Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met bibliogr., lit. opg. - Met een samenvatting in het Nederlands.

The X chromosome is present as a single copy in the heterogametic sex, and this hemizygosity is expected to drive unusual patterns of evolution on the X relative to the autosomes. For example, the hemizgosity of the X may lead to a lower chromosomal effective population size compared to the autosomes, suggesting that the X might be more strongly affected by genetic drift. However, the X may also experience stronger positive selection than the autosomes, because recessive beneficial mutations will be more visible to selection on the X where they will spend less time being masked by the dominant, less beneficial allele—a proposal known as the faster-X hypothesis. Thus, empirical studies demonstrating increased genetic divergence on the X chromosome could be indicative of either adaptive or non-adaptive evolution. We measured gene expression in Drosophila species and in D. melanogaster inbred strains for both embryos and adults. In the embryos we found that expression divergence is on average more than 20% higher for genes on the X chromosome relative to the autosomes; but in contrast, in the inbred strains, gene expression variation is significantly lower on the X chromosome. Furthermore, expression divergence of genes on Muller's D element is significantly greater along the branch leading to the obscura sub-group, in which this element segregates as a neo-X chromosome. In the adults, divergence is greatest on the X chromosome for males, but not for females, yet in both sexes inbred strains harbour the lowest level of gene expression variation on the X chromosome. We consider different explanations for our results and conclude that they are most consistent within the framework of the faster-X hypothesis.

Thesis (doctoral)--University of Göteborg, 1983. / Extra t.p. with thesis statement inserted. Includes the author's five published papers. Includes bibliographical references.

Proefschrift Maastricht. / Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

The X chromosome is present as a single copy in the heterogametic sex, and this hemizygosity is expected to drive unusual patterns of evolution on the X relative to the autosomes. For example, the hemizgosity of the X may lead to a lower chromosomal effective population size compared to the autosomes, suggesting that the X might be more strongly affected by genetic drift. However, the X may also experience stronger positive selection than the autosomes, because recessive beneficial mutations will be more visible to selection on the X where they will spend less time being masked by the dominant, less beneficial allele—a proposal known as the faster-X hypothesis. Thus, empirical studies demonstrating increased genetic divergence on the X chromosome could be indicative of either adaptive or non-adaptive evolution. We measured gene expression in Drosophila species and in D. melanogaster inbred strains for both embryos and adults. In the embryos we found that expression divergence is on average more than 20% higher for genes on the X chromosome relative to the autosomes; but in contrast, in the inbred strains, gene expression variation is significantly lower on the X chromosome. Furthermore, expression divergence of genes on Muller's D element is significantly greater along the branch leading to the obscura sub-group, in which this element segregates as a neo-X chromosome. In the adults, divergence is greatest on the X chromosome for males, but not for females, yet in both sexes inbred strains harbour the lowest level of gene expression variation on the X chromosome. We consider different explanations for our results and conclude that they are most consistent within the framework of the faster-X hypothesis.

