IBP) e dos estereoisômeros do carboxi-ibuprofeno (COOH-IBP) foi realizada empregando-se uma coluna Chiralpak AS-H e fase móvel constituída por hexano: isopropanol: TFA (95: 5: 0,1, v/v/v). O solvente extrator usado na extração líquido-líquido foi uma mistura de hexano: acetato de etila (1: 1, v/v). A detecção foi feita por espectrometria de massas (MS/MS), com a fonte de ionização por eletronebulização operada no modo positivo (ESI+). O método foi linear nos intervalos de 0,1 a 20,0 g mL-1 para IBP, de 0,05 a 7,5 g mL-1 para o cada enantiômero do 2-OH-IBP e de 0,025 a 5,0 g mL-1 para cada estereoisômero do COOH-IBP. Os demais parâmetros de validação obtidos para o método apresentaram-se dentro dos limites recomendados pela literatura. Os sete fungos endofíticos estudados se mostraram eficientes na biotransformação do IBP em seu principal metabólito 2-OH-IBP, mas apenas os fungos Nigrospora sphaerica (SS67) e Chaetomium globosum (VR10) iii biotransformaram o IBP de forma enantiosseletiva mais acentuada, observando-se maior formação do metabólito ativo (+)-(S)-2-OH-IBP. A não estereosseletividade observada para os demais fungos pode ser indício de uma possível conversão quiral do fármaco, similar a que ocorre em humanos. A formação dos estereoisômeros do COOH-IBP não foi observada, provavelmente, porque sua rota de formação envolve uma seqüência de reações. Os resultados apresentados nesse trabalho mostram que fungos, particularmente os endofíticos, podem ser uma fonte promissora para obtenção de metabólitos de fármacos, inclusive de forma enantiomericamente pura. / This work aimed the development and validation of suitable methods for the stereoselective analysis of some drugs and metabolites, as well as, the application of these methods to assess the potential of fungi, mainly the endophytic ones, in biotransformation processes. The following drugs were selected for this study: fluoxetine, propranolol, omeprazole, oxybutynin and ibuprofen. The simultaneous determination of fluoxetine (FLX) and norfluoxetine (NFLX) enantiomers in culture media of endophytic fungi was carried out by high-performance liquid chromatography with UV-detection, in a system of two columns coupled in series, in which one of them was a reversed phase (C18) column and the another one was a chiral stationary phase column (Chirobiotic ® V). The mobile phase consisted of ethanol: ammonium acetate buffer, 15 mol L-1, pH 5.90: acetonitrile (77.5: 17.5: 5, v/v/v) and the detection was performed at 227 nm. Liquid-liquid extraction was employed for sample preparation. The analytical curves were linear over the concentration range of 12.5 to 3750 ng mL-1 (r 0.996) for all enantiomers evaluated. The coefficients of variation and relative errors obtained in the evaluation of method precision and accuracy were lower than 10%. In the studied conditions, the five endophytic fungi used were not able to perform the biotransformation of FLX (demethylation reaction). Capillary electrophoresis was employed for the enantioselective analysis of propranolol (PROP) and 4-hydroxypropranolol (4-OHPROP). The best condition for enantiomer resolution was obtained by applying an experimental design of Box-Behnken: electrolyte solution composed of triethylamine / phosphoric acid (TEA/H3PO4) buffer, 25 mmol L-1, pH 9.00, with 4% (w/v) carboxymethyl--cyclodextrin as the chiral selector and analysis performed at 17 kV. Liquid-liquid extraction was also used for sample preparation. The analytical curves were linear over the concentration range of 0.25 to 10.0 g mL-1 for 4-OHPROP and 0.10 to 10.0 g mL-1 for PROP, presenting correlation coefficients (r) 0.995 for all enantiomers evaluated. The coefficients of variation and relative errors obtained in the evaluation of precision and accuracy were lower than 15%. All the five endophytic fungi (Phomopsis sp. (TD2), Glomerella cingulata (VA1), Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globosum (VR10) and Aspergillus fumigatus (VR12)) showed effectiveness in the stereoselective biotransformation of PROP, with higher formation of (-)-(S)-4-OH-PROP. The fungus Glomerella cingulata (VA1), in particular, showed a concentration of 1.745 g mL-1 for the enantiomer (-)-(S)-4-OHPROP after 72 hours of incubation, whereas there was no formation of the enantiomer (+)-(R)-4-OHPROP. Therefore, the use of this fungus in large scale may be a promising source to obtain 4-OHPROP in the enantiomerically pure form. A fast analytical method based on ultra-performance liquid chromatography / diode array detector (UPLC/DAD) using a monolithic reversed phase column and gradient elution was developed for the simultaneous determination of omeprazole (OMZ), 5-hydroxyomeprazole (5-HOMZ) and omeprazole sulfone (OMZ SUL) in modified and buffered Czapek-Dox culture medium. OMZ, 5-HOMZ and OMZ SUL were extracted using a mixture of ethyl acetate: methyl t-butyl ether (9: 1, v/v). The separation was achieved using a Chromolith Fast Gradient RP 18 endcapped column with the mobile phase consisting of 0.15% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA) in water (solvent A) and 0.15% (v/v) TFA in acetonitrile (solvent B). Retention times were 0.70 min for 5-HOMZ, 0.74 min for OMZ, 0.77 min for OMZ SUL and 0.91 min for internal standard (bupropion, BUP). The method was linear over the concentration range of 0.2 to 10.0 g mL-1 (r 0.995) for all analytes. The biotransformation process was carried out only within 24 hours of incubation, due to OMZ instability. For the same reason, the stereoselectivity in this process was not evaluated. The formation of the metabolite 5-HOMZ was observed only for three fungi, and among them, only the fungus Botrytis cinerea (BC) produced this metabolite in concentrations higher than the limit of quantification. The formation of OMZ SUL was observed for all fungi, except for Guignardia mangiferae (VA1) and Glomerella cingulata (VA15). The fungi evaluated in this study can be useful to obtain the metabolites of OMZ, but detailed study of the drug stability in culture conditions is required, since this substrate can undergo degradation in acidic conditions and in the presence of light. The simultaneous analysis of oxybutinin (OXY) and N-desethyloxybutinin (DEOB) enantiomers in Czapek culture medium was carried out by liquid chromatography with UV detection (HPLC/UV). The analytes were separated using a Chiralpak AD column employing as mobile phase hexane: isopropanol: ethanol: diethylamine (94: 4: 2: 0.05, v/v/v/v) and detection at 210 nm. A pilot study of biotransformation using the same fungi and conditions employed for the biotransformation of the other drugs showed that the metabolite of interest was not formed. Moreover, the decrease in the concentration of OXY, which could be indicative of the formation of other metabolites not monitored under the conditions of analysis, was not observed. Since the reaction of OXY desethylation to form DEOB was not observed in the experiments, the validation of the analytical method was not required. The method for the simultaneous analysis of ibuprofen (IBP), 2-hydroxyibuprofen (2-OH-IBP) enantiomers and carboxyibuprofen (IBP-COOH) stereoisomers was developed using a Chiralpak AS-H column and a mobile phase consisting of hexane: isopropanol: TFA (95: 5: 0.1, v/v/v). A mixture of hexane: ethyl acetate (1: 1, v/v) was used as solvent extractor for sample preparation. The detection was performed by tanden mass spectrometry (MS/MS) with the electrospray interface operated in the positive mode (ESI+). The method was linear over the concentration range of 0.1 to 20.0 g mL-1 for IBP, 0.05 to 7.5 g mL-1 for each 2-OH-IBP enantiomer and 0.025 to 5.0 g mL-1 for each COOH-IBP stereoisomer. The other validation parameters studied were within the limits established in the literature. The seven studied endophytic fungi showed to be efficient in the biotransformation of IBP to its main metabolite 2-OH-IBP, however, only the fungi Nigrospora sphaerica (SS67) and Chaetomium globosum (VR10) biotransformed IBP enantioselectively, with greater formation of the active metabolite (+)-(S)-2-OH-IBP. The lack of stereoselectivity observed for the other fungi could be caused by a possible chiral inversion process occurring for IBP, in a similar way that happens in humans. The formation of COOH-IBP stereoisomers was not observed probably because the route of formation of this metabolite requires a sequence of reactions. The results presented here show that fungi, particularly the endophytic ones, may be a promising source to obtain the metabolites of drugs, including in their enantiomerically pure form.

