Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Kelly Marques (pereira.kelly@gmail.com) on 2009-10-21T18:46:59Z No. of bitstreams: 1 2008_AlessandraMenezesCampos.pdf: 1238572 bytes, checksum: dab07da7d1c9342e2084f202e412302b (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-10-30T12:18:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_AlessandraMenezesCampos.pdf: 1238572 bytes, checksum: dab07da7d1c9342e2084f202e412302b (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-30T12:18:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_AlessandraMenezesCampos.pdf: 1238572 bytes, checksum: dab07da7d1c9342e2084f202e412302b (MD5) Previous issue date: 2008 / A renina é uma aspartil protease sintetizada in vivo pela remoção proteolítica do prósegmento amino-terminal de seu precursor, a pró-renina. A catepsina B, uma tiol protease, tem sido sugerida como candidata à enzima conversora de pró-renina devido à sua colocalização com a renina nos grânulos secretórios e também pela sua capacidade de processar a pró-renina em renina in vitro e em cultura de células. Vetores de expressão de pró-renina selvagem (WT) e mutantes foram co-transfectados com catepsina B em células hipofisárias de ratos GH4C1, que naturalmente não converte pró-renina em renina. Mutações pontuais foram utilizadas para identificar quais aminoácidos presentes no sítio de clivagem da pró-renina são reconhecidos pela catepsina B. Experimentos de pulse-chase foram realizados para rastrear se a pró-renina radiomarcada é capaz de seguir para os grânulos secretórios das células GH4C1. Para investigar se a pró-renina humana poderia ativar o promotor do Peptídeo Natriurético Cerebral (BNP) em cardiomiócitos de ratos neonatos, essas células foram co-transfectadas com o plasmídeo repórter BNP-luciferase com (ou sem) angiotensinogênio humano. Os cardiomiócitos foram co-incubados com as células não-aderentes U937 transfectadas com pró-renina humana WT ou mutantes (-1-2 ou +5). Os cardiomiócitos foram lisados 96 horas após a eletroporação para a análise de geração de luciferase. Células não-transfectadas U937 foram usadas como grupo controle. Captopril e Losartan (10-7 M) foram usados para testar a participação da enzima conversora de angiotensina (ECA) e dos receptores AT1. Os resultados demonstraram que mutações pontuais na metionina -3(M/A), lisina -2(K/A) e leucina +2(L/A) reduzem o processamento da pró-renina pela catepsina B. Além disso, a remoção da cadeia glicosídica na asparagina +5 aumenta a conversão de pró-renina, sugerindo que a glicosilação poderia impedir o processamento enzimático da pró-renina. Nos experimentos de pulse-chase, a pró-renina não foi direcionada aos grânulos secretórios e a presença de catepsina B não alterou esse resultado, indicando que o processamento de pró-renina provavelmente ocorre fora dessas organelas. A pró-renina WT secretada pelas células U937 é capaz de ativar o promotor do BNP em cardiomiócitos de ratos transfectados com angiotensinogênio humano. O par de aminoácidos básicos arginina-lisina e a cadeia glicosídica +5 parecem ser tão importantes quanto a atividade enzimática da ECA e os receptores AT1 para a ativação do promotor do BNP em cardiomiócitos de ratos neonatos. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Renin is an aspartyl protease synthesized in vivo by proteolytic removal of amino-terminal prosegment of its precursor, prorenin. Cathepsin B, a thiol protease, has been proposed to be a good candidate for prorenin processing enzyme because of its co-localization with renin in secretory granules and also by its ability to activate prorenin in vitro and in cell culture. It was co-transfected vectors expressing wild type and mutant prorenins with cathepsin B in rat pituitary GH4C1 cells, which normally do not activate prorenin into renin unless cotransfected with a prorenin processing enzyme. Scanning mutagenesis was used to identify which amino acids at prorenin cleavage site are specifically recognized by cathepsin B. Pulsechase experiments were performed to follow whether radiolabeled prorenin is sorted to secretory granules. To investigate whether human prorenin could activate the Brain Natriuretic Peptide promoter (BNP) in neonatal rat cardiomyocytes, these cells were cotransfected with a reporter gene BNP-luciferase associated or not with a human angiotensinogen. The cardiomyocytes were co-incubated with no adherent U937 cells transfected with human prorenin wild type (WT) or mutants (-1-2 or +5). Cardiomyocytes were lysated 96 hours after electroporation for luciferase generation analysis. No transfected U937 cells were used as a control group. Captopril and Losartan at 10-7 M were used to test angiotensin converting enzyme (ACE) and AT1 receptors participation in this process. The results demonstrated that single mutations at - 3 methionine (M/A), -2 lysine (K/A) and +3 leucine (L/A) reduced prorenin processing by cathepsin B. Moreover, removal of N-linked oligosaccharides at +5 asparagine enhanced prorenin conversion by cathepsin B, showing that glycosylation seems impair enzymatic prorenin processing. In pulse-chase experiments, prorenin was not targeted to secretory granules and cathepsin B co-transfection did not changed this sorting, indicating that prorenin processing probably occurs outside these organelles. These findings suggest that cathepsin B removes prorenin prosegment at correct cleavage site and this proteolysis occurs outside the dense core granules. Prorenin WT secreted by U937 cells could activate the BNP promoter in rat cardiomyocytes transfected with human angiotensinogen. Dibasic arginine-lisine prorenin amino acids and N-linked glycosilation seems to be important as well as ACE enzymatic activity and AT1 receptors for BNP promoter activation.

