Made available in DSpace on 2016-01-07T13:36:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bianca_vitorio_ioc_mest_2014.pdf: 8997482 bytes, checksum: 58bdb04feb407967d076809db7227935 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As diversas espécies de Leishmania são parasitas de considerável importância médica e econômica. As drogas atualmente utilizadas no tratamento da leishmaniose apresentam efeitos adversos, alta toxicidade, elevado custo e surgimento de cepas resistentes. Nesse contexto, inibidores proteolíticos é uma alternativa para o tratamento desta doença. Este estudo está focado nas calpaínas, que compreendem uma família de cisteína peptidases neutras dependentes de cálcio, envolvidas numa ampla variedade de funções fisiológicas. As calpaínas estão envolvidas em importantes doenças humanas, portanto inibidores de calpaínas já vêm sendo desenvolvidos e testados para o tratamento dessas doenças, alguns encontra-se em estágios avançados de triagem clínica. Dessa forma, o presente trabalho avalia a expressão e identificação de homólogos das calpaínas em Leishmania braziliensis e o efeito do inibidor de calpaínas MDL28170 em ensaios in vitro. Através da busca por sequências no GenBank, alinhamentos múltiplos, filogenia e análise de domínios conservados nas sequências obtidas, selecionamos como alvo inicial sequências de calpaínas que possuíam o maior número de domínios conservados. A análise da expressão gênica relativa indica que 13 das 20 calpaínas estudadas apresentam níveis constitutivos de mRNA nas formas procíclica e metacíclica de L. braziliensis. A expressão de cinco alvos é maior na forma procíclica, e a de um alvo é maior na forma metacíclica e há expressão estágio específica de apenas um alvo na forma procíclica. A partir de análises in silico, das sequências proteicas dessas calpaínas, selecionamos uma região consenso e um peptídeo correspondente a essa região foi sintetizado e empregado na imunização de coelhos A reatividade do anticorpo gerado (Anti-TryTrip CALPAIN) foi avaliada por Western blotting, citometria de fluxo e imunocitoquímica. Em ensaios de Western blotting,verificamos que o anticorpo foi capaz de reagir contra uma proteína de 50 kDa. Já na imunolocalização foi possível observar calpaínas dispersas no citoplasma, membrana e núcleo. Além disso, através de citometria de fluxo, as moléculas homólogas às calpaínas foram identificadas em maior abundância no interior das células. Nos ensaios de inibição com o MDL28170, inibidor de calpaínas, foi possível observar a redução da proliferação nas formas promastigotas recém isoladas e múltiplas passagens de forma dose-dependente nas diferentes concentrações do inibidor ao longo de quatro dias. O efeito reversíveldo inibidor também foi avaliado nas formas promastigotas, com taxas menores comparado com o controle. O efeito do inibidor, também foi capaz de diminuir de maneira dose-dependente o índice de associação e aumentou o percentual de células com parasitos aderidos durante o processo de interação com macrófagos peritoneais. O parasito aumentou a expressão de uma peptidse clássica (gp63) quando tratado com o MDL28170, já a expressão de calpaínas e cpb não foi alterada pelo estresse induzido pelo composto. Estes dados sugerem mais estudos para melhor caracterizar as calpaínas em L. braziliensis e sugerem uma maior avaliação para uma possível associação de moléculas similares as calpaínas com a virulência ou não do parasito. Assim este trabalho acrescenta novas possibilidades para a utilização de inibidores de calpaínas como um potencial alvo de desenvolvimento para o tratamento da leishmaniose / The various species of Leishmania are parasites of considerable medical and economic importance. The drugs used in the treatment of leishmaniasis have adverse effects, high toxicity, high cost and emergence of resistant strains. In this context, proteolytic inhibitors could be an alternative for the treatment of this disease. This study is focused on calpains, which comprise a family of neutral cysteine peptidases, which are strictly dependent of calcium, and are there of known as Calcium Dependent Peptidases.These enzymes play a variety of physiological functions, and are involved in human diseases, therefore calpains inhibitors are under trial to treat these diseases. Thus, this study aimed to assess calpain expression levels in Leishmania braziliensis, as well as the effect of the calpain inhibitor MDL28170 in vitro. Through the searching for sequencesin GenBank, multiple alignments, and phylogenetic analysis of the obtained sequences conserved domains, selected as an initial target sequences of calpain which possessed the greatest number of conserved domains. In this sense, we assessed the expression levels of mRNA from a