Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T16:28:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Thamile_versaofinal.pdf: 1994677 bytes, checksum: ae5ee13d8f71c37552b741b9a2c81a37 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T16:46:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Thamile_versaofinal.pdf: 1994677 bytes, checksum: ae5ee13d8f71c37552b741b9a2c81a37 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T16:46:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Thamile_versaofinal.pdf: 1994677 bytes, checksum: ae5ee13d8f71c37552b741b9a2c81a37 (MD5) / As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células indiferenciadas capazes de se autorrenovarem e diferenciarem em diversos tipos celulares; estas células têm sido amplamente avaliadas quanto ao uso em terapias para doenças cardiovasculares, visando recuperar o tecido cardíaco danificado. É sabido que o comportamento biológico das CTMs depende do microambiente onde se encontram, que é composto principalmente por células, matriz extracelular (MEC) e fatores solúveis. Desta forma, isolamos células residentes cardíacas através da cultura de explantes de aurícula e ventrículo cardíaco humano e realizamos a caracterização do fenótipo destas células, bem como de proteínas de MEC e do meio condicionado (fatores solúveis) secretados por elas. Constatamos que ambas as populações celulares são compostas por CTMs, fibroblastos cardíacos e possivelmente pericitos/miofibroblastos. Realizamos o cultivo destas células e isolamos a MEC por meio da descelularização das monocamadas celulares com uma solução de Triton X-100 0,5%. Por outro lado, obtivemos o meio condicionado (MC) de ambas as populações celulares e observamos que estes são compostos por diversas proteínas, muitas das quais sendo relacionadas aos processos de regulação da diferenciação celular, desenvolvimento e reparo tecidual. Devido ao fato destas populações celulares serem populações heterogêneas compostas de células encontradas no coração, procuramos avaliar o papel das proteínas de MEC e do MC secretados por elas em cultivos de CTMs. Primeiramente, observamos através de ensaios de viabilidade celular e morte por apoptose e necrose, que as MEC e os MCs não foram tóxicos para os cultivos de CTMs. Observamos que a MEC derivada de células de aurícula induziu redução da taxa de proliferação das CTMs em 24 horas. Em contrapartida, após 7 dias, o número de CTMs cultivadas na presença de ambos os MCs aumentou significativamente em relação ao controle, sugerindo um papel destas proteínas secretadas como indutoras da proliferação celular. Em relação a adesão, observamos que as MECs não influenciaram o número de CTMs aderidas em comparação com o controle de colágeno tipo I. Da mesma forma, não observamos diferença na taxa de migração e na marcação para GATA-4 e Troponina-I entre os grupos controle e os cultivados na presença das MECs e/ou MCs. Embora não tenhamos observado diferença nestes parâmetros, ao menos nas condições avaliadas neste estudo, conseguimos demonstrar através deste trabalho que as populações celulares derivadas de aurícula e ventrículo são secretoras ativas de diversas proteínas relacionadas a processos de desenvolvimento celular e possivelmente ao reparo do tecido cardíaco. Portanto, estas células podem representar uma importante fonte de fatores tróficos a ser avaliada como indutora de estímulos em células progenitoras com objetivos terapêuticos em lesões cardiovasculares.

O diabetes mellitus tipo 1 é uma doença autoimune causada pela destruição das células β produtoras de insulina, presentes nas ilhotas pancreáticas, por células autorreativas do sistema imune. A opção de tratamento mais utilizada são injeções diárias de insulina exógena, o que configura um tratamento não curativo. Para alcançar a independência de insulina, alternativas como o transplante de ilhotas vêm sendo estudadas. Entretanto, a disponibilidade de pâncreas de doadores cadavéricos para o isolamento destas ilhotas é pequena e os métodos de isolamento, pouco eficazes, sendo necessários de 2 a 4 doadores para atingir o número adequado de ilhotas. Além disso, o transplante apresenta problemas relacionados à enxertia, devidos principalmente à baixa vascularização, o que leva à morte de células β nos primeiros dias pós-transplante. Desta forma, estudos explorando alternativas que aumentem a sobrevivência e a funcionalidade dos transplantes e diminuam o número de ilhotas exigido por receptor fazem-se muito necessários. As células-tronco mesenquimais apresentam propriedades interessantes para aplicação em terapia celular. Entre elas, destaca-se o efeito parácrino, que exerce diversas funções benéficas, como o aumento da vascularização, nos locais onde estas células estão presentes. Sendo assim, este trabalho explorou o co-transplante de ilhotas pancreáticas com células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo, para o tratamento do diabetes mellitus em modelo murino. Os resultados mostraram que a presença destas células no grupo que recebeu o co-transplante não aumentou a taxa de cura, em relação ao grupo que recebeu somente ilhotas. No entanto, o fenômeno de reversão do diabetes foi antecipado no grupo co-transplantado, o que sugere um possível efeito angiogênico das células-tronco adiposo-derivadas presentes neste grupo. Desta forma, conclui-se que estas