La réceptivité de l’endomètre à l’embryon est un point crucial en reproduction. Il semblerait qu’une synchronisation entre l’endomètre maternel et le développement de l’embryon soit nécessaire. Pour se faire, les stéroïdes ovariens préparent le contact de l’endomètre avec l'embryon. De son côté, l’embryon communique avec l’endomètre par l’intermédiaire d’un vaste réseau moléculaire. Dans certains cas d’infertilité, la réceptivité maternelle est altérée, il en résulte alors un échec d’implantation. D’où l’importance d’explorer le côté maternel de l’implantation. C’est pourquoi, en tenant compte des précédents travaux menés au laboratoire, portant sur le système IL (interleukine) 1, la hCG (hormone gonadotrophine chorionique humaine) et les cellules de l’endomètre, nous avons étudié le rôle de ces deux facteurs embryonnaires précoces, dans l’acquisition de la réceptivité endométriale, au début du phénomène d’implantation. Ce projet de recherche sur la physiologie de l’implantation embryonnaire est strictement fondamental et représente la base pour une meilleure compréhension de la fertilité et l’infertilité féminine. Pour se faire, des approches in vitro et in vivo ont été utilisées. Nos résultats semblent indiquer que la famille de l’IL1 est ciblée de façon originale par la hCG. Celle-ci semble favoriser l’effet de l’IL1 par le biais d’un déséquilibre pro-fonctionnel touchant les différents récepteurs. En outre, l’effet de la hCG sur les différentes cibles de l’IL1 apparaît sélectif et semble modérer certains aspects qui pourraient s’avérer néfastes pour l’implantation embryonnaire, tandis qu’elle favorise certaines cibles par effet de coopération. Nos travaux démontrent l’existence d’une dynamique dans l’expression des différents récepteurs de l’IL1 en lien avec la présence du chef de file des facteurs embryonnaires, la hCG. / The endometrium receptivity for embryo is a crucial feature in reproduction. Overall, it seems that synchronization between the maternal endometrium and the developing embryo is necessary. At the maternal side, the appointment with the embryo is carefully prepared by ovarian steroids’ action. An another hand, the embryo communicates with the endometrium through a large molecular network. In some cases of infertility, maternal receptivity is altered, resulting in implantation failure. Moreover, the maternal side of implantation is in question. Therefore, taking into account our previous studies revealing a close cooperation between major and early embryonic signals, hCG (human chorionic gonadotropin) and interleukin1 (IL1), at the feto-maternal interface, we have studied the role of these embryonic factors in the acquisition of endometrial receptivity. This research on the physiology of embryo implantation is strictly fundamental and the basis for a better understanding of female fertility and infertility. Using in vitro and in vivo approaches, our results suggest that the IL1 family is targeted in an original way by hCG. This seems to favor the effect of IL1 through a functional imbalance affecting different IL1 receptors. In addition, the effect of hCG on various targets of IL1 appears to be selective and seems to moderate some aspects that could be detrimental for embryo implantation, while it favors certain targets by synergic cooperation. Our work demonstrates the existence of a dynamic expression of different IL1 receptors in link with the presence of hCG, the leading embryonic factor.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 86-94. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / L'interleukine-1 (IL-1) est impliquée au niveau de plusieurs phénomènes. Dans l'implantation, au niveau de l'endomètre, l'IL-l agit en augmentant l'expression de certaines cytokines, de molécules d'adhésion et de facteurs de remodelage tissulaire permettant ainsi l'adhésion du blastocyte à l'endomètre et favorisant l'angiogénèse. L'IL-l joue également un rôle important dans l'endométriose. Deux objectifs étaient prévus pour ces études. Le premier était de déterminer l'effet de l'hormone gonadotrophine chorionique (hCG) sur le récepteur type II de l'IL-l (IL-1R2) chez les femmes normales. Le deuxième était de déterminer l'effet de l'IL-l sur le facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF) dans l'endométriose. Nos résultats montrent que la hCG diminue la synthèse et la sécrétion de l'IL-lR2, un inhibiteur spécifique de l'IL-l, dans les cellules épithéliales de femmes normales sans modifier l'expression du récepteur type I de l'IL-l (IL-1R1), le récepteur qui médit l'activation cellulaire induite par l'IL-l. La hCG semble donc favoriser le processus de l'implantation en favorisant potentiellement les effets de l'IL-l. Nos résultats montrent également que l'IL-l augmente la synthèse et la sécrétion de MIF au niveau des cellules endométriosiques. L'IL-l semble donc favoriser le développement de la maladie en favorisant l'action de MIF, un facteur proinflammatoire et angiogénique, ce qui permettrait le développement d'une nouvelle vascularisation essentielle à la survie des lésions d'endométriose.

