Biomass recalcitrance has been recognized as one of the major barriers that hided the cost-effective conversion of lignocellulosic biomass to bioethanol, therefore the current bioconversion process require an essential step known as pretreatment to increase the cellulose accessibility. This thesis provides information about changes in cellulose accessibility upon different pretreatments, along with how these pretreatments alter the chemical and physical structures of biomass, will be extremely helpful to further optimize the current pretreatment process. Multiple promising analytical techniques including Simons’ stain, NMR cryoporometry, relaxometry, mercury porosimetry was introduced and successfully applied on pretreated biomass samples to characterize the cellulose accessible surface area and biomass porosity. Different pretreatments increase cellulose accessibility through different mechanisms to different extent. Dilute acid pretreatment is more effective than steam explosion in terms of increasing accessible surface area of cellulose as reflected by Simons’ stain and NMR cryoporometry, while NMR relaxometry suggested steam explosion is more effective at pore expansion for the cell wall water pools detected by changes in NMR relaxation time. Alkaline pretreatment decreased cellulose degree of polymerization, cellulose crystallinity, lignin content and subsequently increased cellulose accessibility, with sodium hydroxide pretreatment proved to be much more effective compared lime or soaking in ammonia pretreatment. Delignification through alkaline-based pretreatment is found less effective than removal of hemicellulose using acid in terms of cellulose accessibility increase. Lignin didn’t directly dictate cellulose accessibility but rather restricted xylan accessibility which in turn controls the access of cellulase to cellulose. Pore size distribution analysis based on mercury porosimetry also indicated that the most fundamental barrier in terms of biomass porosity scale for efficient enzymatic hydrolysis is the nano-pore space formed between coated microfibrils, despite some of the porous architecture such as cell lumen and pit could be severely destroyed after pretreatment. The action of cellulase on the characteristics of cellulosic fractions obtained from pretreated biomass was also investigated. Cellulose accessibility was found to increase at the beginning of hydrolysis, and after reaching a maximum value then starting to decrease. Enzymatic hydrolysis resulted in a rapid decrease in the cellulose degree of polymerization then gradually leveled off, suggesting the existence of a synergistic action of endo- and exo-glucanases that contribute to the occurrence of a peeling off type mechanism.

The enzymatic hydrolysis of cellulose to glucose by cellulases is one of the major steps in the conversion of lignocellulosic biomass to biofuel. This hydrolysis by cellulases, a heterogeneous reaction, currently suffers from some major limitations, most importantly a dramatic rate slowdown at high degrees of conversion in the case of crystalline cellulose. Various rate-limiting factors were investigated employing experimental as well as computational studies. Cellulose accessibility and the hydrolysable fraction of accessible substrate (a previously undefined and unreported quantity) were shown to decrease steadily with conversion, while cellulose reactivity, defined in terms of hydrolytic activity per amount of actively adsorbed cellulase, remained constant. Faster restart rates were observed on partially converted cellulose as compared to uninterrupted hydrolysis rates, supporting the presence of an enzyme clogging phenomenon. Cellulose crystallinity is a major substrate property affecting the rates, but its quantification has suffered from lack of consistency and accuracy. Using multivariate statistical analysis of X-ray data from cellulose, a new method to determine the degree of crystallinity was developed. Cel7A CBD is a promising target for protein engineering as cellulose pretreated with Cel7A CBDs exhibits enhanced hydrolysis rates resulting from a reduction in crystallinity. However, for Cel7A CBD, a high throughput assay is unlikely to be developed. In the absence of a high throughput assay (required for directed evolution) and extensive knowledge of the role of specific protein residues (required for rational protein design), the mutations need to be picked wisely, to avoid the generation of inactive variants. To tackle this issue, a method utilizing the underlying patterns in the sequences of a protein family has been developed.

