Thesis (Ph. D.)--University of Queensland, 2002. / Includes bibliographical references.

Myokinins are invertebrate neuropeptides with myotropic and diuretic activity. The lymnokinin receptor from the snail Lymnaea stagnalis was the only previously identified myokinin receptor. A cDNA encoding a neuropeptide receptor was cloned from the southern cattle tick, Boophilus microplus. The deduced amino acid sequence was 40 % identical to the lymnokinin receptor. The receptor transcript is present in all tick life stages as determined by semiquantitative RT-PCR. When expressed in mammalian CHO-K1 cells, myokinins at nanomolar concentrations induced increases in intracellular calcium as measured by fluorescent cytometry. The rank order of potency for peptides tested was FFFSWS-NH2≥FFFSWG-NH2≥FFSWG-NH2>FYSWG-NH2>muscakinin>lymnokinin>>APTGFFGVR-NH2. The receptor coupled to a pertussis toxin insensitive G protein. Absence of extracellular calcium did not inhibit the calcium response, indicating the release of Ca2+ from intracellular stores. Receptor transcript was detected by RT-PCR in the dissected synganglia, ovaries, salivary glands, guts and Malpighian tubules of partially engorged adult female ticks. It is concluded that the B. microplus receptor is the first myokinin receptor cloned from an arthropod, and the first neuropeptide receptor known from the Acari. The presence of this receptor transcript in multiple tissues and all life stages suggests a multifunctional role in ticks.

O carrapato bovino, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, é um artrópode hematófago, responsável por importantes perdas na pecuária. Durante o desenvolvimento do embrionário do carrapato a cisteíno endopeptidase degradadora de vitelina (VTDCE) participa do processo de hidrólise de vitelina (Vt), a principal fonte de energia e aminoácidos durante esse período. Devido à sua importância na fisiologia do parasita, a VTDCE é um alvo potencial para o desenvolvimento de vacinas anti-carrapatos. Estudos anteriores demonstraram que a VTDCE nativa, purificada de ovos confere proteção contra R. microplus, desencadeada pela resposta imune dos bovinos após a administração deste antígeno. Entretanto, o extenso e dispendioso processo de purificação desta proteína, acrescido do baixo rendimento e fonte escassa de material (ovos de carrapato) inviabiliza a utilização da proteína nativa para fins comerciais. Tais dificuldades podem ser ultrapassadas por meio do uso de uma proteína recombinante. O presente trabalho tem por objetivo a expressão, purificação e caracterização da VTDCE recombinante (rVTDCE). Parte da sequência de aminoácidos da VTDCE nativa foi obtida por sequenciamento de edman e pela análise por especrometria de massas de petídeos obtidos pelo tratamento da proteína com tripsina e. As sequências obtidas assim obtidas foram utilizadas para buscar a sequência da ORF da VTDCE em um banco de cDNA. Por meio de PCR, a ORF da enzima foi clonada em vetor de clonagem e posteriormente de expressão. A rVTDCE expressa em Escherichia coli foi purificada por cromatografia de afinidade e utilizada para determinar algumas de suas propriedades, como atividade enzimática e antimicrobiana. A atividade enzimática foi avaliada através de ensaios fluorimétricos, onde a rVTDCE mostrou características similares à VTDCE nativa. Ensaios antimicrobianos foram realizados para avaliar a possível atividade sugerida após análise da sequencia da ORF da VTDCE. A análise molecular mostrou que a sequência da VTDCE apresenta semelhança com peptídeos antimicrobianos, fato comprovado através de ensaios antimicrobianos. Efetivamente, a VTDCE apresentou atividade antimicrobiana tanto na sua forma nativa como na forma desnaturada desprovida de atividade peptidásica, demonstrando que ambas as atividades são independentes. Foram feitos também ensaios imunológicos, onde anticorpos policlonais anti-rVTDCE foram produzidos em coelhos e bovinos. Por Western blot foi observado que os anticorpos policlonais produzidos contra VTDCE recombinante reconheceram a VTDCE nativa, e o inverso também, indicando que a forma recombinante pode ser utilizada para experimentos de vacinação. / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous arthropod, responsible for significant losses in livestock. During the tick embryo the vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE) participates in the vitellin (Vt) hydrolysis, the main energy source and amino acids during this period. Due to the importance of this enzyme in parasite physiology the VTDCE is a potential target for development of anti-tick vaccine. In previous studies, the immunization with native VTDCE, purified