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Numerous challenges arise in modeling and simulation as biochemical networks are discovered with increasing complexities and unknown mechanisms. With the improvement in experimental techniques, biologists are able to quantify genes and proteins and their dynamics in a single cell, which calls for quantitative stochastic models for gene and protein networks at cellular levels that match well with the data and account for cellular noise. This dissertation studies a stochastic spatiotemporal model of the Caulobacter crescentus cell cycle. A two-dimensional model based on a Turing mechanism is investigated to illustrate the bipolar localization of the protein PopZ. However, stochastic simulations are often impeded by expensive computational cost for large and complex biochemical networks. The hybrid stochastic simulation algorithm is a combination of differential equations for traditional deterministic models and Gillespie's algorithm (SSA) for stochastic models. The hybrid method can significantly improve the efficiency of stochastic simulations for biochemical networks with multiscale features, which contain both species populations and reaction rates with widely varying magnitude. The populations of some reactant species might be driven negative if they are involved in both deterministic and stochastic systems. This dissertation investigates the negativity problem of the hybrid method, proposes several remedies, and tests them with several models including a realistic biological system. As a key factor that affects the quality of biological models, parameter estimation in stochastic models is challenging because the amount of empirical data must be large enough to obtain statistically valid parameter estimates. To optimize system parameters, a quasi-Newton algorithm for stochastic optimization (QNSTOP) was studied and applied to a stochastic budding yeast cell cycle model by matching multivariate probability distributions between simulated results and empirical data. Furthermore, to reduce model complexity, this dissertation simplifies the fundamental cooperative binding mechanism by a stochastic Hill equation model with optimized system parameters. Considering that many parameter vectors generate similar system dynamics and results, this dissertation proposes a general α-β-γ rule to return an acceptable parameter region of the stochastic Hill equation based on QNSTOP. Different objective functions are explored targeting different features of the empirical data. / Doctor of Philosophy / Modeling and simulation of biochemical networks faces numerous challenges as biochemical networks are discovered with increased complexity and unknown mechanisms. With improvement in experimental techniques, biologists are able to quantify genes and proteins and their dynamics in a single cell, which calls for quantitative stochastic models, or numerical models based on probability distributions, for gene and protein networks at cellular levels that match well with the data and account for randomness. This dissertation studies a stochastic model in space and time of a bacterium’s life cycle— Caulobacter. A two-dimensional model based on a natural pattern mechanism is investigated to illustrate the changes in space and time of a key protein population. However, stochastic simulations are often complicated by the expensive computational cost for large and sophisticated biochemical networks. The hybrid stochastic simulation algorithm is a combination of traditional deterministic models, or analytical models with a single output for a given input, and stochastic models. The hybrid method can significantly improve the efficiency of stochastic simulations for biochemical networks that contain both species populations and reaction rates with widely varying magnitude. The populations of some species may become negative in the simulation under some circumstances. This dissertation investigates negative population estimates from the hybrid method, proposes several remedies, and tests them with several cases including a realistic biological system. As a key factor that affects the quality of biological models, parameter estimation in stochastic models is challenging because the amount of observed data must be large enough to obtain valid results. To optimize system parameters, the quasi-Newton algorithm for stochastic optimization (QNSTOP) was studied and applied to a stochastic (budding) yeast life cycle model by matching different distributions between simulated results and observed data. Furthermore, to reduce model complexity, this dissertation simplifies the fundamental molecular binding mechanism by the stochastic Hill equation model with optimized system parameters. Considering that many parameter vectors generate similar system dynamics and results, this dissertation proposes a general α-β-γ rule to return an acceptable parameter region of the stochastic Hill equation based on QNSTOP. Different optimization strategies are explored targeting different features of the observed data.

