Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La régulation de la dynamique des chromosomes dicte la finalité de nombreux processus, tels la transcription, la réparation, la réplication et la recombinaison de l'ADN. Ce contrôle s'exerce notamment par la modification de la chromatine, un assemblage nucléoprotéique responsable de l'organisation de l'information génétique à l'intérieur du noyau des cellules eucaryotes. La chromatine constitue une plateforme dynamique et active où l'intégration de multiples événements de signalisation s'effectue. De ce fait, elle est porteuse d'une information épigénétique cruciale à l'homéostasie de la cellule et des organismes. Les complexes multiprotéiques pouvant modifier ou remodeler la structure de la chromatine sont au cœur de cette régulation. Leur caractérisation biochimique et fonctionnelle est donc primordiale à la compréhension des fonctions nucléaires. Une des modifications les mieux caractérisées est l'acétylation post-traductionnelle des queues N-terminales des histones, protéines structurales majeures de la chromatine. Chez Saccharomyces cerevisiae, le complexe histone acétyltransférase NuA4, dont l'activité catalytique est portée par la protéine Esal, est le seul de ce type à être essentiel à la viabilité de la levure. Cet assemblage de 13 sous-unités cible les extrémités des histones H2A et H4 et agit comme co-activateur transcriptionnel ainsi que co-facteur dans la réparation des cassures double brin de l'ADN. Le but premier mes études doctorales était de déterminer si le complexe NuA4 était conservé chez l'humain. Nous avons donc entrepris la purification et la caractérisation biochimique et fonctionnelle de ce complexe à partir de cellules humaines en culture. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence l'étonnante conservation de NuA4 chez les eucaryotes, en plus d'observer l'évolution convergente de deux complexes aux activités distinctes, réunis en une seule entité chez les métazoaires. L'identification des différentes protéines constituant ces complexes nous a amené à caractériser l'environnement moléculaire d'une famille de suppresseurs de tumeur impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire et agissant comme co facteurs de p53; la famille « inhibitor of growth ». Ceci nous a permis d'identifier trois nouveaux complexes histone acétyltransférase chez l'humain. De plus, nous avons mis en évidence leur rôle essentiel dans le processus de réplication de l'ADN.

En réponse à des signaux environnementaux, la cellule module son programme transcriptionnel afin de mener à une expression spatio-­temporelle adéquate des gènes. L’orchestration d’une telle adaptation repose entre autres sur la séquence primaire du génome, son organisation au sein de la chromatine, ainsi que sa structure tridimensionnelle au sein du noyau. De plus, de nombreux régulateurs permettent d’intégrer ces différents niveaux de régulation afin de contrôler l’activité de l’ARN polymérase II. Dans ce contexte, le complexe cohésine et son facteur de charge sur l’ADN, NIPBL, jouent un rôle clé dans l’interconnexion fonctionnelle entre l’organisation 3D du génome et la transcription. En effet, ces facteurs modulent l’activation de la transcription en rapprochant des régions enhancers de promoteurs et participent à la formation de domaines d’interactions chromosomiques. Par ailleurs, des mutations de NIPBL et du complexe cohésine sont associées au Syndrome de Cornelia de Lange (CdLS), une pathologie caractérisée par une altération de l’expression des gènes. Toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la transcription par NIPBL et cohésine sont encore méconnus. L’objectif général de mon projet de doctorat est de définir le rôle de NIPBL et du complexe cohésine dans la régulation du lien entre la topologie du génome et le contrôle de l’expression des gènes. Dans un premier temps, nous montrons que les gènes dérégulés dans le CdLS sont préférentiellement organisés au sein de communautés de gènes, des structures formées par des interactions d’éléments régulateurs non codants ainsi que de gènes dans l’espace chromosomique tridimensionnel. Au sein de cette organisation, les gènes affectés par des mutations de NIPBL ou de la sous-­unité SMC1A du complexe cohésine sont retrouvés positionnés à portée de régions occupées par cohésine et NIPBL et interagissent par l’intermédiaire de contacts promoteur-­promoteur. Dans un second temps, nous présentons des données suggérant un rôle de cohésine dans la régulation de l’initiation de la transcription