from tick egg, conferred protection against R. microplus. However, the extensive and expensive purification process, plus the low achievement precludes the use of the native protein for commercial purposes. This difficulty can be overcome by the expression of a recombinant protein in heterologous organism. This work aims the expression, purification and characterization of recombinant VTDCE (rVTDCE). Part of the native VTDCE amino acid sequence was determined by Edman sequencing. Native protein was also trypsinized and peptides sequenced by mass spectrometry. The sequences obtained from mass spectrometry and Edman sequencing were used to search the ORF sequence of VTDCE in a tick cDNA library. Through PCR enzyme ORF was cloned into a cloning vector and further into an expression vector. The rVTDCE expressed in Escherichia coli was purified by affinity chromatography and used to determine some of its properties such as antimicrobial and enzyme activity. The enzymatic activity was measured using fluorimetric assays, where rVTDCE had similar characteristics to VTDCE. Antimicrobial assays were performed to evaluate the possible activity suggested after sequence analysis. Molecular analysis showed that the sequence of VTDCE shows similarity with antimicrobial peptides, which was proven through antimicrobial assays. Effectively, the VTDCE presented antimicrobial activity even when the protein didn’t present enzymatic activity, demonstrating that both activities are independent. Immunological assays were also performed. Polyclonal anti-rVTDCE serum were produced in rabbits and cattle. Western blot showed that the polyclonal antibodies raised against recombinant VTDCE recognized the native form, indicating that the recombinant form may be used for vaccination experiments.

A caracterização molecular e morfofisiológica de 28 isolados de Metarhizium ssp. foi avaliada por análises de seqüências do espaçador transcrito interno (ITS1 e ITS2), presença de elementos dsRNA e taxa de crescimento e esporulação em diferentes temperaturas e pH. A patogenicidade de 19 isolados do fungo entomopatogênico Metarhizium ssp. foi avaliada para fêmeas ingurgitadas do carrapato Boophilus microplus. As alterações cronológicas durante o processo de infecção Metarhizium anisopliae isolado E6 em B. microplus foi avaliada em detalhe por microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão. O seqüenciamento do espaçador transcrito interno confirmou a identidade taxonômica dos isolados avaliados como M. anisopliae var. anisopliae ou M. anisopliae var. majus e mostrou que dois isolados (CG291 e CG423), previamente classificados como Metarhizium flavoviride, são pertencentes a M. anisopliae var. anisopliae. Os testes sobre a influência da temperatura e pH no desenvolvimento e esporulação dos isolados evidenciaram que a melhor temperatura de crescimento para a maioria desses foi 28oC e que o crescimento foi ótimo na faixa de pH entre 4 a 9. Os bioensaios mostraram que três isolados (C14, CG47 e CG97) foram altamente patogênicos para fêmeas ingurgitadas de B. microplus sendo tão virulentos quanto o isolado E6, previamente analisado, causando cerca de 90-100% de mortalidade ao 4o dia de infecção. Outros isolados foram menos virulentos ou não mostraram virulência para o carrapato. A presença de dsRNA foi avaliada em 28 isolados e detectada em 21 isolados. Vários padrões de dsRNA foram observados baseados no tamanho molecular analisado por eletroforese em gel de agarose. Nenhuma correlação foi observada entre a presença de dsRNA e a virulência do fungo. As observações microscópicas evidenciaram que o fungo M. anisopliae isolado E6 invade seu hospedeiro por penetração direta da cutícula, sendo que este processo envolveu as etapas de adesão e germinação dos conídios, formação do apressório e penetração do fungo na cutícula do hospedeiro. A adesão e germinação dos conídios na superfície da cutícula se iniciou após 24 h de infecção. Neste mesmo tempo, ocorreu diferenciação do apressório, estrutura que exerce a pressão mecânica durante o processo de penetração, sendo que este processo é facilitado pela ação de enzimas hidrolíticas secretadas pelo fungo. A penetração de algumas hifas ocorreu até 24 h após a infecção do fungo, embora, neste mesmo tempo de infecção, a maioria dos conídios ainda estivesse em processo de germinação. A penetração em massa do fungo foi observada 72 h após a infecção e, após 96 h, as hifas emergiram na superfície da cutícula para originarem novos conídios e assegurarem a perpetuação do fungo. A intensa invasão das hifas nos tecidos adjacentes confirmou a eficácia do isolado E6 na infecção do carrapato B. microplus.

