Quatro espécies de cianobactérias, heterocistadas, fixadoras de nitrogênio: Westiellopsis yengarii, Nostoc punctiforme, Nostoc muscorum e Nostoc commune foram isoladas e clonadas a partir de solos de várzea da região Amazônica e dos tabuleiros irrigados cultivados com arroz do Vale do Paraíba, São Paulo. Uma espécie de Nostoc sp. ATCC 29133, isolada da raiz de Macrozamia lucida (Linnaeus), adaptada à regiões de clima temperado, foi utilizada neste trabalho como parâmetro de comparação entre cianobactérias de solos temperados e tropicais. As taxas de crescimento das cianobactérias foram avaliadas em termos do conteúdo de clorofila α em experimentos onde a temperatura, o pH, a salinidade e a concentração de fósforo foram variáveis. A temperatura ótima para o crescimento das cianobactérias de solo tropical variou entre 25° e 35°C e para Nostoc sp., de solo temperado, foi de 20°C; o pH ótimo para o crescimento foi igual a 7,9. O crescimento das cianobactérias em meio salino mostrou que N. muscorum apresentou a maior tolerância e Nostoc sp. foi a espécie mais sensível à concentração de 0,2M de NaCl, com reduções no crescimento iguais a 63% e 97%, em relação ao controle, respectivamente. O crescimento em meio de cultura deficiente em fósforo (P) mostrou que N. muscorum teve a menor redução no crescimento (52%), enquanto N. commune, a espécie mais sensível a deficiência de P, teve uma redução de 72%. Estimativas da fixação biológica do nitrogênio, às temperaturas de 20°, 25° e 35°C, através do método de redução do acetileno, indicaram uma baixa atividade da nitrogenase, no período amostral, que variou de 4,87 nmol em N. muscorum à 25°C a 0,88 nmol em Nostoc sp à 35°C. A temperatura ótima registrada para a atividade enzimática foi igual a 25°C. Mutantes espontâneos de N. punctirorme e N. muscorum foram obtidos a partir do crescimento em substâncias análogas ao L-glutamato (L-metionina-DL- sulfoximina, MSX) e à citosina (5'-fluorocitosina, 5FC), respectivamente, suplementados ao meio de cultura. Os clones resistentes foram testados juntamente com o tipo selvagem, sendo que a caracterização da mutação espontânea somente foi obtida para N. muscorum (+5FC¹R), em presença do análogo uracil, 5' Fluorouracil (5FU). Uma estimativa da atividade da nitrogenase mostrou que os mutantes espontâneos fixaram N₂ 2 a taxas mais elevadas que os respectivos tipos selvagens. / Four species of nitrogen fixing heterocystous cyanobacteria: Westiellopsis yengarii, Nostoc punctiforme, Nostoc muscorum and Nostoc commune were isolated from soils of varzea (low floaded land) of the Amazon region and floaded rice fields inside the Valley Paraiba, São Paulo state. For the comparison the temperate soil species Nostoc sp - ATCC 29133, taken from the roots of Macrozamia lucida (Linnaeus) was also included in this study as a control of comparison between cyanobacteria from temperate and tropical soil. The growth rate of cyanobacteria were evaluated based on Clorophyll a content in one experiment where temperature, pH, salinity and phosphorous concentration were variable. The optimal temperature for growth of cyanobacteria from tropical region ranged from 25° to 35°C; and, for Nostoc sp around 20°C; the optimal pH for growth was equal to 7.9. Growth of cyanobacteria in saline medium showed that N. muscorum had greater tolerance and Nostoc sp was the species more sensitive to 0,2M of NaCl, with growth reduction of 63% and 97%, respectively. Growth on medium with phosphorous (P) deficiency showed that N. muscorum had a lower growth reduction (52%) while N. commune, the more sensitive specie to phosphorous deficiency had a 72% reduction in growth. Biological nitrogen fixation estimative at temperature of 20°; 25° and 35°C, using the acetylene reduction methods indicated an activity range for nitrogenase during the sampling period variable