L’implication des cellules B dans le développement de l’auto-immunité ne cesse d’être illustrée par de récentes publications. Les cellules présentent des peptides du soi aux cellules T auto-réactives ce qui mène à la production de cytokines pro-inflammatoires et d’anticorps auto-réactifs. Dans le présent document, nous explorons la présentation antigénique et la modification post-traductionnelle du complexe majeur d’histocompatibilité II (CMH-II). MARCH1 est une E3 ubiquitine ligase qui cible le CMH-II et le relocalise le complexe vers les endosomes de recyclage. Ainsi, MARCH1 est un inhibiteur de la présentation d’antigènes exogènes. Ici, nous démontrons que MARCH1 est exprimé seulement dans la sous-population des cellules B folliculaires et que cette expression est perdue lors de l’entrée dans les centres germinatifs. Nous proposons que MARCH1 établie une barrière de formation de centres germinatifs. Nous démontrons le lien entre MARCH1 et la hausse de CMH-II à la surface des cellules B à la suite d’un traitement à l’IL-10. De plus, nous avons testé plusieurs stimuli activateurs des cellules B et démontrons que MARCH1 est régulé à la baisse dans tous les cas. De plus, nous mettons en valeurs le rôle de la voie canonique d’activation de NF-κB dans cette régulation de MARCH1. Finalement, nous avons développé un système de lentivirus exprimant MARCH1 qui nous permet de forcer l’expression de MARCH1 dans des cellules réfractaires à la transfection. Nous discutons de l’implication de cette régulation du CMH-II par MARCH1 dans le développement de maladies auto-immunes. / Increasing evidence suggests a major role for B cells in the onset of auto-immune diseases. B cells present self-antigens to auto-reactive T cells which leads to the production of pro-inflammatory cytokines and auto-immune antibodies. Here we look at the process of antigen presentation and at post-transcriptional modifications of the MHC-II molecule. MARCH1 is an E3 ubiquitin ligase which targets MHC-II and re-localises the complex into recycling endosomes. Thus, MARCH1 is a direct inhibitor of exogenous antigen presentation. Here we show that only follicular B cells express MARCH1 and that upon germinal center entry, these cells lose all traces of MARCH1. We propose that MARCH1 may establish a threshold for germinal center creation. Moreover we demonstrate that the well-established increase in surface MHC-II induced by IL-10 on murine B cells is a result of a decrease in MARCH1 expression. We tested different B cell activation stimuli and showed that upon activation, MARCH1 mRNA is decreased in a time-dependent manner. In addition, we demonstrate the implication of the canonical NF-κB pathway in this regulation. Finally, we developed a lentiviral vector system expressing MARCH1 which enables us to force the expression of our target protein in non-transfectable cell types. We discuss the implication of MARCH1 in the presentation of self-antigens to auto-reactive T cells and the generation of auto-immunity.

La protéine de fusion E2A-PBX1 induit une leucémie lymphoblastique aigüe des cellules B pédiatrique chez l’humain. E2A-PBX1 possède de puissantes propriétés de trans-activation et peut se lier à l’ADN ainsi qu’aux protéines homéotiques (HOX) via des domaines conservés dans sa portion PBX1, ce qui suggère qu’une dérégulation des gènes cibles de HOX/PBX1 contribue à la leucémogénèse. Précédemment, Bijl et al. (2008) ont démontré que certains gènes Hox collaborent de manière oncogénique avec E2A-PBX1, et que ces interactions sont cellules-spécifiques et varient en fonction du gène Hox impliqué. Une mutagénèse d’insertion provirale suggère et supporte la collaboration des gènes Hoxa et E2A-PBX1 lors de la leucémogénèse des cellules B. La présence de ces interactions dans les cellules B et leur implication dans l’induction des B-ALL est pertinente pour la compréhension de la maladie humaine, et reste encore mal comprise. Notre étude démontre qu’Hoxa9 confère un avantage prolifératif aux cellules B E2A-PBX1. Des expériences de transplantation à l’aide de cellules B E2A-PBX1/Hoxa9 positives isolées de chimères de moelle osseuse démontrent qu’Hoxa9 collabore avec E2A-PBX1 en contribuant à la transformation oncogénique des cellules, et qu’Hoxa9 seul n’induit aucune transformation. Une analyse par Q-RT-PCR nous a permis de démontrer une forte inhibition de gènes spécifiques aux cellules B dans les leucémies co-exprimant Hoxa9 et E2A-PBX1, en plus d’une activation de Flt3, suggérant une inhibition de la différenciation des cellules B accompagnée d’une augmentation de la prolifération. De plus, la surexpression de Hoxa9 dans des cellules leucémiques de souris transgéniques E2A-PBX1, confère aussi un avantage prolifératif aux cellules in vitro, qui semblent être influencé par une augmentation de l’expression de Flt3 et Pdgfδ. En conclusion, nous démontrons pour la première