Despite the advances in modern technology, unraveling the genome evolution of an organism or even groups of several species remains a challenging task. Up-to-date cytogenetics and computational approaches enable the investigation of genomes from the nucleotide sequence up to the chromosomes, yet, drawing conclusions about evolutionary and mechanistic processes remains far from being trivial. The crop sugar beet (<i>Beta vulgaris</i> subsp. <i>vulgaris</i>) and its wild relatives form a well-suited group of plants (members of the Amaranthaceae family) to demonstrate the possibilities and limits that both, cytological and computational genomics, possess in addressing open questions on the genome in a phylogenetic context and in all its conformations: from its organization in chromosomes right down to the loss and gain of genes and the composition of repetitive DNA sequences. Since the two beet genera <i>Beta</i> and <i>Patellifolia</i> comprise diploid as well as polyploid species, genomic variability between them is not only based on DNA sequence differences, but on changes in the chromosome number as well. In the frame of this work, using microscopic approaches (outlined in chapter II), it was determined that all beets share a base chromosome number of x = 9. Differing properties between cultivated and wild beet accessions are the result of polyploidization and changes in the DNA sequence rather than a restructuring of the chromosomes. In chapter III, the focus is on the tetraploid wild beet <i>Beta corolliflora</i>, whose polyploidization likely led to the development of many tolerances against adverse environmental conditions. Since its ancestry remained unresolved for a long time, five different bioinformatics tools have been developed and complemented with cytogenetics to unravel its parental relationships. As an ‘autopolyploid’ hybrid descending from closely related <i>Beta macrorhiza</i> accessions, <i>B. corolliflora</i> occupies an intermediate position within the spectrum of auto- to allopolyploidy. Today’s breeding endeavors aim for the (re-)introduction of genes from wild beet into cultivated beet accessions to improve crop species in the face of changing cultivation conditions. Yet, such efforts are impeded due to crossing barriers, reflected in the separation of the beet species into three distinct gene pools. Chapter IV aims to identify repetitive DNA sequences that may be involved in speciation and formation of these gene pools. For this, genome data has been generated for a panel of 17 different beet accessions and was analyzed bioinformatically as well as experimentally, using long and short read technology, fluorescent <i>in situ</i> and Southern hybridization. The overall repeat content was found to correlate with the beet genome sizes and whereas some repeats are well conserved among the beet species, the specificity of others mirrors the split into the three beet gene pools. Satellite DNAs in particular vary considerably between beet genomes, leading to the evolution of distinct chromosomal setups in the three gene pools with uniform centromeres in the primary and tertiary gene pool and patchwork centromeres in the secondary gene pool, likely contributing to the barriers in beet breeding. Furthermore, endogenous sequences of viral origin were also detected in all beet genomes with specific elements for the different beet gene pools. As for <i>B. vulgaris</i>, these endogenous pararetroviruses were found to contribute to the host’s defense against other (putatively harmful) viruses (chapter V). In summary, this thesis demonstrates the synergistic potential of integrating computational and cytological genomics for a comprehensive genome analysis of beets that can be transferred to any other species panel. Combining both approaches enables to unlock a deeper understanding of the genetic makeup and evolution of the species of interest, in particular with regard to the impact of repetitive elements. / Trotz des technologischen Fortschritts bleibt die Entschlüsselung der Evolution eines Genoms oder gar der Genome mehrerer Arten eine anspruchsvolle Aufgabe. Moderne zytogenetische und computergestützte Ansätze ermöglichen