group of twenty sequences containing archetypal calpain domain. The analysis indicated that 13 out of the 20 studied calpains have constitutive levels of mRNA between the procyclic and metacyclic forms of L. braziliensis, while five calpains presented higher expression levels at the procyclic stage, and only one sequence is augmented at the metacyclic stage. One calpain molecule was found to be procyclic-specific. After that, we selected a consensus region and a peptide was synthesized and used to immunize rabbits. The reactivity of the antibody (anti-calpainTryTrip) was evaluated by Western blotting, flow cytometry and immunocytochemistry. In Western blotting assays, we found that the anti-calpain TriTryp antibody was able to recognize a 50 kDa protein. The immunolocalization assays revealed calpain molecules present at the membrane, nucleus and dispersed throughout the cytoplasm. Also, by flow cytometry, molecules homologous to calpains have been identified in abundance within cells. In inhibition assays employing MDL28170, a potent and specific calpain inhibitor, it was possible to observe a dose-dependent reduction in the proliferation rate, either in freshly isolated promastigotes or multiple passages parasites. MDL28170 presents a reversible inhibitory effect. The inhibitor was also able to decrease in a dose-dependent manner the association index and the percentage of host cells with attached parasites during the process of interaction with peritoneal macrophages. Finally, MDL28170 enhanced the expression of gp63 molecules, while cpb and calpains expression were not affect. Further studies to better characterize the calpain in L. braziliensis should be performed, aiming to add new possibilities for the exploitation of calpain inhibitors as a potential for the treatment of leishmaniasis. / The various species of Leishmania are parasites of considerable medical and economic importance. The drugs used in the treatment of leishmaniasis have adverse effects, high toxicity, high cost and emergence of resistant strains. In this context, proteolytic inhibitors could be an alternative for the treatment of this disease. This study is focused on calpains, which comprise a family of neutral cysteine peptidases, which are strictly dependent of calcium, and are there of known as Calcium Dependent Peptidases.These enzymes play a variety of physiological functions, and are involved in human diseases, therefore calpains inhibitors are under trial to treat these diseases. Thus, this study aimed to assess calpain expression levels in Leishmania braziliensis, as well as the effect of the calpain inhibitor MDL28170 in vitro. Through the searching for sequencesin GenBank, multiple alignments, and phylogenetic analysis of the obtained sequences conserved domains, selected as an initial target sequences of calpain which possessed the greatest number of conserved domains. In this sense, we assessed the expression levels of mRNA from a group of twenty sequences containing archetypal calpain domain. The analysis indicated that 13 out of the 20 studied calpains have constitutive levels of mRNA between the procyclic and metacyclic forms of L. braziliensis, while five calpains presented higher expression levels at the procyclic stage, and only one sequence is augmented at the metacyclic stage. One calpain molecule was found to be procyclic-specific. After that, we selected a consensus region and a peptide was synthesized and used to immunize rabbits. The reactivity of the antibody (anti-calpainTryTrip) was evaluated by Western blotting, flow cytometry and immunocytochemistry. In Western blotting assays, we found that the anti-calpain TriTryp antibody was able to recognize a 50 kDa protein. The immunolocalization assays revealed calpain molecules present at the membrane, nucleus and dispersed throughout the cytoplasm. Also, by flow cytometry, molecules homologous to calpains have been identified in abundance within cells. In inhibition assays employing MDL28170, a potent and specific calpain inhibitor, it was possible to observe a dose-dependent reduction in the proliferation rate, either in freshly isolated promastigotes or multiple passages parasites. MDL28170 presents a reversible inhibitory effect. The inhibitor was also able to decrease in a dose-dependent manner the association index and the percentage of host cells with attached parasites during the process of interaction with peritoneal macrophages. Finally, MDL28170 enhanced the expression of gp63 molecules, while cpb and calpains expression were not affect. Further studies to better characterize the calpain in L. braziliensis should be performed, aiming to add new possibilities for the exploitation of calpain inhibitors as a potential for the treatment of leishmaniasis.