between 4,87 nmol C2H4μ g Cla-1 min-1 for N. muscorum at 25°C to 0,88 nmol C2H4μ g Cla-1 min-1 for Nostoc sp at 35°C. The optimal temperature for enzymatic activity was 25°C. Expontaneous mutants of N. punctiforme and N. muscorum were achieved when growing in culture medium suplemented with substance like L-glutamate (L-methionine-DL-sulphoximine-MSX) and cytosine (5'fluorocytosine, 5FC) respectively. Resistent clones were isolated, selected and tested at the same time wild type and the characterization of the expontaneous mutation was achieved only for N. muscorum in the presence of 5' fluorouracil (5FU). Nitrogenase activity estimative showed that expontaneous mutants N2 at a higher rate when compared to wild types.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Recursos y Medio Ambiente Hídrico / Ingeniera Civil / La eutroficación y florecimiento de algas es un problema común en lagos y embalses que reciben elevadas cargas de nutrientes en sus afluentes. Como consecuencia, se pueden generar incompatibilidades con algunos de los propósitos de los embalses, tales como consumo humano, riego o generación hidroeléctrica; así como también con las actividades recreacionales o deportivas que se desarrollan en torno a estos cuerpos de agua. El embalse Rapel, ubicado en la zona costera de la Región de O'Higgins, es un ejemplo de esta situación. Si bien se han realizado estudios relativos al diagnóstico de la calidad del agua, no se ha investigado completamente cómo se ve afectada la calidad del agua del embalse como consecuencia del esquema de operación que mantiene la central. Esto motiva la realización de esta tesis, cuyo objetivo principal es estudiar esta relación mediante el análisis de escenarios de simulación. Para ello, se utiliza el modelo ELCOM-CAEDYM, capaz de representar la hidrodinámica y calidad del agua del embalse.Por otro lado, se utiliza el modelo MIPUC que permite reproducir la labor del operador del sistema eléctrico de Chile central de coordinar el funcionamiento de corto plazo de las plantas eléctricas pertenecientes al sistema. Un total de veinte escenarios de simulación son definidos de acuerdo a dos criterios: condición hidrológica para el caudal afluente al embalse (año seco, normal o húmedo) y restricción de caudal mínimo en la operación de la central hidroeléctrica. Los resultados de las simulaciones son comparados por el grado de alteración hidrológica que imponen en el caudal aguas abajo del embalse, la energía generada por la central Rapel, variaciones en el nivel del agua del embalse y la concentración de clorofila-a en un eje central que recorre el embalse, desde la llegada del río Cachapoal hasta la presa. Los resultados de las simulaciones mostraron que la inclusión de un caudal mínimo ecológico en la operación de la central reduce la alteración hidrológica en el río aguas abajo de la presa. Por otro lado, las condiciones hidrológicas asociadas a un menor caudal entrante al embalse, resultaron ser las más sensibles al efecto del caudal ecológico, tanto en la variación del nivel como en la concentración de cianobacterias. En particular, se observó que el caudal mínimo más restrictivo resultaba en una mejora de la calidad del agua de las cubetas Cachapoal y Muro. Este resultado es consecuencia de un bajo nivel del embalse y de la concentración de sólidos suspendidos del afluente que generan una mayor turbidez a la entrada del embalse. Esto a su vez, limita el crecimiento del fitoplancton se tiene por tanto una disminución de la concentración de clorofila-a. Estos resultados muestran que cambios del esquema de operación de la central pueden afectar la calidad del agua del embalse de manera significativa, y plantea la inclusión de esta opción como una alternativa en el estudio de embalses existentes o en los estudios previos de proyectos de recursos hídricos futuros.

