Resumo: Os prejuízos causados à pecuária brasileira pelo carrapato (Rhipicephalus (B.) microplus) são significativos e, uma das estratégias utilizadas para aumentar a produtividade dos rebanhos nas regiões tropicais tem sido a utilização de raças mais resistentes a esse ectoparasita. O objetivo desse projeto foi aplicar a tecnologia de microarray de DNA para a prospecção de genes relacionados com os mecanismos de resistência/tolerância ao carrapato, mediante a análise da expressão gênica diferencial em linfonodos de bovinos suscetíveis (Aberdeen Angus) e resistentes (Nelore) infestados artificialmente com este parasita. Os bezerros foram mantidos livres de carrapato desde o nascimento e foram infestados artificialmente com larvas de carrapato aos quatro meses de idade. As biópsias de linfonodo foram realizadas antes e após a infestação e mantidas a -80°C até o seu processamento. Essas amo stras foram submetidas a extração de RNA, síntese de cDNA e marcação . Depois elas foram submetidas a hibridização pela técnica de microarray. Foram identificados 341 genes diferencialmente expressos nos bovinos da Raça Angus e 254 para bovinos da Raça Nelore, os quais foram agrupados em categorias funcionais. Foram identificadas diferenças no padrão de expressão de genes de resposta imune entre as raças, tais como: Moléculas CD, Imunoglobulinas, Fator de Necrose tumoral, Integrinas e Interferon-γ. Para validação dos resultados de expressão diferencial foi empregada a técnica de PCR em tempo real, onde se verificou a expressão dos genes das citocinas IL-5 e IL12p40 nas duas Raças estudadas. / Abstract: Significant losses are brought by ticks (Rhipicephalus (B.) microplus) to Brazilian beef farming. One of the strategies to increase yield in tropical regions is the use of resistant breeds. This study was undertaken to apply the DNA microarray technology for the prospection of genes related to tick resistance/tolerance mechanisms, through differential gene expression analysis in lymphonodes of susceptible (Aberdeen Angus) and resistant (Nelore) breeds artificially infested with the parasite. Calves were kept tick-free since birth and infested with tick larvae when they reached four months of age. Lymphonode biopsies were performed before and after infestation and kept at -80°C until analyses. Samples were subjected to RNA extraction, cDNA synthesis and labelling. Hybridization was then performed through the microarray technique. In Angus, 341 differentially expressed genes were found against 254 in Nelore, which were grouped in functional categories. Different expression patterns were identified immune response genes between breeds, such as: CD molecules, Immunoglobulines, Tumor Necrosis Factor, Integrins and Interferon-γ. Real-time PCR was used to validate results, which showed the expression of cytokines IL-5 and IL12p40 in both breeds. / Orientador: Luiz Roberto Furlan / Coorientador: Márcia Cristina de Sena Oliveira / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Maribel Elizabeth Funes Huacca / Mestre

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008 - Andreia Loureiro Musso Terra.pdf: 563785 bytes, checksum: 76a3e7d6481a0e5c675edb61b485bfab (MD5) Previous issue date: 2008-08-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Rhipicephalus (Boophilus) microplus causes severe economic losses to the Brazilian cattle raising industry. In nowadays, the control of the cattle tick is especially based on the use of chemical acaricides. The inadequate use of these acaricides allows the development of tick s resistant strains and environmental contamination. Several entomopathogenic fungal species have been investigated to control arthropod populations and, therefore, minimize the damages caused by them. The current study investigates Nomuraea rileyi isolates (Nr 151 and Nr 177) to control the three developmental stages of R. (B.) microplus tick. The fungal isolates were cultivated on modified Sabouraud Maltose Agar with yeast extract (SMAY) at 25 ? 1 ?C and relative humidity (RH) higher or equal to 80% for 30 days. Conidia were harvested from the SMAY medium surface and suspended in sterile Tween 80 0.1% aqueous solution. The suspensions were adjusted to 108 conidia ml-1 using the hemacytometer, other conidial suspensions (107, 106 and 105 conidia ml-1) were obtained by serial dilution (1:10). The specimens were immersed in 1 ml of conidial suspension for three minutes, while control groups were immersed in Tween 80 0.1% aqueous solution (no conidia). Each treatment or control groups were composed of 10 repetitions. The effects of fungal isolates on engorged female ticks were investigated through the evaluation of the following parameters: pre-oviposition period, oviposition period, egg production, egg incubation and hatching period, and dead tick weight. These data were used to calculate the Nutrient Index and Egg Production Index. The effect of fungal isolates on egg and larva was evaluated by recording the hatchability daily, and mortality (at every 5-day intervals), respectively. In general, N. rileyi isolates did not cause significant alteration of engorged females parameters; however, the isolate Nr 177 at 108 conidia ml-1 significantly reduced larvae hatchability. The percentage of control of engorged females exposed to N. rileyi was 17.15 or 27.62% at 105 or 108 conidia ml-1, respectively. The percent hatchability of eggs exposed to N. rileyi isolates did not differ from control group. The best result with the isolate Nr 177 was observed on non-fed larvae, all conidial suspensions caused significant mortality rates. The isolate Nr 177 at 108 conidia ml-1 caused 14.5% and 69.5% larva mortality only at day 15 and day 20 after treatment, respectively. Other fungal suspensions caused significant larva mortality, but the results were not reasonable as the results observed with the fungal suspension with the highest conidia concentration. The isolate Nr 151 caused low non-fed larva mortality rates, 10% or 15%, at 107 or 108 conidial ml-1, respectively. These results demonstrate that the N. rileyi isolates investigated did not cause significant harmful effect to control R. (B.) microplus tick. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari:Ixodidae) ? respons?vel por grandes perdas econ?micas na pecu?ria brasileira e atualmente seu controle consiste basicamente no uso de acaricidas qu?micos. A sua utiliza??o inadequada tem favorecido o desenvolvimento de cepas resistentes e a contamina??o do meio ambiente. Diversos fungos entomopatog?nicos t?m sido estudados no intuito de minimizar os problemas ocasionados por esse artr?pode. O objetivo desse estudo foi testar in vitro os isolados Nr 151 e Nr 177 de Nomuraea rileyi sobre as diferentes fases de desenvolvimento do carrapato R. (B.) microplus. O fungo foi repicado em Sabouraud Maltose ?gar com extrato de levedura (SMAY) - modificado e mantido a 25 ? 1?C e umidade relativa ≥ 80% por 30 dias. Para o preparo das suspens?es, os con?dios da superf?cie da placa foram raspados, suspensos em solu??o de ?gua destilada est?ril e Tween 0,1% e quantificados em c?mara de Neubauer. Ap?s preparo da suspens?o 108 con?dios ml-1, as concentra??es 107, 106 e 105 con?dios ml-1 foram obtidas por dilui??o seriada. Cada tratamento foi constitu?do pela imers?o dos esp?cimes em 1 ml de suspens?o durante tr?s minutos enquanto o grupo controle foi exposto apenas ao diluente sem adi??o de con?dios. Cada grupo foi formado por 10 repeti??es. Para avalia??o do efeito dos isolados f?ngicos sobre as f?meas ingurgitadas, os seguintes par?metros biol?gicos foram observados: peso de postura, per?odos de pr?-postura, postura, incuba??o e eclos?o, al?m do peso da quen?gina, necess?rios para a realiza??o dos c?lculos do ?ndice nutricional e de produ??o de ovos. Os par?metros utilizados para avalia??o dos isolados sobre ovos e larvas foram: percentual di?rio de eclos?o das larvas e percentual de mortalidade (observado a cada cinco dias at? o 20? dia), respectivamente. Os isolados de N. rileyi n?o foram capazes de ocasionar altera??es significativas nos par?metros biol?gicos de f?meas ingurgitadas, exceto no percentual de eclos?o das larvas, quando a maior concentra??o de 108 con?dios ml-1 foi utilizada, e no percentual de controle onde se obteve 17,15% e de 27,62% nas concentra??es 105 e 108 con?dios ml-1, respectivamente. Os ovos tratados com as diferentes concentra??es dos isolados de N. rileyi n?o apresentou diferen?a significativa no percentual das larvas eclodidas. O melhor resultado obtido com o isolado Nr 177 foi sobre larvas n?o alimentadas, onde todas as concentra??es utilizadas demonstraram um percentual de mortalidade significativo. A concentra??o 108 con?dios ml-1 do isolado Nr 177 de Nomuraea rileyi foi capaz de promover um percentual de mortalidade das larvas de 14,5 e 69,5% somente no 15? e 20?dia ap?s o tratamento, respectivamente. As demais concentra??es apresentaram um percentual de mortalidade significativo, no entanto esses resultados n?o foram t?o satisfat?rios quanto aos obtidos com a maior concentra??o utilizada. O isolado Nr 151 de Nomuraea rileyi ocasionou baixo percentual de mortalidade das larvas n?o alimentadas, entre 10 e 15% quando as concenta??es 107 e 108 con?dios ml-1 foram utizadas. Dessa forma, esses resultados demonstram que os isolados de N. rileyi n?o apresentaram efeitos delet?rios significativos ao carrapato R. (B.) microplus.