Des hormones gonadotropiques sont utilisées pour la maîtrise de la reproduction dans le domaine vétérinaire. Ces hormones sont actuellement extraites de tissus ou de fluides animaux. L’entreprise CEVA Santé Animale a récemment fait le choix stratégique de produire ces hormones par voie recombinante. L’objectif de cette étude était d’obtenir une gonadotropine chorionique équine recombinante, reCG, pure et biologiquement active, à partir d’une lignée de cellules mammifères CHO. Les étapes de production, de purification et de caractérisation de l’hormone recombinante ont été développées. Les cellules CHO ont été cultivées en fiole d’Erlenmeyer dans différents milieux de culture. Le suivi de la croissance cellulaire et de la quantité d’hormone produite a permis de sélectionner deux milieux. Le procédé de production, avec ces deux milieux, a été optimisé en bioréacteur en contrôlant les paramètres de culture (température, pH). Les protéines produites dans le surnageant, de ces deux cultures, ont été nommées reCG 1 et reCG 2. Un procédé de purification en 3 étapes a été mis au point pour la reCG 1. Plusieurs résines et conditions chromatographiques ont été criblées en microplaques. Les résines multimodales utilisées ont permis d’éliminer des contaminants majeurs grâce à leur sélectivité. Les agrégats de la reCG ont été éliminés grâce à une résine anionique. Le procédé de purification global a été validé pour la reCG 1 et la reCG 2. Il a permis d’obtenir une pureté de 98 % avec un rendement de 80 %. L’activité biologique de la reCG 1 et la reCG 2, in vitro et in vivo, est comparable à celle de la protéine naturelle. L’activité biologique in vivo des reCG est cohérente avec l’étude réalisée sur les glycosylations des hormones et notamment avec leur degré de sialylation. / The gonadotrophic hormones are used for reproduction control in farming animals. Up to now, these hormones were extracted from animal fluids or tissues. The company CEVA Santé Animal has recently decided to produce recombinant versions of these hormones. The objective of this study was to obtain a pure and biologically active recombinant equine chorionic gonadotropin (reCG) after expression in CHO mammalian cells. The production, purification and characterization steps have been developed. CHO cells were grown in Erlenmeyer flasks with different culture media. Two media were selected based on their cell growth potency and of the amount of reCG produced. By using a bioreactor to control key parameters (temperature, pH), the production process was then optimized. The recombinant proteins that accumulated in the supernatant of the two conditions were called reCG 1 and reCG 2. A 3-steps purification process was then developed using reCG 1. Several resins and chromatographic conditions were screened in microplates. Multimodal resins were used to eliminate the main contaminants thanks to their selectivity. reCG aggregates were efficiently eliminated by a chromatographic step with an anionic resin. The overall purification process was finally validated for reCG 1 and reCG 2. Purity and yield were respectively, 98 % and 80 % for the two reCG. We verified that the in vitro and in vivo activities of reCG 1 and reCG 2 were comparable to those of the CG extracted from natural sources. The in vivo assays also confirmed previous studies showing that the degree of glycosylation of an hormone, and most notably their level of sialytation, is important for their biological activity.