fois à l’aide d’un modèle murin qu’Hoxa9 collabore avec E2A-PBX1 lors de la transformation oncogénique des cellules B et que la signalisation via Flt3 est impliquée, ce qui est potentiellement pertinent pour la maladie humaine. / The fusion protein E2A-PBX1 induces pediatric B cell leukemia in human. It has strong transactivating properties and can bind to DNA and homeobox (HOX) proteins through conserved domains in the PBX1 portion, suggesting that deregulation of HOX/PBX target genes contribute to leukemogenesis. Previously, we reported oncogenic interactions between Hox genes and E2A-PBX1, which are dependent on cell type as well as on the particular Hox member. A proviral insertional mutagenesis screen provided support for collaboration between Hoxa genes and E2A-PBX1 in B cell leukemogenesis. Whether these interactions occur in B cells and lead to B-ALL, relevant for human disease is still not clear. Here we report that Hoxa9 confers a proliferative advantage to E2A-PBX1 B cells. Transplantation experiments with E2APBX1/Hoxa9 positive B cells isolated from bone marrow (BM) chimeras showed that Hoxa9 interacts with E2A-PBX1 contributing to the oncogenic transformation of B cells, but is unable to transform B cells alone. Q-RT-PCR analysis demonstrated a strong repression of B cell specific genes in leukemias co-overexpressing Hoxa9 and E2A-PBX1 in addition to Flt3 activation, indicating inhibition of B cell differentiation in combination with enhanced proliferation. Overexpression of Hoxa9 in E2A-PBX1 mouse leukemic B cells also resulted in a growth advantage in vitro, likely mediated by the enhanced expression of Flt3 and Pdgfδ. In conclusion we show for the first time that Hoxa9 collaborates with E2A-PBX1 in the oncogenic transformation of B cells in a mouse model that involves Flt3 signaling, which is potentially relevant to human disease.

RÉSUMÉ L’implication des cellules B dans le développement de l’auto-immunité ne cesse d’être illustrée par de récentes publications. Les cellules présentent des peptides du soi aux cellules T auto-réactives ce qui mène à la production de cytokines pro-inflammatoires et d’anticorps auto-réactifs. Dans le présent document, nous explorons la présentation antigénique et la modification post-traductionnelle du complexe majeur d’histocompatibilité II (CMH-II). MARCH1 est une E3 ubiquitine ligase qui cible le CMH-II et le relocalise le complexe vers les endosomes de recyclage. Ainsi, MARCH1 est un inhibiteur de la présentation d’antigènes exogènes. Ici, nous démontrons que MARCH1 est exprimé seulement dans la sous-population des cellules B folliculaires et que cette expression est perdue lors de l’entrée dans les centres germinatifs. Nous proposons que MARCH1 établie une barrière de formation de centres germinatifs. Nous démontrons le lien entre MARCH1 et la hausse de CMH-II à la surface des cellules B à la suite d’un traitement à l’IL-10. De plus, nous avons testé plusieurs stimuli activateurs des cellules B et démontrons que MARCH1 est régulé à la baisse dans tous les cas. De plus, nous mettons en valeurs le rôle de la voie canonique d’activation de NF-κB dans cette régulation de MARCH1. Finalement, nous avons développé un système de lentivirus exprimant MARCH1 qui nous permet de forcer l’expression de MARCH1 dans des cellules réfractaires à la transfection. Nous discutons de l’implication de cette régulation du CMH-II par MARCH1 dans le développement de maladies auto-immunes. / ABSTRACT Increasing evidence suggests a major role for B cells in the onset of auto-immune diseases. B cells present self-antigens to auto-reactive T cells which leads to the production of pro-inflammatory cytokines and auto-immune antibodies. Here we look at the process of antigen presentation and at post-transcriptional modifications of the MHC-II molecule. MARCH1 is an E3 ubiquitin ligase which targets MHC-II and re-localises the complex into recycling endosomes. Thus, MARCH1 is a direct inhibitor of exogenous antigen presentation. Here we show that only follicular B cells express MARCH1 and that upon germinal center entry, these cells lose all traces of MARCH1. We propose that MARCH1 may establish a threshold for germinal center creation. Moreover we demonstrate that the well-established increase in surface MHC-II induced by IL-10 on murine B cells is a result of a decrease in MARCH1 expression. We tested different B cell activation stimuli and showed that upon activation, MARCH1 mRNA is decreased in a time-dependent manner. In addition, we demonstrate the implication of the canonical NF-κB pathway in this regulation. Finally, we developed a lentiviral vector system expressing MARCH1 which enables us to force the expression of our target protein in non-transfectable cell types. We discuss the implication of MARCH1 in the presentation of self-antigens to auto-reactive T cells and the generation of auto-immunity.