The life cycle of Caulobacter crescentus is of interest because of the asymmetric nature of cell division that gives rise to progeny that have distinct morphology and function. One daughter called the stalked cell is sessile and capable of DNA replication, while the second daughter called the swarmer cell is motile but quiescent. Advances in microscopy combined with molecular biology techniques have revealed that macromolecules are localized in a non-homogeneous fashion in the cell cytoplasm, and that dynamic localization of proteins is critical for cell cycle progression and asymmetry. However, the molecular-level mechanisms that govern protein localization, and enable the cell to exploit subcellular localization towards orchestrating an asymmetric life cycle remain obscure. There are also instances of researchers using intuitive reasoning to develop very different verbal explanations of the same biological process. To provide a complementary view of the molecular mechanism controlling the asymmetric division cycle of Caulobacter, we have developed a mathematical model of the cell cycle regulatory network. Our reaction-diffusion models provide additional insight into specific mechanism regulating different aspects of the cell cycle. We describe a molecular mechanism by which the bifunctional histidine kinase PleC exhibits bistable transitions between phosphatase and kinase forms. We demonstrate that the kinase form of PleC is crucial for both swarmer-to-stalked cell morphogenesis, and for replicative asymmetry in the predivisional cell. We propose that localization of the scaffolding protein PopZ can be explained by a Turing-type mechanism. Finally, we discuss a preliminary model of ParA- dependent chromosome segregation. Our model simulations are in agreement with experimentally observed protein distributions in wild-type and mutant cells. In addition to predicting novel mutants that can be tested in the laboratory, we use our models to reconcile competing hypotheses and provide a unified view of the regulatory mechanisms that direct the Caulobacter cell cycle. / Ph. D.

Com a construção da linhagem RlhE fusionada a um epitopo, fomos capazes de investigar o acúmulo da proteína após choque frio, em fase estacionária, durante o ciclo celular de Caulobacter crescentus, sob diferentes condições de estresses e, finalmente, após a adição de cloranfenicol, para o estudo a estabilidade protéica. Foi observado um aumento no acúmulo da proteína após choque frio. Além disso, quando em diferentes condições de estresses, RlhE obteve uma leve indução na presença de NaCl e Sacarose; mas permanaceu constante em fase estacionária e durante o ciclo celular. Finalmente, vimos que a estabilidade de RlhE varia de acordo com a temperatura, tendo um aumento da estabilidade a 10°C. As análises de expressão do gene rhlE foram realizadas por ensaios de atividade de betagalactosidase. Demonstramos que a presença da região 5UTR é importante para a indução, e que rlhE possui, pelo menos em parte, uma regulação pós-transcricional. Uma análise transcriptômica global da linhagem selvagem e mutante para rhlE, após o choque frio, foi realizada por RNAseq, o qual nos auxiliou na identificação de genes envolvidos em diversos processos biológicos. Finalmente, a co-imunoprecipitação e identificação dos RNAs por sequenciamento em larga escala revelou que RlhE interage com 51 mRNAs. / Here, we constructed a strain in which the RhIE protein was fusioned to an epitope that allowed the investigation of the protein profile after cold-shock, at stationary phase, during cell cycle of Caulobacter crescentus, under different environmental stresses, and, finally, after chloramphenicol addition to study protein stability. The results showed an increase in protein concentration after cold shock stress. When exposed to different stresses RhlE was slightly induced in the presence of NaCl and Sucrose; but its abundance remained constant at stationary phase and during C. crescentus cell cycle. Lastly, the protein stability varies depending on temperature - increasing at low temperature. Gene expression analysis was performed using beta-galactosidase assays. We showed that the presence of the 5UTR is important for the induction of rhlE, and that RhlE is posttranscriptionally regulated. A global transcriptome analysis was performed using RNAseq after cold shock stress of the wild type strain and null mutant for rhlE, and several genes involved in a wide range of biological process were identified. Finally, High-throughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation revealed interactions of RhlE with 51 mRNAs.