Le polyéthylène glycol (PEG) a longtemps été considéré comme biologiquement inerte, mais il est maintenant clair que non seulement les anticorps antiPEG existent, mais qu'aussi ceux-ci peuvent être répandus dans la population. Actuellement, le mécanisme par lequel ces anticorps se lient et interagissent avec les protéines plasmatiques est encore à l'étude. Cependant, nous savons qu'ils sont responsables du phénomène de clairance accélérée (ABC) et de certains effets néfastes comme : l'hypersensibilité et l'anaphylaxie. D'ailleurs, une étude récente suggère que 7% de la population préexposée (72%) au PEG possèdent un taux d'anticorps élevés (immunoglobuline G ˃ 500 ng/mL), ce qui les rend plus sujets à faire des réactions allergiques.¹ ² Entre autres, six personnes sur 272 000 auraient été atteintes d'anaphylaxie, potentiellement causée par la présence du PEG, lors de l'injection du vaccin de Pfizer-BioNTech contre la COVID-19 en date de décembre 2020. Il est important au fur et à mesure que nous développons des modalités thérapeutiques utilisant des polymères, d'évaluer leurs effets in vivo. Plusieurs alternatives au PEG ont été proposées comme le polyvinylpyrrolidone, le poly(N-isopropylacrylamide), le poly(glycérol) et le poly(2-oxazoline). Malheureusement, à ce jour, aucun de ces polymères n'a encore réussi à être approuvé pour des applications biomédicales et pharmaceutiques. Les objectifs de cette étude étaient dans un premier temps de synthétiser un polymère qui pourrait potentiellement remplacer le PEG à la surface de vecteurs pharmaceutiques tels que les liposomes ou les nanoparticules. Un polymère alkylé à base de monoglycérol acrylate a été incorporé dans une formulation de liposomes. Dans un deuxième temps, l'ancrage de ce polymère à la surface du vecteur a été évalué. Nos résultats démontrent que son caractère amphiphile, créé par une ou des chaînes alkyles influence l'ancrage des polymères dans la bicouche lipidique et ainsi sa réponse in vivo. / For a long time, polyethylene glycol (PEG) has been considered as biologically inert, but it is now clear that not only antiPEG antibodies do exist , but also, they can be widespread in the general population. Currently, the mechanism by which these antibodies bind to the plasmatic proteins is still under investigation. However, they are responsible for the phenomenon of accelerated blood clearance and some adverse effects such as hypersensitivity and anaphylaxis. Moreover, recent studies suggest that 7% of the population pre-exposed (72%) to PEG have a high level of antibodies (immunoglobuline G ˃ 500 ng/mL), making them susceptible to allergic reactions.¹ ² Among other things, 6 out of 272 000 people did suffer from anaphylaxis during the injection of Pfizer-BioNTech's COVID-19 vaccine last December, potentially because of the presence of PEG in the formulation. It is therefore very important as we develop therapeutic modalities using polymers, to assess their effects in vivo. Several alternatives have been proposed to PEG such as polyvinylpyrrolidone, poly(N-isopropylacrylamide), poly(glycerol) and poly(2-oxazoline). Unfortunately, to date none of these polymers have yet succeeded reaching the FDA approved PEG standard. The objectives of this study were initially to synthesise a polymer which could potentially replace PEG on the surface of pharmaceutical vectors such as liposomes or nanoparticles. An amphiphilic polymer based on monoglycerol acrylate was incorporated into a liposome formulation. Secondly, the anchoring of this polymer to the surface of our vector was evaluated using several techniques. Our results demonstrate that the amphiphilic character, created by one or many alkyl chains is important, and it influences drastically the anchoring of the polymer into the bilayer but also the pharmacokinetic (PK) of the nanocarrier.