die Untersuchung von Genomen von der Nukleotidsequenz bis hin zu den Chromosomen. Trotzdem ist es alles andere als trivial, daraus Rückschlüsse auf evolutionäre und mechanistische Prozesse zu ziehen. Die Zuckerrübe (<i>Beta vulgaris</i> subsp. <i>vulgaris</i>) und ihre wilden Verwandten stellen eine Pflanzengruppe aus der Familie der Amaranthaceae dar, die sich gut dafür eignet, Möglichkeiten und Grenzen der zytologischen sowie computergestützten Genomik aufzuzeigen. Bei der Beantwortung offener Fragen zum Genom in einem phylogenetischen Kontext werden dabei all seine Ausprägungen in Betracht gezogen: von der Genomorganisation in Chromosomen bis hin zum Verlust und Erhalt von Genen und der Zusammensetzung repetitiver DNA-Sequenzen. Da die beiden Rübengattungen <i>Beta</i> und <i>Patellifolia</i> sowohl diploide als auch polyploide Arten umfassen, beruht die genomische Variabilität zwischen den Rübengenomen nicht nur auf Unterschieden in der DNA-Sequenz, sondern auch auf Veränderungen in der Chromosomenzahl. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe mikroskopischer Methoden (siehe Kapitel II) festgestellt, dass alle Rüben eine Basischromosomenzahl von n = 9 aufweisen. Unterschiedliche Eigenschaften zwischen kultivierten und wilden Rüben-Akzessionen sind das Ergebnis von Polyploidisierung und Veränderungen in der DNA-Sequenz und nicht von chromosomalen Umstrukturierungen. In Kapitel III liegt der Fokus auf der tetraploiden Wildrübe <i>Beta corolliflora</i>, deren Polyploidisierung wahrscheinlich zahlreiche Toleranzen gegenüber widrigen Umweltbedingungen bedingt. Da ihre Abstammung lange Zeit ungeklärt blieb, wurden fünf verschiedene bioinformatische Methoden entwickelt und zytogenetisch komplementiert, um die Elternspezies zu entschlüsseln. So handelt es sich bei <i>B. corolliflora</i> wahrscheinlich um eine „autopolyploide“ Hybride, die von eng verwandten <i>Beta macrorhiza</i>-Akzessionen abstammt und eine Zwischenform im Spektrum der Polyploidie darstellt. Heutige Züchtungsansätze zielen auf die (Wieder-)Einführung von Genen aus Wildrüben in kultivierte Rübensorten ab, um die Kulturarten angesichts der sich ändernden Anbaubedingungen widerstandsfähiger und/oder ertragreicher zu machen. Solche Bemühungen werden jedoch durch Kreuzungsbarrieren eingeschränkt, die sich in der Gruppierung der Rübenarten in drei verschiedene Genpools widerspiegeln. Kapitel IV zielt darauf ab, repetitive DNA-Sequenzen zu identifizieren, die möglicherweise an Adaption und Artbildung beteiligt sind. Genomdaten wurden für 17 verschiedene Rüben-Akzessionen generiert und sowohl bioinformatisch als auch experimentell mittels Fluoreszenz-<i>in situ</i>- und Southern-Hybridisierung analysiert. Der Gesamtgehalt an repetitiven DNA-Sequenzen korreliert mit der Genomgröße der Rübenakzessionen. Während einige repetitive DNA-Sequenzen zwischen den Rübenarten konserviert sind, spiegelt die Spezifität anderer die Aufteilung in die drei Rübengenpools wider. Insbesondere die Satelliten-DNA variiert beträchtlich zwischen den Rübengenomen, was zur Entwicklung unterschiedlicher chromosomaler Strukturen in den drei Genpools geführt hat: Der primäre und tertiäre Genpool sind hierbei durch einheitlichen Zentromere gekennzeichnet, während sich der sekundäre Genpool durch eine individuelle Zentromerzusammensetzung auszeichnet, die von Chromosom zu Chromosom verschieden sein kann. Dies trägt wahrscheinlich zu den Hindernissen im Zuge der Rübenzucht bei. Außerdem wurden in allen Rübengenomen endogene Sequenzen viralen Ursprungs nachgewiesen, die für die verschiedenen Rübengenpools spezifisch sind. Für <i>B. vulgaris</i> wurde festgestellt, dass diese endogenen Pararetroviren zur Verteidigung gegen andere (ggf. schädliche) Viren beitragen (Kapitel V). Zusammenfassend zeigt diese Arbeit das synergistische Potenzial einer Integration der computergestützten und zytologischen Genomik für eine umfassende Genomanalyse von Rüben auf, die auf jedes andere Artenpanel übertragen werden kann. Die Kombination beider Ansätze ermöglicht ein tieferes Verständnis des Genoms und der Evolution der betreffenden Art, insbesondere in Hinblick auf den Einfluss repetitiver DNA-Sequenzen.