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:36:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MULTIFUNCIONAcrescentus.pdf: 2433174 bytes, checksum: e25ac7003e428ac0baf41c43a48f0e42 (MD5) Previous issue date: 2014-12-04 / The genetic manipulation of microorganisms has provided great advances in the production of enzymes involved in the bioconversion of biomass to fuels and chemicals. The main component of hemicellulose that compose the plant biomass is xylan, and its degradation dependent on the synergistic action of several enzymes, including xylanases and β-xylosidases stand as the major. The analysis of the genome of Caulobacter crescentus showed that this bacterium has at least eight genes encoding enzymes involved in the degradation of xylan, three coding for endo-xylanases and five β-xylosidases. In the present report, the enzymatic characterization of a C. crescentus β-glucosidase/β-xylosidase V was performed. For this purpose the xynB5 gene (CCNA 03149) was cloned into pJET1.2 /blunt and subcloned into the expression vector pTricHisA for producing a recombinant protein fused to an amino-terminal His-tag. The recombinant enzyme was induced with IPTG in E. coli (TOP10 strain) and the protein was purified using pre-packaged nickel-sepharose column. The characterization of the pure enzyme showed an optimum pH of 6 for both enzyme activity and a temperature optimum of 50 ° C to β-glucosidase and 60 ° C to β-xylosidase in the presence of NPG and NPX substrates, respectively, while also there has been a small activity in the presence of NPA. The multifunctional protein had its predominant enzyme activity to β-glucosidase (7.6 U ml-1) and a secundary β-xylosidase activity (4.3 U ml-1). In addition to greater specificity for NPG (Km = 0.24  0.008 mM) compared to that obtained for NPX (Km = 0.64  0.032 mM) although the Vmáx for both substrates was not statistically significant difference in optimal conditions of each enzyme (NPG = 0.041  0.001 M min-1 and NPX = 0.055  0.002 M min-1). In fact, data to enzymatic characterization corroborated the suggested in genomic annotation to C. crescentus. These multifunctional characteristics of the protein are important for biotechnological applications like the future reuse of agroindustrial residues / A manipulação genética de microrganismos tem propiciado grandes avanços para a produção de enzimas que possam auxiliar na bioconversão da biomassa vegetal a combustíveis e químicos. O principal componente da hemicelulose que compõem a biomassa vegetal é o xilano, e sua degradação depende da ação sinérgica de várias enzimas, das quais Xilanases e β-Xilosidases destacam-se como as principais. A análise do genoma de Caulobacter crescentus revelou que esta bactéria apresenta pelo menos oito genes envolvidos com a degradação do xilano, três deles codificam para endo-Xilanases, e cinco codificam para β-Xilosidases. O presente trabalho objetivou a caracterização enzimática de uma destas enzimas, a β-Glicosidase/β-Xilosidase de C. crescentus. Para isto o gene xynB5 (CCNA 03149) foi clonado em pJET1.2/blunt e subclonado no vetor de expressão pTricHisA para a produção de uma proteína recombinante fusionada a uma cauda de histidinas amino-terminal. A enzima recombinante foi induzida com IPTG na cepa TOP10 de E. coli e a proteína foi purificada com o auxílio de colunas pré-empacotadas de níquel-sepharose. A caracterização da enzima pura mostrou um pH ótimo igual a 6 para ambas as atividades enzimáticas e uma temperatura ótima de 50 C para -Glicosidase e 60 C para -Xilosidase, na presença dos substratos NPG e NPX, respectivamente, embora também tenha ocorrido uma pequena atividade na presença de NPA. A proteína multifuncional teve sua atividade enzimática preponderante para -Glicosidase (7,6 U mL-1) em relação a atividade de -Xilosidase (4,3 U mL-1). Além de maior especificidade para NPG (Km = 0,24  0,008 mM) em relação à obtida para NPX (Km = 0,64  0,032 mM) embora a Vmáx para ambos substratos não tenham apresentado diferença significativa nas condições ótimas de cada enzima (NPG = 0,041  0,001 M min-1 e NPX = 0,055  0,002 M min-1). Os dados de caracterização confirmaram os sugeridos na anotação genômica para C. crescentus. Estas características multifuncionais da proteína são importantes para futuras aplicações biotecnológicas como o reaproveitamento dos resíduos agroindustriais.