Les trois complexes SMC Cohésine, Condensine et SMC5/6 sont principalement étudiés pour leurs rôles mitotiques, cependant tous trois sont localisés à proximité des fourches de réplication en condition de stress réplicatif. Au cours de cette thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés aux complexes Cohésine et Condensine. Dans une première partie, nous décrivons un nouveau rôle des condensines dans la progression des fourches de réplication en condition de stress réplicatif à l’hydroxyurée (HU) et au Méthyl-Méthane-Sulfonate (MMS). Nos données montrent que dans ces conditions, les condensines limitent l’accumulation de la protéine de liaison à l’ADN simple-brin RPA (Replication Protein A) à proximité des fourches de réplication. Ces résultats révèlent que les condensines limitent l’exposition d’ADN simple brin et pourraient ainsi protéger l’intégrité des fourches de réplication et la stabilité du génome. Dans une seconde partie nous décrivons le mécanisme de recrutement du complexe Cohésine aux fourches de réplication en condition de stress réplicatif. Dans ces conditions, les cohésines renforcent la cohésion des chromatides sœurs afin de faciliter le redémarrage des fourches de réplication par recombinaison homologue. Nous montrons que le complexe SMC-like MRX (Mre11-Rad50-Xrs2), l’histone méthyle-transférase Set1 et l’histone acétyle-transférase Gcn5 sont requis pour le recrutement des cohésines aux fourches de réplication. Nos données révèlent qu’en réponse au stress réplicatif, Gcn5, Set1 et MRX modifient la dynamique des histones. Gcn5 et MRX réduisent la densité d’histone sur l’ADN répliqué alors que Set1 maintient la mobilité des nucléosomes. La modification de la dynamique des histones semble importante pour une réponse cellulaire efficace au stress réplicatif et pour le chargement de complexes SMC aux fourches de réplication. / The three SMC complexes Cohesin, Condensin and SMC5/6 are mainly studied for their role in mitosis, nevertheless they all localize at replication forks in replicative stress conditions. During this thesis, we focused on Cohesin and Condensin. In the first part we describe a new role for the condensin complex in response to replicative stress. In the presence of Hydroxyurea (HU) and Methyl-Methan-Sulfonate (MMS), condensin is required for cell growth and replication fork progression. Moreover, our results show that condensin limits the accumulation of the specific single-strand DNA (ssDNA) binding protein RPA (Replication Protein A) in the vicinity of replication forks under HU treatment, revealing that condensin limits ssDNA accumulation during replicative stress. In this way, Condensin could protect replication fork integrity and genome stability in response to replicative stress. In the second part, we decipher the cohesin recruitment mechanisms at replication fork under replicative stress. In that context, cohesin reinforces sister chromatid cohesion and facilitates homologous recombination (HR) dependent replication fork restart pathways. We show here that the SMC-like MRX complex, the histone methyl transferase Set1 and the histone acetyl transferase Gcn5 are required for cohesin recruitment at stalled replication forks. Our results show that these three proteins affect histone H3 dynamics on replicated DNA in response to replicative stress. Gcn5 and MRX reduce H3 density whereas Set1 maintains nucleosome mobility. These two parameters seem to be important for efficient response to replicative stress and for SMC complexes loading close to stressed replication forks.