Regulatorische Landschaften von Genen steuern das präzise transkriptionelle Programm, das für die embryonale Entwicklung notwendig ist. Transkriptionsfaktoren (TFs) interagieren dabei mit regulatorischen Elementen (REs), um die Genexpression zu kontrollieren. Zur Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen konzentriere ich mich auf das Xist-Gen, den Hauptregulator der X-Chromosom-Inaktivierung (XCI) in Säugetieren. In der Embryonalentwicklung wird Xist monoallelisch in weiblichen Zellen aktiviert, woraufhin die Xist-RNA das X-Chromosom überzieht und dessen Inaktivierung einleitet. Dadurch wird die erhöhte Dosis X-chromosomaler Gene in weiblichen Zellen kompensiert. Um ein umfassendes Verständnis der Xist-Regulatoren zu erhalten, nutze ich CRISPR-Screens, um REs und TFs in weiblichen embryonalen Stammzellen zu untersuchen. Dabei identifiziere ich ein neues nicht-kodierendes Gen namens Xert. Daruberhinaus stelle ich fest, dass promotor-nahe REs auf die Anzahl der X-Chromosomen reagieren, während distale REs unbeeinflusst bleiben. Durch meine TF-Screens entdecke ich zwei Gruppen von Aktivatoren: Die frühe Gruppe, darunter der X-chromosomale Faktor ZIC3, zeigt in weiblichen Zellen erhöhte Expression, was darauf hindeutet, dass sie die Xist-Expression auf weibliche Zellen beschränken. Die späte Gruppe, einschließlich OTX2, agiert geschlechtsunabhängig und stellt nach der initialen Xist-Aktivierung ein hohes Transkriptionslevel sicher. Mit weiteren CRISPR-Screens verknüpfe ich TFs mit REs und zeige, dass frühe Aktivatoren promotor-nahe REs beeinflussen, während späte Aktivatoren distale REs stärker regulieren. Diese Arbeit liefert eine systemische Perspektive des trans- und cis-regulatorischen Netzwerks, das die Xist-Aktivierung während der Differenzierung koordiniert und die Beschränkung auf weibliche Zellen gewährleistet. / The regulatory landscapes of developmental genes orchestrate precise and coordinated transcriptional programs required for embryonic development. During this process, transcription factors (TFs) interact with regulatory elements (RE) to finely tune gene expression. To study the regulatory principles acting in this context, I focus on the Xist gene, the master regulator of X-chromosome inactivation (XCI) in mammals. During early development, Xist is upregulated in a monoallelic fashion specifically in females. The Xist RNA then coats the X chromosome in cis, resulting in its inactivation. In this manner, female cells compensate for their increased X-chromosomal dosage in comparison to males. To obtain a complete understanding of Xist regulation, I first perform two CRISPR screens targeting REs and TFs during the early differentiation of female mouse embryonic stem cells. I identify Xist-controlling REs within the locus, unveiling a novel non-coding gene Xert. I further demonstrate the sensitivity of promoter-proximal REs to X-dosage, contrasted by the behavior of distal REs. In the TF screen, I detect two sets of activators which undergo transient upregulation at the onset of XCI. The early group of activators, including the X-linked TF ZIC3, exhibits higher expression levels in XX cells, indicating a role in restricting Xist expression to females. The late group of activators, including the master regulator of the epiblast OTX2, drives high transcript levels following Xist activation. Subsequently, I use a series of CRISPR screens targeting individual reporter constructs to map TF-RE wiring at the locus. I find that the early activators primarily act on the XX-dependent proximal REs. Contrary, the late activators interact with the sex-independent distal REs. With this study, I provide a systems level perspective of the trans- and cis-regulatory network that links Xist activation to early differentiation and ensures female-specificity.

