Les carcinomes hépatocellulaires (CHC) sont la deuxième cause de décès par cancer dans le monde. La signalisation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) joue un rôle au cours du développement des CHC. Il a été montré que le trafic intracellulaire régulait la signalisation des récepteurs de la famille ErbB dans les CHC. De façon intéressante, l'expression de la clathrine, un acteur majeur de l'endocytose, est anormalement élevée dans les CHC. Ainsi, les objectifs de nos travaux étaient de définir si l'endocytose module la signalisation de la famille des récepteurs ErbB en réponse à divers ligands. Les expériences ont été effectuées dans trois lignées cellulaires issues de CHC, qui expriment des niveaux variables des différents récepteurs ErbB. Nos résultats montrent que l'inhibition de l'expression de la clathrine par ARN interférence était associée à une diminution significative de la phosphorylation des récepteurs EGFR, ErbB2 et ErbB3. La phosphorylation de STAT3 était significativement augmentée dans toutes les lignées. Les conséquences de l'inhibition pharmacologique de la dynamine et de la régulation négative de SMAP1 par ARN interférence ont été étudiées dans la lignée Hep3B. L'inhibition de la dynamine entraînait une augmentation significative des niveaux de phosphorylation d'EGFR, d'ErbB3 et d'AKT, alors que SMAP1 ne jouait aucun rôle dans la signalisation. Au total, nos observations soulignent que la signalisation des récepteurs ErbB dans les CHC est un processus complexe qui dépend de l'expression des différents membres de la famille ErbB et de la disponibilité de leurs ligands dans l'environnement tumoral. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the second leading cause of death by cancer in the world. The epidermal growth factor receptor (EGFR) signalling axis plays a key role in HCC. Intracellular trafficking has been shown to regulate receptor signalling, and to be altered in HCC. Our aim was to investigate whether endocytosis may modulate signalling of the ErbB receptor family in response to various ligands. The experiments have been performed in three HCC cell lines, which express variable levels of ErbB receptors. We investigated the role of clathrin, dynamin, and SMAP1 (Small ArfGAP1). Our results show that the effects of down-regulating clathrin by siRNA varied among HCC cell lines, depending on the ligand. Upon clathrin down-regulation by RNA interference, EGFR phosphorylation decreased in Hep3B and in PLC/PRF/5 cells stimulated with AR, EGF or HB-EGF, as well as in HRG-stimulated PLC/PRF/5 cells. Clathrin inhibition decreased ErbB2 phosphorylation in HepG2 cells stimulated with EGF, HB-EGF or HRG, and in HRG-stimulated PLC/PRF/5 cells. Phosphorylation of ErbB3 significantly decreased in all cell lines upon stimulation with EGF, HB-EGF or HRG. STAT3 phosphorylation significantly increased in all cell lines. Dynamin inhibition by dynasore led to a significant increase in the phosphorylation levels of EGFR, ErbB3 and AKT, in the Hep3B cell line. SMAP1 played no role in the early signalling of ErbB receptors upon stimulation with whatever ligand. Altogether, our observations underline that ErbB signalling in HCC is a complex process that may depend on the expression of the various ErbB family members and on the availability of their ligands in the tumour environment.