Th.--Méd.--Nancy 1, 1984. N°: 161.

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Le virus d'Epstein-Barr (EBV), est un gamma herpes virus exclusivement humain qui infecte près de 95% de la population adulte. EBV établit un cycle de latence dans les cellules B mémoires et les cellules épithéliales. EBV entre périodiquement dans une réplication lytique avec sécrétion des virions dans la salive. L’infection EBV est associée à l’apparition de lymphomes, de cancers et de maladies auto-immunes. Les conditions favorisant le développement de ces pathologies restent mal connues mais l’immunodépression et potentiellement l’activation des lymphocytes B nécessaire à la réplication d’EBV jouent un rôle clé.Nous avons examiné l’association entre activation des cellules B dans le compartiment systémique et le contrôle sur le réservoir de l’EBV. Deux situations cliniques d’activation chronique des cellules B ont été explorées ; le syndrome de Gougerot-Sjögren et la mastite subclinique dans le contexte de l’infection par le VIH.Dans ce travail de thèse, nous avons tout d’abord développé une PCR en temps réel pour la quantification de l'ADN de EBV ciblant la région répétée BamHI-W du génome. Le travail de validation de la technique a permis d’évaluer précisément le gain de sensibilité comparativement à une qPCR LMP2 (cible unique). L’impact des variations de répétition de la séquence BamHI-W suivant les souches et isolats EBV a également été analyse.Dans un deuxième travail, nous avons montré que, la mastite subclinique était fréquente au cours de l’allaitement et qu’elle était un facteur indépendant associé à une augmentation de l'excrétion EBV par le lait maternel. Cette sécrétion est associée localement à l’inflammation et à l’excrétion du VIH ce qui témoigne de phénomène de synergie entre les deux virus. Nous avons également démontré que l'ADN EBV dans le lait maternel peut être résistant à la DNase et que le virus était est probablement encapsidé dans le lait, donc potentiellement infectieux.Enfin, bénéficiant d’un accès aux prélèvements de la cohorte ASSESS nous avons recherché de possible anomalie du contrôle de l’infection EBV dans le compartiment sanguin au cours du syndrome de Gougerot-Sjögren primaire dans lequel les lésions glandulaires salivaires et lacrymales sont associées à la présence d’EBV. Nous avons démontré que le réservoir EBV et la réplication EBV dans le compartiment systémique sont bien contrôlées au cours du syndrome de Gougerot-Sjögren primaire. La réponse anticorps contre l’antigène précoce d’EBV (EA) n'était pas associée à une augmentation de l'ADN de EBV.Ce travail de thèse, souligne le lien entre l'activation des lymphocytes B, l'inflammation chronique et le contrôle sur le réservoir d’EBV. Dans la glande mammaire le contrôle de l’infection EBV est perturbé en cas de mastite subclinique. Au contraire dans le syndrome de Gougerot-Sjögren l’infection reste bien contrôlée dans le compartiment sanguin malgré l’activation des lymphocytes B et la présence renforcée du virus dans les lésions glandulaires. / TEpstein-Barr virus (EBV), an ubiquitous human gammaherpesvirus affects 95% of adult human population and establishes a lifelong latency in memory B cells periodically entering into lytic replication with further propagation in oropharyngeal epithelia and shedding through saliva. Latent EBV infection is associated with lymphomas, carcinomas and autoimmune diseases. Although the conditions favoring the development of these pathologies are not completely understood, the immunosuppression and B cell activations play an important role in EBV-associated diseases.We examined the control over the EBV reservoir in a diseases associated with B cell activation. Two clinical situations associated with altered B cell activation were explored: primary Sjogren’s syndrome and subclinical mastitis in HIV-infected mothers.Primarily, we developed an in-house real-time PCR for EBV DNA quantification targeting the repetitive BamHI-W region of EBV DNA. The validation analyses enabled to evaluate the gain in sensitivity of the BamHI-W test relative to single repeat LMP2 qPCR. The impact of the variations in BamHI-W reiteration on EBV DNA quantification was further assessed on different EBV strains and clinical samples.In a second study, we showed that subclinical mastitis was common during breastfeeding, and it was an independent factor associated with increased EBV breast milk shedding. This secretion was associated with local inflammation and HIV shedding, reflecting synergy between the two viruses. We have also demonstrated that breast milk EBV DNA may be resistant to DNase, and the virus was probably encapsidated in the breast milk and thus potentially infectious.Finally, with an access to ASSESS cohort we looked for possible abnormal control over EBV infection in the blood compartment in primary Sjögren's syndrome, where salivary and lacrimal gland lesions were shown to be associated with the local activation of EBV. We have demonstrated that in primary Sjogren's syndrome EBV reservoir and replication in the systemic compartment are well controlled. The antibody response against EBV early antigen (EA) was not associated with increased DNA EBV.This thesis points out the link between the activation of B cells, chronic inflammation and control over the reservoir of EBV. In the mammary gland disturbed control of EBV infection is linked with subclinical mastitis. In contrast, in primary Sjogren’s syndrome EBV infection remains well controlled in the blood compartment despite the activation of B cells and the increased presence of the virus in glandular lesions.

