Estudos relatam alterações cardiovasculares após a estimulação química ou elétrica do córtex pré-límbico (PL) em ratos. O sistema renina-angiotensina (SRA) central está envolvido na regulação do sistema cardiovascular, tendo como um dos principais componentes ativos desse sistema a angiotensina II (ANGII). Além disso, foi demonstrada a presença de um sistema SRA funcional no PL, com a presença de peptídeos e receptores angiotensinérgicos. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi investigar se a estimulação do PL com ANG II induz respostas cardiovasculares mediadas por ativação do sistema nervoso simpático ou por liberação de vasopressina. A microinjeção de ANGII no PL de ratos não anestesiados causou resposta pressora e bradicardíaca de forma dose-dependente. O pré-tratamento sistêmico com o bloqueador ganglionar, pentolínio (5mg/Kg), não alterou a resposta pressora, mas bloqueou a resposta bradicárdiaca causada pela microinjeção de ANGII no PL, sugerindo que o sistema nervoso simpático não medeia a resposta pressora. Além disso, o pré-tratamento sistêmico com antagonista dos receptores vasopressinérgicos do tipo V1, o dTyr(CH2)5(Me)AVP (50 g/kg), bloqueou as respostas cardiovasculares causadas pela microinjeção de ANGII no PL, demonstrando o envolvimento do mecanismo vasopressinérgico humoral na mediação destas respostas. Centralmente, o pré-tratamento do PL com o antagonista AT1, candesartan, bloqueou a resposta cardiovascular induzida pela microinjeção de ANGII, assim como o pré-tratamento com CGP42112A, antagonista AT2, foi capaz de atenuar as respostas cardiovasculares induzidas pela microinjeção de ANGII, sugerindo o envolvimento de ambos os receptores no desencadeamento dessas respostas cardiovasculares. Foi investigada a participação do sistema noradrenérgico no desencadeamento das respostas cardiovasculares à ANGII, através da administração local de um antagonista de receptores 1- adrenérgicos, o WB4101; o qual foi efetivo em reduzir a resposta pressora sem alterar a resposta bradicardíaca à ANGII. Em conclusão, a administração de ANGII no PL de ratos não-anestesiados, através da estimulação de receptores AT1 e AT2, evoca respostas pressoras e bradicardíacas mediadas por liberação sistêmica de vasopressina, envolvendo também a participação do sistema noradrenérgico do PL. / Previous studies have reported cardiovascular responses after chemical or electrical stimulation of the prelimbic cortex (PL) in rats. The central renin-angiotensin system (RAS) is involved in the regulation of the cardiovascular system, being angiotensin II (ANG II) one of the major active components of this system. Furthermore, there are angiotensinergic receptors and peptides in the PL, indicating the presence of a functional RAS in this brain area. Thus, the aim of this study was to investigate if the PL stimulation with ANG II induces cardiovascular responses mediated by activation of the sympathetic nervous system or through the release of vasopressin. ANG II microinjection into the PL of anesthetized rats caused pressor and bradycardiac responses, in a dose-dependent manner. Systemic pretreatment with the ganglionic blocker pentolinium (5 mg / kg) did not affect the pressor response, but blocked the bradycardiac response induced by ANG II, suggesting that the sympathetic nervous system does not mediate the pressor response. Furthermore, systemic pretreatment with the V1-vasopressinergic receptor antagonist, dTyr (CH2) 5 (Me) AVP (50 mg / kg) blocked the cardiovascular responses caused by the microinjection of ANG II into the PL, demonstrating the involvement of the humoral vasopressinergic mechanism in the mediation of these responses. PL pretreatment with the AT1 antagonist candesartan blocked the cardiovascular response induced by the microinjection of ANG II, while PL pretreatment with CGP42112A, an AT2 antagonist, attenuated the cardiovascular responses induced by microinjection of ANG II, suggesting the local involvement of both receptors in triggering these cardiovascular responses. We also investigated the participation of the local noradrenergic system in the triggering of cardiovascular responses to ANG II pretreating the PLwith the 1- adrenergic receptor antagonist WB4101. The pretreatment with WB4101 reduced the pressor response without changing the bradycardiac response. In summary, administration ANG II into the PL of non-anesthetized rats evoked pressor and bradycardiac responses mediated by local stimulation of AT1 and AT2 receptors, with concomitant involvement PL noradrenergic mechanisms, and systemic release of vasopressin.

