A saliva do carrapato bovino Boophilus microplus contém dois inibidores de trombina: o BmAP e a microfilina. Este trabalho apresenta a purificação e a caracterização deste último anticoagulante. A microfilina foi purificada da saliva por cromatografia de gel filtração, ultrafiltração em membrana de exclusão de 3 kDa e cromatografia de afinidade em trombina-Sepharose. A análise por espectrometria de massas mostrou uma massa molecular de 1770 Da. Com uma composição de 16 aminoácidos, a microfilina é o segundo menor inibidor peptídico de trombina já descrito. A microfilina inibe a fibrinocoagulação e a agregação plaquetária induzida por trombina com IC50 de 5 M. Como ela não inibe a atividade amidolítica da enzima sobre S2238, mas inibe a hidrólise de um substrato sintético longo que interage com o exosítio I da trombina, o mecanismo de ação proposto para a microfilina é o bloqueio do exosítio I da enzima. A microfilina é resistente à temperatura e não inibe a atividade amidolítica de fXa, plasmina, proteína C ativada, uroquinase, quimiotripsina e tripsina. O estudo mais detalhado da microfilina permitirá sua avaliação como antígeno contra o carrapato e/ou como droga antitrombótica.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-29Bitstream added on 2014-06-13T20:57:21Z : No. of bitstreams: 1 canavaci_fht_me_jabo.pdf: 217331 bytes, checksum: b1d45ab310a2e588fc1485227ef1cd7d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Avaliou-se comparativamente duas formulações, de ação prolongada, contendo Ivermectina (4% e 3,15%) em quatro experimentos em bovinos. Pelo grupo controle, constatou-se a presença das seguintes espécies de nematódeos gastrintestinais: Haemonchus placei, Cooperia punctata, Cooperia spatulata, Trichostrongylus axei, Oesophagostomum radiatum e Trichuris discolor. Quanto à eficácia anti-helmíntica, observou-se que a Ivermectina 4%* foi estatisticamente (P<0,05) superior à Ivermectina 3,15% contra Haemonchus placei, Cooperia punctata e Oesophagostomum radiatum. As duas formulações praticamente não diferiram quanto à eficácia anti-Boophilus microplus e antilarvas de Dermatobia hominis (berne). Decorridos 120 dias pós-tratamento, foram registrados, em relação ao grupo controle, diferenciais de ganho de peso corporal de 17,79 e 11,19 kg em bovinos medicados com Ivermectina 4% e Ivermectina 3,15%, respectivamente. / Comparative endectocide efficacy and effect on weight gain in cattle treated with two (3.15% or 4%) ivermectin formulations. Four trials were conduced to a comparative evaluation of two long action (3.15% or 4%) ivermectin formulations. In the anthelmintic study, the 4% ivermectin formulation showed efficacy statistically higher than 3.15% ivermectin against Haemonchus placei, Cooperia punctata and Oesophagostomum radiatum. Ivermectin at both concentrations was similarly effective against Boophilus microplus and larvae of Dermatobia hominis (warble fly). After 120 days post-treatment, it was observed, relative to the control group, difference in the weight gain of 17.70kg and 11.10kg in cattle treated with 4% ivermectin and 3.15% ivermectin, respectively.

Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.

A saliva do carrapato bovino Boophilus microplus contém dois inibidores de trombina: o BmAP e a microfilina. Este trabalho apresenta a purificação e a caracterização deste último anticoagulante. A microfilina foi purificada da saliva por cromatografia de gel filtração, ultrafiltração em membrana de exclusão de 3 kDa e cromatografia de afinidade em trombina-Sepharose. A análise por espectrometria de massas mostrou uma massa molecular de 1770 Da. Com uma composição de 16 aminoácidos, a microfilina é o segundo menor inibidor peptídico de trombina já descrito. A microfilina inibe a fibrinocoagulação e a agregação plaquetária induzida por trombina com IC50 de 5 M. Como ela não inibe a atividade amidolítica da enzima sobre S2238, mas inibe a hidrólise de um substrato sintético longo que interage com o exosítio I da trombina, o mecanismo de ação proposto para a microfilina é o bloqueio do exosítio I da enzima. A microfilina é resistente à temperatura e não inibe a atividade amidolítica de fXa, plasmina, proteína C ativada, uroquinase, quimiotripsina e tripsina. O estudo mais detalhado da microfilina permitirá sua avaliação como antígeno contra o carrapato e/ou como droga antitrombótica.