Les éléments cis-régulateurs contrôlent l'expression spatio-temporelle des gènes au cours du développement. La segmentation du rhombencéphale en rhombomères (r) établit l'organisation du cerveau postérieur des vertébrés. La spécification et la formation des segments r3 et r5 sont gouvernées par l'expression du facteur de transcription Krox20/Egr2, sous le contrôle de plusieurs éléments cis-régulateurs. Les éléments B (dans r5) et C (dans r3 et r5) sont actifs au démarrage de l'expression de Krox20 alors que l'élément A (dans r3 et r5) est un élément autorégulateur. En générant la délétion de l'élément A dans le génome murin, nous avons montré qu'il est nécessaire au maintien de l'expression de Krox20 dans r3 et r5. De façon inattendue, la délétion de l'élément C n'impacte pas la phase de démarrage mais abolit le maintien de l'expression de Krox20 dans r3 de manière analogue à celle de l'élément A. J'ai mis en évidence par différentes approches génétiques que l'élément C coopère en cis avec l'élément A, lors de la phase d'autorégulation. Plusieurs approches de conformation et d'accessibilité de la chromatine au locus Krox20 indiquent que l'élément A interagit de façon constitutive avec le promoteur et que l'élément C est capable d'affecter l'accessibilité de l'élément A à distance. Parallèlement, j'ai montré que la délétion de l'élément C chez le poisson-zèbre n'entraîne pas de modification de l'expression du gène Krox20 contrairement à la souris malgré un patron d'expression similaire. Ces approches complémentaires ont permis de caractériser le rôle fonctionnel de plusieurs éléments cis-régulateurs contrôlant l'expression d'un gène clef du développement des Vertébrés. / Cis-regulatory elements ensure the specifity and the maintenance of the spatio-temporal gene expression pattern throughout the development of an organism. Segmentation of the hindbrain into rhombomeres (r) establishes the posterior brain organisation in vertebrates. The specification and formation of r3 and r5 are governed by the expression of the transcription factor Krox20/Egr2, controlled by three cis-regulatory elements. Elements B (in r5) and C (in r3 and r5) are active during the initiation of Krox20 expression while element A (in r3 and r5) is an autoregulatory element. By studying the deletion of element A in the mouse genome, we have shown that Krox20 expression is not maintained in absence of this element. Unexpectedly, the deletion of element C does not impair Krox20 initiation but abolishes the maintenance of expression in r3, similarly to element A knock-out. I also showed by different genetic approaches that element C cooperates in cis with element A. Moreover, investigation of chromatin conformation and accessibility in the Krox20 locus indicate that element A and the promoter are engaged in a constitutive interaction and that element C is able to affect the accessibility of element A at a distance. In parallel, the deletion of element C in zebrafish did not reveal any modification in Krox20 expression, despite a similar expression pattern in mouse. These complementary approaches lead to the characterization of the functional role of several cis-regulatory elements driving the expression of a key developmental gene in vertebrates.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'organisation tridimensionnelle du génome émerge comme un mécanisme de contrôle important dans la fonction génomique. Les études chez S. cerevisiae ont largement contribué à démontrer l'importance fonctionnelle de l'organisation nucléaire. Pendant la fermentation, les 16 chromosomes d'un noyau haploïde de S. cerevisiae sont organisées avec centromères liés à la SPB et télomères regroupés en 3-4 foyers localisés à la périphérie nucléaire. Cet organisation permet la concentration de protéines silencieuse (SIRS) et semble importants pour les fonctions du génome. Le but de mon travail de doctorat était d'étudier la chromatine télomérique silencieuse dans different transitions métaboliques.Nous avons constaté que le génome de cellules quiescente subit une réorganisation spatiale majeure suite à la source de carbone épuisement. Cette modification de l'architecture nucléaire est entraîné par le regroupement des télomères en un foyer unique (hypercluster) localisée au centre du noyau. Nous montrons également que cette réorganisation est un événement programmé déclenché par les espèces réactives de oxigen (ROS) produits lors de la respiration. Enfin, nous déclarons que l'excès d'activité Sir2 contrecarre le regroupement des télomères lors de la quiescence et a un rôle négatif sur la durée de vie en quiescence. Notre travail suggère que la réorganisation drastique du génome en ‘hypercluster’ de télomères favorise la survie lors de quiescence, et dénoue un lien entre le métabolisme, l'organisation nucléaire et le vieillissement. / The tri-dimensional organization of the genome emerges as an important, still poorly understood, control mechanism in genomic function. Studies in S. cerevisiae have broadly contributed to demonstrate the functional importance of nuclear organization. Upon logaritmic growth, the 16 chromosomes of a S. cerevisiae haploid nucleus are organized into the Rabl conformation, with centromeres bound at the SPB and telomeres grouped in 3-4 foci localized at the nuclear periphery. Telomere clusters allow the concentration of silencing proteins (SIRs) and appear important for genome functions. The aim of my doctorate work was to study telomeric silent chromatin upon major metabolic transitions. We found that the genome of long-lived quiescent cells undergoes a major spatial re-organization following carbon source exhaustion. This change in nuclear architecture is driven by the grouping of telomeres into a unique focus (hypercluster) localized in the center of the nucleus. We also show that this reorganization is a programmed event triggered by reactive oxigen species (ROS) produced upon early respiration and involves the DNA damage checkpoint pathway. Finally, we report that excess of Sir2 activity counteracts telomere clustering upon quiescence and has a negative role on chronological life span. Our work suggests that the drastic genome reorganization due to telomere grouping favors survival upon quiescence, and unravels a novel connection between metabolism, nuclear organization and aging.