Le polyéthylène glycol (PEG) a longtemps été considéré comme biologiquement inerte, mais il est maintenant clair que non seulement les anticorps antiPEG existent, mais qu'aussi ceux-ci peuvent être répandus dans la population. Actuellement, le mécanisme par lequel ces anticorps se lient et interagissent avec les protéines plasmatiques est encore à l'étude. Cependant, nous savons qu'ils sont responsables du phénomène de clairance accélérée (ABC) et de certains effets néfastes comme : l'hypersensibilité et l'anaphylaxie. D'ailleurs, une étude récente suggère que 7% de la population préexposée (72%) au PEG possèdent un taux d'anticorps élevés (immunoglobuline G ˃ 500 ng/mL), ce qui les rend plus sujets à faire des réactions allergiques.¹ ² Entre autres, six personnes sur 272 000 auraient été atteintes d'anaphylaxie, potentiellement causée par la présence du PEG, lors de l'injection du vaccin de Pfizer-BioNTech contre la COVID-19 en date de décembre 2020. Il est important au fur et à mesure que nous développons des modalités thérapeutiques utilisant des polymères, d'évaluer leurs effets in vivo. Plusieurs alternatives au PEG ont été proposées comme le polyvinylpyrrolidone, le poly(N-isopropylacrylamide), le poly(glycérol) et le poly(2-oxazoline). Malheureusement, à ce jour, aucun de ces polymères n'a encore réussi à être approuvé pour des applications biomédicales et pharmaceutiques. Les objectifs de cette étude étaient dans un premier temps de synthétiser un polymère qui pourrait potentiellement remplacer le PEG à la surface de vecteurs pharmaceutiques tels que les liposomes ou les nanoparticules. Un polymère alkylé à base de monoglycérol acrylate a été incorporé dans une formulation de liposomes. Dans un deuxième temps, l'ancrage de ce polymère à la surface du vecteur a été évalué. Nos résultats démontrent que son caractère amphiphile, créé par une ou des chaînes alkyles influence l'ancrage des polymères dans la bicouche lipidique et ainsi sa réponse in vivo. / For a long time, polyethylene glycol (PEG) has been considered as biologically inert, but it is now clear that not only antiPEG antibodies do exist , but also, they can be widespread in the general population. Currently, the mechanism by which these antibodies bind to the plasmatic proteins is still under investigation. However, they are responsible for the phenomenon of accelerated blood clearance and some adverse effects such as hypersensitivity and anaphylaxis. Moreover, recent studies suggest that 7% of the population pre-exposed (72%) to PEG have a high level of antibodies (immunoglobuline G ˃ 500 ng/mL), making them susceptible to allergic reactions.¹ ² Among other things, 6 out of 272 000 people did suffer from anaphylaxis during the injection of Pfizer-BioNTech's COVID-19 vaccine last December, potentially because of the presence of PEG in the formulation. It is therefore very important as we develop therapeutic modalities using polymers, to assess their effects in vivo. Several alternatives have been proposed to PEG such as polyvinylpyrrolidone, poly(N-isopropylacrylamide), poly(glycerol) and poly(2-oxazoline). Unfortunately, to date none of these polymers have yet succeeded reaching the FDA approved PEG standard. The objectives of this study were initially to synthesise a polymer which could potentially replace PEG on the surface of pharmaceutical vectors such as liposomes or nanoparticles. An amphiphilic polymer based on monoglycerol acrylate was incorporated into a liposome formulation. Secondly, the anchoring of this polymer to the surface of our vector was evaluated using several techniques. Our results demonstrate that the amphiphilic character, created by one or many alkyl chains is important, and it influences drastically the anchoring of the polymer into the bilayer but also the pharmacokinetic (PK) of the nanocarrier.