células podem exercer atividades benéficas, quando co-transplantadas com ilhotas pancreáticas, para o tratamento do diabetes. / Type 1 diabetes mellitus is an autoimmune disease caused by destruction of insulin-producing β cells, present in pancreatic islets, by auto-reactive cells of the immune system. The most widely used treatment option are daily injections of insulin, which configures a non-curative treatment. To achieve insulin independence, alternatives such as islet transplantation have been studied. However, the availability of pancreas from cadaveric donors for the isolation of these islets is poor and the methods for isolation, ineffective, requiring 2 to 4 donors to achieve the appropriate number of islets. In addition, transplantation presents problems related to engraftment, mainly due to poor vascularization, which leads to β cell death in the first days after transplantation. Thus, studies exploring alternatives that increase the survival and function of transplants and reduce the number of islets required by the recipient are very necessary. Mesenchymal stem cells have interesting properties for application in cell therapy. Among them is the paracrine effect, which has several beneficial functions, such as promoting vascularization in the tissues where these cells are present. Thus, the present study explored the co-transplantation of pancreatic islets with mesenchymal stem cells derived from adipose tissue for the treatment of diabetes mellitus in mice. The results showed that the presence of these cells in the group that received co-transplantation did not increase the cure rate, compared to the group that received islets alone. However, the phenomenon of diabetes reversion was anticipated in co-transplanted animals, which suggests a possible angiogenic effect of adipose-derived stem cells present in this group. Thus, we conclude that these cells may exert beneficial functions when co-transplanted with pancreatic islets for the treatment of diabetes.

As células-tronco mesenquimais (CTM) são consideradas células multipotentes não hematopoéticas com propriedades de autorrenovação e capacidade de diferenciação em tecidos mesenquimais e, talvez, não mesenquimais e, devido sua capacidade imunomodulatória, tem sido utilizada na terapia celular. A Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro aguda (DECHa) resistente aos corticoesteroides é uma complicação do transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas e apresenta um mau prognóstico. Pacientes com DECHa resistente aos corticosteroides não dispõe de um tratamento estabelecido para esta grave complicação e, apesar das várias combinações de agentes imunossupressores, em torno de 16% dos pacientes sobrevivem em 2 anos. Existem diferentes estudos clínicos (fases I, II e III) em diversos países relatando o uso das CTMs na terapia celular para o tratamento de diversas doenças, entre elas a DECH. Este projeto teve como objetivo expandir células tronco mesenquimais em condições de boas práticas de manufatura para uso em terapia celular nestes pacientes acometidos com DECHa e avaliar a segurança e exequibilidade do uso destas células. Cabe salientar que no Rio Grande do Sul este é o primeiro estudo clínico com CTM para tratamento desta patologia. Foram incluídos entre outubro de 2010 a maio de 2011, oito pacientes co DECHa resistente aos corticoesteroides neste estudo. Foram feitas no total 17 infusões de CTM (mediana de 2 infusões por paciente, range: 1-5) em não foram observados efeitos colaterais imediatos ou tardios relacionadas às infusões. Cinco dos oito pacientes apresentaram resposta completa após 28 dias da primeira infusão. A sobrevida média dos pacientes foi de 303 dias e uma mediana de 123 dias (range: 49-740 dias). / The mesenchymal stem cells (MSCs) are considered non-hematopoietic multipotent cells with properties of self-renewal and ability to differentiate into mesenchymal tissues, and perhaps non-mesenchymal, and due to its immunomodulatory capacity, has been used in cell therapy. Acute Graft Versus Host Disease (aGVHD) is a complication of allogeneic hematopoietic stem cells and has a poor prognosis. Patients with aGVHD resistant to corticosteroids does not have an established treatment for this serious complication and, despite various combinations of immunosuppressive agents, around 16% of patients survive for two years. Different clinical trials (Phase I, II and III) in several countries are reporting the use of MSCs in cellular therapy to treat various diseases, including GVHD. This project aimed to expand mesenchymal stem cells under conditions of good manufacturing practices for use in cell therapy in these patients affected with aGVHD and evaluate the safety and feasibility of using these cells. It should be noted that in Rio Grande do Sul, this is the first clinical study with MSC for treatment of this pathology. Were included between October 2010 to May 2011, eight patients which aGVHD resistant to corticosteroids in this study. We made in total 17 infusions of MSC (median of two infusions per patient, range: 1-5) were not observed in either immediate or late side effects related to these infusions. Five of the eight patients showed complete response 28 days after the first infusion. The median overall survival of these patients was 303 days and a median of 123 days (range: 49-740 days).

