La stérilité affecte à l’heure actuelle près de 15-20 % des couples et sa prévalence est en progression depuis quatre à cinq décennies. Cette progression évolue parallèlement à la prévalence de l’épidémie d’obésité et de syndrome métabolique dans le monde. De multiples arguments physiologiques et épidémiologiques chez l’Homme soutiennent l’hypothèse de l’influence de l’homéostasie des lipides sur la fonction gonadique. En particulier, le cholestérol est un facteur clef dans la régulation de la stéroïdogenèse et de la gamétogenèse. Bien que les atteintes gonadiques semblent multifactorielles, les mécanismes moléculaires restent méconnus dans la majorité des cas. Les Liver X receptors (LXRα et β) sont des récepteurs nucléaires activés par les oxystérols. Ce sont classiquement des régulateurs du métabolisme lipidique. Plusieurs études ont démontré l’importance de ces récepteurs dans la physiologie des gonades. Ce travail identifie les rôles multiples des LXRs dans le maintien de la fertilité masculine et féminine, et décrit l’effet de l’homéostasie du cholestérol sur la maturation des cellules germinales dans le testicule et l’ovaire. Ce travail se concentre sur l’analyse comparative d’une lignée de souris ré-exprimant LXRβ (Lxrαϐ-/-:AMHLxrϐ) sous contrôle de promoteur d’AMH humain (expression spécifique dans les cellules de Sertoli dans le testicule et les cellules de granulosa dans l’ovaire) sur un fond génétique de souris Lxrαϐ-/-. L’absence d’un isoforme d LXR aboutit à des défauts spécifiques dans un type cellulaire du testicule. Néanmoins, le dysfonctionnement d’un type cellulaire est compensé. En effet, de multiples défauts sont nécessaires pour aboutir à la stérilité. LXR dans les cellules de granulosa est critique pour la maturation et la survie des ovocytes, l’ovulation, et par conséquence pour la fertilité. Ainsi, LXRβ est une cible potentielle pour réguler la fertilité féminine et la prévention de syndrome d’hyperstimulation ovarienne. Nos résultats ouvrent des perspectives pour des nouvelles cibles diagnostiques et pronostiques dans la fertilité. / Sterility affects 15 % of French population and its prevalence is propagating since four or five decades. Many human physiological and epidemiological arguments support the impact of lipid homeostasis on the gonads; indeed, cholesterol is a key regulator of steroidogenesis and gametogenesis. Nevertheless, the molecular mechanisms remain hidden. Liver X receptors alpha and beta (LXRα and β) belong to the superfamily of nuclear receptors and are activated upon binding to oxysterols. LXRs are mainly implicated in cholesterol homeostasis. Increasing bulk of literature identified these non-steroid nuclear receptors as major regulators of the gonad physiology. This work uncovers previously unidentified putative roles of LXRs and ability of cholecterol excess to alter male and female germ cell maturation. Herein, we analyse a new mouse strain (Lxrαϐ-/-:AMHLxrϐ) re-expressing LXRβ under control of AMH promoter (specific to Sertoli in testis and granulosa cells in ovary) in a background of Lxrαϐ-/- mouse. Our results identify LXRs as primordial to maintain male and female fertility. They have pleotropic « non-classical » roles ranging from lipid homeostasis to the regulation of germ cell maturation and bi-directional control of steroid synthesis. If the cellular defects in the absence of LXRs within the testis are significant, they are generally compensated and consequently, single cell compartment is tolerated. Unlike the testis, LXRβ in the granulosa cells is « the regulator » of multiple mechanisms essential for follicle maturation, ovocyte survival and for controlled ovulation. LXRβ is therefore a potnetial target to regulate female fertility and to prevent ovarian hyperstimulation syndrome. Our results open the perspectives for the identification of new diagnostic and/or prognostic markers in both male and female fertility.