Depuis les années 1980, le marché des molécules biologiques, ou molécules biothérapeutiques, n'a cessé de prendre de l'expansion avec la commercialisation des premières protéines recombinantes. Estimé à 381,9 milliards de dollars américains en 2023, il est projeté à plus de 727,3 milliards de dollars d'ici 2032, avec une augmentation annuelle de 7% entre 2024 et 2032. Les molécules biothérapeutiques sont dérivées de sources biologiques et comprennent les anticorps, les protéines recombinantes, les peptides, les acides nucléiques, les agents utilisés pour des vaccins et la thérapie génique. Elles apportent des alternatives aux molécules chimiques et regroupent les anticorps, les protéines, les peptides et les acides nucléiques. Ces molécules sont dites biologiques puisque constituées d'acides aminés, de nucléotides ou de leurs dérivés, leur procurant l'avantage d'avoir une forte spécificité et affinité pour leurs cibles qui peuvent être intra ou extracellulaires, et la possibilité d'activer ou d'inactiver ces cibles. Cependant pour rejoindre des cibles intracellulaires, les molécules biothérapeutiques doivent traverser la membrane cellulaire qui est imperméable aux grosses molécules telles que les protéines et les acides nucléiques. C'est pour cette raison que de nombreux transporteurs viraux et non-viraux sont développés pour permettre aux molécules biothérapeutiques de rejoindre des cibles intracellulaires. Parmi ces transporteurs, on retrouve des vecteurs viraux, des nanoparticules à base de lipides, des molécules inorganiques ou des peptides de pénétration cellulaire. Cette thèse porte sur le développement d'un peptide transporteur appelé S10 (ou « shuttle »), composé d'un dérivé d'un peptide de pénétration cellulaire, lié par une séquence glycine-glycine-sérine (séquence offrant de la flexibilité) à un domaine de fuite des endosomes. Des études précédentes ont montré que la co-incubation du peptide S10 avec des protéines permettait la livraison de ces dernières dans différents organes et types cellulaires. Cette thèse présente des études menées dans le but d'améliorer la livraison du peptide S10 afin d'acheminer des biomolécules dans des poumons de souris. La thèse est divisée en quatre chapitres. Le premier est une revue de littérature des systèmes de livraison de biomolécules les plus utilisés. Les trois chapitres suivants présentent les résultats obtenus au cours de ce doctorat. Le chapitre deux présente les études de la conjugaison chimique du peptide S10 avec des polyéthylènes glycols afin de modifier l'activité du peptide S10 et de le protéger de la dégradation protéolytique. Ces études montrent l'effet de la PEGylation sur le peptide S10 en mesurant l'activité de livraison sur des cellules HeLa en culture à la suite d'une co-incubation avec une protéine fluorescente verte possédant un signal de localisation nucléaire. Cette étude démontre que la conjugaison du peptide S10 à une molécule de polyéthylène glycol allant jusqu'à 20 kDa lui permet de conserver son aptitude à livrer la GFP. Le chapitre 3 présente la conjugaison chimique du peptide S10 à une molécule biologique active pour la livraison dans les poumons de souris par instillation. Deux molécules ont été liées à S10, la première servant de preuve de concept est un peptide de localisation nucléaire composé d'acides aminés d'isoforme D et la seconde molécule est un oligonucléotide antisens de charge neutre (plus précisément un phosphorodiamidate morpholino oligonucléotide) fonctionnel. Cet oligonucléotide a été conçu pour une utilisation de restauration du gène d'une protéine fluorescente verte possédant un intron aberrant mutant empêchant sa fonctionnalité. L'oligonucléotide antisens permet donc de corriger cette aberration au niveau de l'ARN et de restaurer la séquence de la protéine. Les études des différents composés ont été réalisées *in vitro* dans des cellules HeLa EGFP-654 puis *in vivo* par instillation dans des souris possédant aussi la mutation dans le but de livrer dans les poumons. Les études ont démontré qu'attacher S10 à l'oligonucléotide améliorait la livraison intracellulaire dans l'épithélium des voies respiratoires de souris. De plus la conjugaison de S10 à la molécule à livrer par un pont disulfure à travers un lien PEG est la stratégie qui permet la meilleure livraison. Le chapitre 4 est constitué des résultats complémentaires. La conclusion apporte une vision globale des