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana_ Graciano.pdf: 1359694 bytes, checksum: 9321745e3e0faea5a21d91af3579b01a (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / The optimization of xylanase production of a new Aspergillus fumigatus Fresen strain (OI-1RT) was obtained by statistical approaches. The Plackett-Burman Design evaluation showed that the following components of Czapeck medium were biologically significant: sodium nitrate, potassium phosphate, magnesium sulfate and corn straw. These factors were selected to implement the 24 Central Composite Rotational Delineation with the proposed model validation. The response surface plots have indicated a trend for increased xylanase activity with increasing concentrations of maize straw. An additional test was carried out with different concentrations of maize straw and the optimized xylanase activity was 530 U ml-1 in the presence of 6.5% (w / v) of residual biomass, which was 11 times higher than the one obtained only with the Plackett-Burman Planning (45.8 U mL-1). The thermostability of the enzyme was kept at 90% at 50 °C for 6 hours. Enzyma tic hydrolyses tests were performed to obtain reducing sugars from maize straw, hydrolyzed maize straw and beechwood xylan. This procedure has been performed for 96 hours with 2 U ml-1 for xylanase (crude extract) and resulted in net production of 3.89, 20.96 and 21.64 μmol mL-1 for reducing sugars, respectively. This indicated possible biotechnological applications to the crude extract with xylan-degrading enzymes (xylanase). / As xilanases são glicosídeo hidrolases (GHs) com diferentes propriedades físico-químicas e várias aplicações biotecnológicas, como na indústria têxtil, alimentícia e de papel e celulose. Xilanases podem ser utilizadas para a degradação de fontes de carbono renováveis, tais como os resíduos agroindustriais. Desta forma, é possível aproveitar a capacidade energética de compostos disponíveis em abundância e que poderiam ser descartados levando à poluição de solos e corpos hídricos. Atualmente, existe uma busca por estratégias que permitam a otimização de processos biotecnológicos para utilizar a capacidade energética presentes na biomassa para geração de produtos de valor agregado, como a produção de xilitol e do etanol celulósico. Ferramentas bioquímico-moleculares e planejamentos estatísticos de otimização de processos são exemplos de estratégias que visam melhorar o desempenho catalítico de enzimas. Neste contexto, este trabalho objetivou aproveitar resíduos agroindustriais para a indução de xilanases usando duas abordagens. Na primeira, foi realizada a clonagem e expressão do gene xynA1 (CCNA_02894) de Caulobacter crescentus em Escherichia coli com a obtenção de uma proteína recombinante fusionada a uma cauda de histidina carboxi-terminal (XynA1), que foi posteriormente purificada e caracterizada quanto a suas propriedades bioquímicas e cinéticas. Nesta análise, verificou-se que dentre as várias fontes de carbono testadas para indução da XynA1 em C. crescentus, os substratos palha de milho, palha de milho hidrolisada e o sabugo de milho foram os mais eficientes para induzir a atividade xilanásica. Além disso, a caracterização da XynA pura, obtida por cromatografia de afinidade em colunas préempacotadas de níquel-sepharose de elevado desempenho, mostrou que a XynA1 possui atividade enzimática e atividade específica de 18,26 U mL-1 e 2,22 e U mg-1usando xilano de beechwood como substrato na reação. A atividade de XynA1 foi inibida por EDTA e íons metálicos tais como Cu 2+ e Mg 2+. Em contraste, ß-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), e Ca2+ induziram a atividade da enzima recombinante. Os dados cinéticos para XynA1 revelaram valores de KM e Vmáx de 3,77 mg mL-1 e 10,2 μM min-1, respectivamente. Finalmente, a enzima apresentou um pH ótimo igual a 6 e temperatura ótima de 50 °C. Além disso, 80% da atividade de XynA1 foi mantida a 50 °C por 4 hor as de incubação. Isso sugere estabilidade térmica para aplicação em processos biotecnológicos. Na segunda etapa do trabalho, foi realizada a otimização da produção xilanásica por um novo isolado vii termotolerante de Aspergillus fumigatus Fresen. (OI-1R-T), obtido de bioma de Mata Atlântica, usando metodologias estatísticas de delineamento experimental como Planejamento Plackett-Burman (Plackett-Burman Design-PBD) e Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). Verificou-se, nesses ensaios, uma atividade xilanásica de 530 U mL-1 na presença de 6,5% de palha de milho no meio de cultivo otimizado. Ensaios de hidrólises enzimáticas da palha de milho, palha de milho hidrolisada e do xilano de beechwood foram realizados durante 96 horas com 2 U mL-1 de atividade xilanásica do extrato bruto otimizado no mesmo resíduo, resultando em uma produção líquida de 3,89, 20,96 e 21,64 μmol mL-1 de açúcares redutores, respectivamente. Assim, sugere-se que a enzima fúngica, mesmo em extrato bruto, também poderia ser aplicada em processos biotecnológicos diversos.

