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Investigação in vitro de um possível efeito adverso das células tronco mesenquimais no sistema nervoso centralHorn, Ana Paula January 2009 (has links)
A terapia celular utilizando células tronco mesenquimais (MSC) derivadas da medula óssea surge como uma alternativa para o tratamento das doenças neurodegenerativas. Apesar dos resultados positivos com o uso dessas células nos ensaios pré-clínicos e clínicos após a isquemia cerebral, seus efeitos colaterais e seu mecanismo de ação permanecem desconhecidos. Os benefícios alcançados após a terapia celular para o tratamento da isquemia não são atribuídos à diferenciação dessas células em novos neurônios, mas sim aos fatores que elas podem secretar. Na tentativa de compreender como os fatores secretados pelas MSC podem influenciar o tecido hipocampal que sofreu ou não privação de oxigênio e glicose (POG) e como os fatores liberados pelo tecido lesionado podem atuar sobre as MSC, nós utilizamos culturas organotípicas de hipocampo expostas ao meio condicionado pelas MSC e MSC expostas ao meio condicionado pelas culturas organotípicas de hipocampo expostas à POG. Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que o meio condicionado pelas MSC é tóxico para as culturas organotípicas de hipocampo, induzindo morte celular especificamente nas regiões do Corno de Ammon (CA) e agravando a lesão causada pela POG. Essa toxicidade parece ser específica das MSC, uma vez que o meio condicionado por outros tipos celulares não tem o mesmo efeito. As MSC isoladas tanto de rato como de camundongo e tanto de medula óssea como de pulmão induzem a morte celular de uma maneira semelhante, sugerindo que o efeito não é espécie ou órgão específico. Ainda, nós observamos que os fatores secretados pelas MSC ativam a microglia e os astrócitos, induzindo a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o aumento da iNOS e um aumento de IL-6 e TNFα nas culturas organotípicas. O efeito tóxico do meio condicionado pelas MSC pode ser atenuado por antioxidantes, anti-inflamatórios, antagonistas NMDA e AMPA, bloqueadores de canal de cálcio dependentes de voltagem e por agonista GABA. Quando as MSC foram analisadas após a sua exposição ao meio condicionado pelo tecido hipocampal lesionado, nós não observamos morte celular ou mudanças morfológicas aparentes nessas células após 24 h de exposição ao meio. Surpreendentemente, as MSC aumentaram a proliferação quando expostas ao meio condicionado pelo hipocampo lesionado, não apresentando nenhum marcador neural após 72 h em contato com esse meio condicionado. Em conjunto, nossos resultados mostram um possível efeito adverso de fatores secretados pelas MSC, introduzindo uma nota de cautela na utilização dessas células. / Cell therapy using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) seems to be a new alternative for the treatment of neurodegenerative diseases. In spite of several good and promising results with the use of these cells in preclinical and clinical studies after stroke, their side effects and their mechanism of action are still unknown. The benefits reached after cell therapy to treat stroke are not attributed to the differentiation of the cells in new neurons, but to the factors that these cells can secrete. In an attempt to understand how MSC secreted factors can influence the hippocampal tissue that suffer or not from oxygen and glucose deprivation (OGD) and how the factors secreted from the injured hippocampus can influence MSC behavior, we used organotypic hippocampal slice cultures exposed to MSC conditioned medium and MSC exposed to organotypic hippocampal cultures conditioned medium. The results obtained in this work show that MSC conditioned medium is toxic to organotypic hippocampal slice cultures, inducing cell death specifically in the CA (Cornus Ammonis) region of hippocampus and aggravating the lesion induced by OGD. This toxicity seems to be specific to MSC, once the medium conditioned by other cell types do not induce cell death. Also, MSC isolated from rat or mice and from bone marrow and lungs induce cell death in a similar manner, suggesting that the effect is not organ- or specie- specific. In addition, we have observed that MSC secreted factors activate microglia and astrocytes, inducing reative oxygem species (ROS) generation and iNOS, TNFα and IL-6 increase in organotypic cultures. The MSC conditioned medium-induced toxic effect can be attenuated by antioxidants, antiinflammatory drugs, NMDA and AMPA antagonists, Ca2+ voltage-dependent channel blockers and GABA agonist. When MSC behavior was investigated after these cells were exposed to the conditioned medium from the lesioned hippocampus, we observed that these medium is not able to induce cell death or any apparent change in MSC morphology after a 24 h exposure period. Surprinsingly, MSC increase proliferation in response to the conditioned medium from the injured hippocampal tissue, do not presenting any neural marker after 72 h of contact with this medium. Taken together, our results show a possible side effect of MSC secreted factors, introducing a note of caution in the use of these cells.