résultats présentés dans cette thèse ainsi que les perspectives pour la suite de ce projet. / Since 1980's, the market for biological molecules, or biotherapeutics, has grown steadily, with the commercialization of the first recombinant proteins. Estimated at 263 billion US dollars in 2022, it's predicted to exceed 566 billion dollars by 2032. Biotherapeutic molecules are derived from biological sources and include antibodies, recombinant proteins, vaccine agents and gene therapies. Biotherapeutic molecules are alternatives to chemical molecules, and include antibodies, proteins, peptides, and nucleic acids. These molecules are termed biological because they are made up of amino acids, nucleotides, or their derivatives, giving them the advantage of high specificity and affinity for their targets, which may be intra- or extra-cellular, and the ability to activate or inactivate these targets. However, to reach intracellular targets, biotherapeutic molecules must cross the cell membrane, which is impermeable to large molecules such as proteins and nucleic acids. This is why numerous viral and non-viral carriers have been developed to enable biotherapeutics to reach intracellular targets. These include viral vectors, lipid-based nanoparticles, inorganic molecules, and cell-penetrating peptides. This thesis focuses on the development of a carrier peptide called S10 (or shuttle), composed of a derivative cell-penetrating peptide linked by a glycine-glycine-serine sequence (a sequence offering flexibility) to an endosome leakage domain. Previous studies have shown that co-incubation of the S10 peptide with proteins enables the delivery of proteins to different organs and cell types. This thesis presents studies carried out with the aim of improving S10-mediated delivery of biomolecules to mouse lungs. The thesis is divided into four chapters. The first chapter is a literature review of the most widely used biomolecule carriers. The following three chapters present the results obtained during this Ph.D. Chapter two presents studies of the chemical conjugation of S10 peptide with polyethylene glycol to modify S10 peptide activity and protect it from proteolytic degradation. These studies demonstrate the effect of PEGylation on the S10 peptide by measuring the delivery activity following co-incubation on cultured HeLa cells with a green fluorescent protein geared with a nuclear localization signal. This study demonstrates that conjugation of the S10 peptide to a molecule up to 20 kDa retains some functionality of the S10 peptide. Chapter three presents the chemical conjugation of the S10 peptide to a biologically active molecule for delivery into the lungs of mice by instillation. Two molecules have been linked to S10, the first serving as proof of concept is a nuclear localization peptide composed of D-isoform amino acids, and the second molecule is a functional, charge-neutral antisense oligonucleotide (more precisely, a phoshphorodiamidate morpholino oligomer). This oligonucleotide has been designed to be used to restore a green fluorescent protein sequence containing an aberrant intron that prevents its functionality. The antisense oligonucleotide can therefore correct this aberration at the RNA level restoring the protein sequence. Studies of the various compounds were carried out in vitro using HeLa EGFP-654 cells, then *in vivo* by instillation in mice also possessing the mutated green fluorescent protein, with the aim of assessing lung delivery efficiency. Studies have shown that attaching S10 to the oligonucleotide improves intracellular delivery in mouse airway epithelium. Moreover, conjugation of S10 to the molecule to be delivered by a disulfide bridge through a PEG linker is the strategy that enables the best delivery. Chapter four presents additional results. The conclusion provides an overview and perspectives of the results presented in this thesis.