Les cellules présentatrices d'antigène (CPAs) font le lien entre le système immunitaire inné et adaptatif en présentant des antigènes (Ags) étrangers aux cellules T CD4+. Pour être efficace, cette présentation nécessite que les Ags soient apprêtés et chargés de manière adéquate dans le sillon des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMHII). C'est uniquement dans ce contexte que les cellules T CD4+, via leur récepteur (TCR), peuvent reconnaître l'Ag et engager pleinement la réponse immunitaire adaptative. Ce processus doit être finement contrôlé pour diminuer les risques de réaction auto- immune. L'expression de CMHII est régulée à la fois au niveau transcriptionnel par le trans- activateur du CMHII (CIITA) et au niveau post-traductionnel via l’ubiquitination d'un seul résidu de lysine, situé dans la queue cytoplasmique de sa chaîne b. Dans les cellules dendritiques (DCs) et les cellules B, cette ubiquitination est dépendante de la E3 ubiquitine ligase MARCH1. La baisse d’expression de MARCH1 contribue à l'acquisition de propriétés immuno-stimulatrices qui accompagnent la maturation des DCs humaines. De plus, il a été démontré que l'absence d'ubiquitination du CMHII entraîne son accumulation excessive au niveau de la membrane plasmique, ce qui perturbe les radeaux lipidiques et les réseaux de tétraspanines chez les DCs de souris. Ces structures membranaires sont connues pour interagir avec des molécules de signalisation régulant de nombreux processus biologiques dans les cellules B, comme le récepteur des cellules B (BCR) et CD19. De surcroît, dans les cellules B naïves, les molécules de CMHII sont fortement exprimées à la surface cellulaire, même si elles sont constitutivement ubiquitinées par MARCH1. Il est également intéressant de noter que les lymphocytes B présentent l'expression la plus élevée de MARCH1 parmi toutes les cellules immunitaires et que cette expression augmente au cours de leur développement. L'impact qu’a l’ubiquitination des molécules de CMHII à la surface membranaire des lymphocytes B sur leur développement, leur activation et leurs fonctions n'a pas encore été pleinement étudié. Ici, nous montrons d'abord que l'absence d'ubiquitination du CMHII modifie fortement le pool de cellules B de la zone marginale (MZBs). Nous soutenons que cette altération peut résulter en partie de la protéotoxicité du CMHII sur les réseaux de tétraspanines contenant CD81, ce qui influe sur la dynamique de CD19 à la surface cellulaire et affecte sa capacité à activer la cascade PI3K / Akt induite par les signaux BCR dits « toniques ». L’altération du pool de cellules MZBs a également des répercussions sur la réponse immunitaire aux Ags T-indépendants de type 2 (TI-2 Ags) et sur la formation de centre germinatifs (GCs) dans la rate. Ensemble, ces effets atténuent la réponse humorale et peuvent conférer un effet protecteur contre les infections. Par exemple, nous montrons ici que les infections parasitaires à Leishmania donovani, dont l’établissement nécessite la présence de cellules B pleinement fonctionnelles, sont beaucoup mieux contrôlées en l’absence de MARCH1. Ces résultats démontrent qu’un contrôle fin de l'expression de surface du CMHII est nécessaire pour l'établissement d'un pool de cellules B variées et pleinement fonctionnelles pouvant répondre à une large gamme d'Ags. En second lieu, nous avons décrit une approche expérimentale que nous avons adaptée pour produire des outils moléculaires permettant d’identifier des partenaires d’interaction potentiels de MARCH1 dans des lignées cellulaires et des cellules B primaires. Cette approche repose sur la production de protéine de fusion qui pourront être utilisées dans des tests de liaison de proximité (BioID2). Ce projet a permis de mettre en lumière les effets importants de l'ubiquitination