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Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Los iones calcio, como segundos mensajeros, son de importancia central en la regulación de variados procesos celulares. Las señales de Ca2+ son generadas por ingreso de Ca2+ desde el medio extracelular y/o por liberación de éste desde los reservorios intracelulares. Dos diferentes vías permiten la liberación de calcio desde el retículo sarco/endoplasmático: los canales con receptor para 1,4,5-inositol trifosfato y los canales liberadores de calcio sensibles a ryanodina. Las distintas categorías taxonómicas de animales, expresan diversas isoformas de receptores de ryanodina (RyR) en las diferentes células excitables. En los mamíferos, RyR-1 es la principal isoforma encontrada en las células musculares esqueléticas, mientras que RyR-2 es la principal isoforma de las células del músculo cardíaco. Los canales liberadores de calcio sensibles a ryanodina están regulados por la unión de varios iones y moléculas (Ca2+, Mg2+, H+, ATP, y ADP-ribosa cíclica), por la interacción con otras proteínas (receptores de dihidropiridinas, calmodulina, FKBP12, triadina, juntina, y calsecuestrina), y por reacciones metabólicas que producen modificaciones covalentes de la proteína-canal (fosforilación y oxidación). Estudios previos indican que los canales RyR presentan distintas respuestas a la concentración citoplasmática de calcio, activándose a concentraciones de calcio del orden M, e inhibiéndose a concentraciones de calcio mM. Además, el Mg2+ es un potente inhibidor de la liberación de calcio, a las concentraciones encontradas en el músculo esquelético. Este efecto inhibitorio es muy marcado sobre la isoforma RyR-1, mientras que la inhibición sobre la isoforma RyR-2 es menos pronunciada. Se ha demostrado que la modificación redox de los residuos SH del canal RyR altera su respuesta al Ca2+ y al Mg2+. La oxidación aumenta la afinidad aparente para la activación por Ca2+ y disminuye la afinidad para la inhibición por Ca2+ y/o Mg2+. Inversamente, la reducción de los residuos SH disminuye la afinidad para la activación por Ca2+ y aumenta la afinidad para la inhibición por Ca2+ y/o Mg2+. El propósito de esta memoria de título es estudiar, a nivel de canal único, la modificación de la inhibición por magnesio mediada por oxidación y/o reducción de residuos SH de canales RyR de músculo cardíaco, además de caracterizar el mecanismo por medio del cual la oxidación disminuye la inhibición por magnesio. Nuestros resultados mostraron que los canales con respuesta de tipo MS, correspondientes a canales más reducidos, presentan una Ki para el Mg2+ menor que los canales con respuesta de tipo C, los cuales están más oxidados (Marengo et al., 1998). Además, encontramos que un canal con una conducta espontánea de tipo MS puede disminuir su sensibilidad a la inhibición por Mg2+ por oxidación de sus residuos SH, al transformarse en un canal de tipo C. Estos efectos fueron reversibles por reducción de residuos SH. Utilizando el modelo publicado previamente por Laver et al. (1997) para explicar la inhibición por Mg2+ de los canales RyR, se encontró que a bajas concentraciones de calcio (6 M), los canales con respuesta de tipo MS fueron inhibidos por Mg2+ principalmente por competencia de éste con el Ca2+ por el sitio activador para Ca2+ (inhibición Tipo I). Los canales de tipo C fueron inhibidos principalmente por la unión del Mg2+ a los sitios inhibidores de baja afinidad, los cuales no discriminan entre Ca2+ y Mg2+ (inhibición Tipo II). A concentraciones de Ca2+ más altas (13 M), tanto la unión al sitio activador para Ca2+ como a los sitios inhibidores para divalentes contribuyeron a la inhibición por Mg2+ de los canales de tipo MS

El presente trabajo consiste en el diseño de un modelo teórico que explique el comportamiento de las señales de calcio en un microdominio (agrupación de canales iónicos y transportadores involucrados en la dinámica del calcio dentro de un cilio olfatorio), observadas experimentalmente. Los cilios olfatorios son de gran importancia en la biología ya que funcionan como estructuras receptoras de los odorantes en las neuronas olfatorias. El calcio es uno de los principales transductores de la señal eléctrica generada, por lo que entender su dinámica a cabalidad representa un gran aporte al tema en cuestión. Teniendo en cuenta que el factor más importante en el análisis de muy pocos canales es que la apertura de éstos es probabilística, y que las señales de calcio son muy puntuales en el cilio olfatorio con respecto al tiempo y al espacio, se realizó un modelo matemático estocástico resuelto numéricamente (utilizando el software MATLAB) en Ecuaciones Diferenciales Ordinarias. Se observó claramente que el principal modulador de las señales de calcio en el microdominio es el canal activado por nucleótidos cíclicos CNG, existiendo una dependencia directa entre la corriente a través del canal y la concentración intracelular de calcio. Modificando algunos parámetros de manera apropiada dentro de rangos con sentido desde el punto de vista biológico, fue posible llegar a valores cuantitativos que concuerdan con lo observado experimentalmente. De esta forma, se obtienen resultados numéricos de gran similitud con las mediciones experimentales, siendo la difusión en el cilio y la cinética del canal CNG los parámetros claves en la modulación de las señales de calcio. Finalmente, el modelo cumple con el objetivo de dar un respaldo teórico a la observación experimental de la existencia de microdominios en los cilios olfatorios de las neuronas del olfato.