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Diferenciação de células tronco mesenquimais a partir do meio condicionado da linhagem HepG2Cruz, Carolina Uribe January 2009 (has links)
OBJETIVO: Examinar o efeito do meio condicionado da linhagem HepG2 nas célulastronco mesenquimais in vitro no que se refere à sua diferenciação em hepatócito. MATERIAIS E MÉTODOS: As CTM foram isoladas da medula óssea de ratas Wistar combinando a centrifugação por gradiente de densidade e a aderência à superfície de cultivo. As CTM foram cultivadas em meio de diferenciação osteogênico e adipogênico e coradas com Alizarin Red S e Oil Red-O respectivamente. Para induzir a diferenciação hepática, CTM foram cultivadas com 70% de meio condicionado de HepG2 ou com 50 ng/mL de fator de crescimento de hepatócito (HGF) durante 3 semanas. Foram realizadas RT-PCR e analises imunocitoquímica para marcadores de células-tronco (Thy-1) e marcadores hepáticos como ALB, AFP, CK-8 e CK-18. Adicionalmente foram realizadas colorações de Oil Red-O em CTM tratadas com meio condicionado de HepG2. RESULTADOS: Combinando a centrifugação por gradiente de densidade com a aderência à superfície de contacto, isolamos uma população homogênea de CTM nas quais as colorações de Alizarin Red S e Oil Red-O foram positivas quando tratadas. Logo de 3 semanas de tratamento, com meio condicionado de HepG2 ou HGF, não foram observados câmbios morfológicos nem expressão gênica (RT-PCR ou análise imunocitoquímica) para proteínas hepáticas (AFP, ALB, CK8 e CK18). A expressão de Thy-1 foi positivo antes e depois do tratamento em ambos grupos. Surpreendentemente as CTM tratadas com meio condicionado de HepG2 apresentaram acúmulos de lipídeos perinucleares corados com Oil Red-O. Estes acúmulos de gordura foram distintos às observados nas CTM tratadas com meio adipogênico, mas seu fenótipo foi similar às células HepG2 quando coradas com o mesmo método. CONCLUSÕES: Apesar de que o meio condicionado de HepG2 não foi capaz de induzir a diferenciação de CTM a hepatócitos, ele tem algum efeito sobre as CTM conduzindo a um fenótipo que se assemelha a uma esteatose microgoticular. / AIM: In the present study, we examined the effect of conditioned medium from the HepG2 cell line upon mesenchymal stem cells and their ability to differentiate into hepatocyte-like cells in vitro. METHODS: MSCs were isolated from bone marrow of Wistar rats by combining gradient density centrifugation with plastic adherence. The cells were cultured in osteogenic or adipogenic differentiation medium and analyzed by Alizarin Red S and Oil Red-O staining. To induce hepatic differentiation, MSC were cultured with 70% of HepG2-CM or with 50 ng/mL hepatocyte growth factor (HGF) for 3 weeks. RT-PCR and immunocytochemistry analysis for the stem cell marker Thy-1 and hepatic markers, ALB, AFP, CK-8 and CK-18 were performed. In addition, Oil Red-O and Alizarin Red S staining were also performed in the MSC treated with HepG2-CM. RESULTS: By combining gradient density centrifugation with plastic adherence, we isolated a homogeneous population of MSC and differentiated them into osteocytes and adipocytes. After 3 weeks of treatment no changes in morphology were observed in either group (HepG-CM or HGF). RT-PCR and antibody staining for hepatic proteins (AFP, ALB, CK8 and CK18) were also negative. Expression of Thy-1, a marker of mesenchymal stem cell was positive both before and after treatment in both groups. Surprisingly MSC treated with HepG2-CM for 3 weeks presented lipid droplets that were stained with Oil Red-O. These droplets were very distinct from the ones observed in MSC treated with adipogenic medium but resembled those seen in HepG2 cells stained by the same method. CONCLUSIONS: However, HepG2-CM was not able to induce differentiation of MSC in a hepatocyte-like, they had an effect upon MSC leading to a phenotype resembling mild steatosis.