O carrapato bovino Boophilus microplus está presente em áreas tropicais e subtropicais no mundo e é um ectoparasito hematófago que causa inúmeras perdas à bovinocultura, através da espoliação ao bovino ou das doenças que transmite como vetor. Atualmente, o principal método de controle empregado baseia-se em produtos químicos, que são onerosos e contaminam o ambiente. Estudos a respeito da ecologia, comportamento e fisiologia de B. microplus são importantes para o desenvolvimento de novos métodos de controle do carrapato. A resposta ao estresse oxidadivo e a morte celular programada, examinadas neste estudo, permitem compreender melhor os mecanismos fisiológicos usados pelo carrapato adulto e seus ovos e larvas para sobreviver no ambiente. A resposta a estresse oxidativo foi analisada em ovos e larvas. A atividade de GST e outras moléculas envolvidas em mecanismos de proteção contra estresse oxidativo variaram dependendo do tempo transcorrido após a postura e eclosão. A cinética do consumo de oxigênio apresentou correlação positiva com o aumento na atividade de GST durante a embriogênese. Um alto conteúdo de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico foi observado em extratos de ovos e larvas, indicando que carrapatos apresentam alto estresse oxidativo durante a embriogênese e desenvolvimento larval. Além disso, a atividade de GST apresentou forte correlação com peroxidação de lipídeos, uma indicação de seu papel na defesa antioxidante em ovos. Com o objetivo de melhor caracterizar o processo de morte celular, que elimina tecidos não mais necessários e leva à degeneração de glândulas salivares, ovários e singânglios, foi feita uma investigação usando ensaios de visualização de fragmentação de DNA em gel de agarose, teste cometa e TUNEL e a ativação da via apoptótica foi analisada usando ensaio de caspase. A fragmentação de DNA e a atividade enzimática de caspase-3 foram observadas em glândulas salivares e ovários 48 e 72 h após a remoção do carrapato do hospedeiro; em singânglios estes parâmetros foram mantidos em baixos níveis após 48 h. Estes resultados obtidos sugerem que há um controle refinado de manutenção de tecido através de apoptose. / The cattle tick Boophilus microplus is present in tropical and subtropical areas in the world and it is a haematophagous ectoparasite that causes several losses to cattle breeding, through the bovine exploiting and diseases transmitted. Currently, the main control method is based on chemicals, which are expensive and contaminate the environment. Studies about ecology, behavior and physiology of B. microplus are important to develop new methods for the tick control. The data examined in this study allow understanding the physiologic mechanisms used by the tick, eggs and larvae to survive in the environment. For this, the oxidative stress response in eggs and larvae and the cell death in different tissues of adult tick females during the pre-oviposition period were analyzed. The oxidative stress response was analyzed in eggs and larvae and the results showed that the GST activity and other molecules involved in mechanism of protection against oxidative stress varied depending on the time elapsed after oviposition and eclosion. A positive correlation was observed between the oxygen consumption kinetics and the increase in GST activity during embryogenesis. A high content of thiobarbituric acid reactive substances were observed in egg and larva extracts, indicating that ticks face high oxidative stress during embryogenesis and aging. In addition, GST activity presented strong positive correlation with lipid peroxidation, an indication that it plays a role in oxidant defences in eggs. In order to better characterize the cell death process that eliminates unnecessary tissues, the degeneration of salivary glands, ovaries and synganglia was investigated using DNA fragmentation in agarose gel, comet and TUNEL assays, and apoptosis activation pathway by the caspase assay. DNA fragmentation and enzymatic activity of caspase-3 were observed in salivary glands and ovaries at 48 and 72 h after tick removal from the host; in synganglia these parameters were maintained at low levels upon 48 h. These results obtained suggest that there is a refined control of tissue maintenance through apoptosis.

O carrapato bovino Boophilus microplus está presente em áreas tropicais e subtropicais no mundo e é um ectoparasito hematófago que causa inúmeras perdas à bovinocultura, através da espoliação ao bovino ou das doenças que transmite como vetor. Atualmente, o principal método de controle empregado baseia-se em produtos químicos, que são onerosos e contaminam o ambiente. Estudos a respeito da ecologia, comportamento e fisiologia de B. microplus são importantes para o desenvolvimento de novos métodos de controle do carrapato. A resposta ao estresse oxidadivo e a morte celular programada, examinadas neste estudo, permitem compreender melhor os mecanismos fisiológicos usados pelo carrapato adulto e seus ovos e larvas para sobreviver no ambiente. A resposta a estresse oxidativo foi analisada em ovos e larvas. A atividade de GST e outras moléculas envolvidas em mecanismos de proteção contra estresse oxidativo variaram dependendo do tempo transcorrido após a postura e eclosão. A cinética do consumo de oxigênio apresentou correlação positiva com o aumento na atividade de GST durante a embriogênese. Um alto conteúdo de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico foi observado em extratos de ovos e larvas, indicando que carrapatos apresentam alto estresse oxidativo durante a embriogênese e desenvolvimento larval. Além disso, a atividade de GST apresentou forte correlação com peroxidação de lipídeos, uma indicação de seu papel na defesa antioxidante em ovos. Com o objetivo de melhor caracterizar o processo de morte celular, que elimina tecidos não mais necessários e leva à degeneração de glândulas salivares, ovários e singânglios, foi feita uma investigação usando ensaios de visualização de fragmentação de DNA em gel de agarose, teste cometa e TUNEL e a ativação da via apoptótica foi analisada usando ensaio de