Os agonistas beta-adrenérgicos (βAA) são conhecidos por aumentar a hipertrofia muscular e lipólise, neste caso uma maneira de se reduzir o efeito da lipólise seria a imunocastração. Dessa forma, o objetivo deste projeto foi avaliar o efeito dos βAA e da imunocastração sobre a qualidade da carne de bovinos Nelore. Foram utilizados noventa e seis bovinos Nelore, sendo que metade dos animais (n=48) receberam uma dose da vacina de imunocastração, e após 30 dias receberam a segunda dose. A outra metade dos animais (n=48) não recebeu nenhuma dose da vacina. Durante 70 dias os animais foram alimentados com uma dieta padrão composta de 24% volumoso e 76% de concentrado. Após 70 dias de confinamento os animais foram divididos em três grupos, dentro de bloco (peso inicial) e condição sexual e foram alimentados por 30 dias, com umas das seguintes dietas: CON - dieta padrão utilizada na fase anterior, sem a adição de βAA; ZIL - dieta padrão acrescida de 80 mg/dia Cloridrato de Zilpaterol; RAC - dieta padrão acrescida de 300 mg/dia Cloridrato de Ractopamina. Ao final desse período os animais foram abatidos e colhidas amostras do músculo Longissimus dorsi para as avaliações de qualidade de carne, lipídeos totais, perfil de ácidos graxos, análise sensorial do consumidor, perfil morfométrico muscular, expressão dos genes calpaína e calpastatina, comprimento de sarcômero. Para a maioria das características avaliadas não foram observadas interações entre os tratamentos. Ao avaliar o efeito da condição sexual, os animais imunocastrados apresentaram maiores intensidades de cor L, a e b, lipídios totais, ácidos oleico, palmítico e total de monoinsaturados e maior frequência para as fibras oxidativas (FO) e glicolíticas (FG) em relação aos não-castrados. Contudo, os animais não-castrados tiveram uma tendência a apresentarem uma carne mais macia na análise sensorial e obtiveram maior frequência das fibras oxidativasglicolíticas (FOG) em relação aos imunocastrados. Quanto ao efeito dos βAA, o grupo ZIL apresentaram uma carne menos macia na força de cisalhamento, maiores concentrações de ácidos heptadecanoico, linoleico, araquidonico ácido C20:3 N6C8C11C14, ômega 6, maior frequência para as FO e menor para FG em comparação ao grupo RAC e CON. No entanto, os animais do grupo CON e ZIL apresentaram maior área para as FO em comparação ao grupo RAC, enquanto que para as FOG, os animais do grupo CON tiveram maior área do que os animais do grupo RAC e ZIL. Na análise sensorial, os grupos RAC e ZIL receberam menores notas para os atributos textura e qualidade global em relação ao CON. Não foi observado efeito da condição sexual e dos βAA sobre a expressão dos genes e comprimento de sarcômero. Conclui-se que a condição sexual e a suplementação com os βAA podem alterar a qualidade da carne, perfil de ácidos graxos e morfométrico muscular, sem, contudo, alterar a expressão dos genes e do comprimento de sarcômero. / The Beta adrenergic agonist (βAA) are knowed for increase muscle hypertrophy and lipolysis, in this case on way for decrease the lipolysis effect is use the immunocastration. The objective of this research was evaluated the effect of βAA and immunocastration on meat quality of Nellore . Ninety-six Nellore were fed in this trial; half of the animals (n = 48) received one dose of immunocastration vaccine on d 0, and received another dose at d 30. The other half of animals (n = 48) received no vaccine. Animals were fed with a standard diet consisting of 24% forage and 76% concentrate for 70 d. After 70 d of the standard diet, animals were divided into three groups, and were fed 30 d with one of the following diets: CON - standard diet used in the previous phase, without the addition of βAA; ZIL - standard diet plus 80 mg/d Zilpaterol hydrochloride; RAC - standard diet plus 300 mg/d Ractopamine hydrochloride. After this period, animals were harvested and the Longissimus dorsi sample were colleted to evaluate meat quality, total lipid content, fatty acid profile, consumer sensory analysis, muscle morfometric profile, genes expression of calpain and calpastatin and sarcomere length. For almost of characteristics evaluated, were not observed interactions between treatments. The effect of sexual condition, imunocastrated animals showed higher intensity of color L, a and b, total lipidics, oleic, palmitic and total