Au cours de la méiose, des centaines de cassures doubles brins (CDB) sont générées et réparées par recombinaison homologue. Ces CDB peuvent être réparés par deux voies différentes donnant lieu à des crossing-overs (CO) ou des non crossing-overs (NCO). Le choix entre les deux voies est finement régulé pour assurer un nombre suffisant de CO; les facteurs influençant ce choix n’ont pas encore été bien caractérisés. L’environnement chromatinien pourrait jouer un rôle important dans ce processus.Peu d’études ont été réalisées sur l’influence de la chromatine sur la recombinaison méiotique. Le but de ma thèse a été de caractériser les facteurs chromatiniens nécessaires au remaniement de la chromatine pendant la recombinaison méiotique chez Saccharomyces cerevisiae.J’ai pu montrer que CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) et Hir (Histone Regulator), deux protéines chaperons capables de réassembler les histones, s’associent aux sites de cassures doubles brins méiotiques lors de la recombinaison. L’absence de CAF-1 et Hir n’a pas d’effet sur la progression et la formation de CO. Cependant, par des études de recombinaison sur l’ensemble du génome, j’ai pu observer que l’absence de CAF-1 tend à réduire l’interférence des CO. Ce résultat suggère que CAF-1 pourrait être un des facteurs régulant la réparation au cours de la recombinaison méiotique. Pour finir, je me suis aussi intéressée à un troisième chaperon d’histone H3/H4, Asf1. J’ai aussi pu montrer que la délétion d’un autre chaperon Asf1 (Anti-silencing Function 1) entraîne des défauts de progression méiotique et de formation des spores.Ce travail aide à mieux comprendre l'impact de la chromatine sur la réparation de la méiose et le rôle des facteurs d'assemblage de la chromatine. / During meiosis, hundreds of programmed double strand breaks (DSB) are generated and repaired by homologous recombination. Meiotic DSB can be repaired by two major alternative pathways, which generate either crossing-over (CO) or non-crossing-over (NCO) products. The choice between the two repair pathways is tightly controlled to ensure sufficient and accurate CO formation. The chromatin environment could play a crucial role in this process that has not been elucidated yet. Little information is available about the importance of chromatin factors for meiotic recombination. The aim of my PhD was to study chromatin factors necessary for chromatin dynamic during meiotic recombination. I have shown that CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) and Hir (Histone Regulator), two chaperone proteins that are able to incorporate histones into chromatin, associate with DSB sites during meiotic recombination. CAF-1 and Hir deletion have no effect on the outcome of meiosis and CO formation. However, by genome-wide recombination studies, I have observed that the absence of CAF-1 histone chaperone results in a slight decrease in CO interference. The result suggests that CAF-1 could be one of the factors regulating DNA repair during meiotic recombination. Finally, I have also studied another H3/H4 chaperone, Asf1 (Anti-silencing Function1). Asf1 deletion gives rise to a defect in meiotic progression and spore formation. This work helps to better understand the impact of chromatin on meiotic repair and the role of chromatin assembly factors.