Estudos relatam alterações cardiovasculares após a estimulação química ou elétrica do córtex pré-límbico (PL) em ratos. O sistema renina-angiotensina (SRA) central está envolvido na regulação do sistema cardiovascular, tendo como um dos principais componentes ativos desse sistema a angiotensina II (ANGII). Além disso, foi demonstrada a presença de um sistema SRA funcional no PL, com a presença de peptídeos e receptores angiotensinérgicos. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi investigar se a estimulação do PL com ANG II induz respostas cardiovasculares mediadas por ativação do sistema nervoso simpático ou por liberação de vasopressina. A microinjeção de ANGII no PL de ratos não anestesiados causou resposta pressora e bradicardíaca de forma dose-dependente. O pré-tratamento sistêmico com o bloqueador ganglionar, pentolínio (5mg/Kg), não alterou a resposta pressora, mas bloqueou a resposta bradicárdiaca causada pela microinjeção de ANGII no PL, sugerindo que o sistema nervoso simpático não medeia a resposta pressora. Além disso, o pré-tratamento sistêmico com antagonista dos receptores vasopressinérgicos do tipo V1, o dTyr(CH2)5(Me)AVP (50 g/kg), bloqueou as respostas cardiovasculares causadas pela microinjeção de ANGII no PL, demonstrando o envolvimento do mecanismo vasopressinérgico humoral na mediação destas respostas. Centralmente, o pré-tratamento do PL com o antagonista AT1, candesartan, bloqueou a resposta cardiovascular induzida pela microinjeção de ANGII, assim como o pré-tratamento com CGP42112A, antagonista AT2, foi capaz de atenuar as respostas cardiovasculares induzidas pela microinjeção de ANGII, sugerindo o envolvimento de ambos os receptores no desencadeamento dessas respostas cardiovasculares. Foi investigada a participação do sistema noradrenérgico no desencadeamento das respostas cardiovasculares à ANGII, através da administração local de um antagonista de receptores 1- adrenérgicos, o WB4101; o qual foi efetivo em reduzir a resposta pressora sem alterar a resposta bradicardíaca à ANGII. Em conclusão, a administração de ANGII no PL de ratos não-anestesiados, através da estimulação de receptores AT1 e AT2, evoca respostas pressoras e bradicardíacas mediadas por liberação sistêmica de vasopressina, envolvendo também a participação do sistema noradrenérgico do PL. / Previous studies have reported cardiovascular responses after chemical or electrical stimulation of the prelimbic cortex (PL) in rats. The central renin-angiotensin system (RAS) is involved in the regulation of the cardiovascular system, being angiotensin II (ANG II) one of the major active components of this system. Furthermore, there are angiotensinergic receptors and peptides in the PL, indicating the presence of a functional RAS in this brain area. Thus, the aim of this study was to investigate if the PL stimulation with ANG II induces cardiovascular responses mediated by activation of the sympathetic nervous system or through the release of vasopressin. ANG II microinjection into the PL of anesthetized rats caused pressor and bradycardiac responses, in a dose-dependent manner. Systemic pretreatment with the ganglionic blocker pentolinium (5 mg / kg) did not affect the pressor response, but blocked the bradycardiac response induced by ANG II, suggesting that the sympathetic nervous system does not mediate the pressor response. Furthermore, systemic pretreatment with the V1-vasopressinergic receptor antagonist, dTyr (CH2) 5 (Me) AVP (50 mg / kg) blocked the cardiovascular responses caused by the microinjection of ANG II into the PL, demonstrating the involvement of the humoral vasopressinergic mechanism in the mediation of these responses. PL pretreatment with the AT1 antagonist candesartan blocked the cardiovascular response induced by the microinjection of ANG II, while PL pretreatment with CGP42112A, an AT2 antagonist, attenuated the cardiovascular responses induced by microinjection of ANG II, suggesting the local involvement of both receptors in triggering these cardiovascular responses. We also investigated the participation of the local noradrenergic system in the triggering of cardiovascular responses to ANG II pretreating the PLwith the 1- adrenergic receptor antagonist WB4101. The pretreatment with WB4101 reduced the pressor response without changing the bradycardiac response. In summary, administration ANG II into the PL of non-anesthetized rats evoked pressor and bradycardiac responses mediated by local stimulation of AT1 and AT2 receptors, with concomitant involvement PL noradrenergic mechanisms, and systemic release of vasopressin.