caspase. A fragmentação de DNA e a atividade enzimática de caspase-3 foram observadas em glândulas salivares e ovários 48 e 72 h após a remoção do carrapato do hospedeiro; em singânglios estes parâmetros foram mantidos em baixos níveis após 48 h. Estes resultados obtidos sugerem que há um controle refinado de manutenção de tecido através de apoptose. / The cattle tick Boophilus microplus is present in tropical and subtropical areas in the world and it is a haematophagous ectoparasite that causes several losses to cattle breeding, through the bovine exploiting and diseases transmitted. Currently, the main control method is based on chemicals, which are expensive and contaminate the environment. Studies about ecology, behavior and physiology of B. microplus are important to develop new methods for the tick control. The data examined in this study allow understanding the physiologic mechanisms used by the tick, eggs and larvae to survive in the environment. For this, the oxidative stress response in eggs and larvae and the cell death in different tissues of adult tick females during the pre-oviposition period were analyzed. The oxidative stress response was analyzed in eggs and larvae and the results showed that the GST activity and other molecules involved in mechanism of protection against oxidative stress varied depending on the time elapsed after oviposition and eclosion. A positive correlation was observed between the oxygen consumption kinetics and the increase in GST activity during embryogenesis. A high content of thiobarbituric acid reactive substances were observed in egg and larva extracts, indicating that ticks face high oxidative stress during embryogenesis and aging. In addition, GST activity presented strong positive correlation with lipid peroxidation, an indication that it plays a role in oxidant defences in eggs. In order to better characterize the cell death process that eliminates unnecessary tissues, the degeneration of salivary glands, ovaries and synganglia was investigated using DNA fragmentation in agarose gel, comet and TUNEL assays, and apoptosis activation pathway by the caspase assay. DNA fragmentation and enzymatic activity of caspase-3 were observed in salivary glands and ovaries at 48 and 72 h after tick removal from the host; in synganglia these parameters were maintained at low levels upon 48 h. These results obtained suggest that there is a refined control of tissue maintenance through apoptosis.

O carrapato Riphicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, causando grandes prejuízos à pecuária. O principal método de controle baseia-se nos acaricidas. No entanto, o uso de vacinas tem sido estudado como um método de controle alternativo. A calreticulina (CRT) é uma proteína multifuncional presente em quase todas as células de animais. A secreção da CRT durante a alimentação pode estar relacionada a modulação da interação parasita hospedeiro. No presente estudo, as CRTs de R. microplus (rBmCRT) e do Haemophisalis longicornis (rHlCRT) foram expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia. As propriedades imunogênicas e antigênicas da BmCRT e HlCRT foram analisadas por diferentes métodos. In silico, foram comparandos os epítopos das CRTs pelo índice de Jamerson-Wolf, que mostrou 6 regiões com potenciais epítopos antigênicos diferentes entre as CRTs. Enquanto, a análise in silico, da rBmCRT e rHlCRT mostraram 6 regiões que podem interagir com a proteína C1q. In vitro, por Western blot, a rBmCRT, mas não a rHlCRT, foi reconhecida pelo soro de bovino infestado experimentalmente com R. microplus. Em Western blot de extrato de larvas, os soros do coelho imunizado com rBmCRT e bovinos imunizados com rBmCRT ou rHlCRT reconheceram a BmCRT, sugerindo que os anticorpos direcionados às proteínas recombinantes também reconhecem a proteína nativa BmCRT. Também a rBmCRT mostrou um efeito anticoagulante no teste de recalcificação plasmática. In vivo, a rBmCRT e rHlCRT induziram reações de hipersensibilidade cutânea imediata em bovinos imunizados com rBmCRT ou rHlCRT, mas não foi possível detectar alterações na análise histopatológica. Juntos, estes resultados sugerem, que a rBmCRT e rHlCRT são imunogênicas e pode ter funções imunomoduladoras sobre o sistema imune do hospedeiro, mas não suficiente para prevenir o desenvolvimento da imunidade humoral. / The tick Riphicephalus (Boophilus) microplus is a blood-sucking ectoparasite of bovines from tropical and subtropical regions, causing serious damages to the livestock production. The main method of control is based on the acaricides. However, the use of vaccines has been studied as a promising control method. The calretirulin (CRT) is a multifunctional protein present in almost all cells of animals. The secretion of CRT during feeding might be linked to the modulation of the parasite-host interaction. In the present study, recombinant CRTs of R. microplus (rBmCRT) and of Haemaphysalis longicornis (rHlCRT) were expressed in Escherichia coli and purified by ion exchange chromatography. The immunogenic and antigenic capacities of BmCRT e HlCRT were analyzed by different methods. In silico, were comparisons of the CRTs epitopes, identified by Jameson-Wolf antigenic index, indicates that there are three different regions between the tick CRTs. While, in silico analysis showed 6 regions in rBmCRT and in rHlCRT that could interact with C1q protein. In vitro, by Western blot, rBmCRT, but not rHlCRT, was recognized by the serum of bovine experimentally infested with R. microplus. In Western blot with extracts of larvae, the sera of a rabbit immunized with rBmCRT and bovines immunized with rBmCRT or rHlCRT recognized BmCRT; this suggests that antibodies directed to recombinant proteins also recognize native BmCRT. Also, the rBmCRT showed an anticoagulant effect in recalcification time. In vivo, the rBmCRT and rHlCRT induced reactions of immediate cutaneous hypersensitivity in bovines immunized with rBmCRT and rHlCRT, but it was not possible to detect alterations in histopathologic test. Together, these results suggest that the rBmCRT and rHlCRT are immunogenic and could have immunomodulatory functions on the immunity system of the host, but not enough to prevent the development of humoral immunity.