Cardiovascular diseases are responsible for almost one third of all global deaths yearly, and therefore are largely studied. Cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) have emerged as an exciting technology for cardiac disease modelling and personalised therapy. Nevertheless, issues concerning functional and molecular maturation are still faced. In addition to this, differentiation protocols generally yield a heterogeneous mixed population comprised of nodal, atrial and ventricular-like subtypes, being unsuitable for therapeutic purposes. Bradykinin (BK) is a vasoactive peptide which exerts important physiological roles in the cardiovascular system, having been previously described as important for cellular, keratinocyte and skeletal muscle differentiation. This project performed in cooperation with PluriCell Biotech, a startup specialized in the production and differentiation of hiPSC-CM, has sought (1) characterizing gene and protein expression of molecular markers of maturation and of subtype specification throughout of differentiation; (2) Assessing the electrical functionality of hiPSC-CM through the characterization of subtype-specific action potentials (APs) and (3) Investigating whether the progress of hiPSCCM maturation is regulated by BK through kinin-B2 receptors (B2R). Our results have validated the model that proposes a developmental-dependent switch between skeletal (ssTnI) and cardiac (cTnI) isoforms of troponin I as differentiation progresses, at least to some extent. Furthermore, prolonged time in culture has resulted in higher levels of expression of the ventricular marker MLC2v and in increased rates of ventricular-like action APs. Electrophysiological analysis of hiPSC-CM reveals a mixed population with AP morphologies correspondent to nodal, atrial and ventricular subtypes, all showing pronounced automaticity as well as other features of immature cardiomyocytes, such as low amplitude and depolarization velocity. Such findings are coherent with those from other groups who have attempted to differentiate mature native-like cardiac cells from pluripotent stem cells sources, without fully succeeding. After showing that differentiating hiPSC-CM express a functional and responsive B2R, the receptor was subjected to chronic activation with 10µM BK and 1µM BK or inhibition with 5µM Firazyr+BK. Even though B2R modulation has not interfered negatively with differentiation yields nor cell morphology, analysis of gene andprotein expression of ssTnI or cTnI and of the ventricular marker MLC2v, have revealed no significant results in comparison to untreated controls. This suggests that BK does not interfere on hiPSC-CM maturation nor subtype specification, although we cannot rule out that it could be leading to other unexplored effects. We recommend a closer look into which intracellular signalling pathways become active upon B2R stimulation in hiPSC-CM, in order to narrow down cellular processes for further investigation. / Doenças cardiovasculares são responsáveis por quase um terço de todas as mortes globais anualmente, e por isto o sistema cardiovascular é amplamente estudado. Cardiomiócitos derivados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCCM) emergiram como uma promissora tecnologia para modelagem de doenças cardíacas e terapia personalizada. No entanto, desafios acerca de sua maturação funcional e molecular ainda são enfrentados. Além disso, protocolos de diferenciação geralmente levam à obtenção de populações heterogêneas contendo células com fenótipos similares aos de cardiomiócitos nodais, atriais e ventriculares sendo, portanto, inapropriadas para fins terapêuticos. A bradicinina (BK) é um peptídio vasoativo que exerce importantes papeis fisiológicos no sistema cardiovascular, além de ter sido previamente descrita como importante para a diferenciação neuronal, de queratinócitos e de músculo esquelético. Este projeto foi realizado em colaboração com a empresa PluriCell Biotech, uma startup especializada na produção e diferenciação de hiPSC-CM, e buscou (1) caracterizar a expressão gênica e proteíca de marcadores moleculares de maturação e de especificação de subtipos cardíacos durante a diferenciação; (2) avaliar a funcionalidade elétrica de hiPSC-CM por meio da caracterização de seus potenciais de ação (PAs) e (3) Investigar se o progresso da diferenciação de hiPSCCM é regulado por bradicinina por meio do receptor B2 (B2R). Nossos resultados validaram o modelo que propõe um switch na expressão das isoformas funcionais de troponina I esquelética (ssTnI) e cardíaca (cTnI), durante o desenvolvimento e diferenciação celular, pelo menos parcialmente. Além disso, tempo prolongado em cultura resultou em maiores níveis de expressão do marcador ventricular MLC2v, assim como maiores frequências de PAs com morfologias similares a de cardiomiócitos ventriculares. Análise eletrofisiológica de hiPSCCM revelam a existência de uma população mista contendo PAs correspondentes aos subtipos nodais, atriais e ventriculares, assim como pronunciada automaticidade e outros atributos típicos de cardiomiócitos imaturos, como baixa amplitude e devagar velocidade de despolarização. Estes resultados são coerentes com os de outros grupos que ainda não foram totalmente bem-sucedidos em diferenciar células cardíacas maduras similares acardiomiócitos nativos a partir de células-troncos pluripotentes. Após mostrar que as hiPSCCM expressam receptores B2 funcionais e responsivos, submetemos o receptor a uma ativação crônica com BK 10µM e BK 1µM ou inibição crônica com Firazyr 5µM + BK. Apesar da modulação do B2R não ter interferido de forma negativa no rendimento da diferenciação ou na morfologia celular, análise de expressão gênica e proteica de ssTnI e cTnI e do marcador ventricular MLC2v não revelou resultados significativos em comparação aos controles não-tratados. Isto sugere que a BK não interfere na maturação e especificação de subtipos cardíacos em hiPSC-CM, apesar de não podermos ignorar o fato de que ela poderia estar desencadeando outros efeitos inexplorados. Nós recomendamos um estudo mais aprofundado acerca de quais vias de sinalização se tornam ativas após estimulação do receptor B2 em hiPSC-CM, com o objetivo de afunilar quais processos celulares poderiam ser investigados em uma próxima etapa deste estudo.