L'objectif de ce travail est d'approfondir l'exploration du génome et de l'épigénome somatique et germinal chez des hommes présentant une atteinte sévère de la spermatogenèse. <br />Concernant le génome somatique, nous avons recherché la présence de mosaïques somatiques pour le chromosome Y microdélété chez 44 hommes infertiles, et aucune mosaïque n'a été détectée. Nous avons également analysé des réarrangements complexes du chromosome Y chez 3 patients infertiles. Cette étude nous a permis d'affiner leur caryotype et de mieux définir l'implication de l'anomalie du Y dans le phénotype d'infertilité. La ségrégation méiotique des chromosomes X, Y, 18, 13 et 21 a été étudiée par FISH multi-couleurs sur les spermatozoïdes de 31 patients infertiles. Nous avons montré des taux de disomies spermatiques augmentés chez la moitié de ces patients et identifié 4 facteurs de risques cliniques ou biologiques associés à l'augmentation des anomalies chromosomiques spermatiques. Enfin, concernant l'exploration de l'épigénome germinal, nous avons caractérisé le profil d'acétylation des histones par immunohistochimie sur les biopsies testiculaires de 33 patients atteints d'un syndrome des cellules de Sertoli isolées et/ou d'une tumeur testiculaire. Nous avons mis en évidence une hyperacétylation globale massive du noyau des cellules de Sertoli lorsque les tubes séminifères sont dépourvus de cellules méiotiques et post-méiotiques. Cette étude a révélé que l'acétylation des histones pourrait être impliquée dans le dialogue entre cellules germinales et cellules de Sertoli, et que sa dérégulation pourrait être associée à la genèse des cancers testiculaires. Ce travail ouvre des perspectives intéressantes pour la prise en charge des infertilités masculines sévères.

La metformine est utilisée chez les patients et patientes atteints du diabète de type II. Elle est également administrée lors d’une infertilité liée à une insulino-résistance ou à un désordre métabolique. Mon projet de recherche a été d’analyser les effets de cet antidiabétique sur la fonction gonadique administré au stade foetal ou à la puberté. Nous avons montré par une approche in vivo sur deux modèles animaux: 1) qu'une administration orale de metformine à des poulets pré-pubères entraine un retard de puberté. Il se caractérise par une réduction du poids testiculaire, du diamètre des tubes séminifères et par une baisse de la testostérone sérique. 2) qu’une exposition des foetus mâles à de la metformine, chez la souris, conduit une fois adulte a une diminution de la taille des portées de 30%. Ce dysfonctionnement est associé à des marques épigénétiques sur l’ADN et des anomalies morphologiques de la tête des spermatozoïdes. Des techniques à haut débit (protéomique et métabolomique) réalisées sur des cultures de cellules de Sertoli immatures traitées ou non à la metformine ont permis de démontrer : 1) que le traitement mène à un métabolisme cellulaire de type Warburglike. 2) que des protéines présentent des différences d’abondance entre les deux conditions et qu’elles sont impliquées dans l’organisation du cytosquelette, de l’adhésion cellulaire, de la compaction de l’ADN, de la régulation de la réponse cellulaire à l’hypoxie et de l’immunité. Les résultats obtenus suggèrent que les grandes fonctions de sécrétion, de support et de protection des cellules de Sertoli sont modifiées par cet antidiabétique et qu’une exposition in utero à la metformine pourrait agir sur la fertilité et sur le métabolisme. / Metformin is used to treat patients with type II diabetes, it could be also administered to improve infertility associated to insulin-resistance or metabolic disorder. My research project was to analyse the consequence of a metformin exposure on gonad function from fetal to adult period. We showed by an in vivo approach on two animal models: 1) that oral administration of metformin to young chickens delay the puberty. It is characterized by a reduction in the testis weight, diameter of seminiferous tubule and decrease in testosterone level. 2) that mice, exposed in utero with metformin leads at adulte age to a lower fertility. This dysfunction is associated with morphological abnormalities of the sperm head and epigenetic marks on DNA. The second approach used proteomic and metabolomic strategy on cultured Sertoli cells treated or not with metformin. We demonstrated : 1) that the treatment leads to Warburg-like cellular metabolism. 2) that proteins present differences of abundances are involved in cytoskeleton organization, cell adhesion, DNA compaction, reponsiveness to hypoxia and immunity. The results suggest that the main function of secretion, support and protection of germ cell by Sertoli cells are modified by this antidiabetic, and that in utero exposure to metformin could act on the fertility and metabolism.