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, e é um dos principais causadores de prejuízos econômicos à pecuária. O principal método de controle baseia-se no uso de acaricidas. No entanto, devido à crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do meio ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, métodos alternativos para o controle do R. microplus devem ser encontrados. Um dos métodos alternativos estudados é o uso de vacinas. As glutationa S-transferases (GST) são enzimas que estão presentes em organismos animais e vegetais e entre suas funções podem-se destacar transporte intracelular, participação em processos digestivos, síntese de prostaglandinas, e detoxificação de substâncias tóxicas e proteção contra estresse oxidativo. Neste estudo foi analisada a resposta imunológica comparativa de camundongos para a GST de R. microplus (GST-Bm) e para a GST de Haemaphysalis longicornis (GST-Hl). Ambas as proteínas foram expressas em Escherichia coli linhagem AD494, e purificadas por cromatografia de afinidade por glutationa utilizando a coluna GSTrap FF. Para verificar a imunogenicidade das proteínas, foram utilizados 25 camundongos Balb/c divididos em 12 grupos. As condições testadas foram as inoculações das proteínas GST-Bm e GST-Hl com os adjuvantes Montanide, saponina ou sem adjuvantes. Camundongos controle foram inoculados com extrato de E. coli ou somente com os adjuvantes. Foi coletado sangue de todos os animais com intervalos de sete dias durante 70 dias. Os soros foram analisados por ELISA para acompanhar a cinética da produção de anticorpos de todos os animais imunizados. Os camundongos inoculados com GST-Hl emulsificada com Montanide mostraram aumento dos níveis de anticorpos a partir do dia 21. O nível máximo de anticorpos foi detectado no dia 42, e diminuiu após o dia 56. Todos os outros animais não apresentaram aumento nos níveis de anticorpos. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick is a hematophagous ectoparasite that infests cattle in tropical and subtropical regions and is one of the principal causes of economic losses in the cattle farm. The principal method of control is the use of acaricides. However, due to increased worry about environmental chemical pollution, high costs and drugs toxicity and the selection of ticks resistant to acaricides, alternative methods for R. microplus control should be developed. One of these methods is vaccination. Glutathione S-transferases (GSTs) enzymes are present in animal and vegetal organisms and the functions are intracellular transport, participation in digestive process, synthesis of prostaglandins and detoxification of toxic substances and protection against oxidative stress. In this study the immunological response of mice inoculated with R. microplus GST (GST-Bm) and with Haemaphysalis longicornis GST (GST-Hl) was analysed. Both proteins were expressed in Escherichia coli strain AD494 and were purified by affinity chromatography using GSTrap FF columm. To verify the protein immunogenicity, 25 Balb/c mice divided into 12 groups were used. The tested conditions were inoculation of GST-Bm, GST-Hl proteins with Montanide and saponin adjuvants or without adjuvant. Control mice were inoculated with E. coli extract or the adjuvant alone. Blood from all animals were collected with intervals of seven days during seventy days, the sera were analyzed by ELISA to verify the kinetic of antibodies production of all immunized animals. Mice inoculated with GST-Hl emulsified with Montanide showed an increase in the antibodies levels from day 21. The maximum level of antibodies was detected on day 42 and decreased after day 56. The other animals did not show an increase in antibodies levels.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, e é um dos principais causadores de prejuízos econômicos à pecuária. O principal método de controle baseia-se no uso de acaricidas. No entanto, devido à crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do meio ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, métodos alternativos para o controle do R. microplus devem ser encontrados. Um dos métodos alternativos estudados é o uso de vacinas. As glutationa S-transferases (GST) são enzimas que estão presentes em organismos animais e vegetais e entre suas funções podem-se destacar transporte intracelular, participação em processos digestivos, síntese de prostaglandinas, e detoxificação de substâncias tóxicas e proteção contra estresse oxidativo. Neste estudo foi analisada a resposta imunológica comparativa de camundongos para a GST de R. microplus (GST-Bm) e para a GST de Haemaphysalis longicornis (GST-Hl). Ambas as proteínas foram expressas em Escherichia coli linhagem AD494, e purificadas por cromatografia de afinidade por glutationa utilizando a coluna GSTrap FF. Para verificar a imunogenicidade das proteínas, foram utilizados 25 camundongos Balb/c divididos em 12 grupos. As condições testadas foram as inoculações das proteínas GST-Bm e GST-Hl com os adjuvantes Montanide, saponina ou sem adjuvantes. Camundongos controle foram inoculados com extrato de E. coli ou somente com os adjuvantes. Foi coletado sangue de todos os animais com intervalos de sete dias durante 70 dias. Os soros foram analisados por ELISA para acompanhar a cinética da produção de anticorpos de todos os animais imunizados. Os camundongos inoculados com GST-Hl emulsificada com Montanide mostraram aumento dos níveis de anticorpos a partir do dia 21. O nível máximo de anticorpos foi detectado no dia 42, e diminuiu após o dia 56. Todos os outros animais não apresentaram aumento nos níveis de anticorpos. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick is a hematophagous ectoparasite that infests cattle in tropical and subtropical regions and is one of the principal causes of economic losses in the cattle farm. The principal method of control is the use of acaricides. However, due to increased worry about environmental chemical pollution, high costs and drugs toxicity and the selection of ticks resistant to acaricides, alternative methods for R. microplus control should be developed. One of these methods is vaccination. Glutathione S-transferases (GSTs) enzymes are present in animal and vegetal organisms and the functions are intracellular transport, participation in digestive process, synthesis of prostaglandins and detoxification of toxic substances and protection against oxidative stress. In this study the immunological response of mice inoculated with R. microplus GST (GST-Bm) and with Haemaphysalis longicornis GST (GST-Hl) was analysed. Both proteins were expressed in Escherichia coli strain AD494 and were purified by affinity chromatography using GSTrap FF columm. To verify the protein immunogenicity, 25 Balb/c mice divided into 12 groups were used. The tested conditions were inoculation of GST-Bm, GST-Hl proteins with Montanide and saponin adjuvants or without adjuvant. Control mice were inoculated with E. coli extract or the adjuvant alone. Blood from all animals were collected with intervals of seven days during seventy days, the sera were analyzed by ELISA to verify the kinetic of antibodies production of all immunized animals. Mice inoculated with GST-Hl emulsified with Montanide showed an increase in the antibodies levels from day 21. The maximum level of antibodies was detected on day 42 and decreased after day 56. The other animals did not show an increase in antibodies levels.

Ticks are implicated in serious economic losses to animal production worldwide in the order of billions of dollars. Although many antigens have been in vaccine tests, none has been effective in the control of ticks, which justifies the development of new antigens as well as new vaccine strategies. Phage Display techniques have been widely employed to map epitope structures, which have served as the basis for developing molecular vaccines. In the present study, we have applied this technique to map specific epitopes of Rhipichephalus (Boophilus) microplus and to validate the peptides as potential immunogens, we have adopted a process of selection prior to final field tests. This strategy was established in order to reduce the number of clones to be tested in the field. Six Phage -displayed random peptide libraries were selected with seven different strategies against the purified hyperimmune serum of chickens (IgY) that were immunized with total proteins of larvae and adults of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. The selected Phage clones were sequenced, translated and analyzed through bioinformatics. To evaluate the potential of these phagotopes as effective candidate vaccines, ELISA assays, dot-blot, mice immunization (MI), humoral immune response (HIR) of cattle against the clones and a cutaneous hypersensitivity tests in cattle were performed. The selected Phage clones were analyzed through bioinformatics, generating 107 different peptides in a total of 281 sequences. Some selected phagotopes showed excellent matches with linear sequences of known proteins of the Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Peptides that did not present significant matches with known proteins, but shared extensive homology among each other, were clustered and classified as conformational epitopes of Rhipicephalus (Boophilus) microplus, or considered as mimotopes of unknown proteic antigens. Among all clones tested by dot-blots, the 40 most reactive ones were further screened by HIR and MI. The mice sera raised against the Phage clones clearly recognized tick proteins indicating that the phagotope-induced immune responses were antigen-specific, but not all could be identified by the sera of naturally infested cattle (Bos taurus and Bos indicus). Four clones were then selected to go through the cutaneous hypersensitivity tests, and apparently all of them were effectives at diferent degrees. The stringent selection processes coupled with this schemes of validation assays allowed us to narrow down the number of peptides that should be tested in the field. One of the advantages of using whole recombinant M13 virus, carrying the recombinant peptide in fusion with the pIII protein of the virus, is that its capsid acts as adjuvant and could be tested directly without any further mixture. Additionally, we have finally used anergy skin tests (cutaneous hypersensitivity tests) once they are sometimes used to guide clinical decisions. We have assumed that cutaneous hypersensitivity tests measure a common property of cellular immune function relevant to the outcome, which together with the humoral response in naturally infested animals may provide us with sequences of peptides that may be relevant as vaccines. Finally, we have used those sequences to produce multiple antigen peptide system (MAPS), which will be used in future field tests. The present work demonstrates that the whole epitope profile can obtained through screening the Phage Displayed peptide libraries with the hyperimmune serum and reveals the potential of using epitopedisplaying Phage s as peptide vaccines against ticks. / Os carrapatos tem provocado significativas perdas econômicas na produção animal mundial na ordem de bilhões de dólares anuais. Embora vários antígenos específicos tenham sido empregados em testes vacinais, nenhum tem propiciado controle eficaz, sendo necessária a identificação de novos antígenos, bem como de novas estratégias vacinais. A tecnologia de Phage Display tem sido amplamente empregada no mapeamento de estruturas antigênicas as quais tem servido como base para o desenvolvimento de vacinas moleculares e representa uma alternativa as metodologias tradicionais. No presente trabalho, utilizou-se a tecnologia para o mapeamento de epítopos do Rhipicephalus (Boophilus) microplus e, para validar os peptídeos selecionados como potencial imunógenos, foi adotado um processo com múltiplas etapas de caracterização dos clones previamente aos ensaios clínicos. Esta estratégia foi estabelecida com o objetivo de reduzir o número de clones a ser testados em bovinos como imunógenos candidatos. Foram utilizadas para a seleção seis bibliotecas