monounsaturated acids and more frequency for oxidative fibers (FO) and glycolytic fibers (FG) in relation at noncastrated. However, non-castrated animals had a tendency to show a meat tender in sensory analysis and more frequency of oxidative-glicolytics fibres (FOG) in relation to imunocastrated. The βAA effect, ZIL group showed a meat less tender, higher concentrations of heptadecanoic, linoleic, araquidic acids, C20:3 N6C8C11C14, ômega 6, higher frequency for FO and less for FG than RAC and CON group. Animals of CON and ZIL group showed more FO area than RAC group, while for the FOG, animals from COM group showed more area than animals from RAC and ZIL group. In the sensory analysis, RAC and ZIL group received lower grades for tenderness and global quality in relation to COM group. Was no observed effect of sexual condition and βAA for genes expressions and sarcomere length. As conclusion, sexual condition and βAA affected the meat quality, fatty acid profile, muscle fibers, but not affect genes expression and sarcomere lenght.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de utilização de marcadores moleculares em genes candidatos da calpaína (CAPN) e calpastatina (CAST) como ferramenta auxiliar para programas de melhoramento de características relacionadas ao crescimento e maciez da carne. Foram avaliados 605 bovinos da raça Nelore, pertencentes à Agropecuária CFM Ltda, com idade média ao abate de 24 meses. Após a extração do DNA de amostras de sangue, por desproteinização em presença de NaCl, a identificação e determinação do polimorfismo para os marcadores moleculares CAPN316, CAPN530, CAPN4751, CAPN4753 e UOGACAST1, foi realizada pelo sistema de detecção TaqManTM utilizando-se PCR em Tempo Real. A análise de maciez da carne, aos 7, 14 e 21 dias de maturação, foi realizada com amostras de carne do Longissimus dorsi, retiradas entre a 12ª e 13ª costela e cisalhadas utilizando-se um Warner Bratzler Shear Force. Nenhum efeito significativo dos marcadores avaliados foi observado para as características de crescimento. Foi verificado efeito significativo, em relação à maciez da carne, para os seguintes polimorfismos: aos 7, 14 e 21 dias de maturação para o marcador CAPN4751; aos 21 dias para o marcador CAPN4753 e aos 14 e 21 dias para o marcador UOGCAST1. Em relação aos efeitos das combinações genotípicas para os marcadores dois a dois, os resultados foram significativos para a combinação CAPN4751/UOGCAST1 nos três tempos de maturação. Para a combinação de marcadores CAPN4753/UOGCAST1 também foram verificados resultados significativos para carnes maturadas aos 14 e 21 dias. Os resultados observados neste trabalho sugerem a possibilidade da utilização de seleção assistida por marcadores (MAS), visando o aumento da qualidade da carne em bovinos da raça Nelore. / The objective of this study was to evaluate the potential utilization of molecular markers on candidate calpain and calpastati n genes as an auxiliary tool for breeding programs on traits related to growth and meat tenderness. A total of 605 Nellore animals, raised by CFM Agro-pecuária Ltda, were used in this study and slaughtered with 24 months in average. After DNA blood samples extraction, by desproteinization in presence of NaCl, the polymorphism (CAPN316, CAPN530, CAPN4751, CAPN4753 and UOGACAST1) identification and determination was realized by TaqManTM detection system using real time PCR. The meat tenderness analysis, at the 7, 14 and 21 days of maturation was realized with Longissimus dorsi meat samples, taken at the 12th and 13th rib interval and Warner Bratzler Peak Shear Force measurements were used. There were no significant effects of molecular markers in growth traits. There were significant effects, regarding to meat tenderness, for following polymorphisms: at 7, 14 and 21 days of maturation, for CAPN4751 marker; at 21 days of maturation, for CAPN4753, and finally, at 14 and 21 days of maturation, for UOGCAST1 marker. In respect to genotypic combination effects analysis for pairwise marker, the results were significant for CAPN4751/UOGCAST1 in three days of maturation. In combination effects for CAPN4753/UOGCAST1 markers, significant effects were also observed for meat tenderness at 14 and 21 days. Theses results suggest that marked selection assisted (MAS) can be used to improve meat quality in Nellore beef cattle.