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Le suppresseur de tumeur et sérine/thréonine kinase LKB1 est un régulateur clé de la polarité cellulaire et du métabolisme énergétique en partie grâce à l'activation de sa kinase substrat AMPK. Cette protéine est un senseur métabolique pour adapter les apports énergétiques aux besoins nutritionnels des cellules confrontées à un stress. Pour cela, AMPK phosphoryle divers substrats qui activent les réactions cataboliques et inhibent les processus anaboliques dont la kinase mTOR.Au cours de ma thèse, via l’utilisation de modèles murins d’inactivation conditionnelle, j'ai découvert que Lkb1 est crucial pour la formation des cellules de crête neurale (CCN). Ces cellules multipotentes, originaires du tube neural, donnent naissance à divers dérivés, comme les cellules des os et cartilage de la face, les cellules pigmentées de la peau et les cellules gliales et neurales des nerfs périphériques et du système nerveux entérique. J'ai démontré que Lkb1 est essentiel pour la formation de la tête des vertébrés et pour la différenciation et le maintien des dérivés des CCN dans le système nerveux périphérique. J'ai également mis en évidence l’acétylation de LKB1 sur la lysine 48 par l'acétyltransférase GCN5 et son rôle dans l'ontogenèse des CCN céphaliques et la formation de la tête. De plus, j'ai découvert que Lkb1 contrôle la différenciation des cellules gliales en réprimant un programme de biosynthèse d’acides aminés couplé à la transamination du pyruvate en alanine, en amont de la voie de signalisation mTOR.Les phénotypes dus à la perte de Lkb1 dans les CCN récapitulent les caractéristiques cliniques de maladies humaines appelées neurocristopathies. L’activation anormale du suppresseur de tumeur p53 est également associée à certaines neurocristopathies et l’ablation de p53 sauve le phénotype pathologique. Ainsi, j'ai montré que Lkb1 dans les cellules gliales contrôle p53 en limitant les dommages à l’ADN. Lkb1 est aussi essentiel pour maintenir l’homéostasie lysosomale et le recyclage des protéines et ainsi empêcher la formation de granules nommés lipofuscine, chargés en protéines et lipides oxydés. De façon intéressante, les voies mTOR et LKB1/AMPK sont activées à la surface des lysosomes de façon dépendante des niveaux d’acides aminés. Des données récentes de la littérature suggèrent que les lysosomes constitueraient une plateforme de signalisation pour contrôler la protéolyse et le devenir cellulaire. Ainsi, nos données proposent que les signalisations Lkb1 et p53 pourraient réguler l'homéostasie lysosomale et en conséquence le vieillissement cellulaire.De façon intéressante, les cellules de Sertoli, des cellules somatiques épithéliales, localisées dans les tubes séminifères des testicules, et qui régissent la maturation des cellules germinales et l'homéostasie testiculaire, partagent des fonctions métaboliques similaires avec les cellules gliales. En effet, ces cellules sécrètent le lactate et l'alanine qui alimentent les mitochondries des cellules voisines (cellules germinales ou neurones respectivement) contrôlant ainsi leur survie et leur maturation. Au cours de ma thèse, nous avons observé que Lkb1 est requis pour l'homéostasie testiculaire et la spermatogenèse en régulant la polarité des cellules de Sertoli et leur métabolisme énergétique par le cycle pyruvate-alanine. Ces résultats suggèrent une conservation des régulations métaboliques par Lkb1 dans divers tissus.Dans leur ensemble, mes travaux de thèse ont apporté une meilleure connaissance des mécanismes sous-jacents des régulations métaboliques lors du devenir cellulaire. Ces résultats fournissent de nouvelles perspectives sur le développement des CCN et élargissent notre compréhension du contrôle métabolique exercé par LKB1. Enfin, mes projets de doctorat ont