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A utilização do cimento de fosfato de cálcio como arcabouço para engenharia de tecido ósseo: estudo in vitroSilva, Taís Somacal Novaes January 2009 (has links)
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license.txt: 581 bytes, checksum: 44ea52f0b7567232681c6e3d72285adc (MD5) / Tissue engineering has been showing a promising approach on the treatment of patients with trauma or facial deformities that need extensive areas of bone grafts. It involves the association of an appropriate kind of cell and a biocompatible and biodegradable scaffold that imitates functionally and structurally a specific kind of tissue. Calcium Phosphate Cement (CFC) appears as an interesting alternative of biomaterial to be used as a scaffold due to its characteristics as biocompatibility, bioactivity and osteoconductivity. Thus, the aim of the present study was to evaluate the ability of macroporous tridimensional CFC scaffolds, made with brazilian rawmaterial, to allow the adhesion, proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells, derived from human bone marrow in cells osteogenic lineage. For that, cells obtained from iliac crest of an adult human donor were routinely processed until experimental conditions and, after that, cultured over CFC discs, macroporous that had as poror generation body, paraffin spheres, with size between 100 and 250μm. For the induction of cells in osteogenic lineage, BMP4 was added to the culture. Culture periods were established in five, ten and fifteen days. After these periods cells were evaluated due to their morphology by Scanning Electron Microscopy. The expression levels of genes BGLA and SSP1, that codify the osteocalcine (OC) and osteopontine (OP) proteins, as well as the Alkaline phosphatase activity (ALP), other important osteoblastic marker , were quantified by the PCR technique in real time QT-PCR) using the fluorophore SYBR GREEN® . The QT-PCR detected the expression of the genes BGLA and SSP1 and the alkaline phosphatase activity in the periods of 10 and 15 days of culture, what permitted them to check that had a cell proliferation and the differentiation of it in osteogenic cells.In the period of five days, it was not observed the expression of any observed genes. From theses results we concluded that the macroporous CFC, with pore size between 100 and 250 μm, created through the utilization of the paraffin microspheres, permits the adhesion, proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells and can be used as an scaffold to the bone tissue engineering. / A engenharia tecidual tem se mostrado um campo promissor para a reabilitação de pacientes com traumas ou deformidades faciais que necessitem de áreas extensas de enxerto ósseo. Seu princípio básico envolve a associação de um tipo apropriado de célula e de um arcabouço biocompatível e bioabsorvível que mimetize funcional e estruturalmente determinado tipo de tecido. O Cimento de Fosfato de Cálcio (CFC) aparece como uma alternativa viável de biomaterial a ser utilizado com esta finalidade em virtude de suas características como biocompatibilidade, bioatividade e osteocondutividade. Assim, o objetivo da presente pesquisa foi avaliar a capacidade de suportes tridimensionais macroporosos de CFC, confeccionados com matérias-primas brasileiras, de permitir a adesão, proliferação e diferenciação de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana. Para isso, células obtidas da crista ilíaca de um doador humano adulto foram rotineiramente processadas até as condições experimentais e, a seguir, cultivadas sobre suportes de CFC, macroporosos, que tiveram como corpo gerador de poros, microesferas de parafina, com tamanho entre 100 e 250μm. Para indução das células em linhagem osteogênica foi acrescentada Proteína Morfogênica Óssea (BMP4) ao meio de cultura. Os períodos de cultura estabelecidos foram de cinco, dez e 15 dias. Após estes períodos, o comportamento e a morfologia das células junto ao biomaterial foram avaliados por meio de Microscopia Eletrônica de Varredura.Os níveis de expressão dos genes BGLA e SSP1, que codificam as proteínas osteocalcina (OC) e osteopontina (OP) respectivamente, bem como a atividade da Fosfatase Alcalina (ALP), outro marcador osteoblástico importante, foram quantificados pela técnica de PCR em Tempo Real (QT-PCR) utilizando o fluoróforo SYBR Green®. O QT-PCR detectou a expressão dos genes BGLA e SSP1 e a atividade da fosfatase alcalina nos períodos de 10 e 15 dias de cultura, o que nos permitiu constatar que houve proliferação celular e diferenciação destas em células osteogênicas. No período de cinco dias, não foi observada a expressão de nenhum dos genes investigados. A partir destes resultados concluímos que o CFC, macroporoso, com tamanho de poros entre 100 e 250μm, criados por meio da utilização de microesferas de parafina, permite a adesão, proliferação e diferenciação de células-tronco mesenquimais em células osteogênicas, podendo ser utilizado como arcabouço para engenharia de tecido ósseo.