du CMHII sur le développement, l'activation et les fonctions des lymphocytes B. Il a également permis d’établir des bases solides pour de futures études sur de nouvelles cibles de MARCH1 qui permettront de mieux comprendre les effets biologiques de cette E3 ubiquitine ligase et leurs impacts sur la santé et les maladies. / Antigen-presenting cells (APCs) link the innate and adaptive immune system by presenting foreign antigens to CD4+ T cells. To be efficient, this presentation requires antigens to be adequately processed and loaded in the peptide groove of the major histocompatibility complex class II (MHCII) molecules. It's solely in this context that CD4+ T cells, via their T cell receptor (TCR), can recognize the antigen and fully engage the adaptative immune response. This process needs to be tightly regulated to avoid autoimmunity. MHCII expression is regulated both transcriptionally by the MHCII transactivator (CIITA) and post- translationally by ubiquitination of a single lysine residue located in the cytoplasmic tail of its b-chain. This is carried out by the MARCH1 E3 ubiquitin ligases in dendritic cells (DCs) and B cells. The down-regulation of MARCH1 contributes to the acquisition of potent immunostimulatory properties that coincides with the maturation of human DCs. Accordingly, the lack of MHCII ubiquitination has been shown to result in its excessive accumulation at the plasma membrane and in the disruption of lipid rafts and tetraspanin webs in mice DCs. These membrane structures are known to interact with signaling molecules that regulate numerous biological processes in B cells, such as the B cell receptor (BCR) and CD19. Moreover, in naïve B cells, MHCII molecules are highly expressed at the cell surface even if they are constitutively ubiquitinated by MARCH1. Interestingly, B lymphocytes exhibit the highest expression of MARCH1 among all immune cells and this expression is increasing during B cells development. The impact of the ubiquitin-dependent MHCII turnover on B lymphocytes development, activation, and functions have yet to be fully addressed. Here, we first show that the absence of MHCII ubiquitination strongly alter the marginal zone (MZ) B cell pool. We provide evidence that this alteration may in part be due to the previously described MHCII proteotoxicity on the CD81-containing tetraspanin web, which impacted CD19 surface dynamic and its capacity to activate the PI3K/Akt cascade during “Tonic” BCR signaling. The altered MZ B cell pool also affected the immune response to a type 2 T-independent antigen (TI-2 Ag) and the germinal center (GC) reaction in the spleen, which dampens humoral response and may confer a protective effect against infections. As per example, we show here that parasitic infections with Leishmania donovani, the establishment of which requires the presence of fully functional B cells, are better controlled in the absence of MARCH1. These results demonstrate the need for a tight control over MHCII surface expression for the establishment of a varied and fully functional B cell pool, which are mandatory for proper responses to a broad range of antigens. Secondly, we described an experimental approach that we adapted to produce molecular tools that will allow the identification of potential interacting partners of MARCH1 in cell lines and primary B cells. This approach is based on the production of fusion proteins that can be used in proximity binding assays (BioID2). This project shed light on the important effects of MHCII ubiquitination on the development, activation, and function of B lymphocytes. It also laid the groundwork for valuable future studies on novel MARCH1 targets which will provide a better understanding of the biological effects of this E3 ubiquitin ligase and their impact on health and disease.