Made available in DSpace on 2017-07-10T13:59:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MULTIFUNCIONAcrescentus.pdf: 2433174 bytes, checksum: e25ac7003e428ac0baf41c43a48f0e42 (MD5) Previous issue date: 2014-12-04 / The genetic manipulation of microorganisms has provided great advances in the production of enzymes involved in the bioconversion of biomass to fuels and chemicals. The main component of hemicellulose that compose the plant biomass is xylan, and its degradation dependent on the synergistic action of several enzymes, including xylanases and β-xylosidases stand as the major. The analysis of the genome of Caulobacter crescentus showed that this bacterium has at least eight genes encoding enzymes involved in the degradation of xylan, three coding for endo-xylanases and five β-xylosidases. In the present report, the enzymatic characterization of a C. crescentus β-glucosidase/β-xylosidase V was performed. For this purpose the xynB5 gene (CCNA 03149) was cloned into pJET1.2 /blunt and subcloned into the expression vector pTricHisA for producing a recombinant protein fused to an amino-terminal His-tag. The recombinant enzyme was induced with IPTG in E. coli (TOP10 strain) and the protein was purified using pre-packaged nickel-sepharose column. The characterization of the pure enzyme showed an optimum pH of 6 for both enzyme activity and a temperature optimum of 50 ° C to β-glucosidase and 60 ° C to β-xylosidase in the presence of NPG and NPX substrates, respectively, while also there has been a small activity in the presence of NPA. The multifunctional protein had its predominant enzyme activity to β-glucosidase (7.6 U ml-1) and a secundary β-xylosidase activity (4.3 U ml-1). In addition to greater specificity for NPG (Km = 0.24  0.008 mM) compared to that obtained for NPX (Km = 0.64  0.032 mM) although the Vmáx for both substrates was not statistically significant difference in optimal conditions of each enzyme (NPG = 0.041  0.001 M min-1 and NPX = 0.055  0.002 M min-1). In fact, data to enzymatic characterization corroborated the suggested in genomic annotation to C. crescentus. These multifunctional characteristics of the protein are important for biotechnological applications like the future reuse of agroindustrial residues / A manipulação genética de microrganismos tem propiciado grandes avanços para a produção de enzimas que possam auxiliar na bioconversão da biomassa vegetal a combustíveis e químicos. O principal componente da hemicelulose que compõem a biomassa vegetal é o xilano, e sua degradação depende da ação sinérgica de várias enzimas, das quais Xilanases e β-Xilosidases destacam-se como as principais. A análise do genoma de Caulobacter crescentus revelou que esta bactéria apresenta pelo menos oito genes envolvidos com a degradação do xilano, três deles codificam para endo-Xilanases, e cinco codificam para β-Xilosidases. O presente trabalho objetivou a caracterização enzimática de uma destas enzimas, a β-Glicosidase/β-Xilosidase de C. crescentus. Para isto o gene xynB5 (CCNA 03149) foi clonado em pJET1.2/blunt e subclonado no vetor de expressão pTricHisA para a produção de uma proteína recombinante fusionada a uma cauda de histidinas amino-terminal. A enzima recombinante foi induzida com IPTG na cepa TOP10 de E. coli e a proteína foi purificada com o auxílio de colunas pré-empacotadas de níquel-sepharose. A caracterização da enzima pura mostrou um pH ótimo igual a 6 para ambas as atividades enzimáticas e uma temperatura ótima de 50 C para -Glicosidase e 60 C para -Xilosidase, na presença dos substratos NPG e NPX, respectivamente, embora também tenha ocorrido uma pequena atividade na presença de NPA. A proteína multifuncional teve sua atividade enzimática preponderante para -Glicosidase (7,6 U mL-1) em relação a atividade de -Xilosidase (4,3 U mL-1). Além de maior especificidade para NPG (Km = 0,24  0,008 mM) em relação à obtida para NPX (Km = 0,64  0,032 mM) embora a Vmáx para ambos substratos não tenham apresentado diferença significativa nas condições ótimas de cada enzima (NPG = 0,041  0,001 M min-1 e NPX = 0,055  0,002 M min-1). Os dados de caracterização confirmaram os sugeridos na anotação genômica para C. crescentus. Estas características multifuncionais da proteína são importantes para futuras aplicações biotecnológicas como o reaproveitamento dos resíduos agroindustriais.