et un rôle de NIPBL dans le contrôle de la relâche de la pause. Enfin, nous apportons des évidences d’une fonction de NIPBL et cohésine dans la régulation du niveau basal et de l’activation des gènes dont l’expression est stimulée par des hormones. Dans leur ensemble, ces travaux contribuent à l’amélioration des connaissances sur la contribution de l’architecture des chromosomes aux mécanismes généraux de la régulation de la transcription. / In response to environmental signals, the cell modulates its transcriptional program in order to carry out appropriate spatiotemporal gene expression. The orchestration of this adaptation relies on the primary sequence of the genome, its organization into chromatin, and its tridimensional structure inside the nucleus. Moreover, multiple regulators integrate these different regulation levels in order to control the activity of RNA polymerase II. In this context, the cohesin complex and its DNA loader, NIPBL, play a pivotal role in the functional interconnection between the 3D organization of the genome and transcription. Indeed, these factors modulate the activation of transcription by bringing enhancers and promoters into close proximity and participate in the formation of chromosome interaction domains. Moreover, mutations in NIPBL and the cohesin complex are associated with the Cornelia de Lange Syndrome (CdLS), a pathology characterized by gene expression changes. However, the exact molecular mechanisms involved in the regulation of transcription by NIPBL and cohesin are still not understood. The general aim of my doctoral research is to define the role of the cohesin complex and NIPBL in the regulation of the connection between genome topology and gene expression control. First, we show that genes deregulated in CdLS are preferentially organized into connected gene communities, structures emerging from the interactions of noncoding regulatory elements and genes in the three-­dimensional chromosomal space. Within this organization, genes affected by mutations in NIPBL and the SMC1A subunit of the cohesin complex are positioned within reach of NIPBL-­ and cohesin-­occupied regions through promoter-­ promoter interactions. In addition, we present data suggesting a role of the cohesin complex in the initiation of transcription and a role of NIPBL in the control of pause release. Finally, we show evidence of a function of NIPBL and cohesin in the regulation of the basal level and the activation of genes stimulated by hormones. Ultimately, this work aims to gain insight into the contribution of the architecture of chromosomes to the general mechanisms of transcriptional regulation.

Le génôme des cellules eucaryotes est condensé au sein d'une structure complexe hiérarchiquement organisée : la chromatine. La chromatine est composée d'ADN, de protéines histone et non-histone. Cette thèse a pour but d'étudier le rôle de la chromatine dans la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN (DDR) par les méthodologies de génomique fonctionnelle et de protéomique. Nous avons tout d'abord analysé les modifications post-traductionnelles (PTM) des histones dans le cadre des pontages inter-brins (ou "Interstrand Crosslinks", ICL), type particulier de lésions de l'ADN, en choisissant le modèle de l'Anémie de Fanconi (FA). Ceci a été réalisé grâce aux techniques de protéomique quantitative SILAC (Stable Isotope Labeling of Amino acid during Cell culture) et de spectrométrie de masse (MS). Nous avons ainsi réussi à identifier et à quantifier de nombreuses PTMs dans les histones H3 et H4, et à démontrer que certaines de ces PTM sont dépendantes d'une voie fonctionnelle de la signalisation de FA. Nous avons également approfondi l'étude des DDR dans les cellules de FA par une approche de génomique fonctionnelle. Pour cela, nous avons analysé le profil l'expression d'enzymes associées à l'acétylation et à la méthylation des histones. Nos résultats suggèrent l'existence de corrélations entre le profil d'expression de ces enzymes et les PTMs des histones. Des études complémentaires sont nécessaires en vue de confirmer ces corrélations. Nous avons également comparé le transcriptome de deux lignées cellulaires de FA (mutée en FANCC et corrigée en FANCC) après induction de dommages à l'ADN. Afin de différencier les changements spécifiquement associés à la voie de signalisation de FA en réponse aux ICL de l'ADN des réponses plus générales aux dommages de l'ADN, nous avons inclus des cellules traitées par rayonnement ionisant. En réalisant une analyse d'interactions