c-MYC est un proto-oncogène surexprimé dans les lymphomes de Burkitt et une cible importante pour le traitement de ces maladies. La protéine à domaine BTB/POZ MIZ-1 est un partenaire direct de la protéine c-MYC. En effet, c-MYC via son structure hélice-boucle-hélice se lie précisément à la séquence entre le 12e et 13e doigt de zinc de MIZ-1. Notre groupe a démontré que l’expression de la protéine MIZ-1 tronquée de son domaine POZ (MIZ-1ΔPOZ) peut ralentir la lymphomagenèse. Pourtant, l’interaction directe entre c-MYC et MIZ-1 n’est pas affectée par la délétion du domaine POZ de MIZ-1. Ceci suggère que MIZ-1 est important pour l’activité oncogénique de c-MYC. Il a été observé que l’expression de MIZ-1ΔPOZ diminue le nombre de cellules B pré-tumorales dans les modèles murins de lymphomes Eμ-Myc et Igλ-Myc. De plus, les niveaux protéiques très élevés de c-MYC dans les cellules B Eμ-Myc sont diminués lorsque MIZ-1ΔPOZ est exprimé. Toutefois, l’activité du protéasome ne semble pas être responsable de la diminution de c-MYC. Une analyse des interactions protéiques de MIZ-1 par BioID effectuée par notre groupe a montré que MIZ-1 et MIZ-1ΔPOZ interagissent avec PP1ɣ, TOX4 et PNUTS, trois protéines du complexe PTW/PP1 qui est un complexe transcriptionnel dont c-MYC fait partie. Des résultats de co-IP confirment cette interaction ce qui suggère que MIZ-1 pourrait influencer l’activité de ce complexe. De plus, une lignée cellulaire dans laquelle MIZ-1ΔPOZ est exprimé a été établie ce qui permettra d’approfondir l’étude des interactions protéiques de MIZ-1 avec le complexe PTW/PP1 et d’étudier l’effet de MIZ-1ΔPOZ sur l’activité transcriptionelle de ce complexe. Une meilleure compréhension du mécanisme d’action de MIZ-1 sur c-MYC permettra de mieux comprendre son rôle dans un contexte pathologique, ce qui pourrait permettre le design de nouvelles approches thérapeutiques. / c-MYC is a proto-oncogene overexpressed in Burkitt's lymphoma and an important target for the treatment of these diseases. The BTB/POZ domain protein MIZ-1 is direct a partner of c- MYC. Indeed, c-MYC via its helix-loop-helix structure binds precisely to the sequence between the 12th and 13th zinc finger of MIZ-1. We demonstrated that expression of MIZ-1 that lacks its POZ domain (MIZ-1ΔPOZ) can impair lymphomagenesis. However, the direct interaction between c-MYC and MIZ-1 is not affected by the deletion of the MIZ-1 POZ domain. This suggests that MIZ-1 is important for the oncogenic activity of c-MYC. We observed that expression of MIZ-1ΔPOZ decreases the number of pre-tumor B cells in lymphomas mouse models such as Eμ-Myc and Igλ-Myc. The high c-MYC protein levels observed in Eμ-Myc B cells are decreased when MIZ-1ΔPOZ is expressed. However, proteasome activity does not seem to be responsible for the decrease of c-MYC. After the analysis of MIZ-1 protein interactions by BioID, our group found that MIZ-1 and MIZ-1ΔPOZ interact with PP1ɣ, TOX4 and PNUTS, three proteins of the PTW/PP1 complex which also interact with c-MYC. Co-IP results confirmed these interactions suggesting that MIZ-1 could influence the activity of this complex. In addition, a MIZ- 1ΔPOZ cell line was established which will allow further studies of MIZ-1ΔPOZ protein interactions with the PTW/PP1 complex as well as its effect on the transcriptional activity of this complex. A better characterization of the mechanism of action of MIZ-1 on c-MYC will lead to a better understanding of its role in a pathological context, which could be the basis of new therapeutic approaches.

La dérégulation du compartiment B est une conséquence importante de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), qui peut mener à des manifestations autoimmunes et ultimement à des lymphomes B. Parmi les premières anomalies détectées, on dénote l’activation polyclonale, reflétée par la présence d’hyperglobulinémie (hyper-Ig) et des titres élevés d’autoanticorps chez les patients. On observe également une altération des dynamiques des populations, notamment une expansion de la population des cellules matures activées. De plus, les patients évoluent vers l’incapacité de générer une réponse humorale efficace, et sont sujets à une perte de la mémoire immunologique en phase chronique, caractérisée par une diminution de la population des cellules mémoires et par l’épuisement cellulaire. Toutefois, on connaît très peu les mécanismes impliqués dans de telles altérations. Les cellules dendritiques (DC) sont parmi les premières populations cellulaires à rencontrer et à propager le VIH lors d’une infection, et s’en trouvent affectées directement et indirectement, par le virus et ses composantes. On retrouve en effet une diminution des fréquences de DC dans le sang, les muqueuses et les organes lymphoïdes de patients infectés par le VIH, ainsi qu’un blocage au niveau de la maturation cellulaire. Toutefois, un débat perdure quant à l’apparition de ces altérations durant la phase aigüe de l’infection, et à la restauration des fréquences et des fonctions des DC chez les patients sous traitement. Cette controverse est due à la rareté des études longitudinales incluant des suivis qui s’échelonnent de la phase aigüe à la phase chronique de l’infection. Les DC jouent un rôle important dans le développement, la survie et l’activation des lymphocytes B, de façon T-dépendante et T-indépendante, notamment