Avec près de 350 millions de personnes chroniquement infectées, et malgré l’existence de vaccins efficaces, le virus de l’Hépatite B (VHB) reste un problème majeur de santé publique. Parmi les protéines virales, la protéine régulatrice HBx possèdent des activités qui pourraient être particulièrement impliquées dans le développement de CHC. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés aux différences biologiques entre la protéine HBx issue d’une région non tumorale (HBx-NT) et la protéine HBx issue d’une région tumorale (HBx-T) d’un même patient. En particulier, nous nous sommes intéressés à la régénération hépatique après hépatectomie partielle et à la carcinogenèse hépatique dans un modèle murin transgénique. Nous avons démontré l’absence d’impact de la forme tronquée de la protéine HBx sur la régénération hépatique. Nous avons démontré que la protéine HBx entière avait la capacité d’activer la sécrétion d’IL-6 dans la phase d’initiation de la régénération hépatique, conduisant à l’hyperactivation de STAT3, l’accumulation de SOCS3 et la diminution de phosphorylation de ERK. Au final, la protéine HBx entière induit un retard de régénération hépatique. Nous avons démontré une cinétique d’apparition de tumeurs plus rapide chez les souris HBx-T que chez les souris HBx-NT après injection d’un carcinogène chimique. Nous avons aussi pu observer que les deux formes HBx-T et HBx-NT sensibilisaient les hépatocytes à l’apoptose, au cours d’un dommage hépatique aigue, et que cette sensibilisation à l’apoptose pouvait en partie rendre compte de l’effet co-carcinogène observé chez les souris HBx-T et HBx-NT. L’ensemble de mes résultats a permis de mieux comprendre les mécanismes par lesquels la protéine HBx participe au développement de CHC. / Hepatitis B virus (HBV) is a worldwide health issue, as it is estimated that 350 millions people are chronically infected. Among the viral proteins, HBx is thought to be involved in hepatocellular carcinoma (HCC) development. In this work, we were interested in biological differences between HBx sequence from non tumoral region (HBx-NT) compared to HBx from tumoral region (HBx-T) from a single patient. In particular, we studied liver regeneration after partial hepatectomy et hepatocarcinogenesis in a transgenic mice model. We demonstrated that HBx-T did not modulate liver regenereation. We also showed that HBx-NT induced IL-6 overexpression during priming phase of liver regeneration, and that IL-6 overexpression was involved in STAT3 hyperactivation, SOCS3 accumulation and inhibition of ERK. Overall, HBx-NT induced IL-6 overexpression was responsible for a delay in liver regeneration. Moreover, we showed that HBx-T induced a faster development of hepatic tumor after DEN initiation, compared to HBx-NT. Both HBx forms were involved in an apoptosis sensibilization during acute liver injury, that could be involved in co-carcinogenic effect of HBx-T and HBx-NT. Overall, my results participate to the comprehension of HBx impact on liver carcinogenesis

Le virus de l'hépatite C (HCV) est responsable de maladies chroniques du foie et l'une des principales causes de développement du carcinome hépatocellulaire (HCC). Cependant, les mécanismes moléculaires qui permettent le développement d’un HCC suite à une infection chronique par le HCV restent incompris. Les microARN (miR), de petits ARNs non codants qui régulent l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel, sont connus pour jouer un rôle important dans l'homéostasie cellulaire du foie. De plus en plus d’études suggèrent que l'infection par le HCV induit la modification de réseaux intracellulaires impliquant les miRs hépatiques contribuant au développement des lésions du foie, y compris le HCC. En utilisant des techniques d'analyse systématiques, nous avons identifié des miRs qui modulent le cycle viral du HCV mais également des miRs modulés lors de l'infection par le HCV. Cette analyse globale des interactions entre les miRs de l'hôte et le HCV améliore les connaissances actuelles sur les interactions entre le HCV et l’hôte qui contribuent vraisemblablement à la tumorigenèse dans le foie, et ouvre des perspectives pour de potentielles nouvelles approches pour prévenir et/ou traiter le HCC chez les patients infectés par le HCV. / Hepatitis C virus (HCV)-induced chronic liver disease is one of the leading causes of hepatocellular carcinoma (HCC). However, the molecular mechanisms that enable HCC development following chronic HCV infection remain poorly understood. MicroRNAs (miRs), small non coding RNAs that regulate gene expression at a post-transcriptional level have been reported to play an important role in cellular homeostasis within the liver. Increasing evidence suggests that HCV infection induces alteration of intrahepatic miR networks and that deregulation of miRs contributes to liver disease including HCC. Using high-throughput screening and RNA sequencing, we identified miRs that modulate the HCV life cycle and miRs that are modulated upon HCV infection. This comprehensive analysis of the HCV-host miR network improves the current knowledge of the HCV-host interactions that likely contribute to tumorigenesis in the liver and opens perspectives for novel potential approaches to prevent and/or treat HCC in HCV-infected patients.