O carrapato bovino, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, é um artrópode hematófago, responsável por importantes perdas na pecuária. Durante o desenvolvimento do embrionário do carrapato a cisteíno endopeptidase degradadora de vitelina (VTDCE) participa do processo de hidrólise de vitelina (Vt), a principal fonte de energia e aminoácidos durante esse período. Devido à sua importância na fisiologia do parasita, a VTDCE é um alvo potencial para o desenvolvimento de vacinas anti-carrapatos. Estudos anteriores demonstraram que a VTDCE nativa, purificada de ovos confere proteção contra R. microplus, desencadeada pela resposta imune dos bovinos após a administração deste antígeno. Entretanto, o extenso e dispendioso processo de purificação desta proteína, acrescido do baixo rendimento e fonte escassa de material (ovos de carrapato) inviabiliza a utilização da proteína nativa para fins comerciais. Tais dificuldades podem ser ultrapassadas por meio do uso de uma proteína recombinante. O presente trabalho tem por objetivo a expressão, purificação e caracterização da VTDCE recombinante (rVTDCE). Parte da sequência de aminoácidos da VTDCE nativa foi obtida por sequenciamento de edman e pela análise por especrometria de massas de petídeos obtidos pelo tratamento da proteína com tripsina e. As sequências obtidas assim obtidas foram utilizadas para buscar a sequência da ORF da VTDCE em um banco de cDNA. Por meio de PCR, a ORF da enzima foi clonada em vetor de clonagem e posteriormente de expressão. A rVTDCE expressa em Escherichia coli foi purificada por cromatografia de afinidade e utilizada para determinar algumas de suas propriedades, como atividade enzimática e antimicrobiana. A atividade enzimática foi avaliada através de ensaios fluorimétricos, onde a rVTDCE mostrou características similares à VTDCE nativa. Ensaios antimicrobianos foram realizados para avaliar a possível atividade sugerida após análise da sequencia da ORF da VTDCE. A análise molecular mostrou que a sequência da VTDCE apresenta semelhança com peptídeos antimicrobianos, fato comprovado através de ensaios antimicrobianos. Efetivamente, a VTDCE apresentou atividade antimicrobiana tanto na sua forma nativa como na forma desnaturada desprovida de atividade peptidásica, demonstrando que ambas as atividades são independentes. Foram feitos também ensaios imunológicos, onde anticorpos policlonais anti-rVTDCE foram produzidos em coelhos e bovinos. Por Western blot foi observado que os anticorpos policlonais produzidos contra VTDCE recombinante reconheceram a VTDCE nativa, e o inverso também, indicando que a forma recombinante pode ser utilizada para experimentos de vacinação. / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous arthropod, responsible for significant losses in livestock. During the tick embryo the vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE) participates in the vitellin (Vt) hydrolysis, the main energy source and amino acids during this period. Due to the importance of this enzyme in parasite physiology the VTDCE is a potential target for development of anti-tick vaccine. In previous studies, the immunization with native VTDCE, purified from tick egg, conferred protection against R. microplus. However, the extensive and expensive purification process, plus the low achievement precludes the use of the native protein for commercial purposes. This difficulty can be overcome by the expression of a recombinant protein in heterologous organism. This work aims the expression, purification and characterization of recombinant VTDCE (rVTDCE). Part of the native VTDCE amino acid sequence was determined by Edman sequencing. Native protein was also trypsinized and peptides sequenced by mass spectrometry. The sequences obtained from mass spectrometry and Edman sequencing were used to search the ORF sequence of VTDCE in a tick cDNA library. Through PCR enzyme ORF was cloned into a cloning vector and further into an expression vector. The rVTDCE expressed in Escherichia coli was purified by affinity chromatography and used to determine some of its properties such as antimicrobial and enzyme activity. The enzymatic activity was measured using fluorimetric assays, where rVTDCE had similar characteristics to VTDCE. Antimicrobial assays were performed to evaluate the possible activity suggested after sequence analysis. Molecular analysis showed that the sequence of VTDCE shows similarity with antimicrobial peptides, which was proven through antimicrobial assays. Effectively, the VTDCE presented antimicrobial activity even when the protein didn’t present enzymatic activity, demonstrating that both activities are independent. Immunological assays were also performed. Polyclonal anti-rVTDCE serum were produced in rabbits and cattle. Western blot showed that the polyclonal antibodies raised against recombinant VTDCE recognized the native form, indicating that the recombinant form may be used for vaccination experiments.