Cardiovascular diseases are responsible for almost one third of all global deaths yearly, and therefore are largely studied. Cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) have emerged as an exciting technology for cardiac disease modelling and personalised therapy. Nevertheless, issues concerning functional and molecular maturation are still faced. In addition to this, differentiation protocols generally yield a heterogeneous mixed population comprised of nodal, atrial and ventricular-like subtypes, being unsuitable for therapeutic purposes. Bradykinin (BK) is a vasoactive peptide which exerts important physiological roles in the cardiovascular system, having been previously described as important for cellular, keratinocyte and skeletal muscle differentiation. This project performed in cooperation with PluriCell Biotech, a startup specialized in the production and differentiation of hiPSC-CM, has sought (1) characterizing gene and protein expression of molecular markers of maturation and of subtype specification throughout of differentiation; (2) Assessing the electrical functionality of hiPSC-CM through the characterization of subtype-specific action potentials (APs) and (3) Investigating whether the progress of hiPSCCM maturation is regulated by BK through kinin-B2 receptors (B2R). Our results have validated the model that proposes a developmental-dependent switch between skeletal (ssTnI) and cardiac (cTnI) isoforms of troponin I as differentiation progresses, at least to some extent. Furthermore, prolonged time in culture has resulted in higher levels of expression of the ventricular marker MLC2v and in increased rates of ventricular-like action APs. Electrophysiological analysis of hiPSC-CM reveals a mixed population with AP morphologies correspondent to nodal, atrial and ventricular subtypes, all showing pronounced automaticity as well as other features of immature cardiomyocytes, such as low amplitude and depolarization velocity. Such findings are coherent with those from other groups who have attempted to differentiate mature native-like cardiac cells from pluripotent stem cells sources, without fully succeeding. After showing that differentiating hiPSC-CM express a functional and responsive B2R, the receptor was subjected to chronic activation with 10µM BK and 1µM BK or inhibition with 5µM Firazyr+BK. Even though B2R modulation has not interfered negatively with differentiation yields nor cell morphology, analysis of gene andprotein expression of ssTnI or cTnI and of the ventricular marker MLC2v, have revealed no significant results in comparison to untreated controls. This suggests that BK does not interfere on hiPSC-CM maturation nor subtype specification, although we cannot rule out that it could be leading to other unexplored effects. We recommend a closer look into which intracellular signalling pathways become active upon B2R stimulation in hiPSC-CM, in order to narrow down cellular processes for further investigation. / Doenças cardiovasculares são responsáveis por quase um terço de todas as mortes globais anualmente, e por isto o sistema cardiovascular é amplamente estudado. Cardiomiócitos derivados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCCM) emergiram como uma promissora tecnologia para modelagem de doenças cardíacas e terapia personalizada. No entanto, desafios acerca de sua maturação funcional e molecular ainda são enfrentados. Além disso, protocolos de diferenciação geralmente levam à obtenção de populações heterogêneas contendo células com fenótipos similares aos de cardiomiócitos nodais, atriais e ventriculares sendo, portanto, inapropriadas para fins terapêuticos. A bradicinina (BK) é um peptídio vasoativo que exerce importantes papeis fisiológicos no sistema cardiovascular, além de ter sido previamente descrita como importante para a diferenciação neuronal, de queratinócitos e de músculo esquelético. Este projeto foi realizado em colaboração com a empresa PluriCell Biotech, uma startup especializada na produção e diferenciação de hiPSC-CM, e buscou (1) caracterizar a expressão gênica e proteíca de marcadores moleculares de maturação e de especificação de subtipos cardíacos durante a diferenciação; (2) avaliar a funcionalidade elétrica de hiPSC-CM por meio da caracterização de seus potenciais de ação (PAs) e (3) Investigar se o progresso da diferenciação de hiPSCCM é regulado por bradicinina por meio do receptor B2 (B2R). Nossos resultados validaram o modelo que propõe um switch na expressão das isoformas funcionais de troponina I esquelética (ssTnI) e cardíaca (cTnI), durante o desenvolvimento e diferenciação celular, pelo menos parcialmente. Além disso, tempo prolongado em cultura resultou em maiores níveis de expressão do marcador ventricular MLC2v, assim como maiores frequências de PAs com morfologias similares a de cardiomiócitos ventriculares. Análise eletrofisiológica de hiPSCCM revelam a existência de uma população mista contendo PAs correspondentes aos subtipos nodais, atriais e ventriculares, assim como pronunciada automaticidade e outros atributos típicos de cardiomiócitos imaturos, como baixa amplitude e devagar velocidade de despolarização. Estes resultados são coerentes com os de outros grupos que ainda não foram totalmente bem-sucedidos em diferenciar células cardíacas maduras similares acardiomiócitos nativos a partir de células-troncos pluripotentes. Após mostrar que as hiPSCCM expressam receptores B2 funcionais e responsivos, submetemos o receptor a uma ativação crônica com BK 10µM e BK 1µM ou inibição crônica com Firazyr 5µM + BK. Apesar da modulação do B2R não ter interferido de forma negativa no rendimento da diferenciação ou na morfologia celular, análise de expressão gênica e proteica de ssTnI e cTnI e do marcador ventricular MLC2v não revelou resultados significativos em comparação aos controles não-tratados. Isto sugere que a BK não interfere na maturação e especificação de subtipos cardíacos em hiPSC-CM, apesar de não podermos ignorar o fato de que ela poderia estar desencadeando outros efeitos inexplorados. Nós recomendamos um estudo mais aprofundado acerca de quais vias de sinalização se tornam ativas após estimulação do receptor B2 em hiPSC-CM, com o objetivo de afunilar quais processos celulares poderiam ser investigados em uma próxima etapa deste estudo.