A hidroquinona (HQ) é um composto fenólico obtido a partir da metabolização endógena do benzeno, está presente no cigarro, medicamentos, reveladores fotográficos, alimentos e plantas medicinais. Temos demonstrado que a intoxicação experimental de ratos à HQ compromete a migração de leucócitos para o pulmão na vigência de resposta inflamatória alérgica ou inespecífica. O presente trabalho visou avaliar os efeitos da HQ sobre atividades da célula endotelial e de neutrófilos envolvidas na inflamação. Culturas primárias de células endoteliais da rede microcirculatória obtidas do músculo cremaster de ratos Wistar, machos, foram tratadas com HQ (10 ou 100 µM, 2 horas) e posteriormente incubadas ou não com LPS de E. coli (LPS; 2 µg/mL). Neutrófilos obtidos da cavidade peritoneal de ratos Wistar, 4 horas após a injeção local de glicogênio de ostra (10 mL, 1%) , foram tratados com HQ (5 ou 10 µM, 1 hora) e, em seguida, foram incubados ou não com LPS (5 µg/mL). Células controles receberam volumes equivalentes dos veículos da HQ e do LPS. Os dados obtidos mostram que o tratamento com a HQ não induziu necrose ou apoptose em ambos os tipos celulares; reduziu a produção de NO pela célula endotelial e por neutrófilos, por bloqueio das atividades das óxido nítrico sintases; reduziu a expressão gênica e protéica de TNF-α, IL-6 e IL-1β induzida pelo LPS em neutrófilos, possivelmente decorrente de redução da translocação nuclear do NFκB; por outro lado aumentou a expressão gênica e protéica basal de TNF-α, IL-1β, ICAM-1, PECAM-1 e VCAM-1, bem como a translocação nuclear do NF-κB; reduziu a atividade fagocítica e microbicida de neutrófilos frente a Candida albicans; não afetou a expressão gênica da CYP2E1 em ambos os tipos celulares, mas aumentou a expressão gênica de MPO em neutrófilos. Em conjunto, os dados permitem concluir que a HQ atua diferentemente nos dois tipos de células estudadas, ativando e inibindo propriedades inflamatórias na célula endotelial e nos neutrófilos, respectivamente. É possível as ações sobre os neutrófilos possam contribuir, pelo menos em parte, pela redução da migração celular durante a resposta inflamatória observada após exposição in vivo à HQ. / Hydroquinone (HQ) is a fenolic compound obtained after benzene metabolism, it is a component of cigarette, medicines, photographic developer, and it is also finding in some foods and medicinal herbs. Our research group has been shown that rats in vivo exposed to HQ present impaired leukocyte migration into lung during allergic or non-specific inflammation. In the present study, we investigate the effects of HQ on functional activities of neutrophils and endothelial cells (EC) involved in inflammation. Primary cultured EC was obtained from microcirculatory network of male Wistar rats, and treated with HQ (10 or 100 µM, two hours). After the treatments, EC was incubated in presence or absence of lipopolissacharide of E. coli (LPS; 2 µg/mL). Peritoneal neutrophils obtained four hours after local injection of oyster glycogen (10 mL, 1%) were incubated with HQ (5 or 10 µM, one hour) and in sequence it was incubated in presence or absence of LPS (5 µg/mL) .Control cells were cultured with equivalent volumes of HQ and LPS vehicle. Results obtained showed that treatment with HQ did not induce apoptosis or necrosis in both types of cells; impaired NO production by endothelial cells and neutrophils dependent on blockade of Ca+2-dependent and independent NOS activity; decreased gene and protein expression of TNF-α, IL-6 and IL-1β in neutrophils induced by LPS, possibly due to reduced nuclear translocation of the NF-κB. On the other hand, HQ treatment enhanced basal protein and gene expression of TNF-α, IL-1β , ICAM-1, PECAM-1 and VCAM-1 and the nuclear translocation of NF-κB; impaired Candida albicans phagocytic and killing indexes; did not affect the gene expression of CYP2E1 in both types of cell, but increased the gene expression of MPO in neutrophils. Taken together, results obtained show that HQ acts differently in the two types of cells studied, activating and inhibiting inflammatory properties in endothelial cells and neutrophils, respectively. Actions on neutrophils may contribute, at least in part, on the reduced leukocyte recruitment during in vivo HQ exposure.