A caracterização molecular e morfofisiológica de 28 isolados de Metarhizium ssp. foi avaliada por análises de seqüências do espaçador transcrito interno (ITS1 e ITS2), presença de elementos dsRNA e taxa de crescimento e esporulação em diferentes temperaturas e pH. A patogenicidade de 19 isolados do fungo entomopatogênico Metarhizium ssp. foi avaliada para fêmeas ingurgitadas do carrapato Boophilus microplus. As alterações cronológicas durante o processo de infecção Metarhizium anisopliae isolado E6 em B. microplus foi avaliada em detalhe por microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão. O seqüenciamento do espaçador transcrito interno confirmou a identidade taxonômica dos isolados avaliados como M. anisopliae var. anisopliae ou M. anisopliae var. majus e mostrou que dois isolados (CG291 e CG423), previamente classificados como Metarhizium flavoviride, são pertencentes a M. anisopliae var. anisopliae. Os testes sobre a influência da temperatura e pH no desenvolvimento e esporulação dos isolados evidenciaram que a melhor temperatura de crescimento para a maioria desses foi 28oC e que o crescimento foi ótimo na faixa de pH entre 4 a 9. Os bioensaios mostraram que três isolados (C14, CG47 e CG97) foram altamente patogênicos para fêmeas ingurgitadas de B. microplus sendo tão virulentos quanto o isolado E6, previamente analisado, causando cerca de 90-100% de mortalidade ao 4o dia de infecção. Outros isolados foram menos virulentos ou não mostraram virulência para o carrapato. A presença de dsRNA foi avaliada em 28 isolados e detectada em 21 isolados. Vários padrões de dsRNA foram observados baseados no tamanho molecular analisado por eletroforese em gel de agarose. Nenhuma correlação foi observada entre a presença de dsRNA e a virulência do fungo. As observações microscópicas evidenciaram que o fungo M. anisopliae isolado E6 invade seu hospedeiro por penetração direta da cutícula, sendo que este processo envolveu as etapas de adesão e germinação dos conídios, formação do apressório e penetração do fungo na cutícula do hospedeiro. A adesão e germinação dos conídios na superfície da cutícula se iniciou após 24 h de infecção. Neste mesmo tempo, ocorreu diferenciação do apressório, estrutura que exerce a pressão mecânica durante o processo de penetração, sendo que este processo é facilitado pela ação de enzimas hidrolíticas secretadas pelo fungo. A penetração de algumas hifas ocorreu até 24 h após a infecção do fungo, embora, neste mesmo tempo de infecção, a maioria dos conídios ainda estivesse em processo de germinação. A penetração em massa do fungo foi observada 72 h após a infecção e, após 96 h, as hifas emergiram na superfície da cutícula para originarem novos conídios e assegurarem a perpetuação do fungo. A intensa invasão das hifas nos tecidos adjacentes confirmou a eficácia do isolado E6 na infecção do carrapato B. microplus.