Memoria para optar el título de Bioquímico / El musculo esquelético es un tejido de gran plasticidad, capaz de responder y adaptarse a los desafíos físicos y metabólicos impuestos por la actividad contráctil. La respuesta adaptativa, que incluye procesos que llevan a hipertrofia y activación de mecanismos antioxidativos, ha sido asociada a cambios transitorios en la actividad transcripcional de genes específicos. Nuestro laboratorio ha determinado, mediante análisis de microarreglos, que la despolarización con alta concentración de K+ altera la expresión de un número limitado de genes, relacionados principalmente con respuesta a estrés y metabolismo. Los mayores cambios de expresión observados corresponden a los genes que codifican para la Proteína de Shock Térmico 70 (Hsp70) y para Heme Oxigenasa I (Hmox-1). En el musculo esquelético Hsp70 y Hmox-1 son inducidas por una variedad de estímulos estresantes. Hsp70 actúa como chaperona molecular participando en la síntesis, translocación y degradación de proteínas durante episodios de estrés. Además ha sido involucrada en la adaptación hipertrófica, facilitando el apropiado plegamiento de proteínas sintetizadas de novo. Se ha descrito que Hmox-1 ejerce un efecto protector frente al daño ocasionado por radicales libres en varios tejidos, ejerciendo una acción antioxidante durante la contracción muscular. Se desconoce la vía de señalización que lleva a la expresión de Hsp70 y Hmox-1 en el musculo esquelético en respuesta al ejercicio, pero existen evidencias que sugieren que los cambios en la concentración intracelular de Ca2+ estarían participando en este proceso. Estudios previos en células musculares esqueléticas han demostrado que el aumento en la concentración de Ca2+ intracelular, inducida por despolarización, es un evento complejo de al menos dos componentes con cinéticas diferentes. Después de una señal rápida de Ca2+ asociada al acoplamiento excitación-contracción, se presenta una señal lenta de Ca2+, dependiente de inositol-1,4,5-trifosfato (IP3), principalmente asociada a los núcleos celulares. Nuestro grupo ha demostrado que la señal lenta de Ca2+, inducida por despolarización, está involucrada en los eventos tempranos que regulan la expresión génica. El objetivo principal de esta tesis fue investigar los mecanismos moleculares involucrados en la expresión de Hsp70 y Hmox-1 en miotubos de rata sometidos a despolarización. Demostramos que la despolarización induce la expresión de las proteínas Hsp70 y Hmox-1 a las 4 y 6 horas respectivamente, lo que está de acuerdo con los resultados obtenidos por microarreglos. Además observamos un aumento transitorio en el nivel de mRNA de Hsp70, con un máximo a las 2 horas después de despolarizar las células con una alta concentración de K+ o mediante estimulo eléctrico. Este incremento en el nivel de mRNA de Hsp70 es independiente de Ca2+ extracelular. Tanto el quelante de Ca2+ intracelular BAPTA-AM como los inhibidores de la señal lenta de Ca2+, 2-APB y LY294002, disminuyen la expresión del mRNA de Hsp70. La inhibición de la señal rápida de Ca2+, mediante ryanodina, no afecta la inducción de Hsp70. La participación de la señal lenta de Ca2+ en la regulación de la expresión de las proteínas Hsp70 y Hmox-1 fue confirmada mediante inmunofluorescencia. Determinamos que PKC está involucrada en la vía de señalización que induce un aumento en los niveles de mRNA de Hsp70. La despolarización de miotubos en presencia de Go6976, inhibidor de las isoformas de PKC dependientes de Ca2+, inhibe completamente la inducción del mRNA de Hsp70. Nuestros resultados indican que la señal lenta de Ca2+, inducida por despolarización, tiene un papel importante en la activación de vías que acoplan la excitación a la transcripción de genes específicos. Estos hallazgos nos permiten proponer un modelo acerca del mecanismo involucrado en la regulación de la expresión de Hsp70 y Hmox-1 en células musculares sometidas a despolarización. El receptor de dihidropiridina detectaría el cambio de voltaje en la membrana plasmática activando la fosfolipasa C, que mediante hidrolisis de PIP2 produce IP3 y DAG. El IP3 difundiría al citosol favoreciendo la generación de oscilaciones de Ca2+, que activarían a PKC. PKC a su vez fosforilaria al factor transcripcional HSF1, promoviendo su translocación al núcleo y favoreciendo su interacción con secuencias regulatorias HSE, presentes en las regiones promotoras de los genes Hsp70 y Hmox-1