Resumo não disponível.

A síndrome dos ovários policísticos atinge 5 - 10% das mulheres em idade fértil e mais de 40% destas pacientes apresenta obesidade e resistência insulínica, o que aumenta o risco para o desenvolvimento do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Numerosos genes poderiam contribuir para o desenvolvimento do DM2 e outras alterações metabólicas. Dentre estes o gene da calpaína-10 (CAPN-10), tem sido associado com DM2 em populações mexicanosamericanos, e em duas populações do Norte da Europa (Finlândia e Alemanha). No presente estudo analisamos o genótipo de 96 pacientes hiperandrogênicas reunidas em dois grupos: Síndrome dos ovários policísticos (PCOS) e Hirsutismo idiopático (HI), com relação à freqüência de quatro polimorfismos do gene da CAPN-10 (SNP-44, 43, 19 e 63). Foram ainda realizadas análises de associação entre a freqüência alélica dos polimorfismos e características clínicas das pacientes, com ênfase na obesidade e resistência insulínica A variação genética da CAPN-10 foi avaliada a partir do DNA genômico por amplificação pela Polimerase Chain Reaction (PCR) e PCR-aleloespecífico (Teste de AMRS) dos fragmentos que contém os polimorfismos do gene da CAPN-10. Nossos resultados mostraram que não houve diferença entre as freqüências genotípicas e alélicas dos SNPs 44, 43, 19 e 63 entre os grupos PCOS e HI. Por outro lado, a comparação das características clínicas dos dois grupos mostrou que o alelo Ins do SNP-19 da CAPN-10 tendeu a ser mais freqüente entre as pacientes PCOS estratificadas para sobrepeso e obesas (p≤0,05). Não houve diferença na comparação das características clínicas avaliadas e a freqüência alélica para os SNPs 43 e 63. A análise da amostra total de pacientes hirsutas, ou seja, pacientes com PCOS e HI agrupadas não evidenciou diferença entre a freqüência alélica das variantes genéticas estudadas para a CAPN-10 e a presença de resistência insulínica. Tendo em vista o efeito modesto dos SNPs 44, 43, 19 e 63 avaliados isoladamente nestas pacientes, estudos adicionais serão necessários avaliando a freqüência desses polimorfismos na população do Sul do Brasil.

Made available in DSpace on 2016-04-12T12:39:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 vitor_vidal_ioc_dout_2015.pdf: 6590315 bytes, checksum: d6d795223559de178805e770f1f778fc (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As calpaínas são cisteíno-peptidases intracelulares dependentes de cálcio classicamente citosólicas envolvidas em diversas funções moduladores da célula, como transdução de sinais, divisão celular, apoptose e diferenciação. Embora melhor caracterizadas em mamíferos, as calpaínas já foram descritas em insetos, nematódeos, plantas, fungos, protozoários e bactérias. No Trypanosoma cruzi, como nos demais tripanossomatídeos, já foi descrita a presença de uma ampla e diversa família de calpaínas em seu genoma, mas pouco se sabe a respeito das suas funções específicas. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo buscar as sequências de calpaínas do T. cruzi em seu genoma no intuito de classificá-las, assim como avaliar a expressão gênica das sequências de maior similaridade com as calpaínas de mamíferos. Além disso, um anticorpo gerado contra uma sequência peptídica conservada entre as calpaínas selecionadas foi utilizado em ensaios de identificação, expressão e localização celular. Nesse contexto, as análises in silico identificaram ao todo 55 sequências relacionadas às calpaínas no genoma do T. cruzi. Em seguida, através de alinhamentos múltiplos e análise de domínios conservados, foi possível classificar as calpaínas em quatro grupos distintos de acordo com a presença de domínios conservados característicos desta família multigênica. Dos quatro grupos identificados, foi selecionado para aprofundamento do estudo aquele que possuía o maior número de domínios conservados e continha o domínio que alberga o sítio catalítico das calpaínas (conservado ou não) A análise de expressão gênica de um