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Le polyéthylène glycol (PEG) est un polymère reconnu comme généralement sécuritaire (GRAS) et son utilisation est très répandue dans plusieurs domaines, dont celui de la pharmaceutique. Ce polymère peut être conjugué à des protéines ou des vecteurs pharmaceutiques transportant des médicaments afin de prolonger le temps de circulation dans l'organisme. Bien que le PEG ait été considéré comme non immunogène, des études récentes montrent qu'environ 20 à 70 % de la population possèdent des anticorps capables de reconnaitre le polymère. Par un effet neutralisant, ces anticorps anti-PEG pourraient réduire l'efficacité et le temps de circulation de certains médicaments PEGylées. Ces travaux s'intéressent à comprendre les mécanismes derrière la réponse immunitaire anti-PEG des vecteurs pharmaceutiques et plus particulièrement des nanoparticules de polymère composé de PLGA-PEG. Notre hypothèse est que ces nanoparticules de polymère causent la production d'anticorps anti-PEG initier à l'aide de la cascade du complément. Lors de ces travaux, des anticorps anti-PEG étaient mesurés après sept jours, peu importe la voie d'administration des nanoparticules. L'isotype des anticorps dirigés contre le PEG mesuré est majoritairement des IgM. Les anticorps anti-PEG en circulation réduisent le temps de circulation de différentes architectures PEGylées, dont les nanoparticules et les liposomes. La présence des anticorps IgM anti-PEG altère les protéines retrouvées à la surface des nanoparticules. Des souris splénectomisées ont été utilisées dans plusieurs expériences afin d'investiguer le rôle de la rate dans la production des anticorps anti-PEG après l'administration de nanoparticules. Chez les souris qui ne possédaient pas de rate, la production des anticorps anti-PEG était abrogée lorsque les nanoparticules étaient administrées par voie intraveineuse. Par voie d'injection sous-cutanée, une petite quantité d'anticorps anti-PEG était mesurée après sept jours dans le plasma des souris splénectomisées. Ensuite, deux modèles de souris avec une cascade du complément abrogé (CVF) ou absence (C3[exposant -/-]) ont été utilisés pour investiguer le rôle de la cascade du complément sur la production des anticorps anti-PEG. La cascade du complément semble impliquée dans la production des anticorps anti-PEG lorsque les nanoparticules sont administrées par voie intraveineuse. Lors d'une injection sous-cutanée des nanoparticules, la concentration IgM anti-PEG mesurée après 7 jours est similaire entre le groupe témoin et le groupe ne possédant pas de cascade du complément active. Finalement, des études en cytométrie en Flux avec des nanoparticules fluorescente administrée à des souris avec et sans complément nous ont permis d'identifier l'importance des protéines du complément sur l'interaction entre les cellules immunitaires et les nanoparticules. Les protéines du complément à la surface des nanoparticules semblent favoriser leur interaction avec les lymphocytes B splénique. Les protéines du complément ne semblent pas changer l'interaction des nanoparticules avec les cellules B des ganglions lymphatiques après une administration sous-cutanée. Ces résultats suggèrent que le différent mécanisme est impliqué lors de la production des anticorps anti-PEG, selon la route d'administration des nanoparticules. Des études supplémentaires sont requises pour comprendre les effets de ces anticorps anti-PEG en clinique. / Polyethylene glycol (PEG) is a polymer recognized as generally safe (GRAS) and its use is widespread in several fields. This polymer can be conjugated to proteins or pharmaceutical carriers carrying drugs to prolong circulation time in the body. Although PEG has been considered as non-immunogenic, recent studies show that approximately 20-70% of the population have antibodies that can recognize the polymer. Through a neutralizing effect, these anti-PEG antibodies could reduce the effectiveness and circulation time of certain PEGylated drugs. This work focuses on understanding the mechanisms behind the anti-PEG immune response of pharmaceutical vectors and more particularly of polymer nanoparticles composed of PLGA-PEG. Our hypothesis is that these polymer nanoparticles cause the production of anti-PEG antibodies to initiate with the help of the complement cascade. During this work, anti-PEG antibodies were measured after 7 days, regardless of the route of administration of the nanoparticles. The isotype of the antibodies directed against the PEG was IgM. Anti-PEG antibodies in circulation reduce the circulation time of different PEGylated architectures including nanoparticles and liposomes. The presence of anti-PEG IgM antibodies alters the proteins found on the surface of the nanoparticles. In addition, anti-PEG antibodies promote the activation of the complement cascade which helps eliminate subsequent doses of nanoparticles. Splenectomized