O córtex pré-límbico (PL) é uma importante área límbica envolvida em vários processos funcionais correlatos ao estresse, tais como respostas cardiovasculares, hormonais e comportamentais. O modelo de estresse de restrição (ER) foi padronizado na literatura como uma situação aversiva capaz de promover aumento da pressão arterial e frequência cardíaca, queda da temperatura cutânea e estimulação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA). Trabalhos da literatura evidenciaram que ratos submetidos ao ER apresentavam aumento da atividade neuronial no PL, sugerindo que essa estrutura module respostas ao ER. Assim, a inibição temporária de sinapses no PL potencializou a resposta taquicárdica induzida pelo ER, sem alterar a resposta pressora. Além do controle cardiovascular, outros trabalhos demonstraram que o PL também participa do controle hormonal durante o ER. O ER agudo também está envolvido com a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), fator que pode estar envolvido nas alterações a longo prazo observadas após exposição a uma situação aversiva. O sistema renina angiotensina (SRA) central modula respostas cardiovasculares, inclusive aquelas induzidas por situações aversivas, além de ter um papel reconhecido na produção de EROs. Além disso, foi demonstrado que o PL possui SRA funcional com presença dos peptídeos a ele relacionados. Baseado nos fatos mencionados acima, a hipótese do presente projeto é que a neurotransmissão angiotensinérgica do PL está envolvida na modulação de respostas autonômicas (aumento de pressão arterial e frequência cardíaca, e queda da temperatura cutânea) e hormonal (aumento plasmático de corticosterona) evocadas pelo ER, e que essa via envolveria a formação de EROs. A microinjeção do inibidor da enzima conversora de angiotensina (ECA) lisinopril no PL, nas doses de 0,5 e 1nmol/100nL, reduziu a resposta pressora, sendo a dose de 1nmol/100nL de lisinopril também capaz de reduzir a resposta taquicárdica induzida pelo ER; porém nenhuma dose utilizada ocasionou mudanças na queda da temperatura cutânea evocada pelo ER. O pré-tratamento do PL com o antagonista de receptores do subtipo AT1 candesartan reduziu o efeito pressor induzido pelo ER, porém não alterou a resposta taquicárdica e queda da temperatura cutânea associadas ao ER. Por sua vez, o pré-tratamento com o antagonista de receptores do subtipo AT2, PD123177, reduziu a resposta taquicárdica sem alterar a resposta pressora e a queda da temperatura cutânea evocadas pelo ER. Em adição, o estresse de restrição agudo e os pré-tratamentos realizados não foram capazes de alterar a atividade da enzima NADPH oxidase no PL. Em conclusão, os presentes resultados sugerem a participação do SRA na modulação da resposta cardiovascular ao ER, através da ativação de receptores AT1, e AT2 do PL, afetando respectivamente, o componente vascular e o cardíaco da resposta autonômica causada pelo ER. Além disso, os resultados da atividade da enzima NADPH oxidase no PL sugerem que o ER agudo, os receptores AT1, AT2 e a ECA não modulam o status oxidativo local. / The prelimbic cortex is an important limbic structure involved in several stressrelated functional processes, such as cardiovascular, hormonal and behavior responses. Restraint stress (RS) was standardized in literature as an aversive situation able to promote blood pressure and heart rate increases, reduction in tail temperature and stimulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA). Previous studies demonstrated that rats submitted to RS exhibited increased neuronal activity in the PL, suggesting that this structure modulates RS-evoked responses. Temporary, synaptic temporary inhibition in the PL markedly increased the RS-evoked tachycardiac response, without affecting the pressor one. Beyond cardiovascular control, other studies demonstrated that PL also participates in hormonal control during RS. Acute RS is also involved in the production of reactive oxygen species (ROS), which could be involved in long- term changes observed after exposure to an aversive situation. The central renin-angiotensin system (RAS) modulates cardiovascular responses, including those induced by aversive situations. In addition, this system has a well-known role in ROS production. Furthermore, the presence of angiotensinergic peptides in PL has also been demonstrated, suggesting the