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:00:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4203_1.pdf: 1549042 bytes, checksum: b31328490ec2b8e8c66279e28c438620 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Universidade Federal de Pernambuco / O estudo pretendeu observar possíveis alterações morfológicas e morfométricas no coração induzidas pelo exercício físico crônico, na vigência de desnutrição protéica, durante o período de lactação. Foram utilizados 32 ratos Wistar, machos, amamentados por nutrizes com dois tratamentos nutricionais distintos: nutridas, caseína 17%; e desnutridas, caseína 8%, e subdivididos de acordo com a dieta materna e submissão à natação. Resultaram assim, quatro grupos experimentais com oito animais cada: Nutrido controle (NC); Nutrido submetidos à natação (NE); Desnutrido controle (DC) e Desnutrido submetido à natação (DE). Os animais dos grupos NE e DE realizaram um programa de exercício constituído de sessões diárias de natação livre do 8º ao 23º dia de vida. Nos 3 dias iniciais, com os animais na idade de 8, 9 e 10 dias de vida, foi realizada a adaptação na proporção de 2, 5 e 10 minutos, respectivamente, de natação, com período de descanso no 11º e 12º dia de vida. A partir do 13º ao 17º dia nadaram progressivamente 15, 20, 25, 30 e 40 minutos/dia. Descansaram por 2 dias e a partir do 20º ao 23º dia nadaram diariamente 40 minutos/dia. Na análise estatística, considerando p<0,05, podemos observar maior evolução ponderal, maior distância átrio ventricular, maior área secção transversa e espessura da parede do ventrículo esquerdo dos grupos nutridos quando comparados aos grupos desnutridos, não havendo diferença relacionada à natação quando comparados os grupos nutridos (NC, NE) e desnutridos (DC, DE) entre si. O peso absoluto do coração também foi maior nos grupos NC e NE em relação aos grupos DC e DE, porém houve diferença significativa entre os grupos NC e NE. O peso relativo do coração do grupo DC foi significativamente maior que o do grupo NC. Não foram encontradas diferenças nas médias das medidas da área da cavidade do ventrículo esquerdo. Observou-se, ainda, que a área do soma celular dos cardiomiócitos e do seu núcleo foi maior nos grupos nutridos em relação aos desnutridos, e no grupo NE em relação ao NC. Nossos resultados sugerem que na vigência da desnutrição protéica ocorre déficit do substrato necessário para que haja resposta ao aumento do metabolismo celular induzido pelo exercício físico

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:03:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo7053_1.pdf: 1434094 bytes, checksum: 2171eb82ddca7b8e7f3163089374f1fe (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Foram analisados os efeitos moduladores do treinamento físico moderado sobre parâmetros morfométricos do ventrículo esquerdo de ratos adultos submetidos à desnutrição protéica perinatal. Ratos machos da linhagem Wistar (n = 27) foram divididos em dois grupos: controle (C, n = 16 caseína 17%) e desnutrido (D, n = 11 caseína 8%), de acordo com a dieta oferecida à mãe durante a gestação e lactação. Após o período de desmame, todos os animais receberam dieta padrão do biotério (Labina®). Aos 60 dias de vida, os dois grupos foram subdivididos de acordo com a realização do treinamento físico: Controle (C: caseína 17%, n=8); Desnutrido (D: caseína 8%, n= 4; Treinado (T: caseína 17%, n= 8) e Desnutrido Treinado (DT: caseína 8%, n= 7). O treinamento físico moderado foi realizado em esteira motorizada (8 semanas, 5 dias/semana, 60 min/dia e VO2 max de 70% ). Após o treinamento os animais foram sacrificados e o coração foi analisado para estudos dos parâmetros morfométricos do ventrículo esquerdo. A histomorfometria do coração e de suas células foi realizada com o programa de análise de imagens Image J 1.44p®. O crescimento corporal foi avaliado ao longo do experimento. Observou-se menor peso corporal ao final da lactação no grupo D (26,09 ± 1,93) em relação ao C (37,70 ± 3,06) (p<0,05). A taxa de crescimento foi menor em D (0,96 ± 0,08) em relação a C (1,55 ± 0,12). O percentual de ganho de peso corporal (%GPC) foi maior no grupo D (284,49 ± 22,54) em relação a C (214,99 ± 8,24) na lactação, bem como no pós-desmame D (630,72 ± 36,16) e C (458,81 ± 28,31) (p<0,05). Esse percentual, no entanto, diminuiu no grupo DT em relação ao D e ao T após o início do treinamento físico moderado (p<0,05). Não houve diferença no peso absoluto (C = 1,39 ± 0,08; D = 1,53±0,30; T = 1,44±0,06; DT= 1,61 ± 0,08) bem como no peso relativo do coração (C = 0,003±0,0001; D = 0,0048±0,0009; T = 0,004164±0,0001; DT = 0,0046±0,0003) quando os grupos foram comparados entre si (p>0,05). A área do ventrículo esquerdo não sofreu alteração nos