mice have been used in several experiments to investigate the role of the spleen in the production of anti-PEG antibodies after the administration of nanoparticles. In mice without a spleen, the production of anti-PEG antibodies was abrogated when the nanoparticles were administered intravenously. By subcutaneous injection, a small quantity of anti-PEG antibodies were measured after seven days in the plasma of splenectomized mice. Two mouse models with an abrogated complement cascade (CVF) or absence (C3[superscript -/-]) were used to investigate the role of the complement cascade on the production of anti-PEG antibodies. The complement cascade seems to be involved in the production of anti-PEG antibodies when the nanoparticles are administered intravenously. During a subcutaneous injection of the nanoparticles, the anti-PEG IgM concentration measured after 7 days is similar between the control group and the group without an active complement cascade. Finally, Flow cytometry studies with fluorescent nanoparticles administered to mice with and without complement allowed us to identify the importance of complement proteins on the interaction between immune cells and nanoparticles. Complement proteins on the surface of the nanoparticles appear to promote their interaction with splenic B lymphocytes. The complement deposited on the nanoparticles does not appear to direct their interaction with the B cells of the lymph nodes after subcutaneous administration. These results suggest that different mechanisms are involved in the production of anti-PEG antibodies, depending on the route of administration of the nanoparticles. Further studies are required to understand the effects of these anti-PEG antibodies in the clinic.

La thérapie génique, appelée aussi génothérapie, est une stratégie thérapeutique utilisable en principe pour traiter de nombreuses maladies génétiques. Une variation récente de cette approche thérapeutique utilise le système bactérien CRISPR/Cas9 (The Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)) pour modifier les gènes défectueux des patients atteints d'une maladie héréditaire. Ce système a déjà démontré sa grande capacité à modifier l'ADN chromosomique in vitro ainsi que in vivo mais le problème majeur réside au niveau de la livraison des composantes du système CRISPR, soit la Cas9 et un ARN guide (ARNg). Malgré l'existence de plusieurs vecteurs de livraison viraux ou non viraux, les Adeno-associated virus (AAV) sont les virus les plus utilisés pour livrer des gènes thérapeutiques aux cellules in vitro et aux animaux et aux humains in vivo. Malheureusement, cet outil de livraison commence à démontrer ses limites à cause de sa capacité d'empaquetage très limitée (environ 4.8 kb) par rapport à d'autres outils de livraison et à cause de son immunogénicité. Ces limitations nous amènent à développer une nouvelle approche qui pourrait être plus puissante et beaucoup moins immunogène soit l'utilisation des vésicules extracellulaires produites par toutes les cellules de l'organisme et qui constituent un outil de communication cellulaire. Les travaux de ce mémoire démontrent qu'il est possible d'introduire la protéine Cas9 et plus spécifiquement la Cas9 du Streptococcus pyogène (SpCas9) dans les vésicules extracellulaires. L'utilisation de ces vésicules nous a permis de livrer la SpCas9 à des cellules in vitro et d'induire une édition génique. / Gene therapy, also called genotherapy, is a therapeutic strategy used to treat many genetic diseases. A recent variation of this technology uses the bacterial CRISPR/Cas9 system, The Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) to modify the defective genes of affected patients. This system has already demonstrated its great capacity to modify chromosomal DNA in vitro as well as in vivo, but the major problem lies in the delivery of the CRISPR components (i.e., the Cas9 gene or protein and its guide RNA (gRNA)). Despite the existence of several viral and non-viral delivery vectors, Adeno-associated viruses (AAV) are the most used vector to deliver therapeutic genes to cells in vitro and to animals and humans in vivo. Unfortunately, this delivery vector is starting to demonstrate its limitations due to its very limited packaging capacity (about 4.8 kb) compared to other delivery vectors and due also to its immunogenicity. These limitations lead us to develop a new approach that could be more powerful and much less immunogenic such as extracellular vesicles, which are produced by all cell types in the body, and which constitute an inter-cellular communication tool. Our work demonstrates that we are able to introduce the Cas9 protein, more specifically the Streptococcus pyogene Cas9 (SpCas9) into extracellular vesicles. These vesicles allowed us to deliver the SpCas9 to cells in vitro and to induce genetic editing.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