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Atividade anti-tumoral estimulada pela infusão de células tronco mesenquimais utilizadas no tratamento da doença do enxerto contra hospedeiro aguda (DECHa) resistente a esteroidesValim, Vanessa de Souza January 2017 (has links)
O transplante de Células Tronco Hematopoéticas alogênico é o tratamento curativo para diversas doenças hematológicas malignas, benignas e imunodeficiências, porém é acompanhado de grande morbidade e mortalidade. Uma das principais complicações é a doença do enxerto contra hospedeiro aguda que, se não controlada rapidamente, pode ser fatal. A Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda tem como tratamento o uso de esteróides, no entanto, em cerca de 30 a 50% dos casos se revela resistente à esta terapia, sendo considerados com Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda refratária ou resistente. O tratamento para Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda refratária ou resistente à esteróides não está ainda estabelecido sendo alta a mortalidade desses pacientes. Nesse contexto, começou-se a pesquisar o papel das células-tronco mesenquimais em pacientes com Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteróides, devido a capacidade de imunomodulação que aquelas possuem. As células-tronco mesenquimais são células-tronco adultas, com capacidade de autorrenovação, proliferação e diferenciação em diferentes linhagens celulares. As propriedades imunomoduladoras das células-tronco mesenquimais ainda não são totalmente conhecidas, mas sabe-se por estudos in vitro que elas interagem com diversos tipos celulares e citocinas, sendo sua aplicabilidade terapêutica muito pesquisada em diversas doenças inflamatórias; ainda assim, poucos se conhece sobre o efeito modulador das células-tronco mesenquimais in vivo. Inúmeros estudos piloto ou séries de casos sobre a aplicabilidade de célula-tronco mesenquimal para o tratamento da Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda foram publicados com resultados animadores, no entanto, não há até o momento na literatura estudo prospectivo randomizado em pacientes com Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda refratária comparando célula-tronco mesenquimal com o tratamento padrão. Finalmente, dentre os problemas decorrentes da intensa imunossupressão necessária para controlar a Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteroides, se destacam o aumento da incidência de infecções graves e a possibilidade da diminuição do Efeito Enxerto Versus Leucemia, ao qual se atribui o poder curativo do transplante de células-tronco hematopoético alogênico. As células Natural Killer com sua capacidade anti-tumoral inata, parecem ser os principais linfócitos envolvidos no Enxerto Versus Leucemia. Esse estudo teve como objetivo determinar o papel das células-tronco mesenquimais no tratamento da Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteroides comparando, de forma randomizada, com a terapia com anticorpos monoclonais padrão; e estudar aspectos relacionados à imunomodulação decorrente da terapia com célulatronco mesenquimal, in vivo, com particular atenção à citocinas a ao comportamento das células Natural Killer neste contexto. Nossos resultados confirmam que a infusão de célula-tronco mesenquimal levam a um aumento significativo da Interleucina 10 de efeito anti-inflamatório, e indicam pela primeira vez, que as células Natural Killer aumentam gradativamente durante e após as infusões de células-tronco mesenquimais tanto em proporção dentre os linfócitos, como no seu grau de ativação, resultando em uma atividade citotóxica significativamente elevada no 280 dia após o início das infusões. Postulamos, inclusive, que a ativação das células Natural Killer seria o mecanismo pelo qual não se observa aumento de recidiva ou das infecções com o emprego de infusões de células-tronco mesenquimais para o tratamento da Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteróides. / Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is the curative therapy for several malignant and non-malignant hematological diseases as well as for immunodeficiences. Although curative, morbidity and mortality are high, been acute Graft versus Host Disease and infections amongst the most frequent life threatening complications. Treatment for acute Graft versus Host Disease is high dose steroids, however, 30 to 50% of the cases are resistant or refractory to it. Steroid resistant or refractory Graft versus Host Disease is a very difficult condition to treat and effective treatment strategies are still to be defined. In this scenario, the intravenous infusion of Mesenchymal Stem Cells has emerged as a tool to rescue patients from that condition because of its immunomodulatory potential. Mesenchymal Stem Cells are adult stem cells with capacity for self-renewal, proliferation and differentiation in mesodermal tissues, particularly chondrocytes, osteoblasts and fibroblasts. Its immunomodulatory proprieties and effectiveness in several inflammatory diseases are still a matter of intense debate and mostly studied in in vitro conditions. There are several published or ongoing studies on the role of Mesenchymal Stem Cells for steroid resistant acute Graft versus Host Disease, but none randomizing it with monoclonal antibody therapy frequently utilized as treatment with variable results, and complicated by an intense cellular immunodeficiency and severe infections. Since hematologic malignancies are the number one indication for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and the secondary Graft versus Leukemia effect mediated by immune effector cells recognized as responsible for its curative potential, an intense cellular immunodeficiency is not desirable in this scenario. In the last few years, Natural Killer cells have emerged as an effector involved in Graft versus Leukemia sparing the patient of Graft versus Host Disease, however, in vivo Mesenchymal Stem Cells and Natural Killer crosstalk have not been studied although severe infections and relapse are not increased after Mesenchymal Stem Cells cellular therapy. Here we show that, in spite of the results of most of the in vitro studies suggesting that Mesenchymal Stem Cells inhibits Natural Killer cell activity, in vivo evidences points to an increment of Natural Killer cells number and activity during the several Mesenchymal Stem Cells infusions, particularly at the 28th day after the beginning of infusions, thereby explaining the apparent infection and relapse protection promoted by Mesenchymal Stem Cells.