animais estudados (p>0,05). Em relação à área da cavidade do VE ocorreu diminuição em DT (29,42 ± 2,40) em relação a C (71,58 ± 6,13) e D (83,28 ± 13,74) (p<0,05). A espessura da parede do VE, apresentou um aumento em DT (6955,84 ± 406,02) quando comparados a C (4678,83 ± 465,79) e D (3981,40 ± 246,18). Houve uma diminuição da área dos cardiomiócitos em D (317,78 ± 9,87) quando comparados a C (441,20 ± 29,40) (p<0,05). DT apresentou aumento da área de secção transversa dos cardiomiócitos (438,59 ± 27,41) quando comparados a D (317,78 ± 9,87) (p>0,05). Os resultados demonstram que a desnutrição pode causar alterações na estrutura cardíaca e que o treinamento físico moderado é capaz de influenciar tais alterações principalmente em termos de estrutura celular

Orientador: Antonio Carlos Cicogna / Resumo: Introdução: Nos últimos anos, investigadores têm demonstrado que há a possibilidade de estimular a proliferação de cardiomiócitos adultos. Atualmente, a comunidade científica está voltada para três principais estratégias para a regeneração cardíaca: uso de células tronco, inibição de genes que regulam o sistema de controle do ciclo celular e o aperfeiçoamento de mecanismos endógenos. Um exemplo de mecanismo endógeno é a estimulação de vias de sinalização que permite a reentrada dos miócitos no ciclo celular e sua posterior divisão. O treinamento físico (TF) é um fator estimulatório para a proliferação das células cardíacas por meio da angiotensina-(1-7) (Ang-(1-7)) via receptor Mas. Além disso, o TF promove cardioproteção e aumenta os níveis deste peptídeo em animais com sobrecarga pressórica. Existem evidências, recentes, que o TF promove proliferação de miócitos em diferentes modelos experimentais e atua sobre os níveis de Ang-(1-7) em corações disfuncionantes. Entretanto, não foram encontrados estudos que avaliaram, concomitantemente, os efeitos do TF sobre a função, níveis de Ang-(1-7) e receptor Mas miocárdicos e proliferação de cardiomiócitos em modelo de sobrecarga pressórica e deterioração da função cardíaca. Objetivo: Testar a hipótese que o TF atenua a queda do desempenho cardíaco, acarreta proliferação de cardiomiócitos e eleva os níveis de Ang-(1-7) e do receptor Mas miocárdicos em ratos com estenose aórtica supravalvar (EAo) e disfunção ventricular esquerda. Méto... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Submitted by GUSTAVO AUGUSTO FERREIRA MOTA null (gugaprotork@hotmail.com) on 2017-04-23T04:00:46Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Gustavo Mota.pdf: 1732955 bytes, checksum: b66f85d7f717fa84ef77b52b75bea952 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-25T19:39:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mota_gaf_me_bot.pdf: 1732955 bytes, checksum: b66f85d7f717fa84ef77b52b75bea952 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-25T19:39:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mota_gaf_me_bot.pdf: 1732955 bytes, checksum: b66f85d7f717fa84ef77b52b75bea952 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Introdução: Nos últimos anos, investigadores têm demonstrado que há a possibilidade de estimular a proliferação de cardiomiócitos adultos. Atualmente, a comunidade científica está voltada para três principais estratégias para a regeneração cardíaca: uso de células tronco, inibição de genes que regulam o sistema de controle do ciclo celular e o aperfeiçoamento de mecanismos endógenos. Um exemplo de mecanismo endógeno é a estimulação de vias de sinalização que permite a reentrada dos miócitos no ciclo celular e sua posterior divisão. O treinamento físico (TF) é um fator estimulatório para a proliferação das células cardíacas por meio da angiotensina-(1-7) (Ang-(1-7)) via receptor Mas. Além disso, o TF promove cardioproteção e aumenta os níveis deste peptídeo em animais com sobrecarga pressórica. Existem evidências, recentes, que o TF promove proliferação de miócitos em diferentes modelos experimentais e atua sobre os níveis de Ang-(1-7) em corações disfuncionantes. Entretanto, não foram encontrados estudos que avaliaram, concomitantemente, os efeitos do TF sobre a função, níveis de Ang-(1-7) e receptor Mas miocárdicos e proliferação de cardiomiócitos em modelo de sobrecarga pressórica e deterioração da função cardíaca. Objetivo: Testar a hipótese que o TF atenua a queda do desempenho cardíaco, acarreta proliferação de cardiomiócitos e eleva os níveis de Ang-(1-7) e do receptor Mas miocárdicos em ratos com estenose aórtica supravalvar (EAo) e disfunção ventricular esquerda. Métodos: Ratos Wistar machos foram separados em dois grupos: controle operado (Sham) e EAo. Após 18 semanas do procedimento cirúrgico, os ratos EAo e Sham foram redistribuídos em 4 grupos e randomizados quanto a presença ou ausência do TF