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Los canales de calcio activados por voltaje pre-sinápticos (CaV2) son proteínas de transmembrana altamente especializadas en la transducción de señales eléctricas en señales químicas. Dado que, en las terminales axonales, la entrada de Ca2+ a través de los CaV2 es condición necesaria para la liberación de neurotransmisores, su modulación constituye un blanco regulatorio de alta efectividad de la actividad neuronal. Dentro de los mecanismos que regulan la actividad de los CaV2 en las membranas pre-sinápticas se encuentra la activación de diversos receptores acoplados a proteína G (GPCR, del inglés G protein coupled receptor). Estos receptores modulan negativamente la actividad de los CaV2 y, en consecuencia, reducen la liberación de neurotransmisores tanto excitatorios como inhibitorios dependiendo de la sinapsis en la que actúen. Los GPCRs constituyen una súper-familia de receptores activados por una gran variedad de ligandos y, dada su participación en múltiples procesos fisiológicos representan blancos terapéuticos muy importantes. La unión de un ligando a su GPCR desencadena la activación de la proteína G, la cual al activarse se escinde en sus subunidades Gα y Gβγ siendo capaces de activar diversas cascadas de señalización intracelular y modular múltiples efectores intracelulares, entre los que se encuentran los CaV2 pre-sinápticos. Sin embargo, el 15 % de los GPCRs pueden adquirir un estado activo en ausencia de ligando que podría potencialmente impactar en la actividad de los CaV2. Adicionalmente, tanto esta actividad constitutiva como la actividad dependiente de agonista pueden verse drásticamente alteradas por la presencia de variaciones en la secuencia de los genes que codifican los GPCRs. Así, debido a los distintos modos de activación y a los subtipos que ocurren como consecuencia de variantes de los GPCRs, es preciso realizar estudios detallados de los mecanismos que median los efectos de cada GPCR de interés para el desarrollo de estrategias farmacológicas efectivas. En este contexto, en el presente trabajo de tesis estudiamos el impacto de la activación de dos GPCRs fisiológicamente muy relevantes sobre la actividad de los CaV2 pre-sinápticos: el receptor opioide μ (MOR, del inglés μ opioid receptor), el cual constituye la principal puerta de entrada de los potentes efectos analgésicos de los opioides más eficaces y utilizados en la historia humana; y el receptor de ghrelina (GHSR1a, del inglés growth hormone secretagogue receptor type 1a), receptor de la única hormona orexigénica y el cual despliega la actividad constitutiva de mayor nivel conocida entre los GPCRs. Adicionalmente, evaluamos cómo variantes de los genes que codifican ambos receptores modifican su actividad y determinamos sus frecuencias en nuestra población. El polimorfismo de un nucleótido N40D de MOR, cuya frecuencia varía notablemente entre las poblaciones humanas, altera las funciones celulares del receptor llevando a diferencias en la sensibilidad al dolor y al tratamiento con opioides. La activación de MOR por agonistas opioides en las terminales de neuronas periféricas que transmiten la sensación dolorosa, inhibe los CaV2.2 disminuyendo, consecuentemente, la liberación de neurotransmisores excitatorios que potencian la señal dolorosa. En estas neuronas se expresa en forma exclusiva una isoforma de splicing alternativo de los CaV2.2, CaV2.2e37a, que posee una sensibilidad aumentada a MOR. En este trabajo evaluamos si la activación de los subtipos de MOR producto de N40D (MOR-N y MOR-D) tiene un impacto diferencial sobre la actividad de los CaV2.2e37a exclusivos de las vías del dolor. Utilizando como modelo de estudio un sistema de expresión heteróloga, mediante la técnica patch-clamp en configuración de