As células tronco mesenquimais de tecido adiposo (MSCs-TA) são células progenitoras que residem entre adipócitos e contribuem para o turnover do tecido adiposo. Gangliosídios são glicoensfigolipídios localizados na membrana das células, envolvidos na regulação do crescimento celular, interação de superfície, sinalização transmembrana e diferenciação celular. O gangliosídio neural GD2 foi relatado como um marcador de superfície de células tronco mesenquimais de medula óssea e cordão umbilical, mas existem poucos dados sobre a expressão do GD2 em MSCs-TA indiferenciadas e nas diferenciadas para adipócito ou osteoblasto. Nosso principal objetivo foi estudar a expressão de gangliosídios nas MSCs-TA, em especial o GD2, durante a diferenciação adipogênica e osteogênica. Para isso, as MSCs-TA foram isoladas de lipoaspirado humano, cultivadas e induzidas para diferenciação adipogênica e osteogênica. As análises foram feitas por HPTLC, microscopia confocal, citometria de fluxo e PCR em tempo real. Por HPTLC, as MSCs-TA indiferenciadas e MSCs-TA diferenciadas para adipócitos e osteoblasto mostraram aumento do perfil de gangliosídios complexos. A microscopia confocal evidenciou os gangliosídios GM3, GM1 e GD2 na superfície das células e, por citometria de fluxo, identificamos uma subpopulação de células GD2 positivas nas MSCs-TA e MSCs-TA diferenciadas para adipócito ou osteoblasto. Entretanto, o percentual de células GD2 positivas decresceu com a diferenciação. A expressão do mRNA da GD2 sintase aumentou na diferenciação adipogênica e diminui na diferenciação osteogênica. O GD2 é um substrato para a biosíntese de gangliosídios complexos e o aumento da expressão da GD2 sintase pode estar relacionado com o aumento de gangliosídios complexos que ocorre durante a diferenciação adipogênica. / Mesenchymal Stem Cells from Adipose Tissue (MSCs-TA) are progenitor cells that reside between adipocytes, and contribute to the turnover of adipose tissue. Gangliosides are glycosphingolipids localized in cell membrane, involved in cell growth regulation, surface interaction, transmembrane signaling and differentiation. The neural ganglioside GD2 has been reported as surface marker for MSCs from bone marrow and umbilical cord, but sparse data exist about the expression of GD2 in MSCs-TA and during the differentiation to adipocytes and osteoblast. Our aim was to study the expression of glangliosides, in special of GD2 in MSCs-TA and during the adipogenic and osteogenic differentiation. Thus MSCs-TA were isolated from lipoaspirate, cultured and induced to adipogenic and osteogenic differentiation. Then, we examined the gangliosides expression by HPTLC, confocal microscopy, flow citometry and real-time PCR. By HPTLC, the MSCs-TA and MSCs-TA differentiated into adipocytes and osteoblast demonstrate an increased complex gangliosides profile. The confocal microscopy showed the presence of GM3, GM1, and GD2 on the cell surface. By the flow cytometry, we identified a GD2 positive subpopulation in MSCs-TA and in MSCs-TA differentiated to adipocytes and osteoblast. However, the percentage of GD2 positive cells decreased with the differentiation. The expression of GD2 synthase mRNA increased during the adipogenic differentiation and decreased in osteogenic differentiation. GD2 is a substrate for the complex gangliosides biosynthesis, and the increase in GD2 synthase expression could be related with the increase in complex gangliosides that occurs during the adipogenic differentiation.

As células tronco mesenquimais de tecido adiposo (MSCs-TA) são células progenitoras que residem entre adipócitos e contribuem para o turnover do tecido adiposo. Gangliosídios são glicoensfigolipídios localizados na membrana das células, envolvidos na regulação do crescimento celular, interação de superfície, sinalização transmembrana e diferenciação celular. O gangliosídio neural GD2 foi relatado como um marcador de superfície de células tronco mesenquimais de medula óssea e cordão umbilical, mas existem poucos dados sobre a expressão do GD2 em MSCs-TA indiferenciadas e nas diferenciadas para adipócito ou osteoblasto. Nosso principal objetivo foi estudar a expressão de gangliosídios nas MSCs-TA, em especial o GD2, durante a diferenciação adipogênica e osteogênica. Para isso, as MSCs-TA foram isoladas de lipoaspirado humano, cultivadas e induzidas para diferenciação adipogênica e osteogênica. As análises foram feitas por HPTLC, microscopia confocal, citometria de fluxo e PCR em tempo real. Por HPTLC, as MSCs-TA indiferenciadas e MSCs-TA diferenciadas para adipócitos e osteoblasto mostraram aumento do perfil de gangliosídios complexos. A microscopia confocal evidenciou os gangliosídios GM3, GM1 e GD2 na superfície das células e, por citometria de fluxo, identificamos uma subpopulação de células GD2 positivas nas MSCs-TA e MSCs-TA diferenciadas para adipócito ou osteoblasto. Entretanto, o percentual de células GD2 positivas decresceu com a diferenciação. A expressão do mRNA da GD2 sintase aumentou na diferenciação adipogênica e diminui na diferenciação osteogênica. O GD2 é um substrato para a biosíntese de gangliosídios complexos e o aumento da expressão da GD2 sintase pode estar relacionado com o aumento de gangliosídios complexos que ocorre durante a diferenciação adipogênica. / Mesenchymal Stem Cells from Adipose Tissue (MSCs-TA) are progenitor cells that reside between