Polytäne Chromosomen von Drosophila sind in eine Abfolge von Banden und Interbanden unterschiedlichen Kompaktionsgrades gegliedert. Das Protein Z4 ist notwendig, um dieses Muster aufrecht zu erhalten (Eggert et al., 2004). Durch Koimmunpräzipitation mit Z4 wurde in unserer Arbeitsgruppe ein Chromodomänen Protein identifiziert, das von uns als Chriz bezeichnet wurde (Gortchakov et al., 2005). In meiner Arbeit testete ich die Interaktion zwischen den vollständigen Proteinen Chriz und Z4. Ich konnte dabei zeigen, dass beide Proteine in vivo direkt miteinander interagieren. Die kartierten Interaktionsdomänen am N-Terminus von Z4 und am C-Terminus von Chriz sind hinreichend für die wechselseitige Interaktion beider Proteine. Chriz ist wie Z4 in vielen Interbanden polytäner Interphasechromosomen gebunden. Die überexpression verschiedener Domänen von Chriz zeigte, dass sowohl der N- als auch der C-Terminus von Chriz für die Interbandenbindung von Chriz ausreichend sind. Der Chriz C-Terminus ist dar Über hinaus notwendig, um das überleben von Tieren mit einer Chriz Null Mutation bis in das larvale Stadium zu gewährleisten. Tiere mit induziertem Chriz RNAi knock down zeigten eine verringerte DNA Kondensation polytäner Chromosomen. Die Ähnlichkeit des chromosomalen Phänotyps von Z4 und Chriz Mutationen legt nahe, dass beide Proteine in einem gemeinsamen Komplex in Interbanden vorkommen. Unter Ausnutzung von Chriz RNAi bzw. Z4 RNAi konnte ich zeigen, dass die chromosomale Bindung von Z4 von Chriz abhängt. Weiterhin sind die Proteinkinase Jil-1 und an Serin 10 phosphoryliertes H3 (H3pS10), beides Marker für dekondensiertes Chromatin, in Chriz RNAi Tieren verringert. Aus meinen Daten schliesse ich, dass Chriz/Z4/Jil-1 in einem gemeinsamen Komplex an Interbanden gebunden sind. Chriz ist dabei fundamental wichtig für die zielgerichtete Bindung und Stabilität des Komplexes. Der Komplex selbst ist erforderlich, um die lokale Chromatinstruktur aufrecht zu erthalten. / Drosophila polytene chromosomes are compacted into a series of bands and interbands. Z4 is a protein to keep this pattern, since Z4 mutant larvae show a decompaction of chromosomes and a loss of banding pattern (Eggert et al., 2004). By coimmuno-precipitation, we identified a chromodomain protein, which we named Chriz, for chromodomain protein interacting with Z4 (Gortchakov et al., 2005). In my PhD thesis, I tested the interactions between the full length proteins and different fragments of Chriz and Z4 which showed that Chriz could directly interact with Z4 in vivo. The interaction domains were mapped and it was determined that the N terminus of Z4 and the C terminus of Chriz are sufficient for mutual interaction. GST pull down confirmed these data and more precisely localized the interaction domains. Chriz, like Z4, is present in many interbands of interphase polytene chromosomes. The overexpression of different domains of Chriz demonstrated that both the N and C terminus are sufficient for targeting of Chriz to interbands. The C terminus was shown to be sufficient for rescue of Chriz null mutations into larva stage. Chriz full length proteins, with site directed mutations within the chromodomain, could still partially rescue the null mutant. Chriz RNAi knock down resulted in a loss of structure of polytene chromosome. The similar chromosomal phenotype of Z4 and Chriz indicate that they cooperate in the formation of chromosomal structure. Using the Chriz RNAi, I showed that Z4 chromosomal binding is dependent on Chriz. However, by a similar assay I showed that Chriz binding did not depend on Z4. Finally, the decondensed interphase chromatin marker Jil-1, a H3S10 histone kinase, and H3pS10 are decreased in Chriz RNAi line. From these data, I conclude that Chriz/Z4/Jil-1 form an interband binding complex. Chriz is the fundamental factor for the chromosomal targeting and stabilitation of the complex that is required to maintain locally chromatin structure.