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Avaliação bioquímica de células-tronco mesenquimais de camundongos NODRosa, Priscila Machado da January 2013 (has links)
A hiperglicemia é uma característica do diabetes mellitus responsável por complicações micro e macrovasculares, que são a principal causa de morbidade/mortalidade em pacientes diabéticos, representando um problema clínico e econômico. Diante de um quadro de hiperglicemia, o aumento na produção de espécies reativas de oxigênio aumenta a atividade de rotas metabólicas que causam dano vascular. Células-tronco mesenquimais (MSCs) são células multipotentes que têm sido vistas como uma atraente ferramenta para o estudo de terapia celular em diversas doenças como diabetes mellitus tipo 1. Devido à origem perivascular das MSCs, elas podem ser alvos da hiperglicemia, levando a um aumento do estresse oxidativo. O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar alterações ultra-estruturais e parâmetros de estresse oxidativo de MSCs derivadas de pâncreas e rim de camundongos NOD diabéticos, NOD não diabéticos, e BALB/c. Nossos resultados mostram um aumento do estresse oxidativo causado pela hiperglicemia em MSCs de camundongos NOD diabéticos. Estas células mostraram uma mudança expressiva na morfologia ultraestrutural das mitocôndrias, aumento na produção de espécies reativas, desequilíbrio da atividade de enzimas antioxidantes e dano oxidativo em proteínas em comparação com os controles não diabéticos, NOD e BALB/c. / Hyperglycemia is a characteristic of diabetes mellitus responsible for micro- and macro- vascular complications which are the main cause of morbidity/mortality in diabetic patients representing a clinical and economic issue. Under hyperglycemic conditions the increase in reactive oxygen species production activates four main pathways that cause vascular damage. Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells which have been seen as attractive tools in cell therapy for many diseases such as diabetes mellitus type 1. Due to the perivascular origin of MSCs they can be affected by hyperglycemia which increases oxidative stress. Our aim in this study was evaluate and compare ultrastructural changes and oxidative stress parameters on MSCs derived from pancreas and kidney of diabetic NOD mice, nondiabetic NOD mice and BALB/c mice. Our results show an increase of oxidative stress caused by hyperglycemia in MSCs from diabetic NOD mice (NOD+). These NOD+MSCs showed an expressive change in ultrastructural morphology of mitochondria, an increase in reactive species content, imbalance of antioxidant enzymes activity and an oxidative damage in proteins compared to no diabetic controls NODand BALB/c.
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Desenvolvimento de matrizes de nanofibras de poli-d,l-ácido láctico pela técnica de electrospinning para utilização no cultivo de células-tronco para a engenharia de tecidosSteffens, Daniela January 2012 (has links)
A associação das células-tronco (CT) com os biomateriais prometem ser os protagonistas para o futuro da medicina regenerativa no tratamento de lesões de tecidos e órgãos. No presente trabalho, as células-tronco foram cultivadas em matrizes construídas pela técnica de electrospinning, usando o polímero poli-D,L-ácido láctico (PDLLA) associado ou não à biomassa da microalga Spirulina (PDLLA/Sp), que possui componentes bioativos de interesse para a engenharia de tecidos (ET). As análises físico-químicas realizadas foram a avaliação da morfologia, do diâmetro das fibras, da degradabilidade, da rugosidade, do teor de solvente residual, do ângulo de contato com água, entre outros. A adesão e a proliferação celular, bem como a citotoxicidade do biomaterial também foram avaliados. As nanofibras obtidas apresentaram-se sem beads e com características semelhantes às da matriz extracelular natural (MEC) em termos de propriedades mecânicas e topográficas. Nos testes biológicos, verificou-se que as CTs aderiram mais e tiveram maior viabilidade nos scaffolds de PDLLA/Sp, quando comparado com as matrizes de nanofibras de PDLLA. Ambos os biomateriais mostraram-se atóxicos para as CTs. Pode-se concluir que as matrizes desenvolvidas neste trabalho apresentam as características necessárias de um novo biomaterial adequado para uso na ET. / The association of stem cells (SCs) with biomaterials promises to be the protagonist for future regenerative medicine in the treatment of tissue and organ lesions. Stem cells were cultivated in scaffolds constructed by the electrospinning technique, using poly-D,L-lactic acid (PDLLA) associated or not with Spirulina biomass (PDLLA/Sp), which has bioactive components of interest for tissue engineering (TE). Physicochemical analyses were performed, such as morphology, fiber diameter, degradability, residual solvent, roughness, contact angle with water, among others. SC adhesion and proliferation and scaffold cytotoxicity were also evaluated. Nanofibers without beads and with characteristics similar to the natural extracellular matrix (ECM) in terms of mechanical and topographical properties were obtained. In biological tests it was found that SCs adhered more and had greater viability in the PDLLA/Sp molds, when compared to the PDLLA scaffolds. The scaffolds were shown to be atoxic for the SCs. It can be concluded that the scaffolds developed in this work have the characteristics to be a new biomaterial suitable for use in TE.