Abstract Replacing the plastics in packaging applications with bio based and biodegradable cellulosic materials, especially all cellulose composites, would be a sustainable alternative. The main problem would be the non ecological and non economic nature of the processing required by all cellulose composites due to the use of toxic and expensive chemicals such as cellulose solvents. In addition, the raw materials typically studied for all cellulose composites have been highly specialized cellulosic pulps. This thesis therefore explores the possibility of using NaOH/urea as a cellulose solvent together with commercially available chemical pulps from the paper and board industry for the production of sustainable all cellulose composites materials. Furthermore, the effect of calendering and fibre orientation was investigated. The methods used for characterizing the materials were tensile strength measurements, X Ray diffraction, imaging and the short compression strength test. In connection with the X Ray diffraction measurements a method for evaluating the crystallinity of cellulose was modified from the literature and partly automated. The results show that NaOH/urea is a suitable solvent for producing all cellulose composites within a significant shorter time than reported in the literature. In addition, the tensile strength of the paper used for this purpose could be increased up to ten times and it is shown that the dissolution of cellulose fibres was indeed only partial. The efficiency of the treatment is nevertheless greatly dependent on the pulps used and their hemicellulose and lignin content. Further post-processing in the form of calendering is not recommended because it weakens the composites. / Tiivistelmä Fossiilisien muovien korvaaminen biopohjaisilla ja -hajoavilla materiaaleilla pakkausteollisuuden sovelluksissa on ympäristön kannalta kestävä vaihtoehto, varsinkin kun materiaalina käytetään itselujittuva selluloosakomposiitti (eng. all-cellulose composite). Tämän materiaalin teollinen valmistus ei kuitenkaan ole vielä ollut taloudellisesti kannattavaa eikä ympäristöystävällistä, koska selluloosan liuotukseen tarvitaan kalliita ja ympäristölle haitallisia kemikaaleja. Lisäksi raaka-aineena on aiemmin käytetty kalliita erikoisselluloosakuituja. Edellä mainituista syistä tässä väitöskirjatyössä tutkitaan itselujittuvien selluloosakomposiittien valmistusta käyttäen raaka-aineina kaupallisesti saatavilla olevia selluloosakuituja ja niiden liuottimena NaOH/urean vesiliuosta. Tämän liuottimen etuja ovat vähäinen myrkyllisyys, edullisuus ja riittävien määrien saatavuus teolliseen tuotantoon. Lisäksi työssä tutkitaan kalanteroinnin ja kuituorientaation vaikutusta komposiitin ominaisuuksiin. Käytettyjä analyysimenetelmiä ovat röntgendiffraktio, elektronimikroskoopilla kuvantaminen ja erityyppiset mekaaniset testit. Röntgendiffraktiomittausten tulosten arvioinnissa käytetään aiemmin raportoidusta menetelmästä kehitettyä osin automatisoitua selluloosan kiteisyyden määrittämisen menetelmää. Tulosten perusteella voidaan sanoa, että NaOH/urea on sopiva liuotin itselujittuvien selluloosakomposiittien valmistukseen ja sillä prosessia voidaan nopeuttaa huomattavasti muihin raportoituihin menetelmiin verrattuna. Raaka-aineena käytetyn paperin vetolujuus parani liuotinkäsittelyllä jopa kymmenkertaiseksi. Liuotinkäsittelyn tehokkuus riippui paljon käytettyjen selluloosakuitujen tyypistä ja niiden hemiselluloosa- ja ligniinipitoisuuksista.

Landlebende Pflanzen weisen differenzierte Gewebetypen auf, die neben der Aufrechterhaltung physiologischer Stoffwechselvorgänge äußeren mechanischen Belastungen standhalten müssen. Durch zweckmäßige Verteilung von Festigkeitsgeweben über den Sprossquerschnitt erlangen Pflanzen die notwendigen Versteifungen und Stabilitäten. Zur ortsaufgelösten Darstellung der unterschiedlichen Pflanzengewebe wird auf die Methode der Ramanspektroskopie zurückgegriffen. Dazu werden valide ramanspektroskopische Methoden entwickelt, die die Bestimmung der Cellulosekristallinität sowie die Quantifizierung des Lignins und der Hemicellulosen zum Ziel haben. Am Beispiel eines Pflanzenquerschnittes des Gemeinen Flachs Linum usitassimum werden die spektroskopischen Methoden angewandt und die Verteilung der unterschiedlichen Gewebetypen aufgezeigt und diskutiert.

Landlebende Pflanzen weisen differenzierte Gewebetypen auf, die neben der Aufrechterhaltung physiologischer Stoffwechselvorgänge äußeren mechanischen Belastungen standhalten müssen. Durch zweckmäßige Verteilung von Festigkeitsgeweben über den Sprossquerschnitt erlangen Pflanzen die notwendigen Versteifungen und Stabilitäten. Zur ortsaufgelösten Darstellung der unterschiedlichen Pflanzengewebe wird auf die Methode der Ramanspektroskopie zurückgegriffen. Dazu werden valide ramanspektroskopische Methoden entwickelt, die die Bestimmung der Cellulosekristallinität sowie die Quantifizierung des Lignins und der Hemicellulosen zum Ziel haben. Am Beispiel eines Pflanzenquerschnittes des Gemeinen Flachs Linum usitassimum werden die spektroskopischen Methoden angewandt und die Verteilung der unterschiedlichen Gewebetypen aufgezeigt und diskutiert.