total de dezesseis genes selecionados por qPCR revelou a presença de seis genes com expressão aumentada nas formas clinicamente relevantes (amastigotas e tripomastigotas) em relação as formas epimastigotas, e cinco genes nesta última forma. Em paralelo, o anticorpo anti-calpaínas se mostrou reativo em ensaios de Western Blotting, citometria de fluxo e microscopia de eletrônica de transmissão. Os ensaios de Western Blotting revelaram uma calpaína específica em amastigotas e outra em tripomastigotas, além de outras sete de massas moleculares variadas presentes nas três formas do parasito. Os resultados de citometria de fluxo indicam maior marcação intracelular do anticorpo nas formas amastigotas e tripomastigotas em relação aos epimastigotas. Por fim, as análises ultraestruturais revelaram a presença das calpaínas em todo citoplasma, nas membranas de vesículas, na membrana plasmática, e no flagelo das diferentes formas do parasito. O estudo comparativo da expressão das calpaínas nas formas evolutivas do T. cruzi, assim como a determinação de sua localização celular, podem ajudar a determinar as funções gerais desta família multigênica no parasito / Calpains comprise a family of calcium dependent cy steine peptidases commonly present in cytoplasm implicated in a broad range of cellular modular functions such as signal transduction, cellular division, apoptosis and differentiation processes. Although well - characterized in mammals, these peptidases have also been described in insects, nematodes, plants, fungi, protozoa and bacteria . In Trypanosoma cruzi , as in other trypanosomatids, the presence of an extensive and diverse family of calpain s had already been described in its genome . However, the specific functions of these molecules are still unclear. In this context, the present study aimed to search calpain sequences in T. cruzi genome to classify the genes and to evaluate mRNA expression levels of the most conserved calpain sequences . In addition, an a ntibody against T. cruzi calpain was produced from a conserved sequence of trypanosomatid calpains to evaluate these proteases levels, also determining their ultrastructural localization. At first, in silico analysis revealed a total of 55 calpain sequence s in T. cruzi genome . Through multiple alignments and phylogenetic analysis of conserved domains in the se sequences, the calpains were sorted into four distinct groups characterized by the presence of classical domains of this multigenic family. After this in silico analysis, we decided to scrutiny the group that has the highest number of conserved domains and presents domain II, which contains the catalytic active site (either altered or conserved), in order to analyze mRNA and protein e xpression patterns in the different T. cruzi forms. The comparison of calpain mRNA abundance of sixteen genes by qPCR in the three distinct parasite forms revealed six genes with increased expression in the clinical relevant forms (amastigotes and trypomas tigotes) and five in the invertebrate form. S imultaneously , the anti - tritryp - calpain antibody was capable of recognizing reactive molecules in Western Blotting, flow citometry and transmission electron microscopy analysis. Altogether, Western Blotting anal ysis revealed seven calpains with different molecular masses present in the three forms of the parasite, while one specific calpain was detected either in amastigotes or tripomastigotes. Also, flow citometry results showed a higher intracellular expression in amastigotes and trypomastigotes in comparison with epimastigotes. Finally, ultrastructural analysis revealed the presence of theses proteases in the cytoplasm, vesicular membranes, plasma membranes and flagellum of the three life cycle forms. The compa rative study of calpain gene expression in the distinct T. cruzi forms, as well as the cellular localization of these molecules could be useful approaches to find out the calpain main functions in this parasite.

Resumo não disponível.