Le gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) a été identifié en 1989. Vingt-cinq ans après, les mécanismes contrôlant sa fine expression, sont encore mal compris. Bien qu’environ 1980 mutations aient été découvertes, il reste des patients pour qui le génotype n’a pas été établi. Les éléments de régulation, décrits au sein du promoteur, ne peuvent à eux seuls expliquer cette complexe régulation tissu spécifique. Des éléments de régulation à distance, en cis ou en trans, sont certainement impliqués dans ce contrôle d’expression. L’objectif de ce projet est de mieux décrypter les mécanismes de régulation à distance du gène CFTR en identifiant des séquences régulatrices éloignées, mais pouvant, par des mécanismes de repliement, interagir spécifiquement avec celui-ci. Afin d’étudier ces contacts chromosomiques, nous avons, dans un premier temps, mis au point la technique de Capture de Conformation Chromosomique (3C). Suite à cette technique, nous sommes passés à une approche à plus grande échelle, la technique de Copie Conforme de 3C (5C), qui permet de mesurer des milliers d’interactions chromatiniennes en une analyse. L’organisation spatiale d’une région d’environ 790 kb recouvrant le gène CFTR, a été analysée dans des cultures primaires de cellules épithéliales nasales, exprimant le gène CFTR et des fibroblastes de peau, ne l’exprimant pas ou très peu. Les interactions entre les régions de ce locus et le promoteur CFTR ont été étudiées par séquençage nouvelle génération sur Ion PGM™. Nous avons comparé ces conformations chromatiniennes afin d’identifier des éléments de régulation spécifiques d’une expression de CFTR. Notre approche a été validée par l’identification de régions régulatrices précédemment décrites. De plus, nous avons mis en évidence de nouveaux contacts chromatiniens avec le promoteur CFTR. Ces régions semblent fortement impliquées dans la régulation de l’expression du gène CFTR. Grâce à la technique 3C et ses variantes, l’identification de nouvelles mutations à distance du gène pourraient expliquer des dérégulations de son expression. / The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene was identified in 1989. Twenty five years later, the regulatory mechanisms controlling its complex expression are still not fully understood. Although, almost 1980 mutations have been identified, many cases of cystic fibrosis or CFTR Related Disorders remain still of unknown origin. The promoter which binds transcription factors and drives some aspects of CFTR gene expression, cannot alone account for tissue specific control. This implicates other distal cis- or trans-acting elements in cell-type-specific regulation of CFTR expression. The aim of our project is to study long-range regulatory elements of the CFTR gene, which could interact specifically with the CFTR promoter by tri-dimensional folding mechanism. We first developed the Chromosome Conformation Captures (3C) approach to map these chromosomal contacts. Subsequently, we enhanced our analyses with a high-throughput adaptation of 3C: the 3C-Carbon Copy (5C) technology. This approach allows the analysis of millions chromatin interactions. Thus, we have analyzed the spatial organization of a ～790kb region, comprising the CFTR gene, in primary nasal epithelial cells, which express the gene, and primary skin fibroblasts, which do not express the gene. Interactions between this locus and the CFTR promoter have been analysed by next generation sequencing with the Ion PGM™. We have compared chromatin conformation in order to identify uncharacterized regulatory elements that act especially in CFTR-expressing cells. Our approach has been validated by the identification of previously characterized regulatory elements. Moreover, we identify novel chromatin contacts of the CFTR promoter with chromosomal regions, which could potentially be involved in CFTR gene expression regulation. Thanks to 3C and 3C-derivated analyses, we could identify new possible mutations far from the gene, which may lead to its dysfunction by modifying the chromatin conformation or regulatory elements.

La protéine INT6/EIF3E codée par le gène mammalien correspondant au site d’intégration du rétrovirus Mouse Mammary tumor virus (MMTV) n°6 (int-6), a été impliquée dans le cancer du sein chez la souris et l’homme. Malgré qu’INT6 soit une sous-unité du facteur d’initiation de la traduction eIF3, elle n’est pas essentielle pour la traduction générale mais pour l’expression d’ARNm spécifiques tel qu’il a été montré pour la traduction d’ARNm histones. Elle a aussi été impliquée dans la réplication d’ADN en stabilisant le facteur de licence de la réplication MCM7, dans la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) et dans la voie du “nonsense-mediated mRNA decay“ (NMD). Par rapport à cette dernière activité j’ai étudié si INT6 pouvait spécifiquement intervenir au niveau de l’homéostasie des télomères en agissant sur les transcrits TERRA. La délétion d’INT6 par une