Las cianobacterias tienen potencial como productoras de biocombustibles y otros productos químicos, ya que pueden crecer utilizando el CO2 presente en la atmósfera como fuente de carbono, la luz como fuente de energía y el agua como fuente de electrones. Esto resulta atractivo en el contexto actual de cambio climático ocasionado por las elevadas concentraciones de CO2 en la atmósfera. En esta tesis se estudia la producción de etanol de cuarta generación y polihidroxibutirato (PHB) a partir de la cianobacteria Synechocystis sp. PCC 6803, con un enfoque de Ingeniería de Sistemas Metabólicos. En primer lugar, se cura un modelo estequiométrico de escala genómica (GEM) de dicha cianobacteria con información bibliográfica específica actualizada, con el objetivo de mejorar las predicciones in silico. Luego, el GEM es validado frente a datos experimentales fisiológicos y datos de fluxómica, demostrándose que la curación resulta efectiva en mejorar las predicciones del modelo. Con el modelo curado y validado, se formulan problemas de programación binivel para buscar estrategias de acoplamiento, a través de la supresión de genes, entre el crecimiento y la producción del compuesto de interés con el objetivo de convertir al metabolito deseado en un subproducto obligado del crecimiento y que en consecuencia, su producción resulte una parte integral de la función metabólica del organismo. Matemáticamente, las intervenciones genéticas se representan por medio de variables binarias asociadas a dichos genes. Estos problemas son reformulados por medio de la teoría de la dualidad, obteniéndose como resultado problemas de programación mixta entera lineal (MILP) en un solo nivel que se resuelven tanto para el caso de etanol como para el de PHB. Existen en bibliografía formulaciones de este tipo, aunque con variables binarias asociadas a reacciones. El aporte realizado en esta tesis al incorporar asociación de variables binarias a genes es un avance en el agregado de información biológica a este tipo de formulaciones. En el caso del etanol se obtienen dos mutantes factibles que presentan diferentes estrategias de intervención para acoplar la producción al crecimiento, una relacionada con la producción de acetato y la otra, con el balance celular de poder reductor, siendo el segundo caso el más prometedor desde el punto de vista biotecnológico ya que aumenta en un 235 % la productividad de la cepa con respecto a las productividades presentadas en bibliografía. Para este producto, también se estudia la posibilidad de producción con una estrategia en dos etapas. En dicha estrategia, se considera un primer biorreactor con condiciones que maximicen el crecimiento y un segundo biorreactor donde un nutriente limita dicho crecimiento y se favorece la producción de etanol. Esta estrategia mejora aún más los índices de producción. En el caso de PHB también se obtienen dos mutantes factibles, pero la estrategia de acoplamiento no varía. La diferencia entre ambos son dos intervenciones más, que hacen que la tasa de producción de PHB aumente un 25%. La estrategia, en este caso, también está relacionada con el balance de poder reductor de la red, pero se observan mayores cambios en los flujos metabólicos internos que para el caso del etanol. La productividad del mejor mutante se analiza en condiciones de exceso y de limitación de nutrientes. Las productividades obtenidas vuelven atractiva la realización de experimentos in vivo para avanzar en el diseño de cepas de Synechocystis como fábricas celulares de etanol de cuarta generación y de bioplásticos. Los modelos desarrollados constituyen herramientas útiles para el diseño de cepas industriales para la producción fotosintética no solo de biocombustibles y bioplásticos, sino también de compuestos de interés en una gran variedad de industrias como la farmacéutica, la nutracéutica, de biofertilizantes, entre otros. / Cyanobacteria are potential candidates for biofuel and chemical product production, due to their ability to grow autotrophically, on the atmospheric CO2 as carbon source, light as energy source, and water as electron source. These capacities become attractive in the current climate change context, caused by the high concentrations of CO2 in the atmosphere. In this thesis, the production of fourth generation ethanol and polyhydroxybutyrate (PHB) from the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 is studied through a Systems Metabolic Engineering approach. First, a genomic scale stoichiometric model (GEM) of Synechocystis is curated, based on specialized and actualized bibliography, to improve the in silico predictions. Then, the GEM is validated against physiological and fluxomic data. After model curation and validation, bilevel programming problems are formulated, to determine genetic engineering strategies to couple growth and bioproduct production by gene knock-outs. The aim of coupling production is turning the biotechnological compound into an obligate subproduct of growth, so that its production becomes an integral part of the organism’s metabolic function. Mathematically, knock-outs are represented by binary variables associated to the corresponding genes. This bilevel programming problems are reformulated into one level Mixed Integer Linear Programming (MILP) problems by applying the duality theory, and are solved for both ethanol and PHB cases. Considering binary variables associated with genes instead of reactions is a novel contribution of this thesis. and constitutes a step towards the incorporation of biological meaning into in silico results. For the case of ethanol, two feasible mutants are obtained, with different intervention strategies to couple production to growth. One of the strategies is related to acetate production and the