factorielles, nous avons pu identifier une réponse transcriptionnelle aux dommages de l'ADN nécessitant une voie fonctionnelle de la signalisation de FA. Nous avons également tenté de pallier aux limitations rencontrées dans l'analyse des PTMs des histones. En effet, les PTMs des histones que nous avons identifiées représentent l'ensemble des modifications, c'est-à-dire les PTMs concernant les histones se trouvant immédiatement à proximité du site du dommage et en relation directe avec celui-ci, et les PTMs se trouvant à distance du dommage et pouvant ne pas être en relation directe avec celui-ci. Les approches courantes pour identifier les PTMs se trouvant à des loci particuliers sont basées sur l'immunoprécipitation classique de la chromatine où l'utilisation de formaldéhyde altère les protéines, ce qui en rend impossible l'analyse par MS. Nous avons proposé une nouvelle méthodologie basée sur la biotinylation expérimentale d'histones situées à proximité d'une protéine particulière, suivie de la purification des nucléosomes contenant ces histones biotinylées. Contrairement àl'immunoprécipiatation classique de la chromatine, cette méthode n'induit pas d'altération des protéines, permettant ainsi de purifier les histones à partir d'un locus spécifique et d'analyser à grande échelle leurs PTMs par MS. Cette approche permet aussi de suivre dans le temps les PTMs d'une fraction des histones juste après leur biotinylation. Enfin, elle présente l'avantage de pouvoir étudier le profil des PTMs de différents états fonctionnels de la chromatine grâce à l'utilisation de variants d'histones. / In eukaryotic cells, the genome is packed into chromatin, a hierarchically organized complex composed of DNA and histone and nonhistone proteins. In this thesis we have addressed the role of chromatin in cellular response to DNA damage (DDR) using various methodologies encompassing functional genomics and proteomics. First, we analyzed histone post-translational modifications (PTM) in the context of specific kind of DNA lesions (ICL-Interstrand Crosslinks) in Fanconi anemia using quantitative proteomics methodology, SILAC (Stable Isotope Labeling of Amino acids during Cell Culture). Using mass spectrometry (MS), we have successfully identified and quantified a number of histone PTM marks in histone H3 and H4, mainly acetylations and methylations,which have shown dependence upon functional FA-pathway. As a next step, we applied a functional genomics approach to study DDR in FA cells. In this analysis we first monitored the expression profile of histone modifying enzymes related to histone acetylations and methylations. Our results suggest some correlations between histone PTMs and gene expression of histone modifying enzymes, although conclusive evidence warrants further investigations. Next, we analyzed the total transcriptome after DNA damage induction in FA mutant and wild type cells. We also included in this analysis IR irradiation, in an attempt to dissociate more generic DDR from more specific changes that are associated with the role of FA pathway to the DNA ICLs. By performing a factorial interaction analysis, we were able to isolate the part of transcriptional response to DNA damage that was requiring functional FA pathway, as well as the genes that were sensitized to DNA damage by the inactivation of FA pathway. In the final part of the thesis, we attempted to solve one of the limitations that we encountered in the histone PTM analysis. The current approaches used to study histone PTMs from particular loci involves classical chromatin immunoprecipitation, which due to involvement of formaldehyde crosslinking render the protein part mostly unavailable for MS-based proteomics. We have proposed a novel methodology, which is based upon the biotin tagging of histones proximal to a protein of interest and subsequent purification of nucleosomes carrying the tagged histone. This methodology does not involve any crosslinking, enabling us to purify histones from specific loci, and subject them to large scale MS-based histone PTM analysis. A time dimension can also be added to our approach, as we can follow the modification status of particular fraction of histones once they get biotinylated. Another advantage is the use of alternate variant histones, which allows us to study the PTM profile of different functional states of chromatin. This methodology certainly has an edge on current techniques to study histone PTMs pattern associated with a particular protein of interest or with particular chromatin state.