L'utilisation de nanoparticules (NPs) comme vecteur de médicaments est actuellement en plein développement de vectoriser des principes actifs dans l'organisme pour en diminuer les effets secondaires. Cependant peu d'études portent sur l'activité biologique de ces NPs et plus particulièrement sur leur toxicité intrinsèque. Récemment, une formulation orale d'Héparine de Bas Poids Moléculaire à base de NPs composées d'un mélange de deux polymères, polycaprolactone et Eudragit® RS, a été développée au sein de l'EA3452. Nous avons entrepris d'étudier la cytotoxicité de ces NPs vides ainsi que celles chargées avec le médicament par deux méthodes d'encapsulation : la nanopréciptation et la double émulsion. La toxicité observée des NP vides a été étudiée. Elles sont toxiques pour la lignée de macrophages de rat NR8383 d'une manière dose- et temps-dépendante. La microscopie électronique a montré que les NPs pénétraient dans la cellule, de façon unitaire, par endocytose et gagnent les mitochondries déclenchant un phénomène de mitophagie alors qu'aucune image évoquant une apoptose n'a été observée. Ceci est confirmé par l'étude des voies métaboliques par « microchip arrays » et RT-PCR quantitative. Les voies métaboliques conduisant à l'autophagie sont activées (en particulier le gène atg1611) sans que l'apoptose soit mise en jeu. La désorganisation des structures mitochondriales est associée à une répression de l'expression du gène opa1. Ces résultats obtenus doivent être confirmé sur des macrophages humains. Cependant ils tendent à montrer que les NPs seules ont des effets biologiques qui doivent être pris en compte avant toute utilisation chez l'homme / Nanoparticles (NPS) are more and more used in medicine, in imaging and as vector for drugs. In this case, NPs are used to lessen the toxicity of the active product. However, a possible toxicity of these carriers is seldom taken into account. In the EA3452, low molecular weight heparin (LMWH)-based NPs have been devised a mix of two polymers, polycaprolactone (PCL) and Eudragit® RS (ERS). Preliminary works has shown that these NPs preparations, obtained by either nanopreciptation or double emulsion, are cytotoxic per se. on a rat macrophage cell line, NR8383 in a dose-dependent (15 - 40 µg/mL) and time-dependent (4 - 24 h) manner which was further investigated. Electron microscopy has shown that NPs enter the cell unitarily by endocytosis. They enter the mitochondria inducing a phenomenon of mitophagy but no pictures evocating apoptosis were observed. Then, we have investigated the metabolic pathways using microchip array and quantitative RT-PCR. The pathways conducting to autophagy are activated (e.g. gene atg1611) while there is no activation of the pathways conducing to apoptosis. The alteration of the morphology of the mitochondria was associated to an underexpression of opa1. Although these results were obtained with animal cell line, and should be confirmed with human macrophages, they show that NPs have biological effects that have to be evaluated before their use in human

Titre de l'écran-titre (visionné le 6 novembre 2023) / Grâce à la disponibilité de programmes de dépistage et de prévention, la plupart des cas de cancer du col de l'utérus sont diagnostiqués à un stade local lorsque la tumeur est confinée au col de l'utérus. Cependant, la livraison localisée de médicaments n'est pas fréquente dans la pratique clinique pour le traitement du cancer du col de l'utérus. L'avantage majeur de ce type de livraison de médicaments est qu'elle peut être effectuée à l'aide de formes posologiques spécifiques à chaque patient. Par exemple, les systèmes de livraison d'hydrogel peuvent contenir divers médicaments et être personnalisés par impression 3D en fonction des besoins des patients. Ainsi, l'objectif principal de ce projet était de développer une formulation d'hydrogel imprimable en 3D qui puisse être utilisée comme système localisé pour la