via des facteurs de croissance tel que BLyS (B lymphocyte stimulator). Par conséquent, nous formulons l’hypothèse que dans le cadre d’une infection VIH, les altérations observées au niveau des cellules B sont modulées par les DC. L’objectif majeur de cette étude est donc d’évaluer l’implication potentielle des DC dans les altérations des cellules B au cours de l’infection par le VIH. Pour ce faire, nous avons d’abord caractérisé de façon longitudinale le statut des populations de DC du sang périphérique de patients infectés au VIH et présentant différents types de progression de la maladie. Cela nous a permis d’évaluer la présence d’une corrélation entre les dynamiques de DC et le type de progression. Par la suite, nous avons évalué la capacité des DC à exprimer BLyS, puis mesuré sa concentration ainsi que celles d’autres facteurs de croissance des cellules B dans le plasma des patients. Enfin, nous avons caractérisé le statut des lymphocytes B, en fonction du stade de l’infection et du taux de progression clinique des patients. Cette étude démontre une diminution de la fréquence des populations de DC myéloïdes (mDC) dans le sang de patients infectés par le VIH sujets à une progression clinique. Cette diminution est observée dès le stade aigu de l’infection et au-delà du traitement antirétroviral (ART). Des concentrations élevées de MCP-1 (monocyte chemotactic protein), MIP (macrophage inflammatory protein) -3α et MIP-3β suggèrent la possibilité d’un drainage vers des sites périphériques. Nous observons également des niveaux supérieurs à la normale de précurseurs CD11c+CD14+CD16- en phase chronique, possiblement liés à une tendence de régénération des DC. Les patients en phase chronique présentent de hautes concentrations plasmatiques de BLyS, reflétée par un haut taux d’expression de cette cytokine par les mDC et leurs précurseurs. Parallèlement, nous observons une expansion des cellules B matures activées ainsi que des taux élevés d’IgG et IgA dans le sang de ces patients. De plus, nous constatons l’expansion d’une population de cellules B qui présente à la fois des caractéristiques de cellules B immatures transitionnelles (TI, transitional immature), et de cellules B recirculantes activées de la zone marginale (MZ, marginal zone), considérées ici comme des «précurseurs/activées de la MZ». Cette étude démontre aussi, chez les progresseurs lents, une meilleure préservation du compartiment des DC du sang périphérique, accompagnée d’une augmentation de précurseurs des DC de phénotype CD11c+CD14+CD16+, ainsi que des concentrations plasmatiques et niveaux d’expression normaux de BLyS. Conséquemment, nous n’avons pas observé d’augmentation des cellules B matures activées et des cellules B précurseurs/activées de la MZ. Toutefois, la fréquence des cellules B matures de la MZ est diminuée, reflétant possiblement leur recrutement vers des sites périphériques et leur contribution à un mécanisme actif de contrôle de la progression de la maladie. L’ensemble de ce travail suggère que dans le cadre d’une infection au VIH, les altérations observées au niveau des DC modulent les anomalies des cellules B. Par conséquent, le maintien de l’équilibre des fonctions DC, notamment les fonctions noninflammatoires, pourrait avoir un impact important dans la prévention de la progression de maladies associées aux altérations du compartiment des cellules B. / Dysregulations of the B cell compartment are an important consequence of human immunodeficiency (HIV) infection, which can lead to auto-immune manifestations and ultimately to B cell lymphomas. One of the first alterations is polyclonal activation, reflected by hyperglobulinemia (hyper-Ig) and elevated autoantibody titers. We can also observe alterations in population dynamics, namely an expansion of the pool of activated B cells. Furthermore, HIV infected patients evolve towards the incapacity to generate effective humoral responses, and experience a loss of immunological memory in the chronic phase, characterized by a decrease in the memory B cell pool and cell exhaustion. The mechanisms involved in this phenomenon are poorly understood and thus remain to be elucidated. Mucosal dendritic cells (DC) are among the first cell populations to encounter HIV during an infection and are directly and indirectly affected by the virus and viral components. Indeed, HIV infected individuals present decreased DC frequencies in their blood, mucosaeand lymphoid organs, as well as a block in DC maturation process. However, whether these defects appear as soon as the acute phase and persist beyond ART, remains controversial. This is mainly due to the scarcity of longitudinal studies including patients’ visits from the earliest phases of infection and following ART. DC play an important role in T-dependent and T-independent B cell development, survival and activation, namely through the production of growth factors such as B Lymphocyte Stimulator (BLyS). Therefore, we hypothesize that B cell abnormalities in HIVinfected individuals may be modulated by altered DC populations. The main objective of this study is to evaluate DC involvement in the establishment of B cell alterations related to HIV infection. We have thus first characterized the DC status by longitudinally assessing the dynamics of peripheral blood DC populations of HIV infected individuals with different rates of