approche d’ARN interférence révèle une augmentation des niveaux des ARN télomériques TERRA qui est dépendante du chromosome et du type cellulaire. Malgré qu’INT6 soit un facteur du NMD, elle n’agit pas sur la demi-vie des TERRA. Les expériences de DNA-FISH ont montré une augmentation des dommages aux télomères (TIF) dans les cellules en absence d’INT6. Les aberrations observées correspondent à des pertes de télomères (TFE) et des signaux multi-télomériques (MTS). Par la technique de digestion de la chromatine à la nucléase micrococcale, nous avons retrouvé une plus rapide accumulation des mono-nucléosomes aux télomères en absence d’INT6, suggérant un rôle dans la conformation de la chromatine télomérique. Ces résultats mettent en évidence INT6 comme un nouveau facteur régulateur de la stabilité des télomères. / The INT6/EIF3E protein encoded by the mammalian integration site 6 (int-6) gene, has been implicated in mouse and human breast carcinogenesis. Although, INT6 is a subunit of the eIF3 translation initiation factor, it is not essential for bulk translation but for specific mRNAs expression as histone mRNA translation. It has also been implicated in DNA replication by stabilizing the DNA replication licensing factor MCM7, in DNA Damage Response (DDR) and in the Nonsense mRNA Decay (NMD) pathway. Relative to the latter activity, I investigated whether INT6 can specifically meddle in telomere homeostasis by acting on TERRA transcripts. Deletion of INT6 by RNA interference approach revealed an increase in the telomeric RNA TERRA levels which is depending on the chromosome and cellular type. Although INT6 is a NMD factor, it doesn’t change TERRA steady-state. DNA-FISH experiments showed an increase in Telomere Induced Foci (TIFs) in INT6 depleted cells. These aberrations correspond to Telomere Free Ends (TFE) and Multi-Telomeric signals (MTS) which implicate INT6 in DDR. By means of Microccocal Nuclease (MNase) mapping assay, we found a rapid accumulation of telomeric mono-nucleosomes in INT6-depleted cells, suggesting a role in telomeric chromatin structure. These findings evidenced that INT6 is a novel key player in telomere stability.

Pour faciliter l’initiation de la transcription par l’ARN Polymérase II, le complexe co-activateur de la transcription SAGA possède une activité d’acétylation des histones H3 et une activité de déubiquitination des histones H2B, catalysée chez l’homme par l’enzyme USP22. Mon travail de thèse a porté sur l’étude de la régulation de cette activité de déubiquitination.Au sein de SAGA, USP22 interagit fortement avec trois protéines pour former un module structural appelé module de déubiquitination (DUBm). Nous avons montré que la formation d’un tel module était requise pour activer USP22. D’autre part, deux sous-unités du DUBm humain, ATXN7 et ATXN7L3, contiennent un domaine SCA7. Nos résultats montrent que le repliement structural adopté par ces deux doigts de zinc n’avait pas encore été décrit. Nous avons démontré que le domaine SCA7 de ATXN7 peut interagir avec un nucléosome in vitro et que cette interaction participe à la régulation fine de l’activité de déubiquitination de SAGA. Nous proposons qu’en interagissant avec le nucléosome, le domaine SCA7 de Sgf73 ou de ATXN7 pourrait positionner le DUBm de façon optimale par rapport à son substrat. / The SAGA complex is one of the most studied transcriptional co-activator complexes. To facilitate transcription by RNA Polymerase II, SAGA presents a modular organization and harbours two enzymatic activities. In human cells, these two enzymes are called GCN5 and USP22 and they can respectivelly acetylate histones H3 and deubiquitinate histones H2B. During my PhD thesis, I have worked on the regulation of SAGA deubiquitination activity. In the SAGA complex, USP22 interacts strongly with three other subunits to form a structural and functionnal module, named deubiquitination module (DUBm). We have shown that the free recombinant USP22 enzyme is not active, but that the formation of a stable DUBm triggers a strong stimulation of USP22 catalytic activity. Secondly, in human cells, two subunits of the DUBm, ATXN7 and ATXN7L3, contain a domain, called SCA7, that is not found in any other protein. Our results show that the new structural fold adopted by these two domains is specific to these zinc-fingers. These two SCA7 domains share a common structural heart, but their atomic structures reveal also differences, especially in the spatial organization of secondary structure elements. Indeed, we have shown that ATXN7 SCA7 domain can interact in vitro with a nucleosome which is not the case of ATXN7L3 SCA7 domain. Finally, I could show that in vivo the SCA7 domain of Sgf73, the ortholog of ATXN7 has a role in fine tunning SAGA deubiquitination activity. We hypothesize that the interaction between a nucleosome and the SCA7 domain of ATXN7 or Sgf73 would regulate SAGA deubiquitination activity by an optimal positionning of the module to its substrate.