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Les maladies à expansion de triplets nucléotidiques situés dans la région codante, telles que la maladie de Huntington, sont des maladies où les gènes en questions possèdent un nombre de répétitions trinucléotidiques anormalement élevé et inversement corrélé avec l'âge d‟apparition des symptômes. Plusieurs de ces maladies démontrent une anticipation paternelle, où un ajout de répétitions trinucléotidiques a lieu pendant la spermiogenèse, mais les étapes et les mécanismes impliqués sont encore mal compris. Or, la spermiogenèse est caractérisée par un remodelage drastique de la chromatine, où les histones sont ultimement remplacées par les protamines afin de compacter et protéger davantage le matériel génétique. Cette transition implique aussi un changement topologique majeur qui mène à une accumulation de superenroulement négatif qui est éliminé par la topoisomérase 2[beta]. Pour identifier les étapes précises où l'extension trinucléotidique a lieu, j'ai développé une stratégie de séparation des spermatides en utilisant la cytométrie en flux, ce qui m'a permis d'obtenir quatre populations, soit les spermatides aux étapes 1 à 9, 10 à 12, 13-14 et 15-16. J'ai appliqué cette stratégie sur un modèle de souris transgéniques pour la maladie de Huntington, ce qui a permis de démontrer par PCR que l'extension trinucléotidique des répétitions CAG a lieu à la fin du remodelage de la chromatine, soit à l'étape 14. Afin d‟élucider le mécanisme d‟extension trinucléotidique, j'ai utilisé une stratégie in vitro, basée sur l'incubation d‟extraits nucléaires actifs de spermatides avec un plasmide contenant des répétitions CAG. Cette stratégie a démontré que le superenroulement négatif libre, tel que retrouvé pendant le remodelage de la chromatine, est capable d'induire des structures secondaires dans les répétitions CAG, ce qui entraîne une cascade d‟événements menant à l'extension trinucléotidique. J'ai validé ce processus en inhibant aussi les topoisomérases de type 2 qui sont responsables d'éliminer le superenroulement. Finalement, j‟ai démontré que la protamination de l‟ADN, telle qu'observée dans les spermatides, accentue l'accumulation de stress torsionnel aux répétitions CAG, ce qui favorise leur extension. Mes travaux sur le stress torsionnel lors de la protamination suggèrent une nouvelle source potentielle d'instabilité trinucléotidique, nécessitant une caractérisation additionnelle. Cette source d'instabilité, qui est spécifique au mâle, jouerait un rôle majeur dans l'anticipation paternelle des maladies trinucléotiditiques. / Abstract : Trinucleotidic diseases, such as the Huntington disease, are genetic diseases characterized by abnormally long trinucleotidic repeats within a specific gene, which are inversely correlated with the age of onset of symptoms when within exons. Many trinucleotidic diseases display paternal anticipation, where trinucleotidic repeats are added during spermiogenesis, without any details on the mechanism or the steps involved. Interestingly, spermiogenesis is characterized by a drastic chromatin remodeling, where histones are ultimately replaced by protamines in order to achieve greater compaction and protection of DNA. This transition also involves major topological changes, where accumulation of negative supercoils are eliminated by the topoisomerase 2[beta]. In order to identify the specific steps where trinucleotidic extension occurs, I have developed a strategy to separate spermatids from mice, using flow cytrometry. This allowed me to purify four distinct spermatids population, consisting of steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16 spermatids. The sorting strategy was used on a transgenic mouse model of the Huntington disease, which allowed me to determine, using PCR, that CAG extension occurs at the end of chromatin remodeling, more specifically at step 14. The mechanism of extension was investigated using an in vitro approach, based on the incubation of active nuclear extracts from spermatids with a plasmid containing CAG repeats. Using this strategy, I showed that free negative supercoils, as observed during chromatin remodeling, may lead to secondary structures, and more specifically hairpins in trinucleotidic repeats, which ultimately result in trinucleotidic extension. This hypothesis was validated by inhibiting enzymes such as type 2 topoisomerases, since they are responsible for negative supercoils removal. Moreover, I showed that DNA protamination, as observed in spermatids, may increase torsional stress at CAG repeats and leads to expansion. In conclusion, this work suggest that torsional stress induced by protamination of DNA could be a new potential source of trinucleotidic instability. Moreover, this male specific source of trinucleotidic instability could play a major role in paternal anticipation of trinucleotidic diseases.