Plusieurs cancers sont associés à des concentrations sériques anormales de marqueurs tumoraux, tels que le prostate specific antigen (PSA) dans le cancer de prostate, l’alfafoetoproteine (AFP) ou l’human chorionic gonadotrophin (hCG) dans les tumeurs germinales ou les maladies trophoblastiques gestationnelles (MTG). Le traitement du cancer doit s’accompagner d’une chute de leurs concentrations. Les valeurs prédictives de nombreux paramètres cinétiques censés caractériser la décroissance des marqueurs ont été publiées dans la littérature (nadir, valeur seuil, demi-vie, temps à normalisation etc…) Cependant très peu de ces paramètres sont utilisés en pratique par manque de reproductibilité. La modélisation en approche de cinétique de population, déjà utilisée dans les études pharmacocinétiques, permettrait de caractériser de façon dynamique la décroissance des marqueurs tumoraux sériques et de compenser les limites des autres méthodes. Nous avons étudié la faisabilité et l’intérêt de cette approche dans 4 études portant sur le PSA après chirurgie d’adénome ou de cancer de la prostate, l’hCG-AFP dans les tumeurs germinales non-séminomateuses traitées par polychimiothérapie de type Bléomycine-Etoposide- Cisplatine (BEP) et l’hCG dans les MTG traitées par méthotrexate. La modélisation de la décroissance des marqueurs tumoraux a été possible dans toutes les études en adaptant la méthodologie aux spécificités de chaque marqueur. Il apparaît que les clairances apparentes du PSA et de l’hCG permettraient d’identifier les patients ayant des profils cinétiques défavorables et donc à haut risque de rechute. Des études de validation sur des cohortes indépendantes sont nécessaires / Several cancers are associated with abnormal serum concentrations of tumor markers such as prostate specific antigen (PSA) in prostate tumor diseases, alfa-fetoprotein (AFP) or human chorionic gonadotrophin (hCG) in germ cell tumors or persistent gestational trophoblastic diseases (GTD). Cancer treatment should induce decline of serum tumor marker concentrations. The predictive values of many kinetic parameters supposed to characterize tumor marker declines such as nadir, time-point cutoff, half-life, time to normalization etc…, have been reported in previous studies. However very few of them have been used in routine due to the lack of outcome reproducibility. Population pharmacokinetic approach-based modeling is already used in pharmacokinetic studies. It might be helpful to characterize tumor marker decline equations dynamically and overcome limitations of previous studies. The feasibility and the relevance of this approach were assessed in 4 studies involving: PSA titers in patients with prostate adenoma or cancer treated with surgery; hCG-AFP in non-seminomatous germ cell tumor patients treated with BEP regimen (Bleomycin-Etoposide-Cisplatin) and hCG in GTD patients treated with methotrexate. Tumor marker decline modeling was feasible in all studies provided the methodology was adjusted to marker specificities. Apparent clearance of hCG and PSA might enable identification of patients with unfavorable decline profiles and thereby with high risk of relapse. Confirmatory studies with independent cohorts of patients are warranted

La glycosylation est la forme la plus courante de modification post-traductionnelle (PTM) des protéines humaines, puisque plus de 70% d’entre elles sont glycosylées. Celle-ci régule de nombreuses propriétés biologiques comme leur stabilité, leur demi-vie et leur activité. Néanmoins, les protéines peuvent également présenter d'autres types de PTM, ce qui peut conduire pour une protéine donnée à un très grand nombre d'isoformes variant par leur masse, leurs propriétés biologiques et physico-chimiques et leur concentration dans les échantillons biologiques. Ainsi, caractériser une glycoprotéine comporte de nombreux défis et nécessite la mise en œuvre de méthodes séparatives très performantes et de détection très sensibles et informatives.La gonadotrophine chorionique humaine (hCG) est l’hormone spécifique de la grossesse humaine. Elle est essentielle au développement du placenta et du fœtus. Elle est composée de deux sous-unités hCGα et hCGβ qui sont fortement glycosylées (4 sites de N-glycosylation et 4 sites d’O-glycosylation). Récemment, des travaux ont montré une corrélation entre sa glycosylation et une bonne implantation du fœtus. Une caractérisation des ces glycoformes s’avère donc nécessaire.Par conséquent, de nouvelles méthodes en LC/CE-MS ont été développées pour la caractérisation de la hCG à l’échelle intacte en utilisant deux médicaments à base de hCG ayant des glycosylations différentes. Alors que la méthode en CZE-MS (TQ) a permis de différencier