La difficulté et la nécessité d'étudier l'organisation dynamique du génome ont poussé ces dernières années les expérimentateurs et les théoriciens à collaborer au développement de modèles théoriques de l'architecture chromosomique. Notre travail s’inscrit dans cet effort. En collaboration avec David Holcman et Assaf Amitaï (ENS Paris), nous avons développé une nouvelle méthode d'analyse de la mobilité de sites chromosomiques marqués avec des protéines fluorescentes. Notre analyse a permis de comparer la mobilité des différents sites du génome afin de comprendre comment l’organisation du noyau influe sur la mobilité de la chromatine, puis dans un second temps nos résultats ont permis d’établir un lien entre les mécanismes de réparation de l’ADN et la mobilité. Il a déjà été prouvé récemment (K. Bloom, 2013) que la mobilité des chromosomes est limitée par leur ancrage au SPB via leur centromère, mais l’étude de l'impact de l’ancrage télomérique sur la mobilité des chromosomes méritait d’être approfondi. Contrairement à ce qui est communément admis, nos résultats ont montré que les télomères ne sont pas fortement ancrés à la membrane nucléaire, de plus il existe une grande variabilité de leur mobilité cellule à cellule. Dans la plupart des cellules, l'interaction télomérique avec la membrane nucléaire est en effet suffisamment forte pour modifier la localisation des locus sub-télomériques mais trop faible pour impacter sa mobilité. Nos résultats ont également montré que les loci sub-télomériques ont une mobilité supérieure à celle des locus situés au milieu du bras chromosomique. Dans les cellules mutantes, la perte de l'intégrité du chromosome lors de l'induction d'une CDB entraîne l'apparition d’extrémités libres sur la chromatine. De manière similaire aux locus sub-télomériques, les extrémités libres des CDB présentent une mobilité plus élevée que les CDB du chromosome dont l'intégrité est préservée, ceci qui pouvant s'expliquer par un degré de liberté de mouvement supérieur des extrémités de la chromatine. Les cassures double-brin de l’ADN sont parmi les lésions les plus toxiques. La non- réparation ou une mauvaise réparation de ces cassures conduit à la mort cellulaire ou à des réarrangements chromosomiques qui sont à l’origine du développement de cancers chez l’homme. Lorsque que la cassure de l’ADN se produit la molécule d’ADN porteuse de l’information génétique est rompue sur les deux brins mais les deux extrémités de la cassure sont maintenues ensemble ce qui préserve l’intégrité du chromosome. En effet l’observation des extrémités de la cassure par microscopie grâce à des tags fluorescents situés de chaque côté de la cassure montre que celles-ci sont maintenues à proximité l’une de l’autre. Il existe donc un ou plusieurs mécanismes permettant à la cellule de préserver l’intégrité du chromosome. Des travaux précédents ont identifié le complexe MRX comme étant l’un des acteurs essentiels de ce mécanisme. Nos travaux ont permis d’identifier une seconde voie, complémentaire de MRX permettant d’assurer le maintien de l’intégrité chromosomique. Nous avons aussi pu observer que nos observations statiques concernant la proportion de cellules présentant des extrémités séparées était en réalité à l’échelle de la cellule le résultat d'un processus dynamique, les extrémités des chromosomes pouvant au cours du temps plusieurs fois se retrouver puis se séparer à nouveau. Afin de mieux comprendre les mécanismes de cohésion entre extrémités, nous avons pensé qu'il était essentiel de comprendre l'impact du recrutement des cohésines sur l'organisation 3D de la chromatine autour de la cassure. En effet, le recrutement de cohésines sur des dizaines de kilobases autour de la rupture est susceptible de générer l'assemblage d'une grande structure capable de modifier l'organisation 3D du chromosome à grande échelle. / The difficulty and the need to study the dynamic organization of the genome have pushed in recent years, experimenters and theorists to collaborate in the development of theoretical models of chromosomal architecture. Our work is a part of this effort. In collaboration with David Holcman and Assaf Amitaï (ENS Paris), we developped a new method of data analysis for the study of chromosomal sites tagged with fluorescent proteins. This new method allows us to extract from miscroscopy analysis a parameter named Kc characterizing constraints