A síndrome dos ovários policísticos atinge 5 - 10% das mulheres em idade fértil e mais de 40% destas pacientes apresenta obesidade e resistência insulínica, o que aumenta o risco para o desenvolvimento do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Numerosos genes poderiam contribuir para o desenvolvimento do DM2 e outras alterações metabólicas. Dentre estes o gene da calpaína-10 (CAPN-10), tem sido associado com DM2 em populações mexicanosamericanos, e em duas populações do Norte da Europa (Finlândia e Alemanha). No presente estudo analisamos o genótipo de 96 pacientes hiperandrogênicas reunidas em dois grupos: Síndrome dos ovários policísticos (PCOS) e Hirsutismo idiopático (HI), com relação à freqüência de quatro polimorfismos do gene da CAPN-10 (SNP-44, 43, 19 e 63). Foram ainda realizadas análises de associação entre a freqüência alélica dos polimorfismos e características clínicas das pacientes, com ênfase na obesidade e resistência insulínica A variação genética da CAPN-10 foi avaliada a partir do DNA genômico por amplificação pela Polimerase Chain Reaction (PCR) e PCR-aleloespecífico (Teste de AMRS) dos fragmentos que contém os polimorfismos do gene da CAPN-10. Nossos resultados mostraram que não houve diferença entre as freqüências genotípicas e alélicas dos SNPs 44, 43, 19 e 63 entre os grupos PCOS e HI. Por outro lado, a comparação das características clínicas dos dois grupos mostrou que o alelo Ins do SNP-19 da CAPN-10 tendeu a ser mais freqüente entre as pacientes PCOS estratificadas para sobrepeso e obesas (p≤0,05). Não houve diferença na comparação das características clínicas avaliadas e a freqüência alélica para os SNPs 43 e 63. A análise da amostra total de pacientes hirsutas, ou seja, pacientes com PCOS e HI agrupadas não evidenciou diferença entre a freqüência alélica das variantes genéticas estudadas para a CAPN-10 e a presença de resistência insulínica. Tendo em vista o efeito modesto dos SNPs 44, 43, 19 e 63 avaliados isoladamente nestas pacientes, estudos adicionais serão necessários avaliando a freqüência desses polimorfismos na população do Sul do Brasil.

Submitted by Jéssica Moraes Malheiros (jessicamalheiros@yahoo.com.br) on 2018-05-03T18:53:41Z No. of bitstreams: 1 TESE MALHEIROS, J. M..pdf: 1363679 bytes, checksum: 33291bc89815d196826e037eeda5b237 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-05-04T18:11:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 malheiros_jm_dr_jabo.pdf: 1400936 bytes, checksum: bf9a223495b522a13300edf9c4026a2e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-04T18:11:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 malheiros_jm_dr_jabo.pdf: 1400936 bytes, checksum: bf9a223495b522a13300edf9c4026a2e (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho teve como objetivo avaliar a associação da expressão gênica e proteômica com a maciez da carne de bovinos da raça Nelore. A partir de uma população de 90 animais foram selecionados três grupos experimentais por meio da análise de força de cisalhamento (FC) e índice de fragmentação miofibrilar (MFI), sendo: carne moderadamente macia, carne moderadamente dura e carne muito dura. A expressão dos genes foi avaliada por meio da análise de PCR em tempo real e a análise proteômica foi realizada com base na separação de proteínas por meio da eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e caracterizção por espectrometria de massas com ionização eletrospray (ESI-MS/MS). A expressão da isoforma da calpastatina (CAST2) mostrou-se up regulated (P<0,05) nos grupos de carne moderadamente dura e muito dura. Os genes HSP90AA1, DNAJA1 e HSPB1, os quais representam as proteínas de choque térmico Hsp90, Hsp40 e Hsp27, respectivamente, mostraram expressão down regulated (P<0,05) no grupo de carne moderadamente macia em relação ao grupo de carne muito dura. Na análise proteômica, a expressão do spot protéico das enzimas metabólicas TPI e PGM1, proteína estrutural PFN1 e aminiopeptidase LAP3 se mostraram up regulated (P<0,05) no grupo de carne moderadamente macia, enquanto que a expressão das proteínas estruturais (ACTA1, ACTB, ACTG1 e MLC1), estresse oxidativo (PRDX6, PRDX2, PRDX1 and PARK7), proteínas de choque térmico (HSP90AA1, HSP90AB1, HSPA1A, HSPA1B, HSPA1L, HSPD1 