Sabe-se que a hemoglobina é uma rica fonte de peptídeos antimicrobianos (hemocidinas). A primeira hemocidina derivada da hemoglobina bovina caracterizada em carrapatos foi o peptídeo Hb33-61, que é ativo contra bactérias gram-positivas e fungos. Acredita-se que tais hemocidinas sejam geradas proteoliticamente no intestino do carrapato. Neste trabalho nós caracterizamos bioquimicamente uma catepsina D, designada BmAP. A análise da expressão gênica por qPCR mostrou que ela é expressa predominantemente no intestino. Através de LC-MS/MS, determinamos a especificidade de clivagem da BmAP utilizando Hb bovina, e verificamos que resíduos hidrofóbicos foram preferencialmente clivados nos subsítios P1 e P1. Também investigamos a especificidade de clivagem da catepsina L intestinal BmCL1, utilizando uma biblioteca combinatória de tetrapeptídeos e através de hemoglobinólise in vitro. A BmCL1 preferiu resíduos alifáticos no P2 e polares no P1 e P1. Além disso, hidrolisou a cadeia da Hb bovina entre A63/A64, gerando peptídeos com estrutura primária similar ao Hb 33-61. A hemoglobinólise com a BmAP e/ou BmCL1 resultou na formação de algumas hemocidinas, corroborando a hipótese do seu envolvimento na geração endógena de peptídeos antimicrobianos. / It is known that hemoglobin is a rich source of antimicrobial peptides (hemocidins). The first hemoglobin-derived hemocidin characterized in ticks was the peptide Hb33-61, which is active against Gram-positive bacteria and fungi. It is believed that hemocidins are endogenously generated in the tick gut. In this work we biochemically characterized a cathepsin D, designated BmAP. Expression analysis by qRT-PCR showed that it is expressed predominantly in the gut. Through LC-MS/MS, we determined the cleavage specificity of BmAP using bovine hemoglobin, and we verified that hydrophobic residues were preferentially cleaved at the subsites P1 and P1. We also investigated the cleavage specificity of the intestinal cathepsin L BmCL1, using a positional scanning synthetic combinatorial library and through in vitro hemoglobinolysis. BmCL1 preferred aliphatic residues at P2 and polar residues at P1 and P1. Also, it hydrolysed the subunit of bovine hemoglobin at A63/A64, generating peptides with a primary structure similar to Hb 33-61. Hemoglobinolysis with BmAP and/or BmCL1 resulted in the formation of some hemocidins, corroborating the hypothesis that these proteinases are involved in the endogenous generation of antimicrobial peptides

A hemoglobina possuí um grande potencial antimicrobiano, sendo os peptídeos antimicrobianos (AMPs) derivados de proteínas contêm o grupamento heme denominados hemocidinas. O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é capaz de adquirir e processar grandes quantidades de sangue para seu metabolismo. Neste trabalho, purificamos hemocidinas produzidas no tubo digestório do carrapato. Identificamos 10 fragmentos da hemoglobina bovina que possuem atividade contra Candida albicans (Hb 1-94, 3-94, 1-87, 93-141, 102-141, 103-141, 107-141, 104-141 e 98-114 e Hb\"beta\" 127-145). Determinamos que todos os peptídeos apresentam um alto conteúdo de aminoácidos básicos, além de uma estrutura secundária em \"alfa\"-hélice, características encontradas em outros AMPs. Verificamos também que as duas principais proteases que atuam na produção das hemocidinas são uma cisteíno- e uma aspártico-proteinase. A identificação de diversas hemocidinas, no tubo digestório de R. (Boophilus) microplus, indica uma possível participação das hemocidinas na proteção contra microorganismos / The hemoglobin posses a great potential as an antimicrobial, being denominated hemocidins the antimicrobial peptides (AMPs) derived from heme containing proteins. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is capable of processing large amounts of blood to its own metabolism. In this work we purified the hemocidins that are produced in the tick gut. We identified 10 fragments from bovine hemoglobin that presents activity towards Candida albicans (Hb 1-94, 3-94, 1-87, 93-141, 102-141, 103-141, 107-141, 104-141 e 98-114 e Hb\"beta\" 127-145). We determined that all the peptides presents a high content of basic amino acids, besides a secondary structure in \"alfa\"-helix conformation, characteristics found in other AMPs. We also verified that a cistein- and an aspartic-protease are the two main proteases involved on the production of these hemocids. The identification of several hemocidins in the gut of R. (Boophilus) microplus, suggests that these AMPs may play a role in the defense of the tick against microorganisms