that restrict the mobility of the chromosomal locus. This new analysis was used to compare the mobility of different sites in the genome in order to understand how organization of the nucleus impacts chromatin mobility with the final aim of understanding the impact of this mobility on the regulation of DNA repair mechanisms. It was already proven recently (K. Bloom, 2013) that mobility of chromosomes is constrained by their anchoring to SPB by their centromeres, but little was known about the impact of telomeric sequences to nuclear membrane on chromosome mobility. Contrary to what is commonly accepted, our results showed that telomeres are not strongly anchored to the nuclear membrane. Within a cell population, it exists a high variability in telomere mobility, indeed most of the cells the telomeric interaction with the nuclear membrane is indeed strong enough to change the location of sub-telomeric loci but too weak to impact its mobility. Our results also showed that sub-telomeric loci have a higher mobility than loci located in the middle of the same chromosome arm. In mutant cells the loss of chromosom integrity upon the induction of a double-strand break leads to the apparition chromatin free extremities. Similarly to sub-telomerics loci, DSBs free extremities exhibit a higher mobility than DSBs in chromosome with a preserved integrity. In summary our study has shown that free ends of a chromatin fiber have a higher mobility than other monomers in the chain. This higher mobility is due to the higher level of freedom that chromatin extremities have. When DNA double strand break (DSB) is generated, the chromosome ends should become physically totally dissociated from one to another, making ensuing repair difficult. To overcome this dramatic event, the DNA damage response (DDR) takes in charge the implementation of a protein bridge that holds the two chromosome ends together and so preserve its integrity. In S. cerevisiae the MRX complex was already known for playing critical functions in early DSB extremities tethering. Several studies showed that a single DSB induces the formation of a ≈100 kb cohesin domain around the lesion. Our study suggests the late role played by cohesins in the emergence of an intra-chromosomal cohesive structure capable to maintain chromosomal integrity. The way of DSB extremities cohesion is established, is consistent with what is published on the recruitment of cohesins at DSBs. Our study also highlight the dynamical behavior of DSB extremities at the cell scale. Indeed once DSB extremities are separated, they alternate during several hours between a tethered and a separated state. We also analysed the impact of cohesins recruitment at DSBs at the chromosome scale. Our results establish a positive correlation between the level of cohesins loaded on the chromosome and the level of folding of the chromatin fiber. The analysis of the chronology of events leading to the preservation of chromosomal integrity upon DSB suggests that chromatin has an intrinsic property (not related to DNA damage response) preserving its integrity despite the apparition of DSBs. This property could potentially be due to short-range inter-nucleosomal interactions or to the presence of secondary structures formed by cohesines in the interphase genome. All these hypothesis should be further tested experimentally.

Le PTGS (post-transcriptional gene silencing) est un mécanisme de défense qui cible les acides nucléiques invasifs d’origines endogènes (transposons) ou exogènes (pathogènes, transgènes). Des mutations dans les gènes JMJ14 et NAC52 ont été isolées lors d’un crible génétique visant à identifier des mutants déficients en PTGS. JMJ14 code une histone déméthylase ciblant la lysine 4 bi- ou tri-méthylée de l’histone H3, tandis que NAC52 code un facteur de transcription. Ces deux protéines forment un complexe qui régule la transcription de centaines de gènes endogènes. Toutefois, le rôle de ce complexe chromatinien dans l’expression des transgènes et surtout dans le PTGS reste incompris. JMJ14 interagit avec NAC52 mais aussi avec une protéine de type guanine exchange factor de la famille RCC1. Des mutations dans l’un ou l’autre des membres du complexe RCC1-JMJ14-NAC52 réduisent la transcription des transgènes. JMJ14 se fixe au promoteur de façon indépendante de NAC52, tandis que NAC52 a besoin de JMJ14 pour se fixer à la région