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden mittels molekular-zytogenetischer Methoden die chromosomalen Aberrationen in c-myc aktivierten ARFnull- und INK4a/ARFnull-Mauslymphomen untersucht. Die zytogenetischen Ergebnisse wurden mit dem Therapieverlauf der Mäuse nach Cyclophosphamid-Behandlung verglichen. In den ARFnull-Lymphomen erkannten wir den Gewinn des Chromosoms 14 als einen Marker für gute und den Gewinn des Chromosoms 6 als Marker für schlechte Behandlungserfolge. Auf den Chromosomen 6 und 14 der Maus liegen demnach bisher unbekannte Gene, welche für die Wahl der Behandlungsmethode ARF-defizienter Tumore von entscheidender Bedeutung sind. Der zweite Teil der Arbeit befaßt sich mit Common Fragile Sites (CFS), die als &amp;quot;hot spots&amp;quot; für chromosomale Brüche und Umbauten in Tumorgenese und Karyotypevolution diskutiert werden. CFSs treten als seltene Lücken im Chromatin oder als partiell deletierte bzw. rearrangierte Chromosomen auf. Ihre Zahl wird durch Zugabe von Replikations-hemmenden Chemikalen, wie Aphidicolin (APC), erheblich gesteigert. Wir untersuchten die CFS-Expression in Lymphozytenkulturen der Mausstämme BALB/c und C57BL/6. Die APC-induzierten CFS-Häufigkeiten der Chromosomenbanden wiesen im Vergleich zwischen beiden Mausstämmen eine signifikante Korrelation und damit eine starke Konservierung auf. Ebenfalls wurde zwischen Maus / Mensch-syntenischen Bereichen eine Konservierung der CFS-Häufigkeiten detektiert. Die Tendenz zur CFS-Bildung ist also ein spezifisches Merkmal jedes chromosomalen Abschnitts, das evolutionär konserviert ist. Weiterhin wurden einzelne CFSs mit molekular-zytogenetischen Methoden genauer kartiert. Auf diese Weise beschrieben wir erstmals eines der zehn häufigsten CFSs menschlicher Lymphozyten, FRA7K, und erweiterten somit die Anzahl molekular charakterisierter humaner CFSs auf insgesamt 13. Für fünf dieser CFSs analysierten wir mittels FISH-Analyse die homologen Bereiche im Mausgenom hinsichtlich ihrer CFS-Expression. Die beobachteten Läsionen traten jeweils in exakt den entsprechenden Sequenzen auf. Vereint man diese fünf Beispiele (FRA2G/Fra2D, FRA7G/Fra6A3.1, FRA7H/Fra6B1, FRA7K/Fra12C1 und FRA9E/Fra4C2) mit bekannten Homologen aus der Literatur, so wurde für insgesamt acht CFSs eine Konservierung zwischen Mensch und Maus auf molekularer Ebene gefunden. Trotz zahlreicher Untersuchungen ist der zelluläre Mechanismus, der die Ausbildung von CFSs an spezifischen Stellen des Genoms bewirkt, bis heute weitgehend unklar. Bekannt ist, daß CFSs durch Replikationsinhibition induziert werden und in Metaphase-Zellen sichtbar werden, welche DNA-Replikations-Checkpoints unterlaufen haben.Sämtliche jüngeren Studien beschrieben Inseln erhöhter DNA-Helix-Flexibilität (Schwankungen im Biegungswinkel des Moleküls) in den Bereichen von CFSs. Wir berechneten die DNA-Helix-Flexibilität entlang der Sequenz für alle molekular kartierten humanen und Maus-CFSs sowie für stabile Kontrollregionen. Anders als in der Literatur beschrieben, fanden wir für Mensch und Maus, daß sich CFSs und Kontroll-DNAAbschnitte in ihrer Dichte an Inseln mit erhöhter DNA-Helix-Flexibilität nicht unterschieden. Nahezu alle Regionen der häufigen molekular charakterisierten CFSs umfassen große Gene, deren Exons mehr als 650 kb genomische Sequenz überspannen. Im Gegensatz dazu traten große Gene in den stabilen Kontrollregionen deutlich seltener auf. Öffentlich zugängliche RNA-Expressionsdaten dieser Gene zeigten, daß CFSs bevorzugt in Bereichen mit transkriptionell aktiven, großen Genen entstehen. Darauf und auf dem Wissen aus der Literatur begründen wir die Hypothese, daß eine Blockierung der DNAReplikationsgabel, vor allem in Bereichen großer transkriptionell aktiver Gene - eventuell begründet durch deren offenere Chromatinstruktur - und das anschließende Unterlaufen von Zellzyklus-Checkpoints an der Bildung von CFSs und damit in einem Anstieg von Doppelstrangbrüchen beteiligt sind.