Carrapatos da espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus causam enormes prejuízos à saúde e à produção animal. Sendo um ectoparasita hematófago, o carrapato espolia seu hospedeiro e transmite doenças. Seu parasitismo é mediado por sua saliva, que inibe as reações homeostáticas do hospedeiro à injúria local causada por sua picada. Seus hospedeiros montam respostas imunes contra esse parasita, incluindo a resposta imune mediada por anticorpos, indicando que o controle imunobiológico é possível. Contudo, o complexo farmacológico da saliva do parasita é composto por proteínas solúveis que são sabidamente pouco ou nada imunogênicos se não forem introduzidos no hospedeiro com adjuvante ou na foram agregada. Assim, dificilmente induziriam imunidade nos hospedeiros. Bovinos apresentam fenótipos contrastantes e herdáveis quanto à intensidade de infestações com carrapatos. Carrapatos alimentados em bovinos resistentes não completam a refeição de sangue, apresentando menor eficiência reprodutiva. É possível que esse desfecho seja devido à capacidade do hospedeiro resistente, mas não do suscetível, de produzir anticorpos que neutralizam componentes salivares do carrapato cruciais para realize a hematofagia. É necessário, portanto, examinar essa possibilidade. Os resultados obtidos também podem ajudar a identificar antígenos úteis para formular uma vacina anti-carrapato. Para estabelecer quais componentes salivares são reconhecidos pelos dois fenótipos de hospedeiros empregamos uma soroteca composta por soros obtidos de bovinos resistentes e suscetíveis ao carrapato em diferentes estágios do ciclo do parasito (larva, ninfa e adulto) e após uma, duas ou três ciclos de infestações. Os soros foram empregados individualmente e em forma de pools para imunodetecção por western blot de proteínas presentes em extrato de larvas não-alimentadas, saliva e glândulas salivares de fêmeas de R. microplus e separadas em uma e duas dimensões. Os resultados obtidos nos western blots 1D de saliva e de extrato de larvas não alimentadas mostraram que houve um reconhecimento diferencial dos antígenos parasitários pelos soros dos animais resistentes e suscetíveis. Os soros dos animais resistentes quando ainda eram livres de infestações (i.e., naïve) ou quando infestados com a forma larval reconheceram com maior freqüência e/ou exclusivamente certas bandas de proteínas. Resultados semelhantes foram vistos nos western blots de géis 2D de saliva e glândulas salivares de fêmeas, onde os soros dos animais resistentes ainda não infestados (i.e., naïve) reconheceram vários spots presentes nessas amostras e soros de animais resistentes infestados reconhecerem spots de forma exclusiva. Também foi observado que, apesar dos hospedeiros suscetíveis estarem expostos a grande quantidade de saliva, os soros desses animais não reconhecem um número maior de spots que os hospedeiros infestados resistentes. Por outro lado, a maioria das proteínas salivares não é reconhecida pelos hospedeiros infestados, sejam resistentes ou suscetíveis. Esses resultados indicam que os hospedeiros bovinos resistentes reconhecem de forma mais precoce que os bovinos suscetíveis certos componentes parasitários. Essa capacidade pode estar relacionada ao fenótipo de resistência ao carrapato / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, causes enormous losses to animal health and production. Since it is a hematophagous parasite the tick expoliates its hosts and transmits diseases. Parasitism by the tick is mediated by its saliva, which inhibits the hosts local homeostatic reactions to its bite. Hosts mount immune responses against this parasite, including antibody-mediated responses, indicating that the immunobiological control of ticks is possible. However, the pharmacological complex of saliva is composed of soluble proteins, which are known to be incapable of eliciting antibody responses if they are not introduced into the host with adjuvant or in aggregated form. Thus, salivary proteins may not be able to induce immunity in hosts. Bovines present contrasting, heritable phenotypes for tick infestations. Ticks fed on resistant hosts are unable to complete a blood meal and present a decrease in reproductive immunity. It is possible that this outcome is caused by an ability of the resistant host to produce antibodies that neutralize salivary components that are crucial to blood feeding. It is necessary, therefore, to examine this possibility. The results will also assist in the identification of protective antigens to formulate an anti-tick vaccine. In order to establish which salivary components are recognized by the two types of host phenotypes, a collection of sera derived from resistant and susceptible bovines infested one, two and three times with different developmental stages of the parasite (larvae, nymphs and adults) was employed to detect which proteins were recognized in western blots of saliva and extracts of salivary glands and unfed larvae. Western blots of tick proteins (saliva and extracts of unfed larvae) separated in one dimension showed that antigens were differentially recognized by resistant and susceptible bovines. Sera from resistant bovines still naïve or infested with larvae recognized certain protein bands