adipocytes, and contribute to the turnover of adipose tissue. Gangliosides are glycosphingolipids localized in cell membrane, involved in cell growth regulation, surface interaction, transmembrane signaling and differentiation. The neural ganglioside GD2 has been reported as surface marker for MSCs from bone marrow and umbilical cord, but sparse data exist about the expression of GD2 in MSCs-TA and during the differentiation to adipocytes and osteoblast. Our aim was to study the expression of glangliosides, in special of GD2 in MSCs-TA and during the adipogenic and osteogenic differentiation. Thus MSCs-TA were isolated from lipoaspirate, cultured and induced to adipogenic and osteogenic differentiation. Then, we examined the gangliosides expression by HPTLC, confocal microscopy, flow citometry and real-time PCR. By HPTLC, the MSCs-TA and MSCs-TA differentiated into adipocytes and osteoblast demonstrate an increased complex gangliosides profile. The confocal microscopy showed the presence of GM3, GM1, and GD2 on the cell surface. By the flow cytometry, we identified a GD2 positive subpopulation in MSCs-TA and in MSCs-TA differentiated to adipocytes and osteoblast. However, the percentage of GD2 positive cells decreased with the differentiation. The expression of GD2 synthase mRNA increased during the adipogenic differentiation and decreased in osteogenic differentiation. GD2 is a substrate for the complex gangliosides biosynthesis, and the increase in GD2 synthase expression could be related with the increase in complex gangliosides that occurs during the adipogenic differentiation.

O Diabetes mellitus (DM) é um grande problema de saúde pública, projeções indicam que em 2030, 366 milhões de indivíduos sofrerão da doença. Durante os últimos anos, tornou-se evidente que a ausência de células produtoras de insulina é um denominador comum em todos os tipos de DM. Assim, várias pesquisas têm procurado desenvolver células produtoras de insulina in vitro. A betacelulina (BTC) é uma proteína ligante de EGFR, relacionada com a proliferação de células β pancreáticas in vitro e, com o aumento no metabolismo da glicose em modelos animais do diabetes. As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células multipotentes, presentes na medula óssea, e vastamente estudadas para terapia celular. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da superexpressão do gene da betacelulina sobre células MSCs de ratos. Foi estabelecida uma cultura de longo termo de células MSCs. Após caracterização, estas foram submetidas à transfecção gênica com o gene da BTC por eletroporação. Células transfectadas foram cultivas em meio de cultivo D-MEM suplementado de 10mM Nicotinamida. Análises de radioimunoensaio demonstraram que 104 MSCs transfectadas com o gene da BCT foram capazes de produzir até 0,45 ng/mL de insulina in vitro. In vivo, as células MSC superexpressando BTC foram capazes de diminuir a hiperglicemia induzida por Streptozotocina em ratos. Nossos resultados demonstraram que os efeitos positivos da superexpressão de BTC em MSCs. / Betacellulin (BTC), a ligand of the epidermal growth factor receptor, has been shown to promote growth and differentiation of pancreatic β-cells and to improve glucose metabolism in experimental diabetic rodent models. Mesenchymal stem cells (MSCs) have already been proved to be multipotent. Recent work has attributed to rat and human MSCs the potential to differentiate into insulin secreting cells. Our goal was to evaluate the effects of betacellulin overexpression in rat MSCs. MSCs were characterized by flow cytometry and mesoderm differentiation markers. MSCs were electroporated with a plasmid containing BTC cDNA. Transfected cells were cultivated in H-DMEM with 10mM Nicotinamide. Radioimmunoassay analysis showed that 104 MSC-BTC cells produced up to 0,4ng/mL of insulin, in contrast, MSCs transfected with the empty vector produced insignificant levels of insulin. Also MSC-BTC cells were positive for insulin in immunohistochemistry. RT-PCR showed expression of pancreatic marker genes. When transplanted to streptozotocin diabetic rats, MSC-BTC cells could revert hyperglycemia. Our results demonstrate that BTC overabundance enhances glucose-induced insulin secretion in mesenchymal stem cells in vitro as well as in vivo.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3854.pdf: 3648790 bytes, checksum: 7cf8d19b11b10f9d50e9f3a326c8d0db (MD5) Previous issue date: 2010-10-07 / Universidade Federal de Sao Carlos / The Mesenchymal Stem Cells (MSCs) from adult tissues are at present an attractive source for applications in tissue engineering and cellular therapies. It presents a potential to differentiate into different cell lines as adipocytes, chondrocytes, osteocytes and myocytes. Due to low availability in the tissues and the fact that the demand for therapeutic applications is much larger than the supply capacity has become necessary to expand them in vitro strongly dependent on conservation of their differentiation potential. The MSCs are anchorage dependent, they have the characteristic of adhering to a solid substrate for subsequent proliferation. The conventional procedure of expansion in T-flasks with growth in monolayers, usually involves a difficult monitoring and control process, with high contamination indexi, low cell yield and high cost. In this work, we evaluated a methodology of expansion