disease progression. This allowed us to evaluate the potential correlation between DC population dynamics and rate of disease progression. We have then evaluated BLyS expression by mDC and their precursors, and measured plasma concentrations of BlyS and other cytokines with B cell growth factor properties. Finally, we have characterized the dynamics of blood B cell populations, with regard to the phase of HIV infection and the rate of clinical progression. We demonstrate a decrease in the frequencies of blood myeloid DC (mDC) in HIV progressors. This drop was observed as early as in the acute phase and following the initiation of ART. Elevated blood concentrations of monocyte chemotactic protein (MCP) -1, macrophage inflammatory protein (MIP) -3α and MIP-3β suggest that the observed decrease is due to recruitment to peripheral sites. However, this hypothesis will be tested in a subsequent projet. We have also observed an increase of monocytic CD11c+CD14+CD16- DC precursors in chronic phases, possibly reflecting the high DC turnover. Furthermore, chronically infected HIV progressors present elevated blood BLyS concentrations, and high BLyS expression by DC and DC precursors. In parallel, these patients present increased frequencies of blood mature activated B cells as well as hyper IgG and IgA. Interestingly, we also observe expansion of a B cell population with features of precursors/activated marginal zone (MZ) B cells. On the other hand, slow progressors show a better preservation of their mDC compartment, accompanied by an increase in DC precursors with a CD11c+CD14+CD16+ phenotype. These patients present normal BLyS plasma concentrations and membrane expression on DC and precursors. In parallel, they have normal frequencies of blood mature activated B cells and precursors/activated MZ B cells. However, we found decreased frequencies of mature MZ B cells, suggesting recruitment to peripheral sites and involvement in active control of disease progression. Our results suggest that, in an HIV infection, alterations observed in the DC compartment contribute to B cell abnormalities. Therefore, it is crucial to maintain the equilibrium of DC fonctions, namely non-inflammatory functions, in order to prevent progression of disease attributable to dysregulation of the B cell compartment.

L'interleukine-15 (IL-15) contribue au développement et à l’activation des lymphocytes T CD8, des cellules immunes qui ont été impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes telle la sclérose en plaques. Des niveaux élevés de l'IL-15 ont été trouvés chez les patients atteints de cette maladie comparativement aux témoins, mais aucune étude n'a examiné les effets de tels niveaux élevés sur les lymphocytes T CD8. Les objectifs de notre étude étaient 1- de caractériser l’expression de l'IL-15 par des lymphocytes B humains et de déterminer ses effets sur les fonctions des lymphocytes T CD8, et 2- d’évaluer l'expression in vivo de l'IL-15 dans des modèles murins de la sclérose en plaques. Nous avons établi que les cellules B humaines augmentaient leur expression de l'IL-15 suite à une stimulation via le CD40. De plus, les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8 ont été significativement augmentées lors des co-cultures avec des cellules B alloréactives exprimant l'IL-15. Dans les modèles murins de la sclérose en plaques, nous avons détecté au sein du système nerveux central des cellules immunes exprimant l’IL-15 ainsi que des cellules T CD8 exprimant le récepteur pour cette cytokine à différents stades de la maladie. Nous avons démontré que les cellules B modulent des réponses des lymphocytes T CD8 via l’IL-15, ce qui suggère un rôle pour les cellules B dans la pathogenèse de la sclérose en plaques. Nous avons aussi mis en évidence la présence de cellules exprimant l’IL-15 dans le système nerveux central dans des modèles murins de cette maladie. / Interleukin-15 is a cytokine involved in the homeostatic proliferation and maintenance of CD8 T cells. Activated CD8 T cells are implicated in several autoimmune diseases, including Multiple Sclerosis (MS). Elevated levels of IL-15 have been reported in serum and on peripheral leukocytes of MS patients relative to controls, yet no study has addressed the effects of elevated IL-15 levels on CD8 T cells. To study the in vivo effects of any molecule, the animal model for MS, EAE, is used; the expression of IL-15 during the EAE disease course has not yet been elucidated. Thus the goals of our study were to characterize surface IL-15 expression on human B lymphocytes and determine the effects on human CD8 T cell functions; and to assess the in vivo expression of IL-15 in MS mouse models. We found that B cells are capable of up-regulating the expression of surface IL-15 upon CD40 stimulation, and CD8 T cell effector functions were significantly enhanced upon co-culture with alloreactive IL-15-expressing B cells. In the MS mouse models we used, we found IL-15-expressing immune cells present within the central nervous system (CNS) at various points of disease, and that CNS-infiltrating CD8 T cells were potentially responsive to IL-15. Here, we not only demonstrate the modulation of CD8 T cell responses by IL-15 presented by B cells, implying a role for B cells in MS pathogenesis, but also show the presence of IL-15-expressing cells within the inflamed CNS of EAE.