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Imunogenicidade de células-tronco mesenquimais em transplante alogênico em camundongos imunocompetentesOliveira, Régis Linhares January 2015 (has links)
As células-tronco mesenquimais (CTMs) tem sido o foco de diversos estudos nos últimos anos, devido ao seu alto potencial terapêutico. Muitos estudos in vitro tem demonstrado que essas células podem ser hipoimunogênicas, indicando a possibilidade de uso dessas células em transplantes alogênicos sem nenhum efeito colateral. No entanto, estudos in vivo demonstram que as CTMs podem gerar uma resposta imune quando transplantadas em hospedeiros imunocompetentes, inclusive com a formação de células T de memória. Isto indica que possívelmente as CTMs não sejam imunoprivilegiadas. O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento de CTMs pré-ativadas e não ativadas, quando transplantadas sob a cápsula renal de camundongos imunocompetentes. Células mesenquimais derivadas do tecido adiposo foram coletadas de camundongos transgênicos C57Bl/6-GFP. As células foram então caracterizadas por ensaios de diferenciação adipogênica e osteogênica, assim como por imunofenotipagem, realizada por citometria de fluxo. Os animais foram divididos em três grupos para o transplante. No grupo singênico, machos C57Bl/6 receberam células C57Bl/6-GFP. Nos grupos alogênicos, camundongos BALB/c foram transplantados com células C57Bl/6-GFP ou células C57Bl/6-GFP pré-ativadas através da incubação com 20 ng/mL IFN-γ e 30 ng/mL TNF-α antes do transplante. A análise histológica e a imunofluorescência demonstraram que nenhum dos animais que receberam o transplante alogênico apresentou células GFP+ 28 dias após o transplante. Aos dias 7 e 14 os animais apresentaram grandes infiltrados de células inflamatórias no local. Aos 28 dias este infiltrado esteve reduzido ou inexistente, indicando completa rejeição das células transplantadas. Os animais que receberam o transplante singênico apresentaram células GFP+ 100 dias após o transplante. A análise histológica e a imunofluorescência demonstraram que nenhum dos animais que receberam o transplante alogênico apresentou células GFP+ 28 dias após o transplante. Aos dias 7 e 14 os animais apresentaram grandes infiltrados de células inflamatórias no local. Aos 28 dias este infiltrado esteve reduzido ou inexistente, indicando completa rejeição das células transplantadas. Os animais que receberam o transplante singênico apresentaram células GFP+ 100 dias após o transplante. A quantificação de citocinas no plasma dos animais não demonstrou diferenças entre os grupos. Foi feito também um teste de proliferação de esplenócitos in vitro, co-cultivado com CTMs. O presente estudo demonstrou que as células alogênicas possuem a capacidade de provocar a proliferação dos esplenócitos, o que poderia explicar a rejeição ocorrida in vivo. / The immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells (MSCs) have been the focus of several studies over the past few years due to their therapeutic potential. Many in vitro studies have shown that these cells can be hypoimmunogenic, indicating the possibility of using them in allogenic transplants without any harmful effects. However, recent in vivo studies show that these cells can generate an immune response when transplanted into an immunocompetent host, with the formation of memory T cells. This indicates that MSCs may not actually be immune privileged. The main goal of this study has been to evaluate the role of activated and non-activated MSCs when transplanted to the renal subcapsular space of allogenic mice. Adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from C57Bl/6-GFP transgenic mice. The cells were characterized by adipogenic and osteogenic differentiation assays and immunophenotyping was performed by flow cytometry. The animals were divided in three different groups for the transplant. Male C57Bl/6 mice were transplanted with C57Bl/6-GFP cells. In the allogenic groups, male BALB/c mice were transplanted with C57Bl/6-GFP cells or C57Bl/6-GFP cells pre-activated by incubation with 20 ng/mL IFN-γ and 30 ng/mL TNF-α for 20h before transplantation. Histological and immunofluorescence analysis of graft-bearing kidneys showed that no GFP+ cells were found in any allogenic transplant after 28 days. At 7 and 14 days, the transplant sites showed a massive proliferation of inflammatory cells, which vanished after 28 days, indicating complete rejection of the transplanted cells. The syngeneic transplant was not rejected, showing GFP+ cells through the whole period of study. Cytokine quantification in the blood plasma showed no difference between any of the groups. An in vitro splenocyte proliferation assay was performed, which indicates that MSCs alone can induce the activation of allogenic splenocytes. This could explain their rejection in vivo.
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Reconstrução óssea experimental de calota craniana com enxerto de células tronco mesenquimais e fator de crescimento vascular endotelial em matriz de hidroxiapatita e osso liofilizadoMattana, Marcelo January 2006 (has links)
Resumo não disponível.
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Investigação in vitro de um possível efeito adverso das células tronco mesenquimais no sistema nervoso centralHorn, Ana Paula January 2009 (has links)
A terapia celular utilizando células tronco mesenquimais (MSC) derivadas da medula óssea surge como uma alternativa para o tratamento das doenças neurodegenerativas. Apesar dos resultados positivos com o uso dessas células nos ensaios pré-clínicos e clínicos após a isquemia cerebral, seus efeitos colaterais e seu mecanismo de ação permanecem desconhecidos. Os benefícios alcançados após a terapia celular para o tratamento da isquemia não são atribuídos à diferenciação dessas células em novos neurônios, mas sim aos fatores que elas podem secretar. Na tentativa de compreender como os fatores secretados pelas MSC podem influenciar o tecido hipocampal que sofreu ou não privação de oxigênio e glicose (POG) e como os fatores liberados pelo tecido lesionado podem atuar sobre as MSC, nós utilizamos culturas organotípicas de hipocampo expostas ao meio condicionado pelas MSC e MSC expostas ao meio condicionado pelas culturas organotípicas de hipocampo expostas à POG. Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que o meio condicionado pelas MSC é tóxico para as culturas organotípicas de hipocampo, induzindo morte celular especificamente nas regiões do Corno de Ammon (CA) e agravando a lesão causada pela POG. Essa toxicidade parece ser específica das MSC, uma vez que o meio condicionado por outros tipos celulares não tem o mesmo efeito. As MSC isoladas tanto de rato como de camundongo e tanto de medula óssea como de pulmão induzem a morte celular de uma maneira semelhante, sugerindo que o efeito não é espécie ou órgão específico. Ainda, nós observamos que os fatores secretados pelas MSC ativam a microglia e os astrócitos, induzindo a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o aumento da iNOS e um aumento de IL-6 e TNFα nas culturas organotípicas. O efeito tóxico do meio condicionado pelas MSC pode ser atenuado por antioxidantes, anti-inflamatórios, antagonistas NMDA e AMPA, bloqueadores de canal de cálcio dependentes de voltagem e por agonista GABA. Quando as MSC foram analisadas após a sua exposição ao meio condicionado pelo tecido hipocampal lesionado, nós não observamos morte celular ou mudanças morfológicas aparentes nessas células após 24 h de exposição ao meio. Surpreendentemente, as MSC aumentaram a proliferação quando expostas ao meio condicionado pelo hipocampo lesionado, não apresentando nenhum marcador neural após 72 h em contato com esse meio condicionado. Em conjunto, nossos resultados mostram um possível efeito adverso de fatores secretados pelas MSC, introduzindo uma nota de cautela na utilização dessas células. / Cell therapy using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) seems to be a new alternative for the treatment of neurodegenerative diseases. In spite of several good and promising results with the use of these cells in preclinical and clinical studies after stroke, their side effects and their mechanism of action are still unknown. The benefits reached after cell therapy to treat stroke are not attributed to the differentiation of the cells in new neurons, but to the factors that these cells can secrete. In an attempt to understand how MSC secreted factors can influence the hippocampal tissue that suffer or not from oxygen and glucose deprivation (OGD) and how the factors secreted from the injured hippocampus can influence MSC behavior, we used organotypic hippocampal slice cultures exposed to MSC conditioned medium and MSC exposed to organotypic hippocampal cultures conditioned medium. The results obtained in this work show that MSC conditioned medium is toxic to organotypic hippocampal slice cultures, inducing cell death specifically in the CA (Cornus Ammonis) region of hippocampus and aggravating the lesion induced by OGD. This toxicity seems to be specific to MSC, once the medium conditioned by other cell types do not induce cell death. Also, MSC isolated from rat or mice and from bone marrow and lungs induce cell death in a similar manner, suggesting that the effect is not organ- or specie- specific. In addition, we have observed that MSC secreted factors activate microglia and astrocytes, inducing reative oxygem species (ROS) generation and iNOS, TNFα and IL-6 increase in organotypic cultures. The MSC conditioned medium-induced toxic effect can be attenuated by antioxidants, antiinflammatory drugs, NMDA and AMPA antagonists, Ca2+ voltage-dependent channel blockers and GABA agonist. When MSC behavior was investigated after these cells were exposed to the conditioned medium from the lesioned hippocampus, we observed that these medium is not able to induce cell death or any apparent change in MSC morphology after a 24 h exposure period. Surprinsingly, MSC increase proliferation in response to the conditioned medium from the injured hippocampal tissue, do not presenting any neural marker after 72 h of contact with this medium. Taken together, our results show a possible side effect of MSC secreted factors, introducing a note of caution in the use of these cells.