célula entera con fijación de voltaje, encontramos que N40D impacta en los efectos inhibitorios de MOR sobre los CaV2.2 provocando una ganancia de función para inhibir las corrientes CaV2.2 pre-sinápticas mediadas por la isoforma de splicing del canal específica de las vías del dolor, CaV2.2e37a, y por la isoforma de splicing de expresión ubicua en el sistema nervioso, CaV2.2e37b. Así mismo, nuestro análisis genético-poblacional reveló que N40D se encuentra en un ~ 18 % en una región de nuestro país y, que su distribución a lo largo de distintas poblaciones mundiales, permite identificar una estructura poblacional formada por tres grupos que se corresponden a distintos linajes de ancestría humana. De esta manera, nuestros resultados sugieren que el polimorfismo humano N40D de MOR impacta en la respuesta fisiológica de la activación de este receptor y que podría estar involucrado, de manera condicionada por la ancestría, en las diferencias inter-individuales de la sensibilidad al dolor y tratamientos opioides. Por otro lado, GHSR1a es el único receptor conocido de la hormona ghrelina. Esta hormona es sintetizada en células endócrinas del estómago, y desde allí llega hasta el cerebro donde casi exclusivamente accede al hipotálamo provocando sus potentes efectos orexigénicos. Ghrelina, tras unirse a GHSR1a, activa transcripcional y eléctricamente a las neuronas hipotalámicas por mecanismos post-sinápticos, sin embargo, GHSR1a también se localiza en las membranas pre-sinápticas, en donde se desconoce si contribuye a dicha activación neuronal. Curiosamente, GHSR1a es el GPCR con mayor actividad constitutiva conocido y tampoco se conoce si esta activación independiente de ghrelina participa en la activación neuronal. Dado que los CaV2 son muy sensibles a la modulación por GPCRs, indagamos si GHSR1a impactaba en la actividad de los CaV2. Utilizando como modelo un sistema de expresión heteróloga, mediante patch-clamp en configuración célula entera y con fijación del voltaje, encontramos que la activación de GHSR1a inhibe drásticamente las corrientes CaV2.1 y CaV2.2. Mientras su actividad constitutiva modula los CaV2 por una disminución crónica de la densidad de canales en la membrana plasmática dependiendo de los niveles de expresión del receptor y por un mecanismo mediado por la proteína Gi/o; la actividad de GHSR1a evocada por ghrelina modula negativamente la actividad de los CaV2 pre-sinápticos de manera reversible y saturable a niveles muy bajos del receptor. Adicionalmente, la inhibición mediada por la activación de GHSR1a por ghrelina involucra a ambas subunidades de la proteína Gq, siendo más sensibles a esta inhibición los CaV2.2 que los CaV2.1. También encontramos que una propiedad fundamental de esta inhibición, como es la dependencia del voltaje, se altera completamente dependiendo del subtipo de subunidad auxiliar CaVβ que acompaña al canal. Para estudiar si la actividad de GHSR1a expresado a niveles nativos y en un contexto neuronal modula las corrientes CaV2 utilizamos cultivos primarios de neuronas hipotalámicas de rata sobre-expresando GHSR1a y de un modelo de ratón transgénico que expresa eGFP (del inglés enhanced green fluorescent protein) bajo el promotor del gen GHSR. En estos experimentos encontramos que GHSR1a es capaz de reducir las corrientes CaV2 pre-sinápticas en neuronas hipotalámicas tanto por su actividad constitutiva como por la dependiente de ghrelina. Posteriormente, indagamos también el efecto de la mutación A204E humana de GHSR1a, que elimina la actividad constitutiva del receptor, y su prevalencia en una población argentina. Encontramos que A204E impacta en la modulación de los CaV2 pre-sinápticos por GHSR1a provocando una inhibición de las corrientes CaV2 sólo cuando es activado por ghrelina tanto es un sistema de expresión heteróloga como en neuronas hipotalámicas en cultivo. Adicionalmente, A204E no constituye un sitio de variación genético-poblacional en la población argentina analizada. De esta manera, A204E, con un impacto poblacional muy bajo, provoca una pérdida de función del rol modulatorio de GHSR1a sobre las corrientes CaV2. Por