les profils des glycoformes de la sous-unité hCGα des deux médicaments, la complémentarité des méthodes RP- et HILIC-MS (qTOF) a conduit à leur identification.Pour limiter les erreurs potentielles d’identification dues au chevauchement des profils isotopiques, le profil de chaque isoforme a été résolu par FT-ICR MS. Dans ce but, une séparation au format nanoLC en mode RP a été développée, améliorant ainsi la sensibilité de la méthode d’un facteur 500 par rapport au format conventionnel. Cette méthode a permis de confirmer l’identification des glycoformes de la sous-unité hCGα. D’autre part, il a été possible d’obtenir des profils différents de glycosylation de la sous-unité hCGβ en favorisant leur ionisation par réduction de la hCG. Enfin, un traitement à la PNGase a conduit à l’élimination des N-glycanes pour l’obtention des profils d’O-glycosylation de la sous-unité hCGβ. / Glycosylation is the most common form of post-translational modifications (PTMs) of human proteins, since more than 70% are glycosylated. It regulates numerous biological properties including their stability, half-life, and activity. Nevertheless, proteins can also exhibit other types of PTMs that lead to a very large number of isoforms, varying in mass, properties and concentration in the biological samples. Therefore, the characterization of a glycoprotein is highly challenging and requires the use of powerful separation techniques and sensitive and informative detection modes.The human chorionic gonadotropin (hCG) is the hormone specific to human pregnancy. It is essential for the development of placenta and fetus. It is based on two heavily glycosylated subunits, hCGα and hCGβ, having 8 glycosylation sites (4 N- and 4 O-glycosylation sites). Some recent studies demonstrated that here is a correlation between the hCG glycosylation state and the fetus implantation. This is why the characterization of the hCG glycoformes is needed.Therefore, new LC/CE-MS methods were developed for the characterisation of hCG at the intact level using two hCG-based drugs having different glycosylation profiles. While the CZE-MS (TQ) method showed its potential for glycosylation fingerprinting, the complementarity of LC-(qTOF) MS methods in RP and HILIC modes allowed the identification of the glycoforms of the hCGα subunit.To limit the identification errors due to the overlapping of isotopic distribution patterns, the profile of each isoform was resolved by FT-ICR MS. For this purpose, a nanoLC separation in RP mode was developed, thus improving the sensitivity of the method by a factor 500 compared to the conventional format. This method allowed the confirmation of the identification of hCGα glycoforms. Then, it was possible to obtain different glycosylation patterns of the hCGβ by promoting its ionization after hCG reduction. Then, a PNGase treatment was carried out to remove the N-glycans in order to obtain the O-glycoprofiles of hCGβ isoforms.

L’exposition prénatale à différents agents toxiques est généralement étudiée en considérant le placenta comme une barrière entre la mère et le fœtus ; nous le considérons en tant qu’organe cible des agents toxiques. Pour ce faire, nous avons sélectionné un modèle cellulaire de trophoblastes adapté aux études toxicologiques. En clinique, des pathologies de la grossesse sont associées à des modifications de la sécrétion de l’hormone placentaire lactogène hPL et de l’hormone gonadotrope chorionique hCG. Nos travaux in vitro ont permis de faire le lien entre une exposition à des micropolluants (le mono(2-ethylhexyl) phtalate, un perturbateur endocrinien, et le benzo(a)pyrene, un carcinogène) et ces observations cliniques. Les biomarqueurs de sécrétion hormonale (hPL et hCG hyperglycosylée) et de dégénérescence (activation du purinorécepteur P2X7) que nous avons identifiés permettent de détecter l’exposition et le risque suite à une exposition à des polluants. / Prenatal exposure to pollutants is commonly evaluated using placenta as a barrier between mother and fetus. Here, we consider placenta as a target organ for toxic agents. To achieve this, we selected a trophoblastic cell model, which is adapted to toxicological studies. In clinical studies, pregnancy pathologies are associated to changes in human placental lactogen (hPL) and human chorionic gonadotropin (hCG) secretions. Our in vitro work links exposure to micropollutants (mono(2-ethylhexyl)phthalate, an endocrine disruptor, and benzo(a)pyrene, a carcinogen) and clinical observations. We identified biomarkers of hormonal secretion (hPL and hyperglycosylated hCG) and degeneration (P2X7 receptor activation), which enable the evaluation of exposure and risk attached to exposure to pollutants.