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden mittels molekular-zytogenetischer Methoden die chromosomalen Aberrationen in c-myc aktivierten ARFnull- und INK4a/ARFnull-Mauslymphomen untersucht. Die zytogenetischen Ergebnisse wurden mit dem Therapieverlauf der Mäuse nach Cyclophosphamid-Behandlung verglichen. In den ARFnull-Lymphomen erkannten wir den Gewinn des Chromosoms 14 als einen Marker für gute und den Gewinn des Chromosoms 6 als Marker für schlechte Behandlungserfolge. Auf den Chromosomen 6 und 14 der Maus liegen demnach bisher unbekannte Gene, welche für die Wahl der Behandlungsmethode ARF-defizienter Tumore von entscheidender Bedeutung sind. Der zweite Teil der Arbeit befaßt sich mit Common Fragile Sites (CFS), die als &amp;quot;hot spots&amp;quot; für chromosomale Brüche und Umbauten in Tumorgenese und Karyotypevolution diskutiert werden. CFSs treten als seltene Lücken im Chromatin oder als partiell deletierte bzw. rearrangierte Chromosomen auf. Ihre Zahl wird durch Zugabe von Replikations-hemmenden Chemikalen, wie Aphidicolin (APC), erheblich gesteigert. Wir untersuchten die CFS-Expression in Lymphozytenkulturen der Mausstämme BALB/c und C57BL/6. Die APC-induzierten CFS-Häufigkeiten der Chromosomenbanden wiesen im Vergleich zwischen beiden Mausstämmen eine signifikante Korrelation und damit eine starke Konservierung auf. Ebenfalls wurde zwischen Maus / Mensch-syntenischen Bereichen eine Konservierung der CFS-Häufigkeiten detektiert. Die Tendenz zur CFS-Bildung ist also ein spezifisches Merkmal jedes chromosomalen Abschnitts, das evolutionär konserviert ist. Weiterhin wurden einzelne CFSs mit molekular-zytogenetischen Methoden genauer kartiert. Auf diese Weise beschrieben wir erstmals eines der zehn häufigsten CFSs menschlicher Lymphozyten, FRA7K, und erweiterten somit die Anzahl molekular charakterisierter humaner CFSs auf insgesamt 13. Für fünf dieser CFSs analysierten wir mittels FISH-Analyse die homologen Bereiche im Mausgenom hinsichtlich ihrer CFS-Expression. Die beobachteten Läsionen traten jeweils in exakt den entsprechenden Sequenzen auf. Vereint man diese fünf Beispiele (FRA2G/Fra2D, FRA7G/Fra6A3.1, FRA7H/Fra6B1, FRA7K/Fra12C1 und FRA9E/Fra4C2) mit bekannten Homologen aus der Literatur, so wurde für insgesamt acht CFSs eine Konservierung zwischen Mensch und Maus auf molekularer Ebene gefunden. Trotz zahlreicher Untersuchungen ist der zelluläre Mechanismus, der die Ausbildung von CFSs an spezifischen Stellen des Genoms bewirkt, bis heute weitgehend unklar. Bekannt ist, daß CFSs durch Replikationsinhibition induziert werden und in Metaphase-Zellen sichtbar werden, welche DNA-Replikations-Checkpoints unterlaufen haben.Sämtliche jüngeren Studien beschrieben Inseln erhöhter DNA-Helix-Flexibilität (Schwankungen im Biegungswinkel des Moleküls) in den Bereichen von CFSs. Wir berechneten die DNA-Helix-Flexibilität entlang der Sequenz für alle molekular kartierten humanen und Maus-CFSs sowie für stabile Kontrollregionen. Anders als in der Literatur beschrieben, fanden wir für Mensch und Maus, daß sich CFSs und Kontroll-DNAAbschnitte in ihrer Dichte an Inseln mit erhöhter DNA-Helix-Flexibilität nicht unterschieden. Nahezu alle Regionen der häufigen molekular charakterisierten CFSs umfassen große Gene, deren Exons mehr als 650 kb genomische Sequenz überspannen. Im Gegensatz dazu traten große Gene in den stabilen Kontrollregionen deutlich seltener auf. Öffentlich zugängliche RNA-Expressionsdaten dieser Gene zeigten, daß CFSs bevorzugt in Bereichen mit transkriptionell aktiven, großen Genen entstehen. Darauf und auf dem Wissen aus der Literatur begründen wir die Hypothese, daß eine Blockierung der DNAReplikationsgabel, vor allem in Bereichen großer transkriptionell aktiver Gene - eventuell begründet durch deren offenere Chromatinstruktur - und das anschließende Unterlaufen von Zellzyklus-Checkpoints an der Bildung von CFSs und damit in einem Anstieg von Doppelstrangbrüchen beteiligt sind.