transcrite. Toutefois, JMJ14 et NAC52 ne semblent pas requis pour la transcription proprement dite. En effet, un niveau normal de transcription est restauré chez le double mutant jmj14 drm2, indiquant que le rôle du complexe RCC1-JMJ14-NAC52 semble être d’empêcher la méthylation de novo du promoteur par DRM2.L’effet des mutations jmj14 et nac52 sur la transcription des transgènes ne peut expliquer leur effet sur certaines formes de PTGS. En effet, les mutations jmj14 et nac52 n’affectent pas le PTGS induit constitutivement. Par contre, elles empêchent la systémie du PTGS induit localement. Des mutations dans le gène SPCL45 codant une Serine Carboxy Peptidase-Like qui interagit avec NAC52, mais pas JMJ14, ont le même effet. En revanche, la mutation rcc1 n’affecte pas la systémie du PTGS, suggérant que c’est au sein d’un complexe JMJ14-NAC2-SPCL45 que JMJ14 et NAC52 contrôlent le PTGS systémique. Ce complexe pourrait agir directement sur la chromatine du transgène pour permettre d’enclencher le PTGS en réponse à la perception du signal systémique, ou indirectement en contrôlant l’expression d’un gène endogène codant une protéine régulant la systémie du PTGS. Afin de mieux comprendre le rôle de JMJ14 dans la systémie du PTGS, un crible génétique visant à isoler des suppresseurs de la mutation jmj14 a été réalisé. Seize mutants correspondants à sept gènes codant des protéines ayant un rapport avec la chromatine et une action antagoniste à JMJ14 ont été caractérisés. Les mutations dans ces sept gènes pourraient supprimer l’effet de jmj14 en augmentant la transcription du transgène cible et donc la quantité du signal systémique de PTGS. Un 17ème mutant pourrait quant à lui affecter qualitativement le signal systémique de PTGS ou la perception du signal dans les cellules qui le reçoivent. Le gène correspondant reste à identifier. / Post-transcriptional gene silencing (PTGS) is a defense mechanism that targets invading nucleic acids from endogenous (transposons) or exogenous (pathogens, transgenes) origins. Mutations in JMJ14 and NAC52 have been retrieved from a genetic screen aiming to identify PTGS deficient mutants. JMJ14 encodes an histone demethylase targeting the bi- or tri-methylated lysine 4 of histone H3, while NAC52 encodes a transcription factor. Both act in a complex that regulates the transcription of hundreds endogenous genes. However, the function of this chromatin complex in transgene expression and in PTGS is not known. JMJ14 interacts with NAC52 but also with a guanine exchange factor of the RCC1 family. Mutations in any member of the RCC1-JMJ14-NAC52 complex reduce transgene transcription. JMJ14 binds to the transgene promoter independently of NAC52, whereas NAC52 requires JMJ14 to bind on the transcribed region. However, JMJ14 and NAC52 do not seem to be required for transcription itself. Indeed, a wild-type level of transcription is restored in the jmj14 drm2 double mutant, suggesting that the complex RCC1-JMJ14-NAC52 prevents de novo DNA methylation of the promoter by DRM2. The effects of jmj14 and nac52 mutations on transgene transcription cannot explain their specific effect on some forms of PTGS. Indeed, jmj14 and nac52 do not affect constitutively-induced PTGS, but prevent the systemic spreading of locally-induced PTGS. Mutations in SCPL45, encoding a Serine-Carboxy Peptidase-Like that interacts with NAC52, but not JMJ14, have the same effect. In contrast, rcc1 does not affect the systemic PTGS, suggesting that a JMJ14-NAC52-SCPL45 complex is involved in the control of systemic PTGS. This complex could act directly on transgene chromatin to trigger PTGS in response to the PTGS signal, or indirectly by controlling the expression of an endogenous gene encoding a protein regulating systemic PTGS. To better understand the function of JMJ14 in systemic PTGS, a genetic screen aiming to identify suppressors of jmj14 have been performed. Sixteen mutants corresponding to seven genes encoding proteins related to chromatin and having an antagonist function to JMJ14, have been characterized. Mutations in theses seven genes could suppress jmj14 by increasing transgene transcription and consequently the quantity of the PTGS systemic signal. A seventeenth mutant could have a qualitative effect on the PTGS systemic signal or could affect the perception of this signal in recipient cells. The corresponding gene remains to identify.