Abstract Wood powders are used in numerous applications such as thermoplastics and filters, and a lot of research effort has been put into developing novel ways of utilising them. The mechanical processing of wood powders, especially at particle sizes below 100 µm, has been reported in several studies, but they lack information on the effect of fine grinding conditions on the particle morphology and cellulose crystallinity, both of which are important parameters in the further processing of wood powders and in their various applications. This makes it very difficult to design and optimise fine grinding processes with different applications in mind. The aim of this thesis was to study the dry fine grinding of wood in several impact-based fine grinding mills in order to find out their effect on the properties of the wood and to study the energy required for the mechanical processing of the resulting powders. The effect of the main operational parameters on the properties of dried Norway spruce wood and the energy consumption was studied using three impact-based fine grinding mills that were capable of pulverising the wood down to a median particle size of less than 25 µm. It was found that the impact events occurring in media mills can be used for the production of very fine wood powders with lower cellulose crystallinity and rounder shaped particles having more uniform shape distribution than powders pulverised to a similar size range by means of impact events in non-media mills. A practical estimate was obtained for the minimum specific energy consumption in fine grinding in mills involving grinding media that could be utilised as a target for optimisation. Impact-based media milling under cryogenic conditions can be used to obtain different Norway spruce wood powders from those produced under ambient grinding conditions, i.e. without the freezing effect of nitrogen liquid. The energy efficiency of fine grinding can be enhanced by choosing cryogenic rather than ambient conditions. The moisture content of the wood has greater influence on the size and shape of the particles when milling is accomplished under ambient conditions. Torrefaction can reduce the energy consumption in impact-based media mills for median particle sizes over 17.4 µm (± 0.2 µm), while the shape and cellulose crystallinity of the particles are not significantly affected by torrefaction pretreatment as a function of energy consumption. / Tiivistelmä Puujauheita käytetään laajalti erilaisissa sovelluksissa, kuten esimerkiksi biokomposiiteissa ja suodattimissa. Tämän lisäksi on olemassa paljon tutkimustietoa siitä, kuinka puujauheita voitaisiin hyödyntää laajemminkin. Puu voidaan mekaanisesti prosessoida alle 100 µm:n kokoluokkaan, mutta yksityiskohtaista tietoa kuivahienojauhatuksen olosuhteiden vaikutuksesta jauheiden morfologiaan ja selluloosan kiteisyyteen ei ole saatavilla. Puujauheen morfologialla ja selluloosan kiteisyydellä on kuitenkin merkittävä vaikutus sovelluksia ja jatkojalostusta ajatellen. Puun kuivahienojauhatuksen tiedon puute hankaloittaa merkittävästi prosessin suunnittelua ja optimointia erilaisia sovelluksia varten. Tämän väitöskirjan tavoitteena on selvittää iskuihin perustuvien hienojauhimien vaikutukset puun ominaisuuksiin ja tutkia mekaanisen prosessoinnin energiatehokkuutta hienojauhatuksessa. Tutkimuksessa selvitettiin kolmen erilaisen iskuun perustuvan hienojauhatusmyllyn pääasiallisten operointiparametrien vaikutusta kuivatun metsäkuusen ominaisuuksiin ja energiankulutukseen. Jokaisella hienojauhimella onnistuttiin tuottamaan puujauhoja, joiden mediaanikoko oli alle 25 µm. Iskuihin perustuvalla jauhinkappalemyllyllä saatiin tuotettua puujauhoa, jonka selluloosan kiteisyys on alhaisempi ja partikkelimuodot pyöreämpiä verrattuna samankokoisiin puujauhoihin, jotka on tuotettu iskuihin perustuvilla jauhinkappaleettomilla hienojauhatusmyllyillä. Työssä saatiin käytännöllinen arvio kuivatun metsäkuusen hienojauhatuksen minimienergiankulutukselle iskuihin perustuville jauhinkappalemyllyille, mitä voidaan käyttää kyseisten myllytyyppien optimoinnin tavoitteena. Työssä havaittiin lisäksi, että kryogeenisiä jauhatusolosuhteita käyttämällä voidaan tuottaa erilaisia puujauhoja verrattuna puujauhoihin, jotka prosessoidaan ilman nestetyppijäädytystä, kun jauhatus suoritetaan iskuihin perustuvalla jauhinkappalemyllyllä. Ilman nestetyppijäädytystä puun kosteuspitoisuudella on merkittävämpi vaikutus puujauhojen ominaisuuksiin kuin kryogeenisissä olosuhteissa jauhetuilla. Kryogeenisillä jauhatusolosuhteilla voidaan parantaa myös jauhatuksen energiatehokkuutta. Torrefioinnilla voidaan vähentää hienojauhatuksen energiankulutusta iskuihin perustuvilla jauhinkappalemyllyillä, kun tavoitekoon mediaani on yli 17,4 µm (± 0,2 µm). Torrefioinnilla ei ole vaikutusta selluloosan kiteisyyteen tai partikkeleiden muotoon energiankulutuksen funktiona.