existence of a functional RAS in this structure. Based on the facts mentioned above, the hypothesis of the present study was that the angiotensinergic neurotransmission in PL is involved in the modulation of autonomic responses (blood pressure and heart rate increase, and reduction in tail temperature) evoked by RS, and this pathway would involve ROS formation. Microinjection of lisinopril (0.5 and 1nmol/100nL), an inhibitor of angiotensinconverting enzyme (ACE), into PL reduced the pressor response, and the dose 1nmol/nL was also able to reduce the tachycardiac response induced by RS; however, none of doses changed the reduction in tail temperature evoked by RS. PL treatment with candesartan, an AT1 receptors antagonist, reduced the RS-evoked pressor response, but did not affect the RS-evoked tachycardiac response and reduction in tail temperature. In addition, pretreatment with PD123177, an AT2 receptors antagonist, reduced the RS-evoked tachycardiac response, without affecting the pressor response or the RS-evoked reduction in tail temperature. In addition, neither acute RS or local treatments affected NADPH oxidase activity in the PL. In conclusion, the present results suggests the involvement of the central RAS in the modulation of the cardiovascular responses caused by RS, through the activation of both AT1 and AT2 receptors in the PL. The PL AT1 receptors modulating the vascular, and the AT2 modulating the cardiac component of RS-evoked autonomic response. Furthermore, our study suggests that neither acute RS or local AT1, AT2 and ACE affect oxidative status in the PL.

O córtex pré-límbico (PL) é uma importante área límbica envolvida em vários processos funcionais correlatos ao estresse, tais como respostas cardiovasculares, hormonais e comportamentais. O modelo de estresse de restrição (ER) foi padronizado na literatura como uma situação aversiva capaz de promover aumento da pressão arterial e frequência cardíaca, queda da temperatura cutânea e estimulação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA). Trabalhos da literatura evidenciaram que ratos submetidos ao ER apresentavam aumento da atividade neuronial no PL, sugerindo que essa estrutura module respostas ao ER. Assim, a inibição temporária de sinapses no PL potencializou a resposta taquicárdica induzida pelo ER, sem alterar a resposta pressora. Além do controle cardiovascular, outros trabalhos demonstraram que o PL também participa do controle hormonal durante o ER. O ER agudo também está envolvido com a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), fator que pode estar envolvido nas alterações a longo prazo observadas após exposição a uma situação aversiva. O sistema renina angiotensina (SRA) central modula respostas cardiovasculares, inclusive aquelas induzidas por situações aversivas, além de ter um papel reconhecido na produção de EROs. Além disso, foi demonstrado que o PL possui SRA funcional com presença dos peptídeos a ele relacionados. Baseado nos fatos mencionados acima, a hipótese do presente projeto é que a neurotransmissão angiotensinérgica do PL está envolvida na modulação de respostas autonômicas (aumento de pressão arterial e frequência cardíaca, e queda da temperatura cutânea) e hormonal (aumento plasmático de corticosterona) evocadas pelo ER, e que essa via envolveria a formação de EROs. A microinjeção do inibidor da enzima conversora de angiotensina (ECA) lisinopril no PL, nas doses de 0,5 e 1nmol/100nL, reduziu a resposta pressora, sendo a dose de 1nmol/100nL de lisinopril também capaz de reduzir a resposta taquicárdica induzida pelo ER; porém nenhuma dose utilizada ocasionou mudanças na queda da temperatura cutânea evocada pelo ER. O pré-tratamento do PL com o antagonista de receptores do subtipo AT1 candesartan reduziu o efeito pressor induzido pelo ER, porém não alterou a resposta taquicárdica e queda da temperatura cutânea associadas ao ER. Por sua vez, o pré-tratamento com o antagonista de receptores do subtipo AT2, PD123177, reduziu a resposta taquicárdica sem alterar a resposta pressora e a queda da temperatura cutânea evocadas pelo ER. Em adição, o estresse de restrição agudo e os pré-tratamentos realizados não foram capazes de alterar a atividade da enzima NADPH oxidase no PL. Em conclusão, os presentes resultados sugerem a participação do SRA na modulação da resposta cardiovascular ao ER, através