por 10 semanas; (Sham, n = 20), (EAo, n = 19), (ShamTF, n = 20) e (EAoTF, n = 15). A remodelação cardíaca foi caracterizada pelas análises estrutural e funcional por ecocardiograma na 18ª e 28ª semana e estudo macroscópico post mortem. A análise da capacidade funcional dos animais foi realizada pelo teste de esforço progressivo. A avaliação da proliferação dos cardiomiócitos, pelo conteúdo de DNA, foi feita por citometria de fluxo. O sistema renina angiotensina cardíaco foi analisado pela expressão proteica dos receptores Mas e AT1 por Western blot. Resultados: O TF promoveu melhoria na capacidade funcional dos animais Sham e EAo quanto a velocidade de exaustão, tempo total e distância percorrida. Ao iniciar o TF na 18º semana os animais EAo apresentavam disfunção diastólica, sistólica e hipertrofia ventricular esquerda concêntrica. Na 28ª semana, este grupo manteve o mesmo padrão de disfunção cardíaca. O TF não acarretou alteração na função diastólica e melhorou a estrutura e função sistólica dos animais EAo. Os animais ShamTF mostraram aumento da função sistólica comparados com o Sham. Não foram observadas diferenças entre os quatro grupos estudados em relação ao ciclo celular dos cardiomiócitos e expressão do receptor Mas no miocárdio. Houve diminuição da expressão do receptor AT1 no grupo EAo, e o TF não alterou este padrão no EAoTF. Conclusão: O treinamento físico melhorou a capacidade funcional e a função sistólica dos animais, sem repercussões benéficas sobre a função diastólica, proliferação de cardiomiócitos e expressão proteica do receptor Mas. / Introduction: In the last years, researchers have showed that it is possible to induce adult cardiomyocytes proliferation. Currently, the scientific community is focused on three main strategies for cardiac regeneration: stem-cell use, inhibition of genes that regulate cell-cycle control system and improvement of endogenous mechanisms. An example of endogenous mechanism is the stimulation of signaling pathways that allow the reentry of myocytes into the cell cycle and their posterior division. The physical training (PT) is a stimulatory factor for the proliferation of cardiac cells through angiotensin-(1-7) (Ang-(1-7)) via Mas-receptor. In addition, PT promotes heart protection and increases this peptide levels in animals with pressure overload. Recent evidences showed that PT promotes myocyte proliferation in distinct experimental models and acts on Ang-(1-7) levels in dysfunctional hearts. However, no studies were found that evaluated, concurrently, the effects of PT on cardiac function, myocardial levels of Ang-(1-7) and Mas receptor and cardiomyocyte proliferation in a model of pressure overload with deteriorated cardiac function. Objective: To test the hypothesis that PT attenuates the impairment in cardiac performance, leads to cardiomyocyte proliferation and increases myocardial Ang-(1- 7) and Mas-receptor levels in rats with supravalvar aortic stenosis (AS) and left ventricular dysfunction. Methods: Male Wistar rats were separated into two groups: operated control (Sham) and AS. After 18 weeks of the surgical procedure, AS and Sham rats were redistributed into four groups and randomized for the presence or absence of PT for 10 weeks; (Sham, n=20), (AS, n=19), (ShamPT, n=20) and (ASPT, n=15). Cardiac remodeling was characterized by structural and functional analysis by echocardiogram at the 18th and 28th week and by post-mortem macroscopic evaluation. The functional capacity of the groups was analyzed by the progressive treadmill running test. The cardiomyocyte proliferation was evaluated by DNA content using flow cytometry. The cardiac renin-angiotensin system was analyzed by protein expression of Mas and AT1 receptors by Western blot. Results: The PT improved the functional capacity of Sham and AS animals regarding the exhaust speed, total time and treadmill running distance. At the beginning of PT, at the18th week, the AS group presented diastolic and systolic dysfunction and concentric left ventricular hypertrophy. At the 28th week, AS group maintained the same pattern of cardiac dysfunction. The PT was not alter diastolic function and improved structure and systolic function in AS group. The ShamPT rats showed increased systolic function in relation to animals of Sham group. No differences were detected among the four groups regarding the cardiomyocyte cell cycle and the myocardial Mas-receptor expression. The expression of AT1 receptor was reduced in the AS group, and PT did not modify this pattern in ASPT group. Conclusion: The PT improved the functional capacity and systolic function of the rats, without beneficial repercussions on diastolic function, cardiomyocyte proliferation and protein expression of Mas receptor.