other with the cellular reductive power balance. The latter is the most promising case from a biotechnological point of view, because it gives a productivity 235%.higher than those reported in bibliography. Also, a two-stage ethanol production strategy is addressed, where a first bioreactor with growth maximizing conditions and a second one with nutrient limiting conditions are considered. This strategy further improves production indexes. In the case of PHB, two feasible mutants are obtained with similar coupling strategies. The difference between them are two interventions that improve PHB production rate by 25%. The strategy in this case is also related with the cellular reductive power balance, but more changes in the internal metabolic fluxes are required, as compared to the ethanol case. The productivity of the best mutant is analyzed under excess and limiting nutrient conditions. The results obtained are encouraging to make further in vivo experiments to move forward in the design of Synechocystis as a microbial cell factory of fourth generation biofuels and bioplastics. The models developed in this thesis constitute useful tools for the design of industrial strains for the photosynthetic production of not only biofuels and bioplastics, but also of compounds of interest with application in a wide range of industries like pharmaceutical, nutraceutical and biofertilizers, among others

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El estudio de las comunidades de cianobacterias en la cuenca del río Muga permite profundizar en la búsqueda de factores que favorezcan o inhiban la acumulación intracelular de microcistinas y su liberación al medio externo en condiciones oligotróficas o con leves signos de eutrofia, al tiempo que permiten aportar nuevos conocimientos que ayuden a mejorar el entendimiento de los mecanismos y procesos que participan en la dinámica de las comunidades de cianobacterias bentónicas y las microcistinas asociadas en ecosistemas fluviales mediterráneos. Se ha realizado un estudio de la estructura y variabilidad de las comunidades de cianobacterias durante un ciclo anual completo mediante muestreos mensuales y muestreos con menor periodicidad durante un segundo ciclo posterior. Dichos muestreos han permitido observar diferentes patrones espacio-temporales a lo largo de todo el período de estudio en los 4 puntos de muestreo seleccionados en la cuenca del río Muga. Estos 4 tramos incluyen 1 punto regulado:aguas abajo del embalse de Boadella, y 3 sin regular:2 cabeceras y un punto aguas abajo de la población de Albanyà. Se han identificado un total de 34 especies de cianobacterias bentónicas en las 4 zonas estudiadas, predominando siempre especies de aguas limpias o poco alteradas. Dos especies, Rivularia biasolettiana (zonas más limpias y expuestas) y Phormidium retzii (sonas esciáfilas o con alta velocidad de corriente), resultan dominantes en gran parte de ellas. Se han reconocido un total de 6 microcistinas acumuladas intracelularmente en la comunidad bentónica de cianobacterias, identificando 3 de ellas: MC-RR, MC-LR y MC-YR. La concentración de microcistinas intracelulares ha disminuído a lo largo del eje principal del río Muga, determinada por diferentes factores físicos, químicos y biológicos. A nivel general, la acumulación total de microcistinas intracelulares ha estado asociada a un aumento de la temperatura del agua, un descenso en la diversidad de la comunidad de cianobacterias y pequeños incrementos de la concentración de fósforo disuelto en el agua. En cuanto a la liberación de microcistinas, ha estado vinculada a distintas perturbaciones soportadas por la comunidad cianobacteriana, tanto asociadas a factores físicos naturales como antrópicos. / The study of cyanobacteria communities in the Muga River basin enables further search for factors that promote or inhibit the intracellular accumulation of microcystins and their external release in oligotrophic or sligthly eutrophic conditions. At the same time, it provides new knowlodge to improve the understanding of the mechanisms and proccesses involved in the community dynamics of benthic cyanobacteria and associated microcystins in Mediterranean River ecosystems. A two-year study of the structure and variability of cyanobacterial communities was carried out: monthly sampling during the first annual cycle and lower frequency sampling during the second cycle. This allows observing the different spatial-temporal patterns over the study period in the 4 selected sampling points in the Muga River basin. These 4 points comprise 1 regulated point downstream of the Boadella reservoir, and 3 unregulated points, namely 2 headers and a thrid one downstream of Albanyà village. A total of 34 species of benthic cyanobacteria were identified in the 4 studied areas. The predominant species were linked to clear waters or slightly altered areas. 2 species were dominant in most of them: Rivularia biasolettiana (in cleaner and exposed areas) and Phormidium retzii (in unexposed areas or with high flow velocity).In the benthic community of cyanobacteria, a total of 6 intracellular microcystins were detected. 3 of them were identified: MC-RR, MC-LR and MC-YR. The accumulation of intracellular microcystins decrease along the stream as determined by different physical, chemical and biological factors. At a general level, the total accumulation of intracellular microcystins was associated with an increase in water temperature, a decrease of benthic cyanobacterial diversity and small increases in the concentration of dissolved phosphorus in the water. On the other hand, microcystins release was linked to the effects of different physical disturbances on the cyanobacterial community, wether of natural or anthropical origin.