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:24:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana_ Graciano.pdf: 1359694 bytes, checksum: 9321745e3e0faea5a21d91af3579b01a (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / The optimization of xylanase production of a new Aspergillus fumigatus Fresen strain (OI-1RT) was obtained by statistical approaches. The Plackett-Burman Design evaluation showed that the following components of Czapeck medium were biologically significant: sodium nitrate, potassium phosphate, magnesium sulfate and corn straw. These factors were selected to implement the 24 Central Composite Rotational Delineation with the proposed model validation. The response surface plots have indicated a trend for increased xylanase activity with increasing concentrations of maize straw. An additional test was carried out with different concentrations of maize straw and the optimized xylanase activity was 530 U ml-1 in the presence of 6.5% (w / v) of residual biomass, which was 11 times higher than the one obtained only with the Plackett-Burman Planning (45.8 U mL-1). The thermostability of the enzyme was kept at 90% at 50 °C for 6 hours. Enzyma tic hydrolyses tests were performed to obtain reducing sugars from maize straw, hydrolyzed maize straw and beechwood xylan. This procedure has been performed for 96 hours with 2 U ml-1 for xylanase (crude extract) and resulted in net production of 3.89, 20.96 and 21.64 μmol mL-1 for reducing sugars, respectively. This indicated possible biotechnological applications to the crude extract with xylan-degrading enzymes (xylanase). / As xilanases são glicosídeo hidrolases (GHs) com diferentes propriedades físico-químicas e várias aplicações biotecnológicas, como na indústria têxtil, alimentícia e de papel e celulose. Xilanases podem ser utilizadas para a degradação de fontes de carbono renováveis, tais como os resíduos agroindustriais. Desta forma, é possível aproveitar a capacidade energética de compostos disponíveis em abundância e que poderiam ser descartados levando à poluição de solos e corpos hídricos. Atualmente, existe uma busca por estratégias que permitam a otimização de processos biotecnológicos para utilizar a capacidade energética presentes na biomassa para geração de produtos de valor agregado, como a produção de xilitol e do etanol celulósico. Ferramentas bioquímico-moleculares e planejamentos estatísticos de otimização de processos são exemplos de estratégias que visam melhorar o desempenho catalítico de enzimas. Neste contexto, este trabalho objetivou aproveitar resíduos agroindustriais para a indução de xilanases usando duas abordagens. Na primeira, foi realizada a clonagem e expressão do gene xynA1 (CCNA_02894) de Caulobacter crescentus em Escherichia coli com a obtenção de uma proteína recombinante fusionada a uma cauda de histidina carboxi-terminal (XynA1), que foi posteriormente purificada e caracterizada quanto a suas propriedades bioquímicas e cinéticas. Nesta análise, verificou-se que dentre as várias fontes de carbono testadas para indução da XynA1 em C. crescentus, os substratos palha de milho, palha de milho hidrolisada e o sabugo de milho foram os mais eficientes para induzir a atividade xilanásica. Além disso, a caracterização da XynA pura, obtida por cromatografia de afinidade em colunas préempacotadas de níquel-sepharose de elevado desempenho, mostrou que a XynA1 possui atividade enzimática e atividade específica de 18,26 U mL-1 e 2,22 e U mg-1usando xilano de beechwood como substrato na reação. A atividade de XynA1 foi inibida por EDTA e íons metálicos tais como Cu 2+ e Mg 2+. Em contraste, ß-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), e Ca2+ induziram a atividade da enzima recombinante. Os dados cinéticos para XynA1 revelaram valores de KM e Vmáx de 3,77 mg mL-1 e 10,2 μM min-1, respectivamente. Finalmente, a enzima apresentou um pH ótimo igual a 6 e temperatura ótima de 50 °C. Além disso, 80% da atividade de XynA1 foi mantida a 50 °C por 4 hor as de incubação. Isso sugere estabilidade