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Diferenciação de células tronco mesenquimais a partir do meio condicionado da linhagem HepG2Cruz, Carolina Uribe January 2009 (has links)
OBJETIVO: Examinar o efeito do meio condicionado da linhagem HepG2 nas célulastronco mesenquimais in vitro no que se refere à sua diferenciação em hepatócito. MATERIAIS E MÉTODOS: As CTM foram isoladas da medula óssea de ratas Wistar combinando a centrifugação por gradiente de densidade e a aderência à superfície de cultivo. As CTM foram cultivadas em meio de diferenciação osteogênico e adipogênico e coradas com Alizarin Red S e Oil Red-O respectivamente. Para induzir a diferenciação hepática, CTM foram cultivadas com 70% de meio condicionado de HepG2 ou com 50 ng/mL de fator de crescimento de hepatócito (HGF) durante 3 semanas. Foram realizadas RT-PCR e analises imunocitoquímica para marcadores de células-tronco (Thy-1) e marcadores hepáticos como ALB, AFP, CK-8 e CK-18. Adicionalmente foram realizadas colorações de Oil Red-O em CTM tratadas com meio condicionado de HepG2. RESULTADOS: Combinando a centrifugação por gradiente de densidade com a aderência à superfície de contacto, isolamos uma população homogênea de CTM nas quais as colorações de Alizarin Red S e Oil Red-O foram positivas quando tratadas. Logo de 3 semanas de tratamento, com meio condicionado de HepG2 ou HGF, não foram observados câmbios morfológicos nem expressão gênica (RT-PCR ou análise imunocitoquímica) para proteínas hepáticas (AFP, ALB, CK8 e CK18). A expressão de Thy-1 foi positivo antes e depois do tratamento em ambos grupos. Surpreendentemente as CTM tratadas com meio condicionado de HepG2 apresentaram acúmulos de lipídeos perinucleares corados com Oil Red-O. Estes acúmulos de gordura foram distintos às observados nas CTM tratadas com meio adipogênico, mas seu fenótipo foi similar às células HepG2 quando coradas com o mesmo método. CONCLUSÕES: Apesar de que o meio condicionado de HepG2 não foi capaz de induzir a diferenciação de CTM a hepatócitos, ele tem algum efeito sobre as CTM conduzindo a um fenótipo que se assemelha a uma esteatose microgoticular. / AIM: In the present study, we examined the effect of conditioned medium from the HepG2 cell line upon mesenchymal stem cells and their ability to differentiate into hepatocyte-like cells in vitro. METHODS: MSCs were isolated from bone marrow of Wistar rats by combining gradient density centrifugation with plastic adherence. The cells were cultured in osteogenic or adipogenic differentiation medium and analyzed by Alizarin Red S and Oil Red-O staining. To induce hepatic differentiation, MSC were cultured with 70% of HepG2-CM or with 50 ng/mL hepatocyte growth factor (HGF) for 3 weeks. RT-PCR and immunocytochemistry analysis for the stem cell marker Thy-1 and hepatic markers, ALB, AFP, CK-8 and CK-18 were performed. In addition, Oil Red-O and Alizarin Red S staining were also performed in the MSC treated with HepG2-CM. RESULTS: By combining gradient density centrifugation with plastic adherence, we isolated a homogeneous population of MSC and differentiated them into osteocytes and adipocytes. After 3 weeks of treatment no changes in morphology were observed in either group (HepG-CM or HGF). RT-PCR and antibody staining for hepatic proteins (AFP, ALB, CK8 and CK18) were also negative. Expression of Thy-1, a marker of mesenchymal stem cell was positive both before and after treatment in both groups. Surprisingly MSC treated with HepG2-CM for 3 weeks presented lipid droplets that were stained with Oil Red-O. These droplets were very distinct from the ones observed in MSC treated with adipogenic medium but resembled those seen in HepG2 cells stained by the same method. CONCLUSIONS: However, HepG2-CM was not able to induce differentiation of MSC in a hepatocyte-like, they had an effect upon MSC leading to a phenotype resembling mild steatosis.
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