A Cardiomiopatia Chagásica Crônica (CCC) é o elemento mórbido mais importante da Doença de Chagas e sua elucidação se tornou fundamental. Estudos da imunologia da CCC demonstram que o sistema imune desempenha um papel duplo no curso da doença, agindo de forma a controlar as formas parasitárias e ainda promovendo lesão tissular. Porém, pouco se sabe do papel das células estruturais, tais como os cardiomiócitos, no curso da doença. Sabe-se que, em outras patologias cardíacas, o IFN-&#947;, citocina produzida em abundância no coração dos pacientes com CCC, determina o priming de diversas populações celulares, modulando positivamente a sua resposta. Cardiomiócitos HL-1 e animais C3H/HePas foram primados com IFN-&#947; e desafiados com LPS para a dosagem de citocinas, simulando quadro agudo e crônico de infecção. Neste trabalho, determinamos que o IFN-&#947; modula positivamente a produção de diversas citocinas in vitro por células HL-1 (IP-10, MCP-1, G-CSF, RANTES, MIG, IL-6, MIF) e também in vivo no coração (IP-10, KC, G-CSF, LIF e IL-6). Além disso, in vitro, o IFN-&#947; foi capaz de diminuir a produção de VEGF e GM-CSF em relação aos grupos tratados apenas com LPS. Os dados corroboram a literatura e permitem concluir que os cardiomiócitos são capazes de participar ativamente da resposta inflamatória no coração e que são sensíveis aos produtos da mesma. O trabalho serve ainda de base para novos estudos sobre o perfil de citocinas expressas no coração no curso da infecção por T. cruzi e como os cardiomiócitos participam da resposta inflamatória em questão. / Chronic Chagasic Cardiomyopathy (CCC) is the most morbid element of Chagas Disease, the elucidation of its physiopathology being fundamental. However, little is known about the role of structural cells, such as cardiomyocytes, in the course of the disease. In other cardiac pathologies, it has been shown that IFN-&#947; determines the priming of several resident populations, positively modulating their response. In this work, HL-1 cardiomyocytes and C3H/HePas mice were primed with IFN-&#947; (in brief or extended protocols) and challenged with LPS, the cytokines produced being measured in the supernatants. We observed that IFN-&#947; positively modulates the in vitro production of many cytokines by HL-1 cells (IP-10, MCP-1, G- CSF, RANTES, MIG, IL-6, MIF) and also their in vivo production at the heart (IP-10, KC, G-CSF, LIF and IL-6). Besides, IFN-&#947; was able to decrease the LPS-induced production of VEGF and GM-CSF by HL-1 cells. Our data allow us to conclude that cardiomyocytes actively participate in the inflammatory response of the heart, being sensitive to products released by professional immune cells. This work may serve as a basis for further studies on the profile of the cytokines secreted in the heart tissue along the course of cardiac inflammation.

As metaloproteases da matriz (MMPs) são enzimas proteolíticas que participam da degradação da matriz extracelular no organismo de vertebrados. Estudos mostram a grande importância dessas enzimas no processo de remodelação do tecido cardíaco, além de sugerirem a participação da MMP-2 em doenças cardiovasculares. Em estudo recente foi demonstrado que as MMPs clivam o receptor ?2-adrenérgico, contribuindo para o aumento do tônus arteriolar de ratos espontaneamente hipertensos (SHR). Acredita-se que processo semelhante possa ser verificado em relação ao receptor ?-1 adrenérgico e proteínas das junções, que são fundamentais para o funcionamento do coração. As análises in sílico realizadas mostraram regiões prováveis de clivagem pela metaloprotease da matriz 2 humana recombinante (rhMMP-2) na porção extracelular, especificamente na região Nterminal deste receptor, no entanto, as análises de comparação de similaridade de substratos não apresentaram resultados significativos, embora os resultados preliminares obtidos no teste in vitro mostraram que houve hidrolise logo no início do peptídeo sintético ASPPASLLPPAS, entre os resíduos alanina e serina, entre as duas prolinas e por fim entre o resíduo de prolina e alanina, regiões com grandes chances de ocorrer a hidrólise, pois o substrato nativo desta enzima é o colágeno que é composto por uma cadeia polipeptídica com uma sequência de repetições onde geralmente temos glicina-X-Y, onde X normalmente é uma prolina e Y frequentemente uma hidroxiprolina, e raramente lisina e hidroxilisina, no entanto a replicação deste experimento não apresentou o mesmo resultado. Já os resultados obtidos no western blotting mostraram que a expressão do receptor é diminuída quando os cardiomiócitos são previamente tratados com 40mM e 120mM de rhMMP- 2 e esse efeito tem uma reversão significativa quando as células são previamente tratadas com inibidores doxiciclina ou ONO-4817, corroborando com os trabalhos apresentados na literatura em que a rhMMP-2 atua no receptor ?1adrenérgico. / Matrix metalloproteinases (MMPs) are proteolytic enzymes that participate in the degradation of the extracellular matrix in the vertebrate organism. Studies show the great importance of these enzymes in the remodeling process of cardiac tissue, besides suggesting the participation of MMP-2 in cardiovascular diseases. In a recent study, MMPs were shown to cleave the ?2-adrenergic receptor, contributing to the increase in arteriolar tone of spontaneously hypertensive rats (SHR). It is believed that a similar process can be verified also in the ?-1 adrenergic receptor and junction proteins, which are fundamental to the heart function. The in situ analyzes performed revealed sections prone to be cleaved by matrix metalloproteinase 2 recombinant human (rhMMP-2) in the extracellular portion, specifically in the Nterminal region of this receptor, however, the comparative analyzes of the similarity of substrates did not present significant results, but those obtained in the in vitro test showed that there was hydrolysis right at the beginning of the synthetic peptide ASPPASLLPPAS, between alanine and serine residues, between the two proline and finally between the proline residue and alanine. Hydrolysis among proline residues was expected, even though it was not predicted for in silica cleavage, since the native substrate of this enzyme is collagen, which is composed of a polypeptide chain with a sequence of repetitions in which it usually has glycine-XY, where X usually is a proline and Y often a hydroxyproline, and rarely lysine and hydroxylysine, however the replication of this experiment di not present the same result. The obtained results in western blotting have presented that receptor expression is decreased when cardiomyocytes are pretreated with 40mM and 120mM rhMMP-2 and this effect has a significant reversion when cells are pretreated with doxycycline or ONO-4817 inhibitors, supporting previous studies which demonstrate that rhMMP- 2 acts on the ? 1 adrenergic receptor.