La chromatine est un système de compaction de l’ADN jouant un rôle important dans la régulation de l’expression génique. L’acétylation de la chromatine provoque un relâchement de sa structure, facilitant le recrutement de facteurs de transcription. Inversement, des complexes histones déacétylases favorisent une structure compacte, réprimant l’expression de gènes. Un complexe HDAC, Rpd3S, est recruté par l’ARN polymérase II phosphorylée sur les régions codantes transcrites. Cette activité HDAC est stimulée par la déposition de la marque H3K36me générée par l’histone méthyltransférase Set2. Par approche génomique, en utilisant comme organisme modèle Saccharomyces cerevisiae, j’ai optimisé la méthode de ChIP-chip puis démontré que les sous unités Hos2 et Set3 d’un autre complexe HDAC, Set3C, étaient recrutées sur des régions codantes de gènes transcrits. De plus, Set3C est connu pour être recruté soit par H3K4me ou par la Pol II. La suite du projet portera sur le recrutement de Set3C qui semble similaire à Rpd3S. / Chromatin is a DNA compaction system and the main mecanism of gene expression regulation. Acetylation of histones loosens DNA compaction and thus facilitates the recruitment of transcription factors. By opposition, histone deacetylase (HDAC) complexes increase the compaction of chromatin and thus repress transcription. Rpd3S, a HDAC complex, is recruited to chromatin by interaction with a phosphorylated form of RNA polymerase II (Pol II) on actively transcribed genes and its activity is stimulated by the presence of the mark H3K36me mark. During my Master degree, I optimized ChIP-chip, using Saccharomyces cerevisiae as model organism, in order to investigate the localisation of two subunits (Hos2 and Set3) of another HDAC complex, Set3C. My datas demonstrate that Set3C subunits localized on actively transcribed genes, in a fashion similar to Rpd3S. Further, Set3C is known to be recruited either by Pol II or H3K4me suggesting that Set3C has a similar recruitment mechanism than Rpd3S. Future experiments in the laboratory will investigate the recruitment of Set3C.

La période de réceptivité endométriale chez l’humain coïncide avec la différentiation des cellules stromales de l’endomètre en cellules hautement spécifiques, les cellules déciduales, durant le processus dit de décidualisation. Or, on sait qu’une transformation anormale des cellules endométriales peut être à l’origine de pertes récurrentes de grossesses. LRH-1 est un récepteur nucléaire orphelin et un facteur de transcription régulant de nombreux évènements relatif à la reproduction et comme tout récepteur, son activation promouvoit l’activité transcriptionnelle de ses gènes cibles. Nous avons déjà montré que LRH-1 et son activité sont essentiels pour la décidualisation au niveau de l’utérus chez la souris et nous savons qu’il est présent dans l’utérus chez l’humain au moment de la phase de prolifération mais aussi de sécrétion du cycle menstruel, et que son expression augmente dans des conditions de décidualisation in vitro. Notre hypothèse est alors la suivante : LRH-1 est indispensable à la décidualisation du stroma endométrial, agissant par le biais de la régulation transcriptionnelle de gènes requis pour la transformation de cellules stromales en cellules déciduales. Afin d’explorer le mécanisme moléculaire impliqué dans la régulation transcriptionnelle effectuée par l’intermédiaire de ce récepteur, nous avons mis en place un modèle de décidualisation in vitro utilisant une lignée de cellules stromales de l’endomètre, cellules humaines et immortelles (hESC). Notre modèle de surexpression développé en transfectant les dites cellules avec un plasmide exprimant LRH-1, résulte en l’augmentation, d’un facteur 5, de l’abondance du transcriptome de gènes marqueurs de la décidualisation que sont la prolactine (PRL) et l’insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). En outre, la sous-régulation de ce récepteur par l’intermédiaire de petits ARN interférents (shRNA) abolit la réaction déciduale, d’un point de vue morphologique mais aussi en terme d’expression des deux gènes marqueurs cités ci-dessus. Une analyse par Chromatin ImmunoPrécipitation (ou ChIP) a démontré que LRH-1 se lie à des régions génomiques se trouvant en aval de certains gènes importants pour la décidualisation comme PRL, WNT 4, WNT 5, CDKN1A ou encore IL-24, et dans chacun de ces cas cités, cette capacité de liaison