La radiothérapie interne sélective (selective internal radiation therapy, SIRT) utilisant des microsphères marquées à l’Yttrium-90 est une technique émergente de traitement des tumeurs hépatiques. Dans ce travail, nous nous sommes attachés à étudier les relations entre traitements systémiques et SIRT à travers un modèle in vitro et deux études cliniques rétrospectives. Les différents résultats obtenus suggèrent des pistes de développement clinique. Dans le cholangiocarcinome, l’utilisation d’une chimiothérapie concomitante pourrait être associée à de meilleurs résultats, comme suggérés dans l’étude in vitro et l’étude clinique. Dans le carcinome hépatocellulaire, nos résultats confirment l’intérêt déjà suggérée de la SIRT en cas de thrombose porte ; nos résultats peuvent aussi suggérer l’intérêt d’augmenter la dose et de sélectionner les patients ayant une bonne fixation de la thrombose tumorale comme meilleurs candidats à la SIRT. / Selective Internal Radiation Therapy (SIRT) with microspheres loaded with Yttrium-90 is an emerging locoregional treatment of liver malignancies. In this work, we studied potential relationships between systemic treatment and SIRT in an in vitro model and two retrospective clinical studies. The results obtained may generate new hypotheses for clinical development. Regarding cholangiocarcinoma, concomitant use of chemotherapy may be associated with better outcomes, as suggested by both the in vitro and clinical retrospective data. Regarding hepatocellular carcinoma, our results confirmed previous interest in SIRT in case of portal vein thrombosis; our results might also suggest potential improvement by increasing the dose delivered, and the need to select patients with good targeting of the thrombosis as better candidate for SIRT. These results should be confirmed in prospective studies, currently ongoing.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la principale forme de cancer primitif du foie. Le CHC présente des variations d'incidence géographique qui reflètent les variations de prévalence des infections chroniques par les virus de l'hépatite B (VHB) et/ou C (VHC), ainsi que l'exposition alimentaire aux aflatoxines. Dans les régions de haute incidence, une mutation spécifique au le codon 249 du gène TP53 est très fréquemment détectée dans les CHC et a été proposée comme un marqueur moléculaire de l'exposition aux aflatoxines. La protéine mutée correspondante, p.R249S, interagit avec l'oncogène viral HBx, qui module la réplication virale, la prolifération et la survie cellulaire. Des séquences HBX sont détectables dans l'ADN génomique de plus de 80% des CHC liés au VHB. Nous avons étudié les associations de mutation R249S avec les caractéristiques moléculaires de HBX et la progression du CHC en utilisant des spécimens obtenus dans deux études cas-témoins développées Thaïlande et en Gambie. Nos résultats démontrent (1) que la mutation R249S est préférentiellement associée aux CHC qui se développent en l'absence de cirrhose hépatique préexistante ; (2) que la mutation est associée à la présence de polymorphismes dans l'intron 1 de TP53, suggérant l'influence de facteurs de susceptibilité génétique sur la formation des mutations ; (3) que la mutation est généralement associée à la rétention dans les cancers de séquences de HBX complètes. Ces résultats suggèrent que la protéine mutée p.R249S coopère avec HBx pour favoriser le développement de CHC sans cirrhose, et que la susceptibilité à la formation de cette mutation est influencée par la structure polymorphique de TP53 / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the main form of primary liver cancer. HCC presents geographical variations in incidence that reflect variations in the prevalence of chronic infections by hepatitis B virus (HBV) and / or C (HCV) and dietary exposure to aflatoxins. In areas of high incidence, a specific mutation at codon 249 of TP53 gene is frequently detected in HCC and has been proposed as a molecular hallmark of aflatoxin exposure. The corresponding mutated protein p.R249S, interacts with the viral oncogene HBx, which modulates viral replication, proliferation and cell survival. HBX sequences are detectable in the genomic DNA of more than 80% of HBVrelated HCC. We investigated the associations of mutation R249S with the molecular characteristics of HBX and progression of HCC using specimens obtained in two case-control studies developed in Thailand and in The Gambia. Our results demonstrate (1) that the mutation R249S is preferentially associated with HCC that develop in the absence of pre-existing liver cirrhosis, (2) that the mutation is associated with the presence of polymorphisms in intron 1 of TP53, suggesting influence of genetic susceptibility factors on the formation of mutations, (3) that the mutation is usually associated with the retention of cancers with complete HBX sequences. These results suggest that the mutated protein p.R249S cooperates with HBx to promote the development of HCC without cirrhosis, and that susceptibility to the formation of this mutation is influenced by the polymorphic structure of TP53