último, abordamos un posible impacto fisiológico de la modulación de los CaV2 por GHSR1a. Dado que en el hipotálamo predomina un tono GABAérgico que controla diversos núcleos neuronales, estudiamos si la modulación de los CaV2 por GHSR1a regulaba la liberación de GABA en neuronas hipotalámicas como un posible mecanismo de activación neuronal. Encontramos que ambos modos de activación de GHSR1a regulan negativamente la liberación de GABA en neuronas hipotalámicas, sólo cuando la misma está mediada por mecanismos dependientes del ingreso de Ca2+ a través de los CaV a las terminales axonales. Este mecanismo podría cobrar relevancia fisiológica en situaciones de ayuno, cuando la expresión de GHSR1a se encuentra aumentada, contribuyendo a la activación neuronal descripta en estas condiciones fisiológicas. Nuestros datos demuestran que GHSR1a modula la actividad de los CaV pre-sinápticos tanto por vías convencionales de inhibición de los CaV (activación de GPCRs dependiente de agonistas), como por vías no convencionales (activación constitutiva de GPCRs), sugiriendo un rol fundamental de la actividad constitutiva de GHSR1a en la fisiología sináptica de neuronas hipotalámicas. Así, GHSR1a modula drásticamente las corrientes CaV2 pre-sinápticas por mecanismos completamente distintos dependientes de su modo de activación. En resumen, en esta tesis describimos por primera vez diferentes mecanismos no convencionales de modulación de los CaV2 pre-sinápticos por la activación de GPCRs. Esta modulación, sumamente efectiva para regular la actividad sináptica, requiere estudios detallados de sus componentes participantes que la median y de sus interacciones para poder comprender el alcance de la misma en distintos contextos celulares. Así mismo, demostramos que las variaciones de los genes de los GPCRs pueden alterar drásticamente su capacidad para modular los CaV2, llevando a grandes diferencias en las respuestas fisiológicas de las que participan, planteando además la relevancia de determinar el alcance poblacional de cada una de ellas para poder encarar estrategias terapéuticas.

Grado de magíster en fisiología / En el músculo esquelético, la función más estudiada del receptor de dihidropiridina o canal de calcio tipo L (Cav1.1), además de su función como canal de Ca+2 tipo L, ha sido el acoplamiento excitación-contracción (ECC). En los últimos años, se ha descrito una nueva función para el Cav1.1, relacionando su actividad al acoplamiento excitación-transcripción (ETC). En el ETC, el Cav1.1 es clave y participa regulando la activación del canal de Panexina 1 (Panx1), el cual permite la salida de ATP desde el interior hacia el exterior de la célula. En fibras musculares, nuestro grupo ha descrito que este proceso de liberación de ATP por parte de Panx1 puede activarse mediante un estímulo eléctrico. Aún más importante, este es un proceso dependiente de la frecuencia de estimulación eléctrica y que, en conjunto a otros intermediarios, genera señales de Ca+2 intracelulares regulando la expresión génica asociada a la plasticidad muscular. El control que ejerce el Cav1.1 sobre la actividad del Panx1 luego de estímulos eléctricos a frecuencias permisivas, demuestra una influencia unidireccional desde Cav1.1 hacia Panx1. Por otro lado, estas proteínas se encuentran a menos de 40 nm de distancia y co-inmunoprecipitan. A pesar de estos hallazgos, la estrecha regulación funcional entre Cav1.1 y Panx1 permanece poco explorada. Se ha descrito que el Cav1.1 en su rol en el ECC, ejerce una regulación unidireccional o anterógrada, en la cual, frente a la depolarización de la membrana plasmática sufre un cambio conformacional que activa al Receptor de Rianodina tipo 1 (RyR1) permitiendo la salida de Ca+2 desde el retículo sarcoplasmático y la contracción muscular. Sin embargo, en las últimas décadas se ha mostrado que existe también una regulación retrógrada desde RyR1 hacia Cav1.1, en la cual el RyR1 puede influenciar las características biofísicas del Cav1.1, como ocurre en modelos de inhibición o ausencia de RyR1, donde se encuentran alteraciones en la corriente de Ca+2 tipo L y en el “movimiento de carga” del Cav1.1. En relación a estos antecedentes, nuestra hipótesis es que existe una regulación retrógrada de Panx1 hacia Cav1.1. En este trabajo, evaluamos la influencia de Panx1 en la función de Cav1.1. Para esto, desarrollamos un modelo de knockdown para Panx1, con la técnica del RNA interferente, mediante la electroporación de un plasmidio shPanx1 en el músculo Flexor Digitorum Brevis (FDB). Medimos la corriente de Ca+2 tipo L y el movimiento de carga en condiciones de “potencial de membrana controlado, en célula completa” (Whole cell Voltage-Clamp) en fibras musculares aisladas del FDB. Observamos una disminución significativa en la amplitud de la corriente de Ca+2 tipo L durante los pulsos de potencial a 0 mV (p=0,023) y 10 mV (p=0,018) en las células que expresaban el plasmidio shPanx1 versus el control. Para el movimiento de carga, observamos una diferencia significativa en el parámetro V0.5, una de las variables de la distribución de Boltzmann para 2 estados, que representa el potencial de membrana al cual se desplaza la mitad de la carga máxima, mostrando una disminución de este valor en las fibras shPanx1 vs el control (p=0,047). De esta manera, podemos concluir que Panx1 cumple un rol en la regulación de la función de Cav1.1 por lo que la interacción funcional entre estas dos proteínas es bidireccional al igual que en el caso de Cav1.1 y RyR1. Esta interacción debe tenerse en cuenta en el desarrollo de futuros tratamientos farmacológicos que tengan como blanco a Panx1 y para condiciones patológicas donde la función de Cav1.1 se encuentre afectada, como la distrofia muscular, así como en aquellos procesos donde la adaptación muscular juega un rol vital, como son el envejecimiento y la diabetes. / In skeletal muscle, the most studied function of dihydropyridine receptor or L-type calcium channel (Cav1.1), in addition to its function as L-type Ca+2 channel, has been the excitation-contraction coupling (ECC). In recent years it has been described a new role for Cav1.1, linking their activity to the excitation-transcription coupling (ETC). In ETC, Cav1.1 is a key participant regulating the Pannexin 1 (Panx1) activation. This channel allows the outflow of ATP in a process dependent on the frequency of electrical stimulation and differents intermediaries, generates intracellular Ca+2 signals regulating gene expression associated with muscle plasticity. However, the close functional regulation between Cav1.1 and Panx1 remains little explored. In addition to this, for Cav1.1 in ECC, initially a unidirectional or anterograde regulation was described, in which Cav1.1 after cellular membrane depolarization undergoes a conformational change that activates ryanodine receptor type 1 (RyR1) allowing the Ca+2 release and muscle contraction. However, in recent decades a retrograde regulation from RyR1 to Cav1.1 has been described, evidenced as a change in the electrophysiology properties of Cav1.1 during blocking or absence of RyR1, with alterations in the L-type Ca+2 current and "Charge Movement", representatives of Cav1.1 function. Our hypothesis is that there is a retrograde regulation from Panx1 to Cav1.1. We evaluated the influence of Panx1 in Cav1.1 function. For this, we decreased the expression of Panx1 by electroporation of a shPanx1 plasmid, encoding an interference RNA against Panx1 in Flexor Digitorum Brevis (FDB). Then we measured the L-type Ca+2 current and the Charge Movement by the "whole cell control voltage" experiment (Voltage-Clamp) in isolated FDB muscle fibers. We observed a significant decrease in L-type Ca+2 current amplitude during the command pulses at 0 mV (p = 0.02297) and 10 mV (p = 0.01778) in shPanx1 vs control (mCherry). In Charge Movement we showed a significant difference in V0.5, a variable in two-state Boltzmann distribution, which represents the voltage at which there is a half maximum charge (Qmax) displacement, with a decrease in shPanx1 V0.5 vs control (p = 0.047). We can conclude that Panx1 has a role in the function of Cav1.1, so they have a bidirectional-relationship, the same that occurs between Cav1.1 and RyR1.