térmica para aplicação em processos biotecnológicos. Na segunda etapa do trabalho, foi realizada a otimização da produção xilanásica por um novo isolado vii termotolerante de Aspergillus fumigatus Fresen. (OI-1R-T), obtido de bioma de Mata Atlântica, usando metodologias estatísticas de delineamento experimental como Planejamento Plackett-Burman (Plackett-Burman Design-PBD) e Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). Verificou-se, nesses ensaios, uma atividade xilanásica de 530 U mL-1 na presença de 6,5% de palha de milho no meio de cultivo otimizado. Ensaios de hidrólises enzimáticas da palha de milho, palha de milho hidrolisada e do xilano de beechwood foram realizados durante 96 horas com 2 U mL-1 de atividade xilanásica do extrato bruto otimizado no mesmo resíduo, resultando em uma produção líquida de 3,89, 20,96 e 21,64 μmol mL-1 de açúcares redutores, respectivamente. Assim, sugere-se que a enzima fúngica, mesmo em extrato bruto, também poderia ser aplicada em processos biotecnológicos diversos.

La plupart des espèces bactériennes possèdent un chromosome circulaire qui est répliqué de façon bidirectionnelle au cours du cycle cellulaire. Bien que la réplication et la ségrégation du chromosome bactérien se développent simultanément, la ségrégation du chromosome s’accomplit après la fin de la réplication et avant la fermeture du septum. La circularité du chromosome bactérien et le grand nombre d’événements de recombinaison homologue donnent lieu à la création des dimères de chromosome dans une fraction de la population cellulaire. Chez Escherichia coli et Bacillus subtilis, la dimérisation des chromosomes se produit respectivement dans 15% et 25% des cas. Un chromosome dimérique doit être résolu avant la fermeture du septum. Chez les espèces bactériennes les plus étudiées, les chromosomes dimériques sont résolus par un système de recombinaison site spécifique hautement réservé incluant deux recombinases à tyrosine, XerC et XerD, et un site génomique dans la région terminus du génome bactérien, appelé le site dif (deletion induced filamentation). L’organisation spatio-temporelle du système de recombinaison site spécifique Xer/dif et l’activation de ce dernier sont réglementées par la protéine transmembranaire impliquée dans la division cellulaire, FtsK. D’autre part, des études récentes ont mis en évidence l’existence de plusieurs éléments mobiles appelés IMEXs (Integrative Mobile Elements Exploiting Xer), capables d’exploiter le système Xer/dif pour leur intégration dans le génome bactérien. Chez E. coli, des déficiences dans la résolution des dimères de chromosome se terminent par le guillotinage du chromosome dimérique au cours de la division cellulaire, ce qui entraîne l’induction de la réponse SOS chez les cellules filles et la mort de ces dernières. Dans cette thèse, le site dif a été identifié et caractérisé chez Caulobacter par une combinaison d’approches in vivo et in vitro. Fait intéressant, il a été démontré que chez Caulobacter, contrairement à E. coli, la perturbation du système Xer/dif ne mène pas au guillotinage du chromosome, et les cellules portant un système Xer/dif défectueux contourne cette déficience en adoptant un nouveau mode de cycle cellulaire. De plus, notre analyse comparative entre les terminus des souches sauvages de C. crescentus a également permis de révéler la présence d’un IMEX putatif de 71 kb dans le terminus de C. crescentus NA1000. / Most bacteria possess a single circular chromosome which is replicated bidirectionally during the cell cycle. Although replication and segregation of the chromosome in bacteria develops simultaneously, the segregation of the chromosome occurs after the completion of replication and before the closure of the septum. The circularity of the bacterial chromosome and the high number of homologous recombination events that occur during replication result in the creation of chromosome dimers in a fraction of the cell population. In Escherichia coli and Bacillus subtilis, chromosome dimer formation occurs, respectively, in 