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est un cancer très fréquent - au 5ème rang de l’échelon mondial - dont l’incidence ne cesse d’augmenter. Lié aux maladies chroniques du foie (hépatite C, syndrome métabolique et, le plus souvent, cirrhose), il représente désormais un véritable problème de santé publique. C’est la nature du foie sous-jacent qui détermine les modalités de sa prise en charge. Lorsque le foie ne présente pas de maladie chronique (foie sain), on se trouve généralement devant une tumeur déjà évoluée; dans ce cas on a recours essentiellement à la résection hépatique. Lorsque le foie présente une maladie chronique (foie pathologique), qu’il s’agisse de fibrose, cirrhose ou hépatite, c’est le stade tumoral au moment du diagnostic qui oriente le choix du traitement ; à part la transplantation, limitée dans ses indications, les options thérapeutiques comportent la résection hépatique, la destruction par voie sous-cutanée (radio fréquence) et un traitement par voie artérielle (chimioembolisation). Cependant, ces traitements à visée curative, ne peuvent être envisagés actuellement que dans 30% des cas. Notre travail porte uniquement sur la résection hépatique. Partout disponible, cette intervention chirurgicale représente en effet le traitement de référence dans la prise en charge du CHC. Nous nous appuyons sur une vaste enquête nationale qui, développée sur une période de 15 ans – de 1990 à 2005 – à partir de 23 centres de chirurgie, à porté sur plus de 2590 dossiers de patients. Grâce à ces données de base, particulièrement précieuses par leur nombre et leur précisions, nous avons tenté de donner une image panoramique des pratiques (indications, techniques opératoires) et des résultats (survie, récidive, morbidité, mortalité) de la résection hépatique pour CHC en France. Il s’agit de la plus grande étude multicentrique chirurgicale menée sur le CHC en France à ce jour. On a classé 102 paramètres dans 6 groupes de données ont été colligés pour chaque malade inclus dans l’étude: Terrain, Bilan préopératoire, Chirurgie, Anatomopathologie, Morbidité et traitements adjuvants et Evolution. Au total, cette enquête a permis de recueillir une somme considérable de données dont l’analyse multivariée avait pour l’objectif d’aboutir à des critères prédictifs de mortalité opératoire et de survie après résection sur foie sain et pathologique. Cette analyse a confirmé le développent et la qualité de la chirurgie hépatique en France. Aussi, l’analyse a montré que la résection hépatique est un traitement efficace du CHC sur foie sain et pathologique. Ces résultats et leur implication pour l’approche multidisciplinaire en cancérologie contribueront à améliorer les connaissances et la prise en charge du CHC. Finalement, à coté de la transplantation hépatique, limitée par ses indications restreintes et la pénurie de greffons, la résection du CHC occupe une place importante qui doit continuer de croître du fait de ses bons résultats et de l’augmentation constante de l’incidence du CHC / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common cancer worldwide, and the third most common cause of cancer-related death. It is a major health problem worldwide, which represents the most prevalent primary liver cancer and constitutes the third most frequent cause of cancer-related deaths. The major risk factor for HCC is cirrhosis. All types of cirrhosis predispose to HCC, but the incidence is particularly high in persistent infection with hepatitis B (HBV) and hepatitis C (HCV) and in alcoholic liver disease. The clinical presentation and management of HCC depends on whether the liver is cirrhotic and whether there is underlying viral hepatitis. Therapeutic options fall into four main categories (1) surgical interventions, including tumor resection and liver transplantation, (2) percutaneous interventions, including ethanol injection and radiofrequency thermal ablation, (3) transarterial interventions, including embolisation and chemoembolisation and (4) drugs as well as gene and immune therapies. Potentially curative therapies are tumor resection, liver transplantation, and percutaneous interventions that can result in complete responses and improved survival in a high proportion of patients. Liver resection offers the greatest impact on survival when patients do not meet transplantation criteria and this is considered as the optimal treatment for HCC. The objective of this thesis, based on a retrospective survey, was to give an overview on conditions of realization and the results of the resection of HCC in France, in the period