exclusively or more frequently than similar sera from susceptible bovines. Similar results were seen in western blots of proteins from saliva and extracts of salivary glands separated in two dimensions, where sera from naïve, resistant bovines recognized several spots and sera from infested, resistant bovines recognized several spots exclusively. In spite of the fac that susceptible hosts are exposed to greater amounts of tick saliva, sera from these animals did not recognize a greater amount of spots than those from resistant bovines. On the other hand, the great majority of spots is not recognized by any of the different sera, be they from resistant or susceptible hosts. These results indicate that resistant bovines are able to recognize parasitic proteins earlier than susceptible bovines. This ability may, in turn, affect expression of salivary components that are crucial for the tick and may explain the phenotypes of tick infestations in bovines.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:16:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008 - Maria Alice Zacarias do Amaral.pdf: 561949 bytes, checksum: 5d68f71db6c659eda036f9c9e229e902 (MD5) Previous issue date: 2008-06-20 / Funda??o Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / With the objective of evaluating the knowledge of milk producers who have received instructions about Efficiency Test and strategic control of cattle ticks by Embrapa Milk Cattle, and those who haven't, there were interviewed, on this present study, by means of questionnaires, 163 producers from the first case, mostly belonging to the state of Minas Gerais, from which 48.5% of the properties with herds up to 100 head of cattle, and 57.3% of the producers belonging to cooperatives; and, 93 producers from the second case, belonging to the estate of Minas Gerais, from which 40.9% producers belong to a cooperative and 92.4% of the properties have herds up to 100 head of cattle. After descriptive analysis and variable crossings, it was determined that among those who had knowledge of strategic control, 157 (98.7%) applied the acaricide indicated by the efficiency test, and 144 (92.9%) affirmed following strategic control, but only 12 (7%) demonstrated understanding of all the stages of strategic control. On the second case, for 96.4% of the producers the determining moment of treatment was the infestation degree of ticks, 67.2% producers choose the acaricide based on advertisements. Other variables tested about biology and control did not demonstrate significant association. The worrisome aspect is that, mostly in the answers considered to be wrong, it is evident that proprietors believe to have knowledge on the subject. The result of this false knowledge is such that they continue to commit control mistakes, in the application of products and don't search for help or a better explanation because they do not see the need to. These data demonstrate the existence of flaws in the proprietors knowledge of biology and cattle tick control. / Objetivando avaliar os conhecimentos dos produtores de leite que receberam instru??es sobre Teste de Efic?cia e controle estrat?gico do carrapato bovino pela Embrapa Gado de Leite e dos que n?o receberam, foram entrevistados, no presente trabalho, por meio de question?rios, 163 produtores de leite do primeiro caso, na maioria pertencentes ao Estado de Minas Gerais, sendo que 48,5% das propriedades com rebanho at? 100 cabe?as de gado, e 57,3% produtores pertencentes a uma cooperativa; e 93 produtores de leite do segundo caso, pertencentes ao Estado de Minas Gerais, sendo que 40,9% produtores pertencentes a uma cooperativa e 92,4% das propriedades com rebanho at? 100 cabe?as de gado. Ap?s an?lise descritiva e cruzamento de vari?veis, constatou-se que dentre os conhecedores do controle estrat?gico, 157 (98,7%) aplicaram o carrapaticida indicado pelo teste de efic?cia, e 144 (92,9%) afirmaram terem seguido controle estrat?gico, mas apenas 12 (7%) demonstraram compreender todas as fases do controle estrat?gico. No segundo caso, 96,4% dos produtores, o que determinava o momento do tratamento era o grau de infesta??o de carrapatos, 67,2% escolhe o produto carrapaticida pela propaganda. Foi constatado que o grau de instru??o aumenta a preocupa??o em adquirir equipamentos melhores para a ordenha e os cuidados no preparo do carrapaticida. As demais vari?veis testadas sobre a biologia e controle levantados n?o demonstraram associa??o significativa. O preocupante ? que, principalmente nas respostas consideradas erradas, fica evidenciado que os propriet?rios acreditam ter conhecimento do assunto. O resultado desse falso conhecimento ? que continuam errando no controle e na aplica??o dos produtos e n?o procuram ajuda ou maiores esclarecimentos por n?o verem necessidade. Esses dados demonstraram que h? falhas no conhecimento dos propriet?rios em rela??o ? biologia e ao controle do carrapato bovino.