distintas de peptídeos randômicos expressados em bacteriófagos filamentosos e sete estratégias de seleção contra as imunoglobulinas (IgY) purificadas de soro hiperimune de galinhas imunizadas com proteínas totais de larvas e adultos de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. As seqüências do DNA correspondente aos insertos dos fagos selecionados foram seqüenciados, traduzidos e analisados por análises in silico. Foram realizados testes de ELISA, Dot-Blot, imunização em camundongos, determinação da resposta imune humoral de bovinos naturalmente infestados, e a medição da hipersensibilidade cutânea com o objetivo de evoluir o potencial destes fagotopos como candidatos efetivos a novos imunógenos. Foram gerados 107 peptídeos distintos em um total de 281 seqüências, sendo alguns destes similares às seqüências protéicas lineares do Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Os peptídeos sem similaridades significativas com proteínas conhecidas, mas que apresentaram seqüências consenso entre os peptídeos obtidos, foram agrupados e classificados como epítopos conformacionais ou considerados como mimetopos de antígenos protéicos desconhecidos do Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Entre os clones testados por Dot-Blot, os 40 mais reativos foram posteriormente testados em ensaios de imunização em camundongos e também submetidos ao reconhecimento humoral de bovinos naturalmente infestados com carrapatos. Adicionalmente, utilizou-se o teste cutâneo de hipersensibilidade para a análise da imunidade celular. Os soros de camundongos imunizados com os clones de fagos foram reativos as proteínas de carrapato indicando que os fagotopos foram capazes de gerar resposta imune antígeno específica, embora nem todos os fagos fossem reconhecidos pelo soro de animais naturalmente infestados (Bos taurus e Bos indicus). Após a caracterização e validação, quatro fagotopos foram escolhidos para a realização dos testes cutâneos, os quais apresentaram graus variados de reatividade. Uma das vantagens da utilização do vírus M13 recombinante, contendo o peptídeo recombinante fusionado na proteína PIII do vírus, é que o próprio capsídio atua como adjuvante e pode ser testado diretamente após a seleção sem procedimentos adicionais de preparo do antígeno. Finalmente, as seqüências determinadas foram utilizadas para a produção e expressão de um sistema recombinante de múltiplos antígenos peptídicos (MAPS). Foram escolhidos 10 peptideos para a expressão na forma de multi-epitopos, os quais serão futuramente utilizados em ensaios clínicos. O presente trabalho demonstrou que um perfil geral dos epítopos pode ser obtido através da utilização de bibliotecas de peptídeos randômicos expressados em bacteriófagos filamentosos contra anticorpos obtidos de soro hiperimune e revela o potencial da seleção e utilização peptídeos epítopos específicos como potenciais vacinas recombinantes multiantigênicas para o controle do carrapato bovino. / Doutor em Genética e Bioquímica

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-08-21Bitstream added on 2014-06-13T19:39:39Z : No. of bitstreams: 1 rodrigues_to_me_jabo.pdf: 708831 bytes, checksum: d0290b981ff3772231b28fddb042fed0 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Angus Bela Vista Pecuaria Ltda / Os prejuízos causados à pecuária brasileira pelo carrapato (Rhipicephalus (B.) microplus) são significativos e, uma das estratégias utilizadas para aumentar a produtividade dos rebanhos nas regiões tropicais tem sido a utilização de raças mais resistentes a esse ectoparasita. O objetivo desse projeto foi aplicar a tecnologia de microarray de DNA para a prospecção de genes relacionados com os mecanismos de resistência/tolerância ao carrapato, mediante a análise da expressão gênica diferencial em linfonodos de bovinos suscetíveis (Aberdeen Angus) e resistentes (Nelore) infestados artificialmente com este parasita. Os bezerros foram mantidos livres de carrapato desde o nascimento e foram infestados artificialmente com larvas de carrapato aos quatro meses de idade. As biópsias de linfonodo foram realizadas antes e após a infestação e mantidas a –80°C até o seu processamento. Essas amo stras foram submetidas a extração de RNA, síntese de cDNA e marcação . Depois elas foram submetidas a hibridização pela técnica de microarray. Foram identificados 341 genes diferencialmente expressos nos bovinos da Raça Angus e 254 para bovinos da Raça Nelore, os quais foram agrupados em categorias funcionais. Foram identificadas diferenças no padrão de expressão de genes de resposta imune entre as raças, tais como: Moléculas CD, Imunoglobulinas, Fator de Necrose tumoral, Integrinas e Interferon-γ. Para validação dos resultados de expressão diferencial foi empregada a técnica de PCR em tempo real, onde se verificou a expressão dos genes das citocinas IL-5 e IL12p40 nas duas Raças estudadas. / Significant losses are brought by ticks (Rhipicephalus (B.) microplus) to Brazilian beef farming. One of the strategies to increase yield in tropical regions is the use of resistant breeds. This study was undertaken to apply the DNA microarray technology for the prospection of genes related to tick resistance/tolerance mechanisms, through differential gene expression analysis in lymphonodes of susceptible (Aberdeen Angus) and resistant (Nelore) breeds artificially infested with the parasite. Calves were kept tick-free since birth and infested with tick larvae when they reached four months of age. Lymphonode biopsies were performed before and after infestation and kept at -80°C until analyses. Samples were subjected to RNA extraction, cDNA synthesis and labelling. Hybridization was then performed through the microarray technique. In Angus, 341 differentially expressed genes were found against 254 in Nelore, which were grouped in functional categories. Different expression patterns were identified immune response genes between breeds, such as: CD molecules, Immunoglobulines, Tumor Necrosis Factor, Integrins and Interferon-γ. Real-time PCR was used to validate results, which showed the expression of cytokines IL-5 and IL12p40 in both breeds.