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 424006 bytes, checksum: e70b787e481758ae2e9bc9b63c6cb946 (MD5) Previous issue date: 2006-12-14 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / It was evaluated the immunology response given by the SBbo23290 and SBm7462 synthetic peptides to the control of Babesia bovis and Riphicephalus (Boophilus) microplus, inoculated by subcutaneous route, individually and simultaneously (Group I) and in a cocktail of both peptides (Group II). Each inoculation was done with intervals of 30 days. In the 30th and 34th days after the 3th inoculation, it was applied in each animal, 4000 larvaes of R. (B.) microplus, free of blood parasites and also, it was inoculated a sample of Babesia bovis UFV1 9th passage with a concentration of 1x106 babesias/mL, respectively. According to the results, the animals inoculated with the Group II obtained greater clinic response after challenging with both parasites. Besides, these animals showed high levels of total IgG specific to the SBbo23290, beginning one week after 1st inoculation, with titles of 1,06 ± 0,2486. The titles with high affinity of total IgG to SBm7462 was presented from the 8th week, with levels of 1,75 ± 0,1849 and 1,13 ± 0,2819 to Groups I and II, respectively. Both Group showed high levels of IgG1 over IgG2 isotopes with high affinity to SBbo23290. The Group I showed titles of total IgG and IgG1 with high affinity to SBm7462 and low efficiency (EF) to control the ticks, different of the obtained in the Group II, where it was found high titles of total IgG, low levels of IgG1 and EF of 46,80 %. These results suggest that, intraclonal competition was present after presentation by APCs (DC or WC1.1+) to CD4+ and lymphocytes B in the germinal centers, with major affinity by specific clones to SBbo23290 over SBm7462. It is possible that these changes were determined by antigen solubility. / Avaliou-se a resposta imunológica conferida pelos peptídeos SBbo23290 e SBm7462 para o controle de Babesia bovis e Riphicephalus (Boophilus) microplus, ao serem aplicados simultaneamente na apresentação individual (Group I) e em associação (Group II). Foram realizadas três aplicações em cada grupo, via subcutânea, com intervalos de 30 dias. O desafio foi feito 30º e 34º dias após a 3ª inoculação, colocando-se 4000 larvas de R. (B.) microplus, cepa livre de hemoparasitas, e inoculando-se a cepa de B. bovis UFV1 9ª passagem numa concentração de 1x106 parasitas/mL, respectivamente. De acordo com os resultados obtidos, os animais do Grupo II, apresentaram uma melhor resposta clínica frente ao desafio, acompanhado de altos níveis de IgG total específicos para o peptídeo SBbo23290, a partir da 1ª semana após a inoculação, com títulos de 1,06 ± 0,2486. Os títulos de IgG total específicos para SBm7462 estiveram presentes a partir da 8ª semana com níveis de 1,75 ± 0,1849 e 1,13 ± 0,2819 para Grupo I e II, respectivamente. Ambos os tratamentos apresentaram maiores níveis de isotipos IgG1 sobre IgG2 específicos para SBbo23290. O Grupo I, apresentou títulos de IgG total e IgG1 específicos para SBm7462 e baixa eficácia (EF) no controle dos carrapatos, diferente do obtido no Grupo II, onde encontrou-se altos títulos de IgG total, níveis baixos do IgG1 e uma EF de 46,80 %. Sugere-se que estes resultados foram determinados por competição intraclonal em populações após a apresentação por APCs (DC ou WC1.1+) a CD4+ e linfócitos B nos centros germinais, com maior afinidade por clones específicos para SBbo23290 sobre SBm7462, talvez determinado por solubilidade antigênica.