of hMSC-TERT line in spinner flask with microcarriers (small particles with properties favorable for cell adhesion and proliferation). In the experiments, two type of microcarriers were used, Cytodex 1 non-porous and with positive electric charge and Cultispher S, macroporous and electrically neutral, both in stirred spinner flask of 100 mL in culture medium α-MEM with 15% fetal calf serum, maintained in a CO2 incubator at 37°C and pH between 7.2 and 7.4. To increase productivity, some strategies were adopted during the research as a nutritional balance of the culture medium, addition of microcarriers and dilution and/or replacement of medium during cultivation. Aided by analysis of metabolites by high performance liquid chromatography and optical microscopy, the results showed that it was possible to grow hMSC-TERT with two microcarriers while maintaining good conditions for growth in three dimensions. However, the cell yield was limited mainly by the formation of clusters of microcarriers/extracellular matrix and is possible to obtain a cellular expansion factor of 4.98 with Cytodex 1 and 9,70 with Cultispher S. Because of the easy recovery of the cell showed by later microcarrier, it was performed an analysis of the maintenance of antigenic phenotype by flow cytometry and induction of differentiation into adipocytes and osteocytes. The results confirmed the conversation of phenotypic characteristics of hMSC-TERT with the cultivation technique evaluated in this work. / As Células-Tronco Mesenquimais (CTMs) de tecido adulto são na atualidade uma fonte atrativa para aplicações na engenharia de tecidos e em terapias celulares. Apresentam um potencial de diferenciação em diversas linhagens celulares como adipócitos, condrócitos, osteócitos e miócitos. Devido à baixa disponibilidade nos tecidos e ao fato da demanda para aplicações terapêuticas ser muito maior do que a capacidade de fornecimento tornou-se necessária sua expansão in vitro fortemente condicionada à conservação do seu potencial de diferenciação. As CTMs são dependentes de ancoramento, ou seja, possuem a característica de aderir a um substrato sólido para posterior proliferação. O procedimento convencional de expansão em frascos T, com crescimento em monocamadas, geralmente envolve um processo de difícil monitoramento e controle, com maior índice de contaminação, de baixo rendimento celular e de alto custo. No presente trabalho, avaliou-se uma metodologia de expansão da linhagem hMSC-TERT em frasco spinner com microcarregadores (pequenas partículas com propriedades favoráveis para adesão e proliferação celular). Nos cultivos foram utilizados dois tipos de microcarregadores, Cytodex 1, não poroso e com carga elétrica positiva, e Cultispher S, macroporoso e eletricamente neutro, ambos em frasco spinner agitado de 100 mL, com o meio de cultura α-MEM com 15% de soro fetal bovino, mantidos em incubadora de CO2 a 37ºC e pH entre 7,2 e 7,4. Para aumentar a produtividade celular, algumas estratégias foram adotadas durante a pesquisa como balanceamento nutricional do meio de cultura, adição de microcarregadores e a diluição e/ou a troca do meio durante o cultivo. Auxiliado pela análise de metabólitos por cromatografia líquida de alta eficiência e por microscopia ótica, os resultados obtidos mostraram que foi possível cultivar as CTMs com os dois microcarregadores mantendo boas condições para o crescimento tridimensional. Contudo, o rendimento celular foi limitado, principalmente, pela formação de aglomerados de microcarregadores/matriz extracelular sendo possível obter um fator de expansão celular de 4,98 com o Cytodex 1 e de 9,70 com o Cultispher S. A fácil recuperação da célula, vantagem oferecida por este microcarregador, foi aproveitada para realizar a análise da manutenção do fenótipo antigênico por citometria de fluxo e por indução da diferenciação em adipócitos e osteócitos. Os resultados comprovaram a conservação das características fenotípicas da hMSC-TERT com a técnica de cultivo avaliada neste trabalho.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3855.pdf: 4228860 bytes, checksum: d98f3c071d7a0193e713fbb5f00c1b41 (MD5) Previous issue date: 2011-08-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / The mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent stem cells that can differentiate into various types of tissue, a characteristic that makes them interesting for applications in cell therapy. Moreover, cells are anchorage-dependent (ability to adhere to surfaces), easy isolation and rapid expansion in vitro. The traditional cultures of anchorage-dependent animal cells, usually grown in monolayers, resulting in low crop yield and cell recovery, preventing the use of MSCs in therapeutic applications. The need for alternative farming techniques for expansion of MSCs in a large scale have led researchers to the use of "bioreactor technology," which has been seconded from the bioreactor, spinner flask with microcarriers and hollow fiber (hollow fiber). The objective of this work was to develop a method of cultivation known as mesenchymal stem cell line hMSC-TERT in spinner flasks with microcarriers for subsequent inoculation into hollow-fiber bioreactor, aiming at the efficient expansion and the subsequent recovery of MSCs so that preserve their differentiation potential in order to be used in cell therapy. In cultured, we used the microcarrier