augmente dans le cadre de la décidualisation in vitro. Par ailleurs, des études structurelles ont identifié les phospholipides comme des ligands potentiels pour LRH-1. Nous avons donc choisi d’orienter notre travail de façon à explorer les effets sur les ligands liés à LRH-1 de traitements impliquant des agonistes et antagonistes à notre récepteur nucléaire. Les analyses par q-PCR et Western blot ont montré que la modulation de l’activité de LRH-1 par ses ligands influait aussi sur la réaction déciduale. Enfin, des études récentes de Salker et al (Salker, Teklenburg et al. 2010) ont mis en évidence que les cellules stromales humaines décidualisées sont de véritables biocapteurs de la qualité embryonnaire et qu’elles ont la capacité de migrer en direction de l’embryon. La série d’expériences que nous avons réalisée à l’aide de cellules hESC placées en co-culture avec des embryons de souris confirme que la migration cellulaire est bien dirigée vers les embryons. Cette propriété quant à l’orientation de la migration cellulaire est notoirement diminuée dans le cas où l’expression de LRH-1 est déplétée par shRNA dans les hESC. Nos données prouvent donc que LRH-1 régule non seulement la transcription d’un ensemble de gènes impliqués dans le processus de décidualisation mais agit aussi sur la motilité directionnelle de ces cellules hESC décidualisées in vitro. / The period of endometrial receptivity in humans coincides with the differentiation of endometrial stromal cells into highly specialized decidual cells through a process known as decidualization. This transformation of endometrial cells is abnormal in recurrent pregnancy loss patients. Liver homolog receptor 1 (LHR-1, NR5A2) is an orphan nuclear receptor and a transcription factor that regulates many reproductive events. The activation of this receptor leads to transcriptional activation of its target genes. We have previously shown that it is essential for decidualization in the mouse uterus. LRH-1 is expressed in the human uterus in both proliferative and secretory phases of the menstrual cycle and its expression increases during in vitro decidualization. We hypothesize that LRH-1 is indispensable for proper decidualization of the endometrial stroma, acting through the transcriptional regulation of genes required for transformation of stromal cells into decidual cells. To explore the molecular mechanism of transcriptional regulation mediated by this receptor, we established an in vitro model of decidualization, using an immortal human endometrial stromal cell line (hESC). An overexpression model developed by transfecting the cells with a plasmid constitutively expressing Lrh-1, resulted in 5 fold increases in abundance of transcripts for the decidualization marker genes prolactin (PRL) and insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). Furthermore, the downregulation of the receptor using short hairpin RNA (shRNA) abrogates the decidual reaction, from both a morphological point of view and in terms of expression of the two marker genes. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis showed that LRH-1 binds to genomic regions upstream of genes important for decidualization such as PRL, wingless-type MMTV integration site family, member 4 (WNT4), wingless-type MMTV integration site family, member 5 (WNT5), cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, CDKN1A) and interleukin-24(IL-24). For each of these genes, the binding increased during in vitro decidualization. Structural studies have identified phospholipids as potential LRH-1 ligands. We therefore explored the effect of ligand treatment on LRH-1 with an agonist and an inverse agonist for the nuclear receptor. Analysis by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and Western blot demonstrated that the modulation of LRH-1 activity by its ligands also affects the decidual reaction. Recent studies have shown that decidualized human stromal cells are biosensors of embryo quality and that they have the capacity to migrate towards the embryo. Our time-lapse evaluation of hESC cells co-cultured with mouse embryos indicates directed migration of the cells toward the embryo. This effect is markedly diminished when LRH-1 is depleted by shRNA in hESC. Our data provide evidence that LRH-1 regulates not only the transcription of a set of genes involved in decidualization but also the directional motility of these cells in vitro.