mis en évidence l'existence d'une communication entre les voie de signalisation Lkb1 et p53 et suggèrent l’importance de cette communication dans les pathologies humaines dues à des défauts des CCN. / The tumor suppressor LKB1 codes for a serine/threonine kinase. It acts as a key regulator of cell polarity and energy metabolism partly through the activation of the AMP-activated protein kinase (AMPK), a sensor that adapts energy supply to the nutrient demands of cells facing situations of metabolic stress. To achieve metabolic adaptations, AMPK phosphorylates numerous substrates which inhibit anabolic processes while activating catabolic reactions. In particular, AMPK inhibits the mammalian target of rapamycin (mTOR).During my PhD, based on genetically engineered mouse models, I uncovered that Lkb1 signaling is essential for neural crest cells (NCC) formation. NCC are multipotent cells that originate from the neural tube and give rise to various derivatives including bones and cartilage of the face, pigmented cells in the skin and glial and neural cells in peripheral nerves and the enteric nervous system. I demonstrated that Lkb1 is essential for vertebrate head formation and for the differentiation and maintenance of NCC-derivatives in the peripheral nervous system. I also emphasized that LKB1 is acetylated on lysine 48 by the acetyltransferase GCN5 and that this acetylation could regulates cranial NCC ontogeny and head formation. Furthermore, I discovered that Lkb1 controls NCC-derived glial differentiation through metabolic regulations involving amino acid biosynthesis coupled to pyruvate-alanine cycling upstream of mTOR signaling.Phenotypes due to Lkb1 loss in NCC recapitulate clinical features of human disorders called neurocristopathies and therefore suggest that aberrant Lkb1 metabolic signaling underlies the etiology of these pathologies. Abnormal activation of the tumor suppressor p53 has been described in some NCC disorders and p53 inactivation in neurocristopathy mouse models rescues the pathological phenotype. By using a NCC line that can be cultivated as progenitors or differentiated in glial cells in vitro, I demonstrated that Lkb1 expression in NCC-derivatives controls p53 activation by limiting oxidative DNA damage and prevents the formation of lysosomes filled with oxidized proteins and lipids called lipofuscin granules. Interestingly, activation of mTOR and LKB1/AMPK pathways is governed by amino acid sensors and takes place at the lysosome surface. Lysosomes have been proposed as a signaling hub controlling proteolysis and aging. Thus Lkb1 and p53 signaling could converge especially through lysosome homeostasis thereby potentially impacting cellular aging.Strikingly, Sertoli cells, that are epithelial somatic cells, located in seminiferous tubules in testes, and which govern germ cells maturation and whole testis homeostasis, share similar metabolic functions with glial cells. For example, they secrete lactate and alanine to fuel mitochondria of neighboring cells (germ cells or neurons respectively) to control their survival and maturation. During my PhD, we highlighted that Lkb1 is essential for testis homeostasis and spermatogenesis by regulating Sertoli cell polarity and, as observed in glial cells, energy metabolism through pyruvate-alanine cycling. These data suggest that this particular Lkb1 metabolic regulation is conserved in tissues with similar function.Taken together, these studies reveal the underlying molecular mechanisms that coordinately regulate energy metabolism and cell fate. They provide new insights into NCC development and expand our understanding of the role of LKB1 as an energy metabolic regulator. Finally, my PhD projects uncover the existence of a crosstalk between Lkb1 and p53 and underline its importance in NCC disorders.