O carrapato Riphicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, causando grandes prejuízos à pecuária. O principal método de controle baseia-se nos acaricidas. No entanto, o uso de vacinas tem sido estudado como um método de controle alternativo. A calreticulina (CRT) é uma proteína multifuncional presente em quase todas as células de animais. A secreção da CRT durante a alimentação pode estar relacionada a modulação da interação parasita hospedeiro. No presente estudo, as CRTs de R. microplus (rBmCRT) e do Haemophisalis longicornis (rHlCRT) foram expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia. As propriedades imunogênicas e antigênicas da BmCRT e HlCRT foram analisadas por diferentes métodos. In silico, foram comparandos os epítopos das CRTs pelo índice de Jamerson-Wolf, que mostrou 6 regiões com potenciais epítopos antigênicos diferentes entre as CRTs. Enquanto, a análise in silico, da rBmCRT e rHlCRT mostraram 6 regiões que podem interagir com a proteína C1q. In vitro, por Western blot, a rBmCRT, mas não a rHlCRT, foi reconhecida pelo soro de bovino infestado experimentalmente com R. microplus. Em Western blot de extrato de larvas, os soros do coelho imunizado com rBmCRT e bovinos imunizados com rBmCRT ou rHlCRT reconheceram a BmCRT, sugerindo que os anticorpos direcionados às proteínas recombinantes também reconhecem a proteína nativa BmCRT. Também a rBmCRT mostrou um efeito anticoagulante no teste de recalcificação plasmática. In vivo, a rBmCRT e rHlCRT induziram reações de hipersensibilidade cutânea imediata em bovinos imunizados com rBmCRT ou rHlCRT, mas não foi possível detectar alterações na análise histopatológica. Juntos, estes resultados sugerem, que a rBmCRT e rHlCRT são imunogênicas e pode ter funções imunomoduladoras sobre o sistema imune do hospedeiro, mas não suficiente para prevenir o desenvolvimento da imunidade humoral. / The tick Riphicephalus (Boophilus) microplus is a blood-sucking ectoparasite of bovines from tropical and subtropical regions, causing serious damages to the livestock production. The main method of control is based on the acaricides. However, the use of vaccines has been studied as a promising control method. The calretirulin (CRT) is a multifunctional protein present in almost all cells of animals. The secretion of CRT during feeding might be linked to the modulation of the parasite-host interaction. In the present study, recombinant CRTs of R. microplus (rBmCRT) and of Haemaphysalis longicornis (rHlCRT) were expressed in Escherichia coli and purified by ion exchange chromatography. The immunogenic and antigenic capacities of BmCRT e HlCRT were analyzed by different methods. In silico, were comparisons of the CRTs epitopes, identified by Jameson-Wolf antigenic index, indicates that there are three different regions between the tick CRTs. While, in silico analysis showed 6 regions in rBmCRT and in rHlCRT that could interact with C1q protein. In vitro, by Western blot, rBmCRT, but not rHlCRT, was recognized by the serum of bovine experimentally infested with R. microplus. In Western blot with extracts of larvae, the sera of a rabbit immunized with rBmCRT and bovines immunized with rBmCRT or rHlCRT recognized BmCRT; this suggests that antibodies directed to recombinant proteins also recognize native BmCRT. Also, the rBmCRT showed an anticoagulant effect in recalcification time. In vivo, the rBmCRT and rHlCRT induced reactions of immediate cutaneous hypersensitivity in bovines immunized with rBmCRT and rHlCRT, but it was not possible to detect alterations in histopathologic test. Together, these results suggest that the rBmCRT and rHlCRT are immunogenic and could have immunomodulatory functions on the immunity system of the host, but not enough to prevent the development of humoral immunity.