from 1990-2005. All the French centers of excellence in the hepatobiliary surgery were contacted and most of them accepted to participate. All the contacted units were essentially localized in University Clinical Centers, all of them experts in hepatic surgery and most of them were centers for liver transplantation. More than 2590 cases with hepatic resection were collected in this study. The file consisted of 102 questions and contained following headings: demographic data, underlined liver pathology, circumstances of diagnosis, imaging, evaluation of underlined liver pathology: biological, morphological, histological, preparation for resection: neoadjuvant treatment of the tumor, portal embolization, surgical intervention: approach, clamping, vascular control, nature and the extent of the exeresis, anatomic or non-anatomic features, histopathological analysis of the removed tissues, results: mortality, morbidity, recurrence, survival, lost from analysis. In total, this survey enabled us to collect a considerable sum of data in order to give a more precise overview on predictive criteria of per operative mortality and survival, as well as recurrence rates, after the resection of normal and pathological livers. It confirmed the development and the quality of the hepatic surgery in France

Introduction : Le récepteur TLR3 (Toll-like receptor 3) détecte l'ARN double brin viral ou cellulaire; il est exprimé dans les hépatocytes humains dans lesquels son activation engendre une réponse proinflammatoire médiée par la production d’interféron de type I. Dans les cellules cancéreuses, TLR3 peut entraîner l’apoptose par sa capacité à activer la voie extrinsèque des caspases. Notre objectif était de caractériser l’expression et la fonctionnalité de TLR3 dans les carcinomes hépatocellulaires (CHC). Matériels et Méthodes : Ce travail a été mené de manière translationnelle. In vitro : le rôle de TLR3 a été analysé dans un modèle de transformation d’hépatocytes primaires humains (PHH) par les oncogènes SV40LT-ST et H-RasG12 V. In vivo : l’impact de TLR3 a été étudié dans un modèle de souris exprimant l’oncogène SV40 avec un TLR3 sauvage (TLR3+/+) ou invalidé (TLR3-/-). Enfin une cohorte française de 126 patients opérés d’un CHC de toutes étiologies a été analysée afin d’évaluer la valeur pronostique en termes de récidive du niveau d’expression du récepteur en ARNm (q-rt-PCR) en protéine (Western Blot) dans le foie tumoral par rapport au foie non tumoral. Résultats: In vitro, la transformation cancéreuse de PHH in vitro par SV40LT-ST et H RasG12 V s’accompagne d’une baisse drastique du niveau d’expression de TLR3 en ARNm et en protéine. L'expression forcée de TLR3 avant transduction par SV40LT-ST est responsable de l'entrée en apoptose des cellules. In vivo, dans le modèle murin SV40, les foyers de transformation cancéreuse et de CHC sont significativement plus nombreux dans les souris SV40-TLR3-/- que dans les souris SV40-TLR3+/+ à 8, 10 et 12 semaines. De plus, dans les souris SV40-TLR3-/-, l’évaluation de l’apoptose montre une diminution significative au sein du parenchyme hépatique comparée aux souris SV40-TLR3+/+ sans impact sur la prolifération hépatique ni le recrutement des cellules immunitaires. Enfin dans une série de 126 patients résequés d'un CHC, la sous-expression de l’ARNm de TLR3 (déterminée par rapport à un panel de foies sains) était significativement associée à la récidive précoce post-résection en analyse univariée (HR=1.79 [1.04 - 3.06] p=0.03) et multivariée (HR=1.73 [1.01–2.97] p=0.04). L'impact pronostique de la sous-expression de TLR3 a été validé dans une large cohorte de 306 CHC réséqués issus du TCGA. Conclusion: la sous-expression de TLR3 est un mécanisme d’échappement à la mort cellulaire des hépatocytes par apoptose durant l'hépatocarcinogenèse. L’évaluation du niveau d’expression pourrait servir de biomarqueur puisque l’absence de TLR3 est associée au risque de récidive. A contrario, la présence de TLR3 constitue une cible thérapeutique / Introduction: The receptor TLR3 (Toll-like receptor 3) detects viral or cellular double-stranded RNA; it is expressed in human hepatocytes in which its activation generates a pro-inflammatory response mediated by the production of type I interferon. In cancer cells, TLR3 can cause apoptosis by its ability to activate the extrinsic pathway of caspases. Our goal was to characterize the expression and functionality of TLR3 in hepatocellular carcinoma (HCC). Materials and Methods: This work was conducted in a translational way. In vitro: the role of TLR3 was in a model of transformation of primary human hepatocytes (PHH) by the oncogene SV40LT-ST and H-RasG12V. In vivo: the impact of TLR3 was studied in a mouse model expressing the SV40 oncogene with wild-type TLR3 (TLR3 + / +) or invalidated (TLR3 - / - ). Finally, a French cohort of 126 patients