Sabe-se que a hemoglobina é uma rica fonte de peptídeos antimicrobianos (hemocidinas). A primeira hemocidina derivada da hemoglobina bovina caracterizada em carrapatos foi o peptídeo Hb33-61, que é ativo contra bactérias gram-positivas e fungos. Acredita-se que tais hemocidinas sejam geradas proteoliticamente no intestino do carrapato. Neste trabalho nós caracterizamos bioquimicamente uma catepsina D, designada BmAP. A análise da expressão gênica por qPCR mostrou que ela é expressa predominantemente no intestino. Através de LC-MS/MS, determinamos a especificidade de clivagem da BmAP utilizando Hb bovina, e verificamos que resíduos hidrofóbicos foram preferencialmente clivados nos subsítios P1 e P1. Também investigamos a especificidade de clivagem da catepsina L intestinal BmCL1, utilizando uma biblioteca combinatória de tetrapeptídeos e através de hemoglobinólise in vitro. A BmCL1 preferiu resíduos alifáticos no P2 e polares no P1 e P1. Além disso, hidrolisou a cadeia da Hb bovina entre A63/A64, gerando peptídeos com estrutura primária similar ao Hb 33-61. A hemoglobinólise com a BmAP e/ou BmCL1 resultou na formação de algumas hemocidinas, corroborando a hipótese do seu envolvimento na geração endógena de peptídeos antimicrobianos. / It is known that hemoglobin is a rich source of antimicrobial peptides (hemocidins). The first hemoglobin-derived hemocidin characterized in ticks was the peptide Hb33-61, which is active against Gram-positive bacteria and fungi. It is believed that hemocidins are endogenously generated in the tick gut. In this work we biochemically characterized a cathepsin D, designated BmAP. Expression analysis by qRT-PCR showed that it is expressed predominantly in the gut. Through LC-MS/MS, we determined the cleavage specificity of BmAP using bovine hemoglobin, and we verified that hydrophobic residues were preferentially cleaved at the subsites P1 and P1. We also investigated the cleavage specificity of the intestinal cathepsin L BmCL1, using a positional scanning synthetic combinatorial library and through in vitro hemoglobinolysis. BmCL1 preferred aliphatic residues at P2 and polar residues at P1 and P1. Also, it hydrolysed the subunit of bovine hemoglobin at A63/A64, generating peptides with a primary structure similar to Hb 33-61. Hemoglobinolysis with BmAP and/or BmCL1 resulted in the formation of some hemocidins, corroborating the hypothesis that these proteinases are involved in the endogenous generation of antimicrobial peptides

A hemoglobina possuí um grande potencial antimicrobiano, sendo os peptídeos antimicrobianos (AMPs) derivados de proteínas contêm o grupamento heme denominados hemocidinas. O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é capaz de adquirir e processar grandes quantidades de sangue para seu metabolismo. Neste trabalho, purificamos hemocidinas produzidas no tubo digestório do carrapato. Identificamos 10 fragmentos da hemoglobina bovina que possuem atividade contra Candida albicans (Hb 1-94, 3-94, 1-87, 93-141, 102-141, 103-141, 107-141, 104-141 e 98-114 e Hb\"beta\" 127-145). Determinamos que todos os peptídeos apresentam um alto conteúdo de aminoácidos básicos, além de uma estrutura secundária em \"alfa\"-hélice, características encontradas em outros AMPs. Verificamos também que as duas principais proteases que atuam na produção das hemocidinas são uma cisteíno- e uma aspártico-proteinase. A identificação de diversas hemocidinas, no tubo digestório de R. (Boophilus) microplus, indica uma possível participação das hemocidinas na proteção contra microorganismos / The hemoglobin posses a great potential as an antimicrobial, being denominated hemocidins the antimicrobial peptides (AMPs) derived from heme containing proteins. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is capable of processing large amounts of blood to its own metabolism. In this work we purified the hemocidins that are produced in the tick gut. We identified 10 fragments from bovine hemoglobin that presents activity towards Candida albicans (Hb 1-94, 3-94, 1-87, 93-141, 102-141, 103-141, 107-141, 104-141 e 98-114 e Hb\"beta\" 127-145). We determined that all the peptides presents a high content of basic amino acids, besides a secondary structure in \"alfa\"-helix conformation, characteristics found in other AMPs. We also verified that a cistein- and an aspartic-protease are the two main proteases involved on the production of these hemocids. The identification of several hemocidins in the gut of R. (Boophilus) microplus, suggests that these AMPs may play a role in the defense of the tick against microorganisms