15% and 25% of the cell population during replication, which needs to be resolved before the closure of division septum. In most of the well-studied bacterial species, chromosome dimers are resolved by a highly conserved site-specific recombination system which employs two tyrosine recombinases, XerC and XerD, and a recombination genomic site located in the terminus region of the bacterial chromosome called dif (deletion induced filamentation). The temporo-spatial organization of the Xer/dif site-specific recombination system, along with its activation, is regulated by a cell division transmembrane protein, FtsK. In E. coli, deficiencies in the resolution of chromosome dimers result in the guillotining of the dimeric chromosome during the cell division leading to the continuous induction of SOS response in the daughter cells and the death of the latter ones. In my thesis, the dif site in Caulobacter is identified and characterized by a combination of in vitro and in vivo approaches. Interestingly, it was observed that, unlike E. coli, in Caulobacter perturbations in the chromosome dimer resolution system do not result in the guillotining of the chromosome dimers. Instead, Caulobacter cells bearing deficiencies in the resolution of dimeric chromosomes adopt a new mode of cell cycle to bypass this deficiency.

O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico σ32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem. / In Caulobacter crescentus, the groESL operon presents a dual type of control. Heat shock induction of the operon is dependent on the heat shock sigma factor σ-32. At physiological temperatures, groESL expression is cell cycle regulated and the control involves the repressor protein HrcA and the element CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin ~xpression). To study the activity of HrcA in vitro, we produced and purified from E. coli a histidine-tagged version of the protein, and specific binding to the CIRCE element was analyzed in electrophoretic mobility shift assays (EMSA). The amount of retarded DNA increased significantly in the presence of GroES/GroEL, suggesting that these proteins modulate HrcA activity. Further evidence of this modulation was obtained using lacZ transcription fusions with the groESL regulatory region in C. crescentus cells producing different amounts of GroES/GroEL. The mutants proteins HrcA Pro81Ala and HrcA Arg87Ala, that contain amino acid substitutions in the putative DNA-bindíng domain of the protein, were found to be deficient in binding to CIRCE in vitro and in vivo. Furthermore, HrcA Ser56Ala expressed together with the wild type protein within the same cell, produced a dominant-negative phenotype, indicating that C. crescentus HrcA binds to CIRCE in an oligomeric form, most likely as a dimer. Attempts to obtain null mutants for groESL or dnaKJ were unsuccessful indicating the importance of GroES/GroEL and DnaK/lDnaJ to the survival of C. crescentus cells. Conditional mutants were then constructed in our laboratory in which groESL and dnaKJ expression is under the control ofaxylose inducible promoter (PxyIX) , giving rise to strains SG300 and SG400, respectively. These strains were characterized in regard to their morphology under permissive and restrictive conditions, as well as their viability under different types of environmental stresses. SG300 cells depleted of GroES/GroEL are resistant to heat shock at 42°C and can acquire some thermotolerance, but they are sensitive to oxidative, saline and osmotic stresses. SG400 cells depleted of DnaKlJ are quite sensitive to heat shock, ethanol and freezing, and are unable of acquiring thermotolerance. Cells depleted of either GroES/EL or DnaKlJ also present morphological problems. SG300 cells depleted of GroES/EL form long and pinched filaments. SG400 cells depleted of DnaKlJ are only somewhat more elongated than wild-type predivisional cells and most cells do not present septum. These observations indicate a cell division arrest, which should occur at different stages in each strain.