operated on with a CHC of all etiologies was analyzed in order to evaluate the prognostic value in terms of recurrence of the receptor expression at mRNA (q-rt-PCR), protein (Western Blot) levels in the tumoral compared to the non-tumoral liver. Results: In vitro, PHH trasformation by SV40LT-ST and H-RasG12V is asociated with a drastic decrease of TLR3 expression at mRNA and protein levels. A forced expression of TLR3 before SV40LT-ST transduction is responsible for the apoptosis of the cells. In vivo, in the SV40 mouse model, CHC foci were significantly higher in SV40-TLR3- / - mice than in SV40-TLR3+ / + mice at 8, 10 and 12 weeks. In addition, in SV40-TLR3- / - mice, comparison of apoptosis showed a significant decrease in hepatic parenchyma compared to SV40-TLR3+ / + mice with no impact on hepatic proliferation or immune cell infiltration. Finally, in a cohort of 126 patients with resected HCC, the downregulation of TLR3 mRNA (compared to a panel of normal livers) was significantly associated with early post-resection recurrence in univariate analysis (HR = 1.79 [1.04 - 3.06] p = 0.03) and multivariate (HR = 1.73 [1.01-2.97] p = 0.04). The prognostic impact of TLR3 downrégulation was validated in a large cohort of 306 resected CHCs from the Cancer genome Atlas (TCGA). Conclusion: TLR3 downregulation is an escape mechanism to apoptosis during hepatocarcinogenesis. TLR3 expression could be used as a prognosis biomarker since the absence of TLR3 is associated with recurrence. On the other hand, the presence of TLR3 constitutes a therapeutic target

Résumé : La répression fréquente du gène encodant pour le « suppressor of cytokine signaling 1 » (SOCS1) dans le carcinome hépatocellulaire (CHC) et la forte susceptibilité des souris déficientes pour SOCS1 à développer des tumeurs hépatiques expérimentales suggèrent que SOCS joue un rôle de suppresseur de tumeur. Cette notion est supportée par les études impliquant la répression de l’expression de SOCS1 via des évènements épigénétiques ou par les microARN dans plusieurs autres types de cancers. Les mécanismes moléculaires sous-jacents au rôle potentiel de suppresseur de tumeur de SOCS1 dans le foie demeurent à ce jour inconnus. Bien que les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) sont reconnus pour induire l’expression de l’ARNm de SOCS1, le rôle et les mécanismes par lesquels SOCS1 peut réguler la signalisation des RTK sont incertains. Le RTK MET, qui a pour ligand le facteur de croissance des hépatocytes (HGF), régule plusieurs fonctions cellulaires normales. La dérégulation de la signalisation du récepteur MET joue des rôles importants dans la pathogenèse du CHC. Des études ont démontré que l’activation de MET promeut la prolifération, l’invasion et la migration des cellules cancéreuses du foie ainsi que leur dissémination métastatique. La signalisation aberrante de MET est un trait commun de plusieurs autres cancers et serait à l’origine de l’émergence de la résistance à la chimiothérapie. Dans ce projet, j’ai investigué les mécanismes moléculaires par lesquels SOCS1 régule l’activité du récepteur MET. Mes résultats indiquent que le foie des souris Socs1[indice supérieur -/-]Ifng[indice supérieur -/-] se régénère plus rapidement que celui des souris contrôles. Suivant une stimulation au HGF, les hépatocytes issus des souris Socs1[indice supérieur -/-] Ifng[indice supérieur -/-] présentent une augmentation de la signalisation de MET, de la migration et de la prolifération cellulaires. L’expression exogène de SOCS1 dans différentes lignées cellulaires d’hépatocarcinomes humains et murins inhibe la signalisation induite par HGF. De plus, SOCS1 diminue la prolifération, la croissance indépendante de l’anchrage et la migration dans ces lignées de CHC in cellulo et réduit de façon significative leur croissance dans les essais de xénogreffes chez les souris immunodéficientes. Mes résultats suggèrent que l’activation de la signalisation HGF-MET induit la transcription du gène SOCS1, suivi par une interaction physique entre SOCS1 et MET. L’analyse de divers mutants de SOCS1 révèle que cette interaction implique principalement les domaines SH2 et « kinase inhibitory region » (KIR) de SOCS1. L’activité kinasique de MET est requise pour cette interaction puisque l’interaction entre SOCS1 et un mutant kinase-inactif de MET est fortement réduite. SOCS1 est aussi phosphorylé en aval de MET sur quatre résidus tyrosine (Tyr). Quoique ces résidus Tyr représentent théoriquement des sites d’interaction pour des protéines adaptatrices possédant des domaines de liaison aux phospho-Tyr, elles ne semblent pas impliquées dans l’interaction de SOCS1 avec MET. Je démontre également que SOCS1 induit l’ubiquitination de MET via l’élongation de chaînes de polyubiquitine de type K48, conduisant à sa dégradation par le protéasome. Cette modulation négative de