[ES] El agua es esencial para la vida. La presente Tesis ha estudiado el uso de ozono y peroximonosulfato como oxidantes en tratamientos de agua para el control de subproductos de desinfección o degradación de contaminantes. La pre-ozonización del agua natural, se consideró como un tratamiento general del agua potable capaz de minimizar la formación de subproductos de la desinfección (DBP). En esta tesis, sin embargo, se ha demostrado que la pre-ozonización de aguas superficiales que contienen cianobacterias comunes, no es un tratamiento adecuado para controlar los DBP basados en cloración (trihalometanos, ácidos haloacéticos, halonitrilos, halocetonas y tricloronitrometano). Los procesos de oxidación avanzada (POAs) basados en ozono y peroximonosulfato se consideran algunas de las tecnologías preferibles para la degradación de contaminantes del agua. Esta tesis ha demostrado que la funcionalización adecuada del carbón activo mediante tratamiento químico da como resultado una funcionalización superficial del carbón con una gran población de grupos funcionales de oxígeno capaces de depositar pequeñas nanopartículas de cobalto. El material resultante exhibe una actividad catalítica para la activación del PMS y la degradación del fenol superior a la mayoría de los estudios previos en este campo. También ha mostrado la posibilidad de desarrollar catalizadores de ozonización libres de metales altamente activos basados en grafito de alta área superficial hidroxilado en los bordes o en nanodiamantes sp2 / sp3 defectuosos. / [CA] L'aigua és essencial per a la vida. La present Tesi ha estudiat l'ús d'ozó i peroximonosulfat com oxidants en tractaments d'aigua per al control de subproductes de desinfecció o degradació de contaminants. La pre-ozonació de l'aigua natural, es va considerar com un tractament general de l'aigua potable capaç de minimitzar la formació de subproductes de la desinfecció (DBP). En aquesta tesi, però, s'ha demostrat que la pre-ozonació d'aigües superficials que contenen cianobacteries comuns, no és un tractament adequat per controlar els DBP basats en cloració (trihalometans, àcids haloacétics, halonitrilos, halocetones i tricloronitrometà). Els processos d'oxidació avançada (POAs) basats en ozó i peroximonosulfat es consideren algunes de les tecnologies preferibles per a la degradació de contaminants de l'aigua. Aquesta tesi ha demostrat que la funcionalització adequada del carbó actiu mitjançant tractament químic dóna com a resultat una funcionalització superficial de l'carbó amb una gran població de grups fun-cionals d'oxigen capaços de dipositar petites nanopartícules de cobalt. El material resultant exhibeix una activitat catalítica per a l'activació del PMS i la degradació del fenol superior a la majoria dels estudis previs en aquest camp. També ha mostrat la possibilitat de desenvolupar catalitzadors d'ozonització lliures de metalls altament actius basats en grafit d'alta àrea superficial hidroxilat en les vores o en nanodiamants sp2 / sp3 defectuosos. / [EN] Water is essential for life. The present Thesis studied the use of ozone and peroxymonosulfate as oxidants in water treatments for disinfection by-products control or pollutant degradation. Pre-ozonation of natural water was considered as a general drinking water treatment able to minimize the formation of DBPs. In this Thesis, however, it has been demonstrated that pre-ozonation of surface water containing common cyanobacteria is not a suitable treatment for controlling chlorination-based DBPs (trihalomethanes, haloacetic acids, haloace-tonitriles, haloketones and trichloronitromethane). AOPs based on ozone and peroxymonosulfate are considered to be some of the preferable technologies for water pollutant degradation. This Thesis has shown that appropriate activated carbon functionalization by chemical treatment results in a surface functionalization with a large population of oxygen functional groups able to deposit small cobalt nanoparticles. The resulting material exhibits a catalytic activity for PMS activation and phenol degradation superior to most of the previous studies in the field. It has also shown the possibility of developing highly active metal-free ozonation catalysts based on edged-hydroxylated high surface area graphite or defective sp2/sp3 nanodiamonds. / Bernat Quesada, F. (2021). Ozone and peroxymonosulfate as oxidants in water treatments for disinfection by-products control or pollutant degradation [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/174887 / TESIS