As metaloproteases da matriz (MMPs) são enzimas proteolíticas que participam da degradação da matriz extracelular no organismo de vertebrados. Estudos mostram a grande importância dessas enzimas no processo de remodelação do tecido cardíaco, além de sugerirem a participação da MMP-2 em doenças cardiovasculares. Em estudo recente foi demonstrado que as MMPs clivam o receptor ?2-adrenérgico, contribuindo para o aumento do tônus arteriolar de ratos espontaneamente hipertensos (SHR). Acredita-se que processo semelhante possa ser verificado em relação ao receptor ?-1 adrenérgico e proteínas das junções, que são fundamentais para o funcionamento do coração. As análises in sílico realizadas mostraram regiões prováveis de clivagem pela metaloprotease da matriz 2 humana recombinante (rhMMP-2) na porção extracelular, especificamente na região Nterminal deste receptor, no entanto, as análises de comparação de similaridade de substratos não apresentaram resultados significativos, embora os resultados preliminares obtidos no teste in vitro mostraram que houve hidrolise logo no início do peptídeo sintético ASPPASLLPPAS, entre os resíduos alanina e serina, entre as duas prolinas e por fim entre o resíduo de prolina e alanina, regiões com grandes chances de ocorrer a hidrólise, pois o substrato nativo desta enzima é o colágeno que é composto por uma cadeia polipeptídica com uma sequência de repetições onde geralmente temos glicina-X-Y, onde X normalmente é uma prolina e Y frequentemente uma hidroxiprolina, e raramente lisina e hidroxilisina, no entanto a replicação deste experimento não apresentou o mesmo resultado. Já os resultados obtidos no western blotting mostraram que a expressão do receptor é diminuída quando os cardiomiócitos são previamente tratados com 40mM e 120mM de rhMMP- 2 e esse efeito tem uma reversão significativa quando as células são previamente tratadas com inibidores doxiciclina ou ONO-4817, corroborando com os trabalhos apresentados na literatura em que a rhMMP-2 atua no receptor ?1adrenérgico. / Matrix metalloproteinases (MMPs) are proteolytic enzymes that participate in the degradation of the extracellular matrix in the vertebrate organism. Studies show the great importance of these enzymes in the remodeling process of cardiac tissue, besides suggesting the participation of MMP-2 in cardiovascular diseases. In a recent study, MMPs were shown to cleave the ?2-adrenergic receptor, contributing to the increase in arteriolar tone of spontaneously hypertensive rats (SHR). It is believed that a similar process can be verified also in the ?-1 adrenergic receptor and junction proteins, which are fundamental to the heart function. The in situ analyzes performed revealed sections prone to be cleaved by matrix metalloproteinase 2 recombinant human (rhMMP-2) in the extracellular portion, specifically in the Nterminal region of this receptor, however, the comparative analyzes of the similarity of substrates did not present significant results, but those obtained in the in vitro test showed that there was hydrolysis right at the beginning of the synthetic peptide ASPPASLLPPAS, between alanine and serine residues, between the two proline and finally between the proline residue and alanine. Hydrolysis among proline residues was expected, even though it was not predicted for in silica cleavage, since the native substrate of this enzyme is collagen, which is composed of a polypeptide chain with a sequence of repetitions in which it usually has glycine-XY, where X usually is a proline and Y often a hydroxyproline, and rarely lysine and hydroxylysine, however the replication of this experiment di not present the same result. The obtained results in western blotting have presented that receptor expression is decreased when cardiomyocytes are pretreated with 40mM and 120mM rhMMP-2 and this effect has a significant reversion when cells are pretreated with doxycycline or ONO-4817 inhibitors, supporting previous studies which demonstrate that rhMMP- 2 acts on the ? 1 adrenergic receptor.