MET par SOCS1 dans les cellules CHC survient indépendamment de la voie de dégradation lysosomale de Cbl qui est partagée par plusieurs autres RTK. // Abstract : Frequent repression of the gene coding for the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1) in hepatocellular carcinoma (HCC) and increased susceptibility of SOCS1 deficient mice to experimental hepatocarcinogenesis suggest a tumor suppressor role for SOCS1. This notion is supported by epigenetic and micro-RNA-mediated blockade of SOCS1 expression in several other cancers. Molecular mechanisms underlying the putative tumor suppressor function of SOCS1 in the liver have not been elucidated yet. Although receptor tyrosine kinases (RTK) can induce SOCS1 mRNA expression, the role and mechanisms of SOCS1 in regulating RTK signaling are not yet clear. c-Met is the RTK for hepatocyte growth factor (HGF) and mediates several normal cellular functions. HGF signaling and MET activation also play important roles in the pathogenesis of HCC. Experimental studies have shown that the activated MET promotes proliferation, invasion and migration of liver cancer cells and enhances metastasis. Aberrant MET signaling is a hallmark of many other cancers and underlies the emergence of chemoresistant clones. In this project, I investigated the molecular mechanisms by which SOCS1 regulates MET RTK activity. My results illustrate that the Socs1[superscript -/-]Ifng[superscript -/-] liver regenerates at a faster rate than the control one. Following HGF stimulation, hepatocytes from Socs1[superscrip -/-]Ifng[superscript -/-] mice display increased MET signaling, cell migration and proliferation. Forced expression of SOCS1 inhibits HGF-induced signaling pathways in different human or murine hepatoma cell lines. Furthermore, SOCS1 also decreases cell proliferation, anchorage-independent growth, and migration of HCC cell lines in cellulo, and results in significant inhibition of their growth as xenografts in immunodeficient mice. My findings show that activation of HGF-MET signaling results in transcriptional activation of SOCS1 gene, followed a physical interaction between SOCS1 and MET. Analysis of various SOCS1 mutants reveals that this interaction is mediated primarily via the SH2 and the kinase inhibitory region (KIR) domain of SOCS1. MET kinase activity is required for this interaction since SOCS1 binding to a kinase-dead MET mutant is dramatically reduced. MET promotes phosphorylation of SOCS1 on four tyrosine (Tyr) residues. Although these Tyr might represent potential binding sites for adaptors containing phospho-Tyr-binding domains, they do not appear to be involved in the interaction of SOCS1 with MET. I also show that SOCS1 induces polyubiquitination of MET via K48-ubiquitin chain elongation leading to its degradation by proteasomes. The SOCS1-mediated downmodulation of MET expression in HCC cells occurs independently of the Cbl-mediated lysosomal degradation pathway shared by many other RTKs. Taken together, my findings show that SOCS1 attenuates HGF-induced cellular functions by targeting the activated MET receptor for proteasomal degradation.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la 3ème cause de mortalité par cancer dans le monde. L'identification de nouveaux marqueurs sériques est cruciale pour améliorer le pronostic. Dans ce travail, nous avons évalué l'intérêt de la spectroscopie vibrationnelle, infrarouge et Raman, appliquée au sérum pour le diagnostic du CHC. Dans un premier temps, nous avons réalisé 2 études pilotes pour évaluer le potentiel de ces deux approches. L'intérêt de la spectroscopie Raman appliquée au sérum a été évalué chez 37 patients cirrhotiques avec CHC et 34 patients cirrhotiques sans CHC. L'analyse des données spectrales a permis de classer les patients avec un taux d'exactitude diagnostique de 85 à 91%. Nous avons également démontré l'intérêt diagnostique de la spectroscopie IRTF dans une population de 40 patients avec CHC et 39 patients sans CHC. Dans cette étude, le taux d'exactitude diagnostique était de 82 à 86%. Dans un deuxième temps, nous avons mené une étude sur un plus grand nombre de patients afin de valider les résultats obtenus dans l'étude pilote IRTF. Les caractéristiques spectrales IRTF du sérum de 308 patients cirrhotiques avec CHC ont été comparées à celles du serum de 509 patients cirrhotiques sans CHC. L'analyse des données spectrales par deux méthodes de classification supervisée, SVM et PLS-DA, n'a pas permis de confirmer les résultats obtenus dans cette étude pilote. Avec un taux d'exactitude diagnostique entre 50 et 60 %, l'analyse spectrale IRTF du sérum entier n'apparait pas discriminante pour distinguer les patients cirrhotiques avec et sans CHC. Ce résultat souligne la nécessité de confirmer sur un grand nombre de patients les résultats obtenus dans des études pilotes. L'analyse spectrale ciblée sur des fractions du sérum pourrait permettre d'identifier plus efficacement des marqueurs diagnostiques en évitant la superposition des informations spectrales liées aux multiples molécules présentes dans le sérum entier. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third cause of cancer death in the world. The identification of novel serum markers is crucial to improve the prognosis. In this work, we evaluated the potentiels of vibrational spectroscopy, infrared and Raman spectroscopy, applied to serum to diagnose HCC. On a first step, two pilot studies were conducted to evaluate these two approaches. Raman spectroscopy applied to the serum was tested in 37 cirrhotic patients with HCC and 34 cirrhotic patients without HCC. Analysis of spectral data showed that it was possible to classify patients with a diagnostic accuracy rate of 85 to 91%. We also demonstrated the diagnostic performance of FTIR spectroscopy in a population of 40 patients with HCC and 39 patients without HCC. In this study, the diagnostic accuracy rate was 82 to 86%. In a second step, an FTIR study on a larger number of patients was performed to validate the results obtained in the pilot studiey. FTIR spectral characteristics of 308 serum from cirrhotic patients with HCC were compared with those of 509 cirrhotic patients without HCC. The supervised classification methods, SVM and PLS -DA were applied but did not confirm the results obtained in the pilot study. The diagnostic accuracy was between 50 and 60%, FTIR spectral analysis of whole serum does not appear discriminant enough to differentiate cirrhotic patients with and without HCC. This result highlights the need to confirm on a large number of patients results in pilot studies. Spectral analysis of serum fractions could be an alternative to more effectively identify diagnostic markers avoiding overlapping spectral information related to the complex composition of whole serum.

Dans les pays d’Afrique Sub-Saharienne et d’Asie du Sud-Est, l’infection chronique par le virus de l’hépatite B (VHB) et l’exposition à l’aflatoxine B1 (AFB1) ont un rôle synergique dans le développement du carcinome hépatocellulaire (CHC). Cependant les mécanismes impliqués ne sont pas élucidés à ce jour. Le VHB est un petit virus à ADN qui induit différentes maladies du foie allant du portage asymptomatique au CHC. L’AFB1 est une mycotoxine qui contamine la nourriture. Après activation en époxyde, elle forme des adduits à l’ADN puis des mutations, dont la mutation au codon 249 du gène suppresseur de tumeur TP53 (AGG → AGT, mutation R249S). Nous avons utilisé les caractéristiques uniques de la lignée cellulaire HepaRG pour étudier les interactions entre le VHB et l’AFB1 : ces cellules se différencient in vitro en hépatocytes qui métabolisent l’AFB1 et peuvent être infectés par le VHB. Nous avons montré que l’AFB1 induit une réponse de p53 dose-dépendante et agit comme un agent antiviral en réprimant la production de particules virales après 48h d’exposition. D’autre part, l’infection par le VHB n’a montré aucun effet sur la formation ou la réparation des adduits. De la réparation et de la prolifération cellulaire ont été observées suite au traitement à l’AFB1, suggérant la faisabilité de l’étude de mutations dans ce système, dont R249S. Ces résultats suggèrent que l’AFB1 atténue l’hépatite chronique tout en maintenant les hépatocytes sous intense pression mutagène, ce qui favoriserait la progression vers le CHC / In sub-Saharan Africa and South-East Asia, chronic infection by hepatitis B virus (HBV) and exposure to aflatoxin B1 (AFB1) play a synergic role in the development of hepatocellular carcinoma (HCC). However mechanisms are still largely unknown. HBV is a small DNA virus which induces different liver diseases from asymptomatic carriage to HCC. AFB1 is a mycotoxin which contaminates food. After activation into an epoxide, it forms DNA adducts and mutations, such as R249S mutation at codon 249 in tumor suppressor TP53 gene (AGG → AGT). We have taken advantage of the unique features of the cell line HepaRG to investigate interactions between both risk factors: cells differentiate in vitro into hepatocytes which metabolize AFB1 and can be infected by HBV. We have shown that AFB1 induces a dose-dependent p53 response and act as an antiviral agent by repressing production of HBV particles after 48 hours of exposure. Nevertheless HBV infection had no effect on adduct formation or repair. Moreover DNA synthesis activity associated to DNA repair and cell proliferation were observed following AFB1 treatment, suggesting the feasibility of mutation research in this model, especially R249S. Overall these results suggest that AFB1 may attenuate HBV chronic hepatitis while maintaining hepatocytes under intense mutagenic pressure, thus enhancing the progression towards HCC