L’O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle qui consiste en l’ajout covalent du N-acetylglucosamine au groupement hydroxyle des sérines et thréonines des protéines nucléaires et cytoplasmiques. Ce type de glycosylation atypique est régulé de manière très dynamique par l’action de l’O-GlcNAc transférase (OGT) et de l’O-GlcNAcase (OGA) qui catalysent et hydrolysent cette modification respectivement. Aujourd’hui, OGT émerge comme un régulateur transcriptionnel et senseur critique du métabolisme où les protéines ciblées par l’O-GlcNAcylation couvrent la presque totalité des voies de signalisation cellulaire. Récemment, des études ont aussi proposé qu’OGT soit impliquée dans la régulation épigénétique par l’O-GlcNAcylation des histones. Dans le but de caractériser le rôle fonctionnel d’OGT dans la régulation épigénétique, nous avons revisité le concept d’O-GlcNAcylation des histones et, de manière surprenante, n’avons pu confirmer cette observation. En fait, nos données indiquent que les outils disponibles pour détecter l’O-GlcNAcylation des histones génèrent des artéfacts. De ce fait, nos travaux supportent plutôt un modèle où la régulation épigénétique médiée par OGT se fait par l’O-GlcNAcylation de régulateurs transcriptionnels recrutés à la chromatine. Parmi ceux-ci, OGT s’associe au complexe suppresseur de tumeurs BAP1. En étudiant le rôle d’OGT dans ce complexe, nous avons identifié le facteur de transcription FOXK1 comme un nouveau substrat d’OGT et démontrons qu’il est régulé par O-GlcNAcylation durant la prolifération cellulaire. Enfin, nous démontrons que FOXK1 est aussi requis pour l’adipogenèse. Ensemble, nos travaux suggèrent un rôle important d’OGT dans la régulation du complexe BAP1. / O-GlcNAcylation is a post-translational modification which consists in the covalent addition of an N-acetylglucosamine sugar to the hydroxyl group of serine and threonine residues of nuclear and cytoplasmic substrates. This atypical glycosylation is regulated in a very dynamic manner through the action of the O-GlcNAc transferase (OGT) and the O-GlcNAcase (OGA) that catalyze and hydrolyze this modification respectively. OGT has emerged as a critical transcriptional regulator and sensor of metabolism whereby proteins targeted by O-GlcNAcylation cover several cell signaling pathways. Recently, studies have also suggested that OGT may be involved in epigenetic regulation through the O-GlcNAcylation of histones. For the purpose of characterizing the functional role of OGT in epigenetic regulation, our group revisited the concept of histone O-GlcNAcylation and surprisingly, our work could not confirm this observation. In fact, our data indicate that the available tools for histone O-GlcNAcylation detection generate artifacts. Consequently, our work rather supports a model whereby OGT-mediated epigenetic regulation is indirectly achieved through O-GlcNAcylation of chromatin-associated transcriptional regulators. Among these, OGT strongly associates with the BAP1 tumor suppressor complex. Thus, by focusing on the role of OGT in this complex, we identified the transcription factor FOXK1 as a novel substrate of OGT and demonstrate that it is regulated throught O-GlcNAcylation during cell proliferation. Finally, we demonstrate that FOXK1 is also required for adipogenesis. Taken together, these data suggest an important role of OGT in regulating the BAP1 complex.