da ativação de receptores AT1, e AT2 do PL, afetando respectivamente, o componente vascular e o cardíaco da resposta autonômica causada pelo ER. Além disso, os resultados da atividade da enzima NADPH oxidase no PL sugerem que o ER agudo, os receptores AT1, AT2 e a ECA não modulam o status oxidativo local. / The prelimbic cortex is an important limbic structure involved in several stressrelated functional processes, such as cardiovascular, hormonal and behavior responses. Restraint stress (RS) was standardized in literature as an aversive situation able to promote blood pressure and heart rate increases, reduction in tail temperature and stimulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA). Previous studies demonstrated that rats submitted to RS exhibited increased neuronal activity in the PL, suggesting that this structure modulates RS-evoked responses. Temporary, synaptic temporary inhibition in the PL markedly increased the RS-evoked tachycardiac response, without affecting the pressor one. Beyond cardiovascular control, other studies demonstrated that PL also participates in hormonal control during RS. Acute RS is also involved in the production of reactive oxygen species (ROS), which could be involved in long- term changes observed after exposure to an aversive situation. The central renin-angiotensin system (RAS) modulates cardiovascular responses, including those induced by aversive situations. In addition, this system has a well-known role in ROS production. Furthermore, the presence of angiotensinergic peptides in PL has also been demonstrated, suggesting the existence of a functional RAS in this structure. Based on the facts mentioned above, the hypothesis of the present study was that the angiotensinergic neurotransmission in PL is involved in the modulation of autonomic responses (blood pressure and heart rate increase, and reduction in tail temperature) evoked by RS, and this pathway would involve ROS formation. Microinjection of lisinopril (0.5 and 1nmol/100nL), an inhibitor of angiotensinconverting enzyme (ACE), into PL reduced the pressor response, and the dose 1nmol/nL was also able to reduce the tachycardiac response induced by RS; however, none of doses changed the reduction in tail temperature evoked by RS. PL treatment with candesartan, an AT1 receptors antagonist, reduced the RS-evoked pressor response, but did not affect the RS-evoked tachycardiac response and reduction in tail temperature. In addition, pretreatment with PD123177, an AT2 receptors antagonist, reduced the RS-evoked tachycardiac response, without affecting the pressor response or the RS-evoked reduction in tail temperature. In addition, neither acute RS or local treatments affected NADPH oxidase activity in the PL. In conclusion, the present results suggests the involvement of the central RAS in the modulation of the cardiovascular responses caused by RS, through the activation of both AT1 and AT2 receptors in the PL. The PL AT1 receptors modulating the vascular, and the AT2 modulating the cardiac component of RS-evoked autonomic response. Furthermore, our study suggests that neither acute RS or local AT1, AT2 and ACE affect oxidative status in the PL.

Extensos dados na literatura têm assinalado a importância da serotonina (5-HT) na modulação de comportamentos de medo e ansiedade em roedores, a grande maioria utilizando ratos machos como sujeitos experimentais. No presente trabalho, foi analisada a influência da neurotransmissão 5-HT periférica e central sobre a expressão da resposta de medo condicionado e incondicionado de ratos machos e fêmeas, previamente selecionados pelo fenótipo como animais de baixa (BA) ou de alta (AA) reatividade emocional. Para este fim foi utilizado o teste do sobressalto potencializado pelo medo (SPM). A influência global e central de 5-HT foi avaliada pela utilização da administração sistêmica ou intraventricular aguda do inibidor irreversível da enzima triptofano hidroxilase PCPA (p-clorofenilalanina) nas doses de 200 mg/mL (i.p.) e 200 µg/5 µL (i.v.), ou através de infusões locais de 5-HT (10 nmol/0.2 µL) ou do agonista seletivo de receptores 5-HT1A 8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)-tetralina (8-OH-DPAT) na dose de 0,3 µg/0.2 µL, diretamente em áreas encefálicas conhecidas por sua influência na modulação do medo e ansiedade a saber: o córtex pré-limbico (CPL), o