Pronectin ® F 100 mL spinner flasks with culture medium α-MEM with 15% fetal calf serum, kept in a CO2 incubator at 37 ° C and pH between 7.2 and 7.4. In cultures in spinner flasks were adopted strategies such as supplementation of the culture medium, exchanges of culture medium during cultivation, addition of reagents to reduce clusters of microcarriers, to increase productivity for the subsequent cell inoculation in hollow fiber bioreactor. The use of these strategies has increased productivity cell, achieving a best result of cell multiplication factor (MCF) of 5.79. However, obtaining higher FMC was drastically limited by the formation of clusters of microcarriers in a gel matrix.The cell recovery was low maintenance and analysis of the antigenic phenotype by flow cytometry confirmed the conservation of phenotypic characteristics of hMSC-TERT. The hollow fiber bioreactor is an alternative to the clusters of microcarriers, it allows oxygenation and adequate supply of nutrients. Thus, in experiments carried out in hollow-fiber bioreactor used the α-MEM supplemented with 15% FBS (v / v), 2.0 g / L glucose, 2.50 mM glutamine, 2.60 mM arginine, 0.07% antifoam PPG. The cells were inoculated after 48 hours of cultivation in spinner flasks in a gel composed of collagen, hyaluronic acid, agar (1.5%) in the proportion 0.75: 0.037: 0.21 at pH 7.2 to 7.4 . Thus, the resulting gel was mixed with culture medium in α-MEM 1:3 ratio, to provide better grip on the fibers. The total expansion factor, ie the one calculated from the inoculation of the spinner to the end of cultivation in hollow fiber bioreactor was 11, 2, which can be considered the greatest value achieved in this work. It is clear that this expansion factor can still be easily overcome by adopting strategies to grow more frequent replacement of culture medium. This hypothesis is strengthened by the proven fact that the microcarriers are not yet saturated with cells at the end of the experiment. / As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células-tronco multipotentes que podem se diferenciar em diversos tipos de tecido, característica que as torna interessantes em aplicações de terapia celular. Além disso, são células dependentes de ancoramento (capacidade de aderir em superfícies), de fácil isolamento e de rápida expansão in vitro. As culturas tradicionais de células animais dependentes de ancoramento, geralmente cultivadas em monocamadas, resultam em baixo rendimento de cultivo e de recuperação celular, inviabilizando o uso das CTMs em aplicações terapêuticas. A necessidade de técnicas de cultivo alternativas para expansão de CTMs em larga escala têm levado pesquisadores à utilização de tecnologia de biorreatores , na qual tem-se destacado dos biorreatores: frasco spinner com microcarregadores e hollow fiber (fibra oca). Assim, o objetivo deste trabalho foi o de desenvolver uma metodologia de cultivo da linhagem de CTM conhecida como hMSC-TERT em frasco spinner com microcarregadores para posterior inoculação em biorreator de fibraoca, visando a expansão eficiente e a posterior recuperação das CTMs de tal forma que, preservassem seu potencial de diferenciação para poderem ser utilizadas na terapia celular. Nos cultivos, utilizou-se o microcarregador Pronectin®F em frasco spinner de 100 mL com o meio de cultura α-MEM com 15% de soro fetal bovino, mantidos em incubadora de CO2 a 37ºC e pH entre 7,2 e 7,4. Nos cultivos em frasco spinner adotaram-se estratégias como suplementação do meio de cultura, trocas de meio de cultura durante o cultivo, adição de reagentes para diminuição de aglomerados de microcarregadores, visando aumentar a produtividade celular para a posterior inoculação em biorreator de fibra oca. A utilização dessas estratégias permitiram aumentar a produtividade celular, obtendo-se como melhor resultado um fator de multiplicação celular (FMC) de 5,79. Contudo, a obtenção de FMC maiores foi drasticamente limitada pela formação de aglomerados de microcarregadores num gel de matriz extracelular. A recuperação celular foi baixa e a análise da manutenção do fenótipo antigênico por citometria de fluxo comprovaram a conservação das características fenotípicas da hMSC-TERT. O biorreator de fibras ocas é uma alternativa em relação aos aglomerados de microcarregadores, pois permite a oxigenação e suprimento adequado de nutrientes. Sendo assim, nos experimentos realizados no biorreator de fibras-ocas utilizou-se o α-MEM suplementado com 15% SFB (v/v), 2,0 g/L de glicose, 2,50 mM de glutamina, 2,60 mM de arginina, 0,07 % do antiespumante PPG. As células foram inoculadas após 48 horas de cultivo em frasco spinner em um gel composto por colágeno: ácido hialurônico: ágar (1,5%) na proporção 0,75: 0,037: 0,21 em pH = 7,2-7,4. Assim, o gel resultante foi misturado com meio de cultura α-MEM na proporção 1:3, para proporcionar melhor aderência nas fibras. O fator de expansão total, ou seja, aquele calculado desde a inoculação do spinner até o final do cultivo no biorreator de fibra oca, foi de 11, 2, que pode ser considerado o maior valor atingido neste trabalho. Convém esclarecer que este fator de expansão ainda pode ser facilmente superado ao se adotarem estratégias de cultivo com trocas mais frequentes de meio de cultura. Esta hipótese é reforçada pelo fato comprovado de os microcarregadores ainda não estarem saturados de células no final do experimento.