e HSPB1), e co-chaperonas e regulação celular (CD37, STIP1 e ARHGDIA) se mostraram down regulated (P>0,05) no mesmo grupo experimental. Estes resultados fornecem uma visão importante de novos possíveis marcadores biológicos atuantes no processo de amaciamento da carne, o que pode colaborar para melhor entender e gerar novas estratégias de seleção nos programas de melhoramento genético de bovinos Nelore. / The objective of this study was to evaluate the association of gene expression and proteomics with meat tenderness in Nellore cattle. From population of 90 animals three experimental groups were selected by shear force (SF) and/or myofibrillar fragmentation index (MFI): moderately tender meat, moderately tough meat and very tough meat. Gene expression was evaluated by real-time PCR and proteomics analysis was performed based on protein separation by two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and characterisation by eletrospray ionisation mass spectrometry (ESI-MS/MS). Expression of the calpastatin isoform (CAST2) was up-regulated (P<0.05) in the moderately tough and very tough meat groups. Expression of the HSP90AA1, DNAJA1 and HSPB1 genes, wich represent the heat shock proteins Hsp90, Hsp40 and Hsp27, respectively, were down-regulated (P<0.05) in the moderately tender meat in relation to the very tough group. In the proteomics analysis, the expression of the protein spots of metabolism TPI1 and PGM1, structural protein PFN1, and aminopeptidase LAP3 were up regulated (P<0.05) in the moderately tender meat, while the expression of structural proteins (ACTA1, ACTB, ACTG1 and MLC1), oxidative stress (PRDX6, PRDX2, PRDX1 and PARK7), heat shock protein (HSP90AA1, HSP90AB1, HSPA1A, HSPA1B, HSPA1L, HSPD1 and HSPB1) and co-chaperones and cellular regulatory (CD37, STIP1 and ARHGDIA) were down regulated (P>0.05) in the same experimental group. The present results suggest an important view of possible new biological markers in the meat tenderization process, wich permit to unsderstand and generate new strategies for selection in Nellore cattle breeding programs. / FAPESP: 15/13021-1

A síndrome dos ovários policísticos atinge 5 - 10% das mulheres em idade fértil e mais de 40% destas pacientes apresenta obesidade e resistência insulínica, o que aumenta o risco para o desenvolvimento do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Numerosos genes poderiam contribuir para o desenvolvimento do DM2 e outras alterações metabólicas. Dentre estes o gene da calpaína-10 (CAPN-10), tem sido associado com DM2 em populações mexicanosamericanos, e em duas populações do Norte da Europa (Finlândia e Alemanha). No presente estudo analisamos o genótipo de 96 pacientes hiperandrogênicas reunidas em dois grupos: Síndrome dos ovários policísticos (PCOS) e Hirsutismo idiopático (HI), com relação à freqüência de quatro polimorfismos do gene da CAPN-10 (SNP-44, 43, 19 e 63). Foram ainda realizadas análises de associação entre a freqüência alélica dos polimorfismos e características clínicas das pacientes, com ênfase na obesidade e resistência insulínica A variação genética da CAPN-10 foi avaliada a partir do DNA genômico por amplificação pela Polimerase Chain Reaction (PCR) e PCR-aleloespecífico (Teste de AMRS) dos fragmentos que contém os polimorfismos do gene da CAPN-10. Nossos resultados mostraram que não houve diferença entre as freqüências genotípicas e alélicas dos SNPs 44, 43, 19 e 63 entre os grupos PCOS e HI. Por outro lado, a comparação das características clínicas dos dois grupos mostrou que o alelo Ins do SNP-19 da CAPN-10 tendeu a ser mais freqüente entre as pacientes PCOS estratificadas para sobrepeso e obesas (p≤0,05). Não houve diferença na comparação das características clínicas avaliadas e a freqüência alélica para os SNPs 43 e 63. A análise da amostra total de pacientes hirsutas, ou seja, pacientes com PCOS e HI agrupadas não evidenciou diferença entre a freqüência alélica das variantes genéticas estudadas para a CAPN-10 e a presença de resistência insulínica. Tendo em vista o efeito modesto dos SNPs 44, 43, 19 e 63 avaliados isoladamente nestas pacientes, estudos adicionais serão necessários avaliando a freqüência desses polimorfismos na população do Sul do Brasil.