A caracterização molecular e morfofisiológica de 28 isolados de Metarhizium ssp. foi avaliada por análises de seqüências do espaçador transcrito interno (ITS1 e ITS2), presença de elementos dsRNA e taxa de crescimento e esporulação em diferentes temperaturas e pH. A patogenicidade de 19 isolados do fungo entomopatogênico Metarhizium ssp. foi avaliada para fêmeas ingurgitadas do carrapato Boophilus microplus. As alterações cronológicas durante o processo de infecção Metarhizium anisopliae isolado E6 em B. microplus foi avaliada em detalhe por microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão. O seqüenciamento do espaçador transcrito interno confirmou a identidade taxonômica dos isolados avaliados como M. anisopliae var. anisopliae ou M. anisopliae var. majus e mostrou que dois isolados (CG291 e CG423), previamente classificados como Metarhizium flavoviride, são pertencentes a M. anisopliae var. anisopliae. Os testes sobre a influência da temperatura e pH no desenvolvimento e esporulação dos isolados evidenciaram que a melhor temperatura de crescimento para a maioria desses foi 28oC e que o crescimento foi ótimo na faixa de pH entre 4 a 9. Os bioensaios mostraram que três isolados (C14, CG47 e CG97) foram altamente patogênicos para fêmeas ingurgitadas de B. microplus sendo tão virulentos quanto o isolado E6, previamente analisado, causando cerca de 90-100% de mortalidade ao 4o dia de infecção. Outros isolados foram menos virulentos ou não mostraram virulência para o carrapato. A presença de dsRNA foi avaliada em 28 isolados e detectada em 21 isolados. Vários padrões de dsRNA foram observados baseados no tamanho molecular analisado por eletroforese em gel de agarose. Nenhuma correlação foi observada entre a presença de dsRNA e a virulência do fungo. As observações microscópicas evidenciaram que o fungo M. anisopliae isolado E6 invade seu hospedeiro por penetração direta da cutícula, sendo que este processo envolveu as etapas de adesão e germinação dos conídios, formação do apressório e penetração do fungo na cutícula do hospedeiro. A adesão e germinação dos conídios na superfície da cutícula se iniciou após 24 h de infecção. Neste mesmo tempo, ocorreu diferenciação do apressório, estrutura que exerce a pressão mecânica durante o processo de penetração, sendo que este processo é facilitado pela ação de enzimas hidrolíticas secretadas pelo fungo. A penetração de algumas hifas ocorreu até 24 h após a infecção do fungo, embora, neste mesmo tempo de infecção, a maioria dos conídios ainda estivesse em processo de germinação. A penetração em massa do fungo foi observada 72 h após a infecção e, após 96 h, as hifas emergiram na superfície da cutícula para originarem novos conídios e assegurarem a perpetuação do fungo. A intensa invasão das hifas nos tecidos adjacentes confirmou a eficácia do isolado E6 na infecção do carrapato B. microplus.

O carrapato bovino, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, é um artrópode hematófago, responsável por importantes perdas na pecuária. Durante o desenvolvimento do embrionário do carrapato a cisteíno endopeptidase degradadora de vitelina (VTDCE) participa do processo de hidrólise de vitelina (Vt), a principal fonte de energia e aminoácidos durante esse período. Devido à sua importância na fisiologia do parasita, a VTDCE é um alvo potencial para o desenvolvimento de vacinas anti-carrapatos. Estudos anteriores demonstraram que a VTDCE nativa, purificada de ovos confere proteção contra R. microplus, desencadeada pela resposta imune dos bovinos após a administração deste antígeno. Entretanto, o extenso e dispendioso processo de purificação desta proteína, acrescido do baixo rendimento e fonte escassa de material (ovos de carrapato) inviabiliza a utilização da proteína nativa para fins comerciais. Tais dificuldades podem ser ultrapassadas por meio do uso de uma proteína recombinante. O presente trabalho tem por objetivo a expressão, purificação e caracterização da VTDCE recombinante (rVTDCE). Parte da sequência de aminoácidos da VTDCE nativa foi obtida por sequenciamento de edman e pela análise por especrometria de massas de petídeos obtidos pelo tratamento da proteína com tripsina e. As sequências obtidas assim obtidas foram utilizadas para buscar a sequência da ORF da VTDCE em um banco de cDNA. Por meio de PCR, a ORF da enzima foi clonada em vetor de clonagem e posteriormente de expressão. A rVTDCE expressa em Escherichia coli foi purificada por cromatografia de afinidade e utilizada para determinar algumas de suas propriedades, como atividade enzimática e antimicrobiana. A atividade enzimática foi avaliada através de ensaios fluorimétricos, onde a rVTDCE mostrou características similares à VTDCE nativa. Ensaios antimicrobianos foram realizados para avaliar a possível atividade sugerida após análise da sequencia da ORF da VTDCE. A análise molecular mostrou que a sequência da VTDCE apresenta semelhança com peptídeos antimicrobianos, fato comprovado através de ensaios