La reproduction sexuée implique une différentiation extrême des gamètes qui s’accompagne de profonds remaniements des chromosomes parentaux. Au moment de la fécondation, ces chromosomes doivent être rendus compétents pour la formation du premier noyau zygotique. Au cours de ma thèse, j’ai étudié l’importance fonctionnelle de plusieurs voies moléculaires paternelles et maternelles participant à cette étape chez la drosophile. Le complexe HIRA est impliqué dans l’assemblage de nucléosomes dans le pronoyau mâle à la fécondation. J’ai décrit le rôle de HIRA et de son partenaire Yemanucléine-α dans cette voie. J’ai caractérisé plus finement ce complexe en étudiant son rôle somatique dans l’assemblage des nucléosomes et son implication dans la stabilité de l’hétérochromatine, améliorant notre compréhension des besoins biologiques qui conditionnent sa conservation et son évolution. Je me suis aussi intéressé à diverses situations affectant l’intégrité des chromosomes parentaux à la fécondation. (1) J’ai décrit les conséquences catastrophiques pour la méiose femelle de l’expression naturelle d’un transposon à travers l’étude d’un cas de dysgénésie hybride. (2) J’ai contribué à montrer que la protéine K81 est essentielle pour la protection des télomères dans les chromosomes paternels au cours de la spermatogénèse. (3) J’ai participé à caractériser les conséquences pour les chromosomes paternels de l’incompatibilité cytoplasmique induite par la bactérie Wolbachia. Ensemble, ces travaux soulignent les particularités des chromosomes parentaux à la fécondation et aident à cerner l’importance des voies maternelles et paternelles dans leur intégration dans le premier noyau du zygote / Sexual reproduction involves dramatic gamete differentiation and profound parental chromosomes remodelling. At fertilization, these chromosomes need to be rendered competent for the formation of the fist zygotic nucleus. I have studied the functional relevance of several paternal and maternal molecular pathways that participate during this process in Drosophila. The HIRA complex is required for nucleosome assembly in the male pronucleus at fertilization. I have further described the rôle of HIRA and its obligatory partner Yemanuclein-α during this step. I have characterized the somatic roles of this complex during nucleosome assembly and its involvment in heterochromatin stability, which gives us a better understanding of the biological needs that drive its conservation and evolution. I have also focused on several situations where parental chromosomes integrity at fertilization is compromised. (1) I have described a meiotic catastrophe associated with the natural expression of a transposon in the female germline during hybrid dysgenesis. (2) I have contributed to show that K81 is an essential protein for telomere protection in paternal chromosomes during spermiogenesis. (3) I have participated in the characterization of the chromosomal abnormalities associated with cytoplasmic incompatibility induced by Wolbachia. Together, these results underscore the specificities of parental chromosomes at fertilization and shed light into the importance of maternal and paternal pathways for their integration in the first zygotic nucleus

La dynamique chromatinienne joue un rôle central dans les contrôles développementaux, la différenciation cellulaire ou les réponses des organismes à l’environnement. Chez les animaux, les protéines du groupe Polycomb sont impliquées dans l’établissement d’états chromatiniens silencieux. Chez les plantes, des données récentes suggèrent que la protéine LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) participerait à un complexe de type Polycomb. Nous nous sommes intéressés aux complexes LHP1 en étudiant un de ses partenaires, LHP1 INTERACTING FACTOR 2 (LIF2). L’objectif de ce travail de thèse a été de poursuivre la caractérisation de LIF2. LIF2 se caractérise par la présence de domaines de liaison à l’ARN, suggérant la participation d’une composante ARN dans les complexes LHP1. Nous avons recherché des ARN ligands de LIF2 et étudié les interactions LIF2/ARN par différentes approches dont la technologie Biacore. En analysant le transcriptome du mutant lif2, nous avons remarqué un enrichissement pour des gènes impliqués dans la réponse aux stress biotiques et abiotiques. Nous avons étudié la fonction de LIF2 dans la réponse aux pathogènes et avons pu mettre en évidence que LIF2 joue un rôle dans l’immunité innée des plantes et est essentiel pour réguler négativement les réactions de défenses en l’absence de pathogènes. / Chromatin dynamics play a central role in developmental control, cell differentiation or responses of the organisms to environment. In animals, Polycomb group proteins are involved in the establishment of silent chromatin states. In plants, recent data suggest that LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) participates to a Polycomb-like complex. We focused on LHP1 complexes by studying one of its partners, LHP1 INTERACTING FACTOR 2 (LIF2). The aim of this thesis was to pursue the characterization of LIF2. LIF2 is composed of RNA-binding domains, suggesting the participation of an RNA component in LHP1 complexes. We have searched for LIF2 RNA-ligands and studied LIF2/RNA interactions with different approaches including Biacore technology. By analyzing the transcriptome profile of lif2, we have noticed an enrichment for genes involved in responses to abiotic and biotic stresses stimuli. We investigated the LIF2 functions in response to pathogens infection and we have been able to highlight that LIF2 plays a role in plant innate immunity and is essential to negatively regulate defense responses in the absence of pathogens.