L'utilisation de nanoparticules (NPs) comme vecteur de médicaments est actuellement en plein développement de vectoriser des principes actifs dans l'organisme pour en diminuer les effets secondaires. Cependant peu d'études portent sur l'activité biologique de ces NPs et plus particulièrement sur leur toxicité intrinsèque. Récemment, une formulation orale d'Héparine de Bas Poids Moléculaire à base de NPs composées d'un mélange de deux polymères, polycaprolactone et Eudragit® RS, a été développée au sein de l'EA3452. Nous avons entrepris d'étudier la cytotoxicité de ces NPs vides ainsi que celles chargées avec le médicament par deux méthodes d'encapsulation : la nanopréciptation et la double émulsion. La toxicité observée des NP vides a été étudiée. Elles sont toxiques pour la lignée de macrophages de rat NR8383 d'une manière dose- et temps-dépendante. La microscopie électronique a montré que les NPs pénétraient dans la cellule, de façon unitaire, par endocytose et gagnent les mitochondries déclenchant un phénomène de mitophagie alors qu'aucune image évoquant une apoptose n'a été observée. Ceci est confirmé par l'étude des voies métaboliques par « microchip arrays » et RT-PCR quantitative. Les voies métaboliques conduisant à l'autophagie sont activées (en particulier le gène atg1611) sans que l'apoptose soit mise en jeu. La désorganisation des structures mitochondriales est associée à une répression de l'expression du gène opa1. Ces résultats obtenus doivent être confirmé sur des macrophages humains. Cependant ils tendent à montrer que les NPs seules ont des effets biologiques qui doivent être pris en compte avant toute utilisation chez l'homme / Nanoparticles (NPS) are more and more used in medicine, in imaging and as vector for drugs. In this case, NPs are used to lessen the toxicity of the active product. However, a possible toxicity of these carriers is seldom taken into account. In the EA3452, low molecular weight heparin (LMWH)-based NPs have been devised a mix of two polymers, polycaprolactone (PCL) and Eudragit® RS (ERS). Preliminary works has shown that these NPs preparations, obtained by either nanopreciptation or double emulsion, are cytotoxic per se. on a rat macrophage cell line, NR8383 in a dose-dependent (15 - 40 µg/mL) and time-dependent (4 - 24 h) manner which was further investigated. Electron microscopy has shown that NPs enter the cell unitarily by endocytosis. They enter the mitochondria inducing a phenomenon of mitophagy but no pictures evocating apoptosis were observed. Then, we have investigated the metabolic pathways using microchip array and quantitative RT-PCR. The pathways conducting to autophagy are activated (e.g. gene atg1611) while there is no activation of the pathways conducing to apoptosis. The alteration of the morphology of the mitochondria was associated to an underexpression of opa1. Although these results were obtained with animal cell line, and should be confirmed with human macrophages, they show that NPs have biological effects that have to be evaluated before their use in human

Eventos isquêmicos seguidos por reperfusão levam ao dano celular e mitocondrial devido à abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). Todavia, o pré-condicionamento evita o dano celular por isquemia e reperfusão. Esse efeito protetor é semelhante ao obtido pela abertura do canal mitocondrial de potássio sensível a ATP (mitoKATP). Aqui, nós mostramos os mecanismos de sinalização que ativam o mitoKATP durante o pré-condicionamento, o papel redox destes canais e seu conseqüente mecanismo protetor. Usando células cardíacas HL-1, nós demonstramos que aumentos em espécies reativas de oxigênio (EROs) observadas durante o pré-condicionamento não foram revertidos por antagonistas do mitoKATP, que significativamente evitaram a proteção pelo pré-condicionamento. Isso sugere que essas espécies são formadas anteriormente à abertura do canal. Consistente com essa hipótese, a adição de catalase a corações perfundidos de rato e a células HL-1 promove reversão dos efeitos benéficos do pré-condicionamento, mas não do diazóxido (um agonista do mitoKATP). Por outro lado, 2-mercaptopropionil glicina preveniu a cardioproteção em ambos os casos, sugerindo que este composto deve apresentar outros efeitos além de antioxidante. De fato, verificamos que agentes redutores tiólicos interferem na ativação do mitoKATP mediada pelo diazóxido em mitocôndrias isoladas de coração de rato. Examinando como o mitoKATP pode ser ativado durante o pré-condicionamento, constatamos que EROs endógenas e exógenas fortemente ativaram o mitoKATP, sugerindo que o moderado aumento nas EROs durante o pré-condicionamento pode ativar esse canal. Uma vez ativado, o canal preveniu as condições (captação de Ca2+ e formação de EROs) que favorecem a ocorrência de TPM em situação de isquemia. A atividade deste canal também leva à diminuição de EROs gerados fisiologicamente ou durante períodos de isquemia e reperfusão, evitando o dano celular conseqüente. Este fato não envolveu nenhum aumento nos sistemas de remoção de oxidantes. Por outro lado, a inibição da TPM, usando ciclosporina A, preveniu o estresse oxidativo somente durante a reperfusão, mas protegeu as células de maneira indistinguível da abertura do mitoKATP. Juntos, nossos resultados sugerem que o mitoKATP age como um sensor para as EROs que diminui a sua geração em resposta a níveis aumentados de oxidantes. Em conseqüência, estes canais regulam o balanço redox em condições fisiológicas e previnem o estresse oxidativo em condições patológicas, inibindo com isso a ocorrência de TPM e morte celular isquêmica. / Ischemia followed by reperfusion results in impairment of cellular and mitochondrial functionality due to opening of mitochondrial permeability transition (MPT) pores. Nevertheless, preconditioning rescues cells from ischemic damage. Mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoKATP) opening also prevents cardiac ischemic cell death. Here we show the signaling mechanisms that activate mitoKATP during preconditioning, the redox role of these channels and consequent protective mechanisms. Using cardiac HL-1 cells, we found that increases in reactive oxygen species (ROS) observed during preconditioning were not inhibited by mitoKATP antagonists, although these drugs significantly avoided the protection afforded by preconditioning, suggesting their activation occurrs upstream of channel activity. Consistent with this, catalase addition to perfused rat hearts and HL-1 cells reversed the beneficial effects of preconditioning, but not of diazoxide (a mitoKATP agonist). On the other hand, 2-mercaptopropionylglycine prevented cardioprotection in both cases, suggesting this compound may present effects other than scavenging ROS. Indeed, thiol reducing agents impaired diazoxide-mediated activation of mitoKATP in isolated rat heart mitochondria. We found that endogenous or exogenous ROS strongly enhanced mitoKATP activity, suggesting that moderate increments in ROS release during preconditioning may activate mitoKATP. Furthermore, mitoKATP prevented conditions (Ca2+ uptake and ROS formation) that favor the opening of MPT pores under ischemic conditions. MitoKATP opening decreased ROS generation physiologically and during both ischemia and reperfusion, consequently avoiding cellular damage. This prevention does not involve an increase in oxidant removal systems. On the other hand, the inhibition of MPT, using cyclosporin A, prevented oxidative stress only during simulated reperfusion, but protected cells in a manner indistinguishable from mitoKATP opening. Collectively, our results suggest that mitoKATP acts as a ROS sensor that decreases mitochondrial ROS generation in response to enhanced local levels of oxidants. As a result, these channels regulate mitochondrial redox state under physiological conditions and prevent oxidative stress under pathological conditions, inhibiting MPT opening and ischemic cardiac damage.

Eventos isquêmicos seguidos por reperfusão levam ao dano celular e mitocondrial devido à abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). Todavia, o pré-condicionamento evita o dano celular por isquemia e reperfusão. Esse efeito protetor é semelhante ao obtido pela abertura do canal mitocondrial de potássio sensível a ATP (mitoKATP). Aqui, nós mostramos os mecanismos de sinalização que ativam o mitoKATP durante o pré-condicionamento, o papel redox destes canais e seu conseqüente mecanismo protetor. Usando células cardíacas HL-1, nós demonstramos que aumentos em espécies reativas de oxigênio (EROs) observadas durante o pré-condicionamento não foram revertidos por antagonistas do mitoKATP, que significativamente evitaram a proteção pelo pré-condicionamento. Isso sugere que essas espécies são formadas anteriormente à abertura do canal. Consistente com essa hipótese, a adição de catalase a corações perfundidos de rato e a células HL-1 promove reversão dos efeitos benéficos do pré-condicionamento, mas não do diazóxido (um agonista do mitoKATP). Por outro lado, 2-mercaptopropionil glicina preveniu a cardioproteção em ambos os casos, sugerindo que este composto deve apresentar outros efeitos além de antioxidante. De fato, verificamos que agentes redutores tiólicos interferem na ativação do mitoKATP mediada pelo diazóxido em mitocôndrias isoladas de coração de rato. Examinando como o mitoKATP pode ser ativado durante o pré-condicionamento, constatamos que EROs endógenas e exógenas fortemente ativaram o mitoKATP, sugerindo que o moderado aumento nas EROs durante o pré-condicionamento pode ativar esse canal. Uma vez ativado, o canal preveniu as condições (captação de Ca2+ e formação de EROs) que favorecem a ocorrência de TPM em situação de isquemia. A atividade deste canal também leva à diminuição de EROs gerados fisiologicamente ou durante períodos de isquemia e reperfusão, evitando o dano celular conseqüente. Este fato não envolveu nenhum aumento nos sistemas de remoção de oxidantes. Por outro lado, a inibição da TPM, usando ciclosporina A, preveniu o estresse oxidativo somente durante a reperfusão, mas protegeu as células de maneira indistinguível da abertura do mitoKATP. Juntos, nossos resultados sugerem que o mitoKATP age como um sensor para as EROs que diminui a sua geração em resposta a níveis aumentados de oxidantes. Em conseqüência, estes canais regulam o balanço redox em condições fisiológicas e previnem o estresse oxidativo em condições patológicas, inibindo com isso a ocorrência de TPM e morte celular isquêmica. / Ischemia followed by reperfusion results in impairment of cellular and mitochondrial functionality due to opening of mitochondrial permeability transition (MPT) pores. Nevertheless, preconditioning rescues cells from ischemic damage. Mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoKATP) opening also prevents cardiac ischemic cell death. Here we show the signaling mechanisms that activate mitoKATP during preconditioning, the redox role of these channels and consequent protective mechanisms. Using cardiac HL-1 cells, we found that increases in reactive oxygen species (ROS) observed during preconditioning were not inhibited by mitoKATP antagonists, although these drugs significantly avoided the protection afforded by preconditioning, suggesting their activation occurrs upstream of channel activity. Consistent with this, catalase addition to perfused rat hearts and HL-1 cells reversed the beneficial effects of preconditioning, but not of diazoxide (a mitoKATP agonist). On the other hand, 2-mercaptopropionylglycine prevented cardioprotection in both cases, suggesting this compound may present effects other than scavenging ROS. Indeed, thiol reducing agents impaired diazoxide-mediated activation of mitoKATP in isolated rat heart mitochondria. We found that endogenous or exogenous ROS strongly enhanced mitoKATP activity, suggesting that moderate increments in ROS release during preconditioning may activate mitoKATP. Furthermore, mitoKATP prevented conditions (Ca2+ uptake and ROS formation) that favor the opening of MPT pores under ischemic conditions. MitoKATP opening decreased ROS generation physiologically and during both ischemia and reperfusion, consequently avoiding cellular damage. This prevention does not involve an increase in oxidant removal systems. On the other hand, the inhibition of MPT, using cyclosporin A, prevented oxidative stress only during simulated reperfusion, but protected cells in a manner indistinguishable from mitoKATP opening. Collectively, our results suggest that mitoKATP acts as a ROS sensor that decreases mitochondrial ROS generation in response to enhanced local levels of oxidants. As a result, these channels regulate mitochondrial redox state under physiological conditions and prevent oxidative stress under pathological conditions, inhibiting MPT opening and ischemic cardiac damage.