antimicrobianos. Efetivamente, a VTDCE apresentou atividade antimicrobiana tanto na sua forma nativa como na forma desnaturada desprovida de atividade peptidásica, demonstrando que ambas as atividades são independentes. Foram feitos também ensaios imunológicos, onde anticorpos policlonais anti-rVTDCE foram produzidos em coelhos e bovinos. Por Western blot foi observado que os anticorpos policlonais produzidos contra VTDCE recombinante reconheceram a VTDCE nativa, e o inverso também, indicando que a forma recombinante pode ser utilizada para experimentos de vacinação. / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous arthropod, responsible for significant losses in livestock. During the tick embryo the vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE) participates in the vitellin (Vt) hydrolysis, the main energy source and amino acids during this period. Due to the importance of this enzyme in parasite physiology the VTDCE is a potential target for development of anti-tick vaccine. In previous studies, the immunization with native VTDCE, purified from tick egg, conferred protection against R. microplus. However, the extensive and expensive purification process, plus the low achievement precludes the use of the native protein for commercial purposes. This difficulty can be overcome by the expression of a recombinant protein in heterologous organism. This work aims the expression, purification and characterization of recombinant VTDCE (rVTDCE). Part of the native VTDCE amino acid sequence was determined by Edman sequencing. Native protein was also trypsinized and peptides sequenced by mass spectrometry. The sequences obtained from mass spectrometry and Edman sequencing were used to search the ORF sequence of VTDCE in a tick cDNA library. Through PCR enzyme ORF was cloned into a cloning vector and further into an expression vector. The rVTDCE expressed in Escherichia coli was purified by affinity chromatography and used to determine some of its properties such as antimicrobial and enzyme activity. The enzymatic activity was measured using fluorimetric assays, where rVTDCE had similar characteristics to VTDCE. Antimicrobial assays were performed to evaluate the possible activity suggested after sequence analysis. Molecular analysis showed that the sequence of VTDCE shows similarity with antimicrobial peptides, which was proven through antimicrobial assays. Effectively, the VTDCE presented antimicrobial activity even when the protein didn’t present enzymatic activity, demonstrating that both activities are independent. Immunological assays were also performed. Polyclonal anti-rVTDCE serum were produced in rabbits and cattle. Western blot showed that the polyclonal antibodies raised against recombinant VTDCE recognized the native form, indicating that the recombinant form may be used for vaccination experiments.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:03:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4519_1.pdf: 6728814 bytes, checksum: 0a2bf9b9ce453a0afed50516c47bdecf (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Foi verificado neste trabalho a atividade quitinolítica de Metarhizium spp. a partir da degradação da cutícula de Boophilus microplus, além das atividades lipolítica, amilolítica e proteolítica em meios basais, como também estudos do crescimento fúngico em três diferentes meios de cultura e isoenzimáticos. Foram observados maiores valores de atividade enzimática na linhagem CG291C (Metarhizium flavoviride var. flavoviride reisolada de B. microplus) em meio contendo cutícula de B. microplus para atividade quitinolítica, CG434C (M. anisopliae var. acridum reisolada de B. microplus) e CG434 (M. anisopliae var. acridum) lipolítica, CG442C (M. anisopliae var. acridum reisolada de B. microplus) proteolítica e CG442 (M. anisopliae var. acridum) para amilolítica. O meio BDA induziu o maior crescimento e esporulação, e entre os meios líquidos, Czapeck e Massa de arroz propiciaram maior peso da matéria seca. A análise eletroforética em gel de poliacrilamida demonstrou variações no número e posições das bandas, em cada um dos sistemas estudados. Foi observada maior variação nos perfis das bandas com relação às proteínas totais, em todas as linhagens, variando de uma a oito bandas com mobilidade relativa diferenciada. No sistema esterase as linhagens CG291 (Metarhizium flavoviride var. flavoviride) e CG291C (Metarhizium flavoviride var. flavoviride reisolada de B. microplus) apresentaram o mesmo perfil e mobilidade relativa o que diferiu das demais linhagens estudadas, revelando polimorfismo. Na visualização do gel para fosfatase ácida, apenas as linhagens CG291 e CG291C mostraram perfis idênticos com cinco bandas de mesma mobilidade relativa e revelando grande polimorfismo nas demais linhagens. No sistema superóxido dismutase as linhagens CG434, CG434c, CG442 e CG442C não apresentaram bandas. De modo geral, todas as linhagens mostraram padrões diferentes indicando uma variação fenotípica