núcleo basolateral da amígdala (BLA), e a substância cinzenta periaqueductal dorsal (SCPd) do mesencéfalo. As variáveis dependentes registradas foram a amplitude e a latência das respostas incondicionadas e condicionadas de sobressalto e a amplitude do SPM. / Extensive data in the literature have signaled the importance of serotonin (5-HT) on the modulation of fear and anxiety-like behaviors in rodents. In the present study, we have analyzed the influence of peripheral and central 5-HT neurotransmission on the expression of the conditioned and unconditioned fear, and on the fear-potentiated startle in male and female rats previously selected as low- (LA) or high-anxiety (HA). For this purpose, we used the fear-potentiated startle (FPS) test. The global and central influence of 5-HT was evaluated by using the acute systemic or intraventricular administration of the irreversible tryptophan hydroxylase inhibitor PCPA (p-chlorophenylalanine - 200 mg/mL i.p., or 200 µg/5 µL i.v.). Local effects were evaluated through local infusions of 5-HT itself (10 nmol/0.2 µL) or the selective 5-HT1A receptors agonist 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)-tetralin (8-OH-DPAT 0.3 µg/0.2 µL) in the prelimbic cortex (PrL), basolateral amygdala (BLA) or the dorsal periaqueductal gray (DPAG). These brain regions were chosen for the present study based on their great importance in the modulation and expression of conditioned and unconditioned fear. Dependent variables recorded were the amplitude and latency of unconditioned and conditioned fear, and fear-potentiated startle (FPS).

Extensos dados na literatura têm assinalado a importância da serotonina (5-HT) na modulação de comportamentos de medo e ansiedade em roedores, a grande maioria utilizando ratos machos como sujeitos experimentais. No presente trabalho, foi analisada a influência da neurotransmissão 5-HT periférica e central sobre a expressão da resposta de medo condicionado e incondicionado de ratos machos e fêmeas, previamente selecionados pelo fenótipo como animais de baixa (BA) ou de alta (AA) reatividade emocional. Para este fim foi utilizado o teste do sobressalto potencializado pelo medo (SPM). A influência global e central de 5-HT foi avaliada pela utilização da administração sistêmica ou intraventricular aguda do inibidor irreversível da enzima triptofano hidroxilase PCPA (p-clorofenilalanina) nas doses de 200 mg/mL (i.p.) e 200 µg/5 µL (i.v.), ou através de infusões locais de 5-HT (10 nmol/0.2 µL) ou do agonista seletivo de receptores 5-HT1A 8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)-tetralina (8-OH-DPAT) na dose de 0,3 µg/0.2 µL, diretamente em áreas encefálicas conhecidas por sua influência na modulação do medo e ansiedade a saber: o córtex pré-limbico (CPL), o núcleo basolateral da amígdala (BLA), e a substância cinzenta periaqueductal dorsal (SCPd) do mesencéfalo. As variáveis dependentes registradas foram a amplitude e a latência das respostas incondicionadas e condicionadas de sobressalto e a amplitude do SPM. / Extensive data in the literature have signaled the importance of serotonin (5-HT) on the modulation of fear and anxiety-like behaviors in rodents. In the present study, we have analyzed the influence of peripheral and central 5-HT neurotransmission on the expression of the conditioned and unconditioned fear, and on the fear-potentiated startle in male and female rats previously selected as low- (LA) or high-anxiety (HA). For this purpose, we used the fear-potentiated startle (FPS) test. The global and central influence of 5-HT was evaluated by using the acute systemic or intraventricular administration of the irreversible tryptophan hydroxylase inhibitor PCPA (p-chlorophenylalanine - 200 mg/mL i.p., or 200 µg/5 µL i.v.). Local effects were evaluated through local infusions of 5-HT itself (10 nmol/0.2 µL) or the selective 5-HT1A receptors agonist 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)-tetralin (8-OH-DPAT 0.3 µg/0.2 µL) in the prelimbic cortex (PrL), basolateral amygdala (BLA) or the dorsal periaqueductal gray (DPAG). These brain regions were chosen for the present study based on their great importance in the modulation and expression of conditioned and unconditioned fear. Dependent variables recorded were the amplitude and latency of unconditioned and conditioned fear, and fear-potentiated startle (FPS).