Made available in DSpace on 2015-01-20T01:01:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000464699-Texto+Completo-0.pdf: 3304843 bytes, checksum: 1c2d736171549331a5af746072affda0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Mesenchymal stem cells hold great promise for tissues repair and regeneration, including bone defects. The association of these cells to a scaffold which resembles bone tissue structure and physiology is a major challenge in bone tissue engineering. The lyophilized bovine bone has a structure, chemical composition and mechanical properties similar to human bone marrow and acts as an excellent osteoconductive material. This in vitro study aimed to evaluate the growth of bone marrow mononuclear cells (BMMC) on a lyophilized bovine bone scaffold (Orthogen® - Baumer S. A., BR) covered with fibronectin; to verify if different cell densities interfere with the adhesion and proliferation of these cells and to evaluate whether the combination of platelet-rich plasma (PRP) interferes with adhesion and proliferation of BMMC grown on the lyophilized bovine bone scaffold. For this purpose, bone marrow cells obtained from a Kyoto rat were grown on blocks of lyophilized bovine bone coated with fibronectin in DMEM culture medium supplemented with 10% inactivated fetal bovine serum. The Orthogen® samples were distributed into four experimental groups, in triplicate, in three 24 wells culture plates and evaluated in three periods: 72 h, 96 h and 192 h. Group 1: lyophilized bovine bone + BMMC (5 x 104 cells / well); Group 2: lyophilized bovine bone + BMMC + PRP; Group 3: lyophilized bovine bone + fibroblasts (3T3); Group 4: lyophilized bovine bone + BMMC (15 x 104 cells / well). Cultures were incubated with the intercalating agent 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for nuclear staining in order to evaluate the cell population density, by detection with confocal microscopy, of the number of cells adhered to the lyophilized bovine bone scaffolds, after 72 h, 96 h and 192 h. The analysis of the lyophilized bovine bone surface and the morphological aspects of the cells adhered to it was performed on one sample from each group, by scanning electron microscopy (SEM). Analysis of variance (ANOVA) with two factors showed a significant interaction between the main effects evaluated: group and time, with p < 0. 001.Through the results of Bonferroni statistical test, significant difference was found in the average number of nuclei in the period of culture of 96 h in group 3, and the period of culture of 192 h in group 4, which was higher than the other groups. Through SEM analysis, mononuclear cells adhered to the lyophilized bovine bone scaffold were observed only in the groups 3 and 4, in the last, progressively, being already possible to observe cell morphology differentiation and to identify spherical and fusiform cells with cytoplasmic extensions. We concluded that BMMC cultured on a lyophilized bovine bone scaffold coated with fibronectin adhered and proliferated on the bone surface. BMMC cultured at a density of 15 x 104 cells / well, adhered and proliferated on the bone surface more evidently, when compared to the BMMC cultured at a density 5 x 104 cells / well, in the three culture periods evaluated. The association of PRP to BMMC culture on a lyophilized bovine bone scaffold increased, but not with statistical significance, the adhesion and proliferation on the bone surface. / As células-tronco mesenquimais detêm grande promessa para a reparação e regeneração de tecidos, inclusive de defeitos ósseos. A associação destas células a um arcabouço que se assemelhe à estrutura e à fisiologia do tecido ósseo é um dos grandes desafios da engenharia tecidual óssea. O osso bovino liofilizado, com estrutura e composição química similares ao osso humano medular, além de possuir propriedades mecânicas comparáveis às do osso humano, atua como excelente material osteocondutor. O presente estudo in vitro teve como objetivos avaliar o cultivo de células mononucleares de medula óssea (CMMO) sobre um arcabouço de osso bovino liofilizado (OrthoGen® - Baumer S. A., BR) recoberto com fibronectina; verificar se diferentes densidades celulares interferem na proliferação e na adesão destas células e avaliar se a associação de plasma rico em plaquetas (PRP) interfere na adesão e na proliferação das CMMO cultivadas sobre o arcabouço de osso bovino liofilizado. Para isso, células da medula óssea obtidas de um rato Kyoto foram cultivadas sobre blocos de osso bovino liofilizado, recobertos com fibronectina, em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado. As amostras do OrthoGen® foram distribuídas em quatro grupos experimentais, em triplicata, em três placas de cultura com 24 poços e avaliadas em três períodos: 72 h, 96 h e 192 h. Grupo 1: osso bovino liofilizado + CMMO (5 x 104 células/poço); Grupo 2: osso bovino liofilizado + CMMO + PRP; Grupo 3: osso bovino liofilizado + fibroblastos (3T3); Grupo 4: osso bovino liofilizado + CMMO (15 x 104 células/poço). As