livraison de nanoparticules d'or (AuNPs) au col de l'utérus avant la curiethérapie. Les AuNPs ont été choisies pour leur potentiel thérapeutique en tant que radiosensibilisateurs en curiethérapie, une modalité de traitement couramment utilisée pour le traitement du cancer du col de l'utérus. Dans ce projet de recherche, la technologie d'impression 3D a été utilisée pour créer des systèmes de livraison d'hydrogel personnalisés, permettant de contrôler la forme, la taille et la dose thérapeutique. Une formulation d'hydrogel a été optimisée en fonction de ses composants (Pluronic F127 et alginate) et leurs rapports respectifs ont été étudiés pour obtenir une imprimabilité 3D, une mucoadhésivité et une dégradation optimales dans les fluides biologiques. La formulation obtenue a été caractérisée in vitro et in vivo. Les données obtenues lors de ces études ont démontré que ces hydrogels sont biocompatibles et peuvent libérer efficacement des AuNPs. Le système de libération d'AuNPs développé a été adapté aux tumeurs cervicales en utilisant un modèle de xénogreffe murine. Des implants radioactifs produits par fabrication additive, contenant des sources d'iode-125 et recouverts d'hydrogels libérant des AuNPs, ont été implantés chez des souris sur les tumeurs. Cette étude a révélé des informations précieuses sur la profondeur de diffusion des AuNPs dans les tumeurs et la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les tissus irradiés. En résumé, ce projet de recherche décrit le premier exemple d'un système de livraison d'hydrogel imprimé en 3D pour la curiethérapie du cancer du col de l'utérus et fournit une base pour le développement de telles formulations pour les besoins cliniques. L'adaptation du système de livraison à l'anatomie spécifique d'un patient est un outil puissant pour augmenter l'efficacité du traitement et la conformité des patients. En outre, l'étude a démontré les effets synergiques entre la curiethérapie et les AuNPs radiosensibilisants dans le traitement du cancer du col de l'utérus. / Thanks to the availability of screening and prevention programs, most cervical cancer cases are diagnosed at an early stage when the tumor is confined to the cervix. However, the localized delivery of therapeutics is not frequent in clinical practice for the treatment of cervical cancer. The major benefit of this type of drug delivery is that it can be performed using patient-specific dosage forms. For instance, hydrogel delivery systems can contain various therapeutics and be personalized by 3D printing according to patients' needs. Therefore, the main objective of this project was to develop a 3D printable hydrogel formulation that can be used as a localized system for delivering gold nanoparticles (AuNPs) to the cervix prior to brachytherapy. AuNPs were chosen for their therapeutic potential as radiosensitizers in brachytherapy (BT), a treatment modality that is commonly used for cervical cancer therapy. In this research project, 3D printing technology was utilized to create customized hydrogel delivery systems, enabling control over the shape, size, and therapeutic dose. A hydrogel formulation was optimized based on its components (Pluronic F127 and alginate), and their respective ratios were studied to achieve optimal 3D printability, mucoadhesiveness, and degradation in biological fluids. The obtained formulation was characterized in vitro and in vivo. The data acquired during these studies demonstrated that these hydrogels are biocompatible and can efficiently release AuNPs. The developed AuNP-releasing system was fitted to cervical tumors using a murine xenograft model. Radioactive implants produced by additive manufacturing, containing iodine-125 sources, and lined with AuNPs-releasing hydrogels, were implanted in mice on top of the tumors. This study revealed valuable information on the diffusion depth of AuNPs in tumors and the production of reactive oxygen species (ROS) in irradiated tissues. Overall, this research project describes the first example of a 3D-printed hydrogel delivery system for cervical cancer BT and provides a basis for developing such formulations for clinical needs. Adapting the delivery system to a patient's specific anatomy is a powerful tool for increasing treatment efficiency and patient compliance. Moreover, the study demonstrated the synergistic effects between BT and radiosensitizing AuNPs in cervical cancer treatment.