culturas foram incubadas com o agente intercalante 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para coloração nuclear visando à avaliação de densidade populacional, por meio da detecção por microscopia confocal, do número de células aderidas aos arcabouços de osso bovino liofilizado, após 72 h, 96 h e 192 h. A análise da superfície do osso bovino liofilizado e das características morfológicas das células aderidas sobre ele o foram realizadas em uma amostra de cada grupo, com o auxílio do microscópio eletrônico de varredura. A análise de variância (ANOVA) com dois fatores mostrou interação significativa entre os efeitos principais avaliados: grupo e tempo, com valor de p < 0,001.Através dos resultados do teste estatístico de Bonferroni, verificou-se diferença significativa da média de núcleos no período de cultura de 96 h no grupo 3, e no período de cultura de 192 h no grupo 4, a qual foi maior do que as dos demais grupos. Através da análise por microscopia eletrônica de varredura foram observadas CMMO aderidas ao arcabouço de osso bovino liofilizado somente no grupo 3 e no grupo 4, neste aumentando de forma progressiva, já sendo possível evidenciar diferenciação na morfologia celular e identificar células esféricas e fusiformes com prolongamentos citoplasmáticos. Conclui-se que as CMMO cultivadas sobre um arcabouço de osso bovino liofilizado recoberto com fibronectina aderiram e proliferaram sobre a superfície óssea. As CMMO cultivadas numa densidade de 15 x 104 células / poço, aderiram e proliferaram sobre a superfície óssea de forma mais evidente, quando comparadas às CMMO cultivadas numa densidade 5 x 104 células / poço, nos três períodos de cultura avaliados. A associação de PRP à cultura de CMMO sobre um arcabouço de osso bovino liofilizado aumentou, mas não de forma estatisticamente significativa, a adesão e a proliferação celular sobre a superfície óssea.

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: O tendão flexor digital superficial (TFDS) é uma estrutura importante para a espécie equina e para animais de alto desempenho atlético. Atualmente, a medicina regenerativa vem evoluindo de forma significativa no tratamento de diversas enfermidades, no entanto, o entendimento a respeito do comportamento celular quando do transplante de células tronco mesenquimais (CTMs) em tecido hígido ainda não é completamente conhecido. Sendo assim, este trabalho tem como objetivo a avaliação da resposta inflamatória local após aplicação de células tronco mesenquimais alogênicas derivadas do tecido adiposo (AdCTMs) em tendão equino comparado ao transplante autólogo e ao grupo controle. Para isso, 18 membros torácicos de 9 animais, divididos em três grupos, foram submetidos à aplicação de AdCTMs em tendão hígido, sendo que em Galog os animais receberam aplicação de AdCTMs alogênicas no membro torácico (MT); em Gauto, aplicação de células autólogas no MT e em Gcont aplicou-se o PBS como grupo controle. Esses animais foram avaliados por parâmetros físicos, exames ultrassonográficos e termográficos até o momento da biópsia, que foi realizada uma semana após aplicação das células autólogas e alogênicas para avaliar a possível reação inflamatória aguda, decorrente do implante de células no tecido tendíneo. O transplante alogênico de CTMs não resultou em reação adversa ou inflamatória que comprometesse o uso dessas células, elucidando a sua segurança neste trabalho. O seu comportamento mostrou-se ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The superficial digital flexor tendon (SDFT) is an important structure for the equine species and for high performance animals. Currently, regenerative medicine has evolved significantly in the treatment of several diseases, even though the cellular behavior during the implantation of mesenchymal stem cells in healthy tissue is not completely known, despite the fact that it has been tirelessly studied in the last few years. This study aims to evaluate and compare the local inflammatory response upon injection in equine tendon of either allogeneic and autologous mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (AdMSC). For this purpose, 18 forelimbs, 9 animals were submitted to the application of AdMSC in healthy tendon, which were divided into 3 groups: in Galog the animals received application of allogeneic AdMSC in the thoracic member; in Gauto, autologous AdMSC were injected in the thoracic member; in Gcont, PBS was implanted as control group. These animals were evaluated through physical exams, ultrasound, and thermography up until the moment of the biopsy, which was performed a week after the application of AdMSC in order to evaluate the inflammatory response due to the implantation of the cells in the tendinous tissue. Biopsy samples were taken to histopathology and immunohistochemistry in order to evaluate the actions of allogeneic AdMSC. The allogeneic MSCs implantation did not result in adverse or inflammatory reaction which could compromise the use of these cells,... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre