BRITO, Teresinha Silva de. Vasodilatação causada pelo 1-nitro-2-feniletano em aorta de rato : provável estimulação da guanilato ciclase. 2012. 105 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-07-26T11:48:12Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_tsbrito.pdf: 5911819 bytes, checksum: aa0eba5915de704484ec5f3bc2d5bbc7 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-08-06T11:52:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_tsbrito.pdf: 5911819 bytes, checksum: aa0eba5915de704484ec5f3bc2d5bbc7 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T11:52:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_tsbrito.pdf: 5911819 bytes, checksum: aa0eba5915de704484ec5f3bc2d5bbc7 (MD5) Previous issue date: 2012 / It was early shown that intravenous treatment with 1-nitro-2-phenylethane (NPE) induced hypotension resulting mainly from its direct vasodilatory action on vascular smooth muscle. Here, it was sudied the underlying mechanism involved in the vasorelaxant effect of NPE in isolated rings of rat arteries. Isometric recordings were obtained from rings made from aorta or mesenteric artery using a digital acquisition system. Experiments in silico (docking) for simulation of molecular interactions between NPE and the enzyme guanylate cyclase were performed. In endothelium-intact aortic preparations, NPE (1-300 g/mL) relaxed the phenylephrine or K+-induced contractions with IC50 values of 35.0 [23.3- 52.6] and 73.2 [39.5-134.3] g/mL, respectively. Vasorelaxant effects of NPE were significantly (P <0.05, Mann-Whitney test) decreased by pretreatment with ODQ (10 µM), methylene blue (10 µM), TEA (5 mM), glibenclamide (10 µM) or 4-aminopyridine (1 mM) but not by vascular endothelium removal or by pretreatment with L-NAME (100 µM), indomethacin (10 µM), MDL-12.330A (3 µM), KT5823 (0.5 µM ) or KT5720 (1 µM). Pharmacological potency of NPE was significantly greater (p <0.01, Mann-Whitney test) in preparations of mesenteric artery compared to that of aorta, as in K+- and norepinephrine-induced contraction with IC50 values of 5.3 [2.6-10.5] and 6.5 [2.8-14.9] g/mL, respectively. In calcium-free medium, in presence of K+ 60 mM or phenylephrine 1 μM, the CaCl2-induced contractions were significantly reduced and almost abolished by NPE at 100 μg/mL, respectively. In calcium-free medium, containing EGTA, the contractile response of phenylephrine was significantly reduced by NPE (100 g/mL), an effect prevented by treatment with ODQ (10 µM), whereas NPE was deprived of any significant effect on caffeine-induced contractions. Similar results were obtained with sodium nitroprusside. NPE also inhibited the contractions induced by the capacitive calcium entry or by phorbol ester. In addition, docking results revealed clusters of interactions of NPE with the guanylate cyclase molecule. The present study suggests that vasorelaxant activity of NPE on rat aorta is due to its stimulatory properties on guanylate cyclase, which activates the guanylate cyclase/cGMP/K+ channels pathway. / Previamente, foi demonstrado que o tratamento via intravenosa com 1-nitro-2-feniletano (NFE) induziu hipotensão que resulta principalmente de sua ação vasodilatadora diretamente sobre o músculo liso. Nesse estudo, estudamos o mecanismo subjacente ao efeito miorrelaxante do NFE em tecidos vasculares isolados de ratos. Registros isométricos foram obtidos a partir de anéis isolados de artéria aorta e do segundo ramo da mesentérica de ratos através de sistema de aquisição de dados. Experimentos in silico (docking) de simulação da formação de complexos entre o NFE e a enzima guanilato ciclase foram realizados. Em preparações de aorta isolada com endotélio intacto, NFE (1-300 g/mL) relaxou a contração induzida por fenilefrina ou K+, com valores de CI50 de 35,0 [23,3–52,6] e 73,2 [39,5–134,3] g/mL, respectivamente. Os efeitos vasorrelaxantes do NFE foram significativamente (P < 0,05, teste de Mann-Whitney) reduzidos pelo tratamento prévio com ODQ (10 µM), azul de metileno (10 µM), TEA (5 mM), glibenclamida (10 µM) ou 4-aminopiridina (1 mM), mas não pela remoção do endotélio vascular ou pelo pré-tratamento com L-NAME (100 μM), indometacina (10 μM), MDL-12.330A (3 μM), KT5823 (0.5 µM) ou KT5720 (1 μM). A potência do NFE para induzir efeito vasorrelaxante foi significantemente maior (p < 0,01, teste de Mann-Whitney) nas preparações de artéria mesentérica quando comparado à aorta, tanto nas contrações induzidas por K+ como por noradrenalina com valores de CI50 de 5,3 [2,6–10,5] e 6,5 [2,8–14,9] µg/mL, respectivamente. Em um meio sem cálcio, na presença de K+ 60 mM ou fenilefrina 1 µM, as contrações induzidas CaCl2 foram significativamente reduzidas e até mesmo abolidas pelo NFE na concentração de 100 µg/mL, respectivamente. Em meio sem cálcio, contendo EGTA, a resposta contrátil da fenilefrina foi significantemente reduzida pelo NFE (100 µg/mL ), efeito impedido pelo tratamento com ODQ (10 µM), enquanto não teve efeito significativo sobre as contrações induzidas por cafeína. Resultados semelhantes foram obtidos com nitroprussiato de sódio. NFE também foi capaz de inibir a contração induzida pela entrada capacitativa de cálcio e pelo éster de forbol. Além disso, os resultados de docking revelam que existem clusters de prováveis interações do NFE com a enzima guanilato ciclase. O presente estudo sugere que a atividade vasorrelaxante do NFE em aorta de rato é causada por provável estimulação da guanilato ciclase e consequente ativação da cascata enzimática guanilato ciclase/GMPc/canais de K+.

CABRAL, P. H. B. Efeitos cardiovasculares do composto [RU(BPY)2(Tioureia)(NO)](FOR 0812) em ratos normotensos e hipertensos. 2016. 124 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-12-20T11:41:41Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_phbcabral.pdf: 3593366 bytes, checksum: 9c3931febf1545f3558996f1c09a3c07 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-12-20T11:44:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_phbcabral.pdf: 3593366 bytes, checksum: 9c3931febf1545f3558996f1c09a3c07 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-20T11:44:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_phbcabral.pdf: 3593366 bytes, checksum: 9c3931febf1545f3558996f1c09a3c07 (MD5) Previous issue date: 2016-08-17 / Ruthenium coordinated nitric oxide donors which do not release cyanide can be less toxic models for the development of drugs to treat angina and hypertensive crisis. The compound [Ru(bpy)2(tioureia)NO(PF6)3]– FOR0812, was synthesized and probed in vitro for its potential vasodilator activity and in vivo for its antihypertensive properties. First, we tested its effects on thoracic aortic rings harvested from male Wistar rats (200-250g). The rings were mounted in 5 ml organ baths in Krebs-Henseleit warmed to 37°C and gassed with 5%CO2 in 95%O2. The tissues were coupled to isometric force transducers under a 1g passive tension and coupled to a data acquisition system and recorded by using LabChart 7.0. FOR0812 was added cummulatively (10-12 a 10-4M) in aortic rings precontracted with phenylephrine or high potassium (60mM). On the other hand, in order to test the potential antihypertensive effects of FOR0812 the drug was administred at 1mg/kg by the oral route during 15 days to 2kidney-1clip hypertensive rats (2K-1C), Dahl salt-sentitive rats (DS) and to spontaneously hypertensive rats (SHR). In addition, the acute effects of intravenous bolus injections of 0.001- 1mg/Kg FOR0812 on systemic hemodynamics and cardiac eletromechanics were also studied by using microtip pressure-volume catheters inserted in the left ventricle and electrocardiogram analysis.FOR 0812 induced a concentration-dependent relaxation of 103±2.3 % with an IC50 of 0.24 µM[0.084 – 0.72] while the positive control sodium nitroprusside had a maximal relaxant effect of 108±5.3% with an IC50 of 0.05 µM[0.025 –0.12]. 100 µM L-NAME did not affect the maximal vasorelaxation induced by FOR0812 but reduced potency by 8-fold. Nevertheless, the vasorelaxant effect of FOR0812 was completely blunted by ODQ (10µM), (*p<0.05). The potency for the vasorelaxant of FOR0812 was reduced 5.8-fold by glibenclamide, 5.4-fold by apamin-carybdotoxin and by 11-fold by tetraethylammonium. The vasorelaxant response was greatly blunted by a nitric oxide scavenger, hydroxocobalamin (FOR0812=103±2.3 % vs. FOR0812+hydroxocobalamin=32.4%, *p<0.05). However, the removal of nitroxyl anions (NO-) with 3 mM L-cystein, did not affect the vasorelaxant effect of FOR0812. Similarly, the blockade of RhoA/Rho kinase (ROCK) with fasudil (HA-1077) did not affect the vasorelaxant effect of FOR0812. The blockade of prostaglandin synthesis with indomethacin did not affect the maximal vasorelaxation incuced by FOR0812 but reduced its potency by 2-fold. Strikingly, FOR0812 reduced mean arterial blood pressure (MAP) of 2K-1C rats from 181.5±3.6 mmHg to 149±3.1 mmHg after 4 days of treatment and continued to decrease MAP towards normal levels and at the end of the experimental period, i.e., 15th day the MAP of control rats was 171.1±3,2 mmHg while rats treated with FOR0812 had values of 111.4±6.9 mmHg. In the group treated only with vehicle (saline) the MAP continued high during the whole experimental period (>160mmHg). FOR also reduced MAP of DS rats from 158.8± 5.6 mmHg to 122.6±6.7mmHg after six days of treatment and this effect lasted throughout the experiment and at the end the control group treated with vehicle had MAP of 158.9±4.2 mmHg while DS rats treated with FOR0812 had MAP of 118.1±5.8mmHg. The intravenous injection of FOR at 0.001; 0.01; 0.1 and 1 mg/Kg decreased vascular resistance (expressed in mmHg x ml/min) of normotensive rats from control values of 6.5±0.8 to 5.6±0.7;4.9±0.6; 4.8±0.6 and 2.6±0.6, respectively. FOR0812 increases in a dose-dependent fashion the systolic work and cardiac output due to decreased afterload. At the higher doses, this compound decreases cardiac maximal dP/dt due to decreased left ventricular pressure. However, at the dose range used, the preload recruitable stroke work is not affected. In conclusion, FOR0812 has antihypertensive effect decreasing cardiac afterload and can decrease wall stress and myocardial oxygen demand in patients with hypertension and acute ischemic heart disease. / Complexos metálicos Ru-NO estáveis, não formadores de cianeto, são capazes de promover relaxamento do músculo liso vascular e são compostos potenciais para uso em distúrbio cardiovasculares como angina e crise hipertensiva. O composto [Ru(bpy)2(tioureia)NO(PF6)3] – FOR0812, foi estudado com objetivo de demonstrar possível efeito vasorelaxante in vitro e anti-hipertensivo in vivo. Ratos Wistar machos (200-250g) foram sacrificados, anéis de 4mm de aorta torácica foram montadas em banho de órgãos de 5 ml a 37°C e aerados com mistura carbogênica (5%CO2 em 95%O2). Os tecidos foram acoplados a um transdutor isométrico sob tensão passiva de 1g e os registros experimentais foram obtidos através de um sistema de aquisição de dados. A droga foi adicionada de maneira cumulativa (10-12 a 10-4M) no platô das contrações. Os estudos in vivo foram feitos em ratos com hipertensão renovascular (2 rins-1 clip), ratos Dahl sensíveis ao sal e ratos espontaneamente hipertensos (SHR) recebendo o composto FOR0812 (1mg/Kg) por via oral durante 15 dias. Os efeitos agudos na hemodinâmica sistêmica e eletromecânica cardíaca também foram estudados. Ademais, estudamos a razão da variação da pressão intracavernosa pela variação na pressão arterial em modelos de disfunção erétil por neuropatia diabética após tratamento agudo com FOR0812. Para os estudos hemodinâmicos um microcateter pressão-volume foi inserido na carótida direita e deslocado até o ventrículo esquerdo. Similarmente, a veia jugular esquerda foi canulada para infusão em bolus do composto nas doses 0,001 a 1mg/Kg. A adição de FOR 0812 induziu relaxamento na aorta da ordem de 103±2,3 % com IC50 de 0,24 µM[0,084 – 0,72] comparado com 108±5,3% e 0,05µM[0,025 –0,12] obtido com SNP. A potência do FOR 0812 foi reduzida em oito vezes por L-NAME(100µM). Por outro lado, a resposta relaxante do metalofármaco foi completamente abolida na presença de ODQ (10µM),(*p<0,05). A potência relaxante do composto FOR0812 também foi reduzida na presença de inibidores de canais de K+ na ordem de 5,8 vezes (glibenclamida), em 5,4 vezes (mistura apamina-iberotoxina) e em 11,2 vezes (tetraetilamônio). Em tecidos pré-tratados com hidroxicobalamina(100µM), um removedor de óxido nítrico (NO.) a resposta máxima relaxante para FOR0812 foi grandemente reduzida (Emáx=103±2,3 % vs. 32,4%, *p<0,05). No entanto a remoção do ânion nitroxil (NO-), em tecido pré-incubados com 3 mM de L-cisteína, não afetou a resposta relaxante para FOR0812. Similarmente, o bloqueio da enzima RhoA/Rho kinase (ROCK) com fasudil (HA-1077) não afetou a resposta relaxante para FOR0812. Em tecidos pretratados com indometacina, houve redução da potência em duas vezes quando comparado ao FOR0812. In vivo, o composto reduziu a pressão arterial de animais com hipertensão renovascular (2rins-1clipe) já no quarto de dia de tratamento (181,5±3,6 mmHg vs. 149±3,1 mmHg) e continuou diminuindo os níveis pressóricos até o fim do tratamento (171.1±3,2 mmHg –controle vs. 111.4±6,9mmHg - tratado). Animais tratados apenas com salina tiverem níveis pressóricos altos (>160mmHg) até o fim do período experimental. Nos animais com hipertensão sal-sensível, o composto reduz a pressão já no sexto dia de tratamento (158,8± 5,6 mmHg vs. 122,6±6,7mmHg-tratado) e o composto continua controlando a pressão até o final do tratamento (158,9±4,2 mmHg vs. 118,1±5,8mmHg-tratado). Animais tratados com salina (veículo) tiveram pressão elevada até o final do experimento.Este composto, nas doses de 0,001; 0,01; 0,1 e 1 mg/Kg , diminui a resistência periférica total (expressa em mmHg x ml/min) de ratos normotensos de valores controle de 6,5±0,8 para 5,6±0,7;4,9±0,6; 4,8±0,6 e 2,6±0,6. Aumenta gradativamente o trabalho sistólico e o débito cardíaco, por diminuição de pós-carga. Nas doses maiores (0,1 e 1 mg) tende a diminuir a dp/dt máxima por reduzir pressão do ventrículo esquerdo por diminuição de pós-carga. NO entanto, o trabalho sistólico recrutável não é prejudicado até a dose de 1mg/kg. O composto FOR0812 tem atividade antihipertensiva por reduzir resistência periférica total atuado como vasodilatador arterial como doador de NO de maneira estável, lenta e sem geração de cianeto.

SOUSA, Ticiana Meireles. Ações farmacológicas da ser-thr-lys-guanilina em sistema de perfusão de rim isolado em rato. 2005. 122 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2005. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-16T19:44:01Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_tmsousa.pdf: 1007904 bytes, checksum: 3a32192e3e1f7dc17ab8c3e0d9c25ec7 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-18T13:02:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_tmsousa.pdf: 1007904 bytes, checksum: 3a32192e3e1f7dc17ab8c3e0d9c25ec7 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-18T13:02:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_tmsousa.pdf: 1007904 bytes, checksum: 3a32192e3e1f7dc17ab8c3e0d9c25ec7 (MD5) Previous issue date: 2008 / Guanylin and uroguanylin are members of a family of peptides that stimulates cGMP production in several organic tissues, as intestine, kidney, airway, linfonodes, testis, brain and adrenal medulla (Field et a.l., 1978; Forte et al., 1988, 1989; Hamra et al., 1993; Schulz et al., 1992). Their 15 amino acid structures have been identified from rat intestine and opossum urine, respectively (Currie et al., 1992; Hamra et al., 1993), and they seem to be the link between intestine and kidney functions in controling blood pressure, as the “intestinal natriuretic hormone” suggested by some authors (Carey, 1978; Lennane et al., 1975). It was demonstrated that a Lysine-1 analog of guanylin is a more potent natriuretic and kaliuretic peptide. The aim of this study was to evaluate the renal effects of a novel analog of guanylin: ser-thr-lys-guanylin. Its effects were examined using isolated perfused kidneys from Wistar rats. All experiments were preceded by a 30 minutes internal control period and an external control group (C), in which the kidneys were perfused only with Krebs-Henseleit solution containing 6g% of a previously dialysed bovine albumine serum. The data was analyzed by Student t-test and ANOVA. The level of significance was set at p<0,05. Ser-thr-lys-guanylin, at the lowest dose (0.1 µg/mL) and uroguanylin (0.5µg/mL) caused similar effects. Both groups were able to increase perfusion presure (PP: 101.5±3.7 to 111±2.9mmHg; 101.2±2.6 to 113.4±2.5 mmHg), urinary flow (UF: 0.158±0.016 to 0.223±0.019 mL.g-1.min-1; 0.16±0.016 to 0.226±0.2mL.g-1.min-1) and to decrease sodium (%TNa+: 0.774±0.06 to 0.724±0.035; 0.735±0.065 to 0.773±0.084), potassium (%TK+: 66.89±2.77 to 47.29±3.34; 63.54±3.82 to 42.54±8.14) and cloride (%TCl-: 85.69±1.19 to 73.59±2.63) tubular reabsorption. Similar effects were also found in response to the Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STa), guanylin, uroguanylin and lys-guanylin in the same system (Lima et al., 1992; Fonteles et al., 1996 e 1998). However, a greater dose (1µg/mL), not only caused signifcantly decrease in the urinary flow (UF: 0.165±0.004 to 0.111±0.009 mL.g-1.min-1), but was also able to block the diuretic effects of uroguanylin (UF: 0.168±0.004 to 0.116±0.006 mL.g-1.min-1), although it still decreased potassium (%TK+: 72.29±1.2 to 49.73±6.75) and cloride(%TCl-: 85.96±0.79 to 81.9±1.47) tubular reabsorption. The precise renal mecanism of action of this family of peptides has not yet been fully elucidated. Deletion of GC-C genes in transgenic mice reveals that intestinal fluid secretion responses to STa are completely lost (Schulz et al., 1997 & Mann et al., 1997), but the natriuretic responses to STa and uroguanylin are retained (Carrithers et al., 1999), suggesting that other receptors are envolved. There is a possibility that there are to peptides causing antagonic effects. Further isolation may be necessary. Further studies are required to elucidate the specific renal mechanism of action of this new peptide. The discovery of guanylin and its family has promoted significant advances in the understanding of endogenous control of salt, water and eletrolites. The study of its analogs in perfused rat kidneys could help in elucidating their specific renal mecanism of action and bring great perspectives in the control of blood pressure. / A guanilina e a uroguanilina foram recentemente descobertas, respectivamente, no intestino e na urina, (Currie et al., 1992; Hamra et al., 1993). Fazem parte da família de peptídeos que ativam a guanilato ciclase de membrana (GC-C), aumentando os níveis intracelulares de cGMP (Schulz et al., 1990). Estão presentes em diversos tecidos, como respiratório, linfonodos, testículos, cérebro e medula adrenal (Field et a.l., 1978; Forte et al., 1988, 1989; Hamra et al., 1993; Schulz et al., 1992). Foi comprovado que adicionando uma lisina na porção N-terminal, obtêm-se um análogo mais estável e potente que a guanilina. O objetivo desse estudo é pesquisar os efeitos renais de um novo análogo, ser-thr-lys-guanilina em sistema de perfusão. Os rins foram perfundidos com a solução de Krebs-Henseleit modificada com 6g% de albumina bovina. Os dados foram comparados através de teste t de Student e ANOVA, com significância p<0,05. Na dose de 0,1 µg/mL, esse peptídeo apresentou efeitos similares aos da uroguanilina, na dose de 0,5 µg/mL, em todos os parâmetros testados. Ambas causaram aumento na pressão de perfusão (PP: de 101,5±3,7 para 111±2,9mmHg; de 101,2±2,6 para 113,4±2,5mmHg), no fluxo urinário (FU: de 0,158±0,016 para 0,223±0,01 mL.g-1.min-1; de 0,16±0,016 para 0,226±0,2mL.g-1.min-1) e diminuição no transporte tubular total e proximal de sódio (%TNa+: de 0,774±0,06 para 0,724±0,035; de 0,735±0,065 para 0,773±0,084), potássio (%TK+: de 66,89±2,77 para 47,29±3,34; de 63,54±3,82 para 42,54±8,14) e cloreto (%TCl-: de 85,69±1,19 para 73,59±2,63). Esses resultados foram similares aos previamente descritos após a administração da toxina termo-estável da Escherichia coli (STa), guanilina, uroguanilina e lys-guanilina no mesmo sistema (Lima et al., 1992; Fonteles et al., 1996 e 1998). A dose maior (1 µg/mL) causou ação antidiurética (FU: de 0,165±0,004 para 0,111±0,009mL.g-1.min-1) e nenhum efeito sobre o transporte de sódio, embora a diminuição na reabsorção tubular de potássio (%TK+: de 72,29±1,2 para 49,73±6,75) e cloreto (%TCl-: de 85,96±0,79 para 81,9±1,47) continuassem presentes. Nesta dose, não apenas bloqueou o efeito diurético da uroguanilina, como continuou causando um efeito antidiurético significativo (FU: de 0,168±0,004 para 0,116±0,006). No entanto, não foi capaz de bloquear os efeitos natriuréticos da uroguanilina (%TNa+: de 85,35±2,55 para 79,92±1,05). O mecanismo de ação renal preciso dos peptídeos da família das guanilinas ainda não foi completamente esclarecido. Sabe-se que esses peptídeos se ligam aos receptores GC-C (Schulz et al., 1990), porém há indícios de que existam outras vias de ação renal, independentes desse receptor. Há ainda a possibilidade de que haja duas entidades agindo de modo antagônico no sistema. Talvez haja a necessidade de isolá-los. A descoberta dos peptídeos da família das guanilinas promoveu avanços significativos na compreensão da regulação endógena dos transportes de água e eletrólitos. O completo esclarecimento do seu mecanismo de ação renal oferece perspectivas reais para o tratamento de doenças como a hipertensão arterial.

TEIXEIRA, Antonio Éder Enzo Albuquerque. Efeito protetor do complexo de rutênio (II) (cis-[RuCl(qui)(bpy)2]PF6) contra lesão gástrica induzida por naproxeno : possível papel regulador da enzima guanilato ciclase solúvel. 2015. 87 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-29T14:15:50Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_aeeateixeira.pdf: 1914602 bytes, checksum: 53f9d8526d9568c9e02bc126aed15b8c (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-29T14:17:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_aeeateixeira.pdf: 1914602 bytes, checksum: 53f9d8526d9568c9e02bc126aed15b8c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-29T14:17:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_aeeateixeira.pdf: 1914602 bytes, checksum: 53f9d8526d9568c9e02bc126aed15b8c (MD5) Previous issue date: 2015 / Introduction: NSAIDs contribute to the pathogenesis of gastrointestinal ulcers and represent an important etiologic factor because is commonly used in clinical practice. Aim: To evaluate the protective effect of the ruthenium complex (II) (cis-[RuCl(qui)(bpy)2]PF6), against the gastric damage induced by naproxen (NPX) in mice. Methods: Swiss mice were used (18-22g). Measure the GMPc levels incubating samples of gastric tissues with DMSO, with the complex of RU (II) and with ODQ, 30 μm of each compound, for 5 minutes. The groups evaluated were: control group that received CMC, group vehicle, in which was administered NPX (300 mg/kg) and who received complex of RU (II), all by gavage. The animals were treated with the complex of RU (II), in the doses of 0.3, 3 and 30 mg/kg. After 30 minutes, was followed with the induction of the lesion with NPX. Following the same protocol, it was evaluated the effect of the compound and its precursors, in dose of 3mg/kg, by gavage. It was verified the effect of compound in accession and leukocyte bearing; following the protocols described, both the bearing for accession were evaluated 3h after the induction of gastropathy and modulation with ODQ (10 mg/kg) by gavage. It examined the effect of the complex of RU (II) in mesenteric arteries of Wistar rats (200-250 g) pre-contracted with phenylephrine (PHE) (0.3 μM). Simulated-If the connection between the compound and the enzyme GCs from resources available in the site that contains the database of proteins. Results: Tissues incubated with metallopharmaceutica had a significant increase in the production of cGMP, when compared to the recipient that contained the solvent and ODQ. Ru complex (II), inhibited the gastric lesions induced by NPX in mice, with maximum effect in dose of 3 mg/kg-1. Only integral Ru complex (II) administration reversed gastric damage. The metallopharmaceutical reduced the leukocyte adhesion and rolling, and the ODQ not reversed this gastroprotetion. The metallopharmaceutical abolished the contraction promoted by PHE, inducing the relaxation of vessel and ODQ can’t reversed this effect. It was observed that Ru complex (II) turns in a more stable in the catalytic domain of the sGC. Conclusions: This compound prevented the gastric damage induced by naproxen in mice, through increased cGMP levels, decreased leukocyte adhesion and rolling, and still due to maintenance of gastric blood flow, with the binding site independent of ODQ, in sGC. / Introdução: Os AINEs são um dos principais agentes que contribuem para a patogênese da úlcera gastrintestinal e representam um importante fator etiológico por serem comumente utilizados na prática clínica. Objetivo: Avaliar o efeito protetor do complexo de rutênio (II) (cis-[RuCl(qui)(bpy)2]PF6), contra a lesão gástrica induzida por naproxeno (NPX) em camundongos. Métodos: Foram utilizados camundongos Swiss (18-22g). Mensuramos os níveis de GMPc incubando amostras de tecidos gástricos com DMSO, com o complexo de Ru (II) e com ODQ, 30 μm de cada composto, por 5 minutos. Os grupos avaliados foram: grupo controle que recebeu CMC, grupo veículo, em que foi administrado NPX (300 mg/kg) e o que recebeu complexo de Ru (II), todos por gavagem. Os animais foram tratados com o complexo de Ru (II), nas doses de 0,3, 3 e 30 mg/kg. Após 30 minutos, seguiu-se com a indução da lesão com NPX. Seguindo o mesmo protocolo, avaliou-se o efeito do composto em estudo e de seus precursores, na dose de 3mg/kg, por gavagem. Verificou-se o efeito do composto na adesão e rolamento leucocitários; seguindo os protocolos descritos, tanto o rolamento quanto a adesão foram avaliados 3h após a indução de gastropatia e de modulação com ODQ (10 mg/kg) por gavagem. Analisou-se o efeito do complexo de Ru (II) em artérias mesentéricas de ratos wistar (200-250g) pré-contraídas com fenilefrina (PHE) (0,3 μM). Simulou-se a ligação entre o composto e a enzima GCs a partir de recursos disponíveis em site que contém banco de dados de proteínas. Resultados: Os tecidos incubados com composto metálico tiveram um aumento significativo da produção de GMPc, quando comparado ao meio que continha o diluente e ODQ .O complexo de Ru (II) inibiu a lesão gástrica induzida por NPX em camudongos, com efeito máximo na dose de 3 mg/kg. Apenas a administração do complexo de Ru(II) integral reverteu a lesão gástrica. O metalofármaco reduziu a adesão e o rolamento leucocitário e o ODQ não reverteu esta gastroproteção. O metalofármaco aboliu a contração promovida pela PHE, induzindo o relaxamento do vaso e o ODQ não reverteu este efeito. Observou-se que o complexo de Ru(II) liga-se de forma mais estável ao domínio catalítico da enzima. Conclusões: O composto preveniu a lesão gástrica induzida pela administração de naproxeno 300 mg/Kg em camundongos, por meio do aumento dos níveis de GMPc, diminuição da adesão leucocitária, e ainda devido à manutenção do fluxo sanguíneo gástrico por meio de sítio de ligação independente do ODQ, presente na enzima GC solúvel.

Orientador: Fabíola Taufic Monica Iglesias / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T16:27:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_WagnerMendes_M.pdf: 1252281 bytes, checksum: ad80513967190699e0001046decc7731 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Duas classes de medicamentos denominadas estimuladores e ativadores da guanilato ciclase solúvel (GCs) foram desenvolvidas para uso terapêutico em situações patológicas onde há menor formação ou biodisponibilidade NO ou tolerância farmacológica. A GCs é uma enzima heterodímera, composta pelas subunidades alfa (?) e beta (?), nas quais há a presença do grupo prostético heme e que catalisa a conversão da guanosina trifosfato (GTP) em guanosina monofosfato cíclico (GMPc) pela ação do NO. Em situações patológicas o átomo de ferro pode encontrar-se na sua forma oxidada (Fe3+), diminuindo assim a resposta máxima do óxido nítrico (NO). A principal diferença entre os moduladores da GCs é que os ativadores (BAY 58-2667, HMR 1766, BAY 60-2770) atuam de maneira mais eficaz mesmo quando a enzima encontra-se no estado oxidado. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar funcionalmente o relaxamento induzido pelo BAY 60-2770 em artéria pulmonar isolada de coelho. O BAY 60-2770 (0,0001-100 ?M) relaxou de maneira potente (10,1 ± 0.04) e eficaz (105 ± 0,9 %) a artéria pulmonar, sendo este efeito significativamente potencializado na presença dos inibidores da GCs (ODQ, 10 ?M, 4,9 vezes), da fosfodiesterase tipo 5 (tadalafil, 100 ?M, 5,6 vezes) ou da sintase de óxido nítrico (LNAME, 100 ?M, 3,0 vezes). A presença do sequestrador de NO, do doador de NO, da indometacina, do bloqueador do canal de potássio ou a remoção endotelial não interferiram no relaxamento induzido pelo BAY 60-2770. A fenilefrina (0,00001-3 mM) e a estimulação elétrica (4-16 Hz) produziram contração dependente da concentração e frequência, respectivamente. Na presença de tetrodotoxina (TTX, 1 ?M) e fentolamina (1 ?M) houve abolição da resposta contrátil a estimulação elétrica, mostrando a liberação neurogênica de catecolamina. Na presença de BAY 60-2770 co-incubado com ODQ uma redução significativa na contração induzida pela estimulação elétrica foi observada. Apesar desta mesma redução ter sido observada na presença do L-NAME, a mesma não foi estatisticamente significante em comparação aos anéis incubados somente com BAY 60-2770 (1 ?M). Nossos resultados mostraram que a oxidação do grupamento heme, a inibição da fosfodiesterase e a ausência do NO favoreceram a resposta relaxante do BAY 60-2770 / Abstract: Soluble guanylate cyclase (sGC) stimulators and activators have been developed for use in pathophysiological condition when NO formation or bioavailability are impaired or when NO tolerance gas developed. Soluble guanylate cyclase is a heterodimer enzyme composed by alpha (?) and beta (?) subunits and a prostetic heme group. Soluble guanylate cyclase converts guanosine triphosphate (GTP) into cyclic guanosine monophosphate (GMPc) after nitric oxide (NO) activaton. Under pathophysiological conditions heme can be oxidized (Fe3+), thus reduzing NO efficacy. The main difference between stimulators and activators (BAY 58-2667, BAY 60-2770 and HMR 1766) is that the latter class of drugs is more efficacious when heme is oxidized. The aim of the present study is to characterize the relaxation induced by BAY 60-2770 in isolated pulmonary artery from rabbit. BAY 60-2770 (0.0001-100 ?M) produced concentration dependent relaxation with potency and maxima response values of 10,1 ± 0.04 and 105 ± 0.9%, respectively. The inhibition of sGC (ODQ, 10 ?M) or phosphodiesterase type 5 (tadalafil, 100 ?M) or the nitric oxide synthase (L-NAME, 100 ?M) produced significantly leftward shifts by, approximately, 4.9, 5.4 and 3.0, respectively. The NO-scavenger, the NO-donor, the cyclooxygenase inhibition, the potassium channel blocker or endothelial removal did not interfere on the pharmacological parameters of BAY 60-2770. Phenylephrine (PE, 0.0001- 3 mM) and electrical field stimulation (EFS, 4-16 Hz) induced concentration and frequency dependent-contraction, respectively. Phentolamine (1 ?M) and tetrodotoxin (TTX, 1 ??) practically abolished EFS-induced contraction, showing the neurogenic source of catecholamines. Co-treatment with BAY 60-2770 with ODQ reduced significantly the EFS-induced contraction in comparison with BAY 60- 2770 (1 ?M) alone. Although we have observed a tendency of reduction in the amplitude of contraction when BAY 60-2770 was co-incubated with L-NAME, it was not statistically significant. Therefore, our results showed that the oxidation of heme group, the inhibition of phosphodiesterase and lower levels of NO favoured the relaxing response of BAY 60- 2770 in isolated rabbit pulmonary artery / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

SÁ, Denise Santos de. Complexos de Ru(II): síntese, caracterização e reatividade de potenciais vasodilatadores. 2015. 207 f. Tese (Doutorado em química)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-10-04T18:13:33Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_dssa.pdf: 6716820 bytes, checksum: 0ae4019e0609ccd2bbb93865c643e0c5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-10-05T23:15:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_dssa.pdf: 6716820 bytes, checksum: 0ae4019e0609ccd2bbb93865c643e0c5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T23:15:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_dssa.pdf: 6716820 bytes, checksum: 0ae4019e0609ccd2bbb93865c643e0c5 (MD5) Previous issue date: 2015 / Cardiovascular disease is a leading cause of death in the world and one of the factors contributing to this is associated with production and action of cyclic guanosine 3'-5'-monophosphate (cGMP) in a biological environment. Recent studies indicate that organic compounds such as YC-1 and BAY class, are able to act on the vasodilatation Once the performance of these organic compounds is dependent on the indole and azaindole rings and knowing they contain nonbonding pair of electrons, a series of complex type cis-[RuCl(L)(X-X)2]+wherein L is quinoline, 1H-indazole, 1H-indazole-6-caboxyaldehyde, 1Hbenzimidazole, 4-azaindole, 5-azaindole, or 7-azaindole, whereas X-X is 2,2-bipyridine or 1,10-phenanthroline, was prepared. The synthesis and characterization of these complexes was performed using elemental analysis, nuclear magnetic resonance spectroscopy, molecular absorption spectroscopy in the ultraviolet-visible, vibrational spectroscopy in the infrared region and conductivity and cyclic voltammetry supporting the formulation and purity of these compounds. Light irradiation data at 300 nm and 420 nm indicated these complexes are photosensitive. Furthermore, such complexes are capable of reacting with superoxide ion (IC50 in the range of 45 to 86 mmol L-1), this behavior that allows the complex to act as antioxidants. There is evidence that the complexes interact with bovine serum albumin, which might improve bioavailability of the drug. Vasodilation assays indicated that these complexes (IC50 between 55 and 700 nmol L-1) are efficient in rat aortic rings when compared to free ligands (IC50 between 560 and 8500 nmol L-1) and BAY-412 272 (IC50 440 nmol L-1). Moreover, assay carried out with the complex cis-[RuCl(5- ain)(bpy)2] + shows that it contributes to increase production of cGMP (about 600fmol per mg protein-1 ), indicative that this complex may be stimulating the activation of soluble guanylate cyclase (sGC) or inhibiting phosphodiesterase (PDE). Therefore, the overall data showed novel strategy is suitable to prepare pharmaceutical compounds for cardiovascular disease. / As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de morte em todo o mundo e um dos fatores que contribui para isto está associado à produção e à ação da guanosina 3’-5’-monofosfato cíclica (cGMP) em meio biológico. Estudos recentes indicam que compostos orgânicos, tais como os derivados do indazol (YC-1 e a classe dos BAY), são capazes de atuar na vasodilatação. Uma vez que a atuação desses compostos orgânicos é dependente dos anéis indólicos e azaindólicos, e sabendo que os mesmos contêm pares de elétrons não ligantes, foi sintetizado uma serie de complexos do tipo cis-[RuCl(L)(X-X)2]+, em que L é quinolina, 1H-indazol, 1H-indazol-6-caboxialdeído, benzimidazol, 4-azaindol, 5azaindol ou 7-azaindol, enquanto X-X é 2,2-bipiridina ou 1,10-fenantrolina. A síntese e a caracterização dos complexos foram realizadas empregando-se análise elementar, espectroscopia de ressonância magnética nuclear, de absorção molecular na região do ultravioleta-visível, vibracional na região do infravermelho bem como voltametria cíclica e a condutividade elétrica que sustentam a formulação e a pureza dos compostos. Os dados de irradiação de luz indicam que os complexos são fotossensíveis quando irradiados em 300 nm e 420 nm. Adicionalmente, tais complexos são capazes de reagir com o íon superóxido (IC50 na faixa de 45 a 86 µmol L-1), comportamento este que permite que os complexos atuem como antioxidantes. Os complexos interagem também com albumina sérica bovina, o que pode facilitar a biodisponibilidade do fármaco. Já os ensaios de vasodilatação indicam que os complexos (IC50 entre 55 e 700 nmol L-1) são mais eficientes no relaxamento da musculatura em anéis de aorta de ratos, quando comparado aos ligantes não coordenados (IC50 entre 560 e 8500 nmol L-1) e ao BAY-412272 (IC50 440). Além disto, ensaios realizados com cis-[RuCl(5-ain)(bpy)2]+ mostram que o mesmo contribui para aumentar a produção do cGMP (cerca de 600 fmol mg-1 por proteína), indicativo que tal complexo pode estar estimulando a ativação da guanilato ciclase solúvel (sGC) ou bloqueando a proteína fosfodiasterase (PDE). Portanto, os dados obtidos indicam que este trabalho se mostra inovador na produção de fármacos, proveniente de complexos, que atuam na vasodilatação.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-22T06:46:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 231431.pdf: 979113 bytes, checksum: 0b9ba07d0cdee414d632647f87fb9825 (MD5) / A alta produção de óxido nítrico (NO) é um dos principais responsáveis pela hipotensão e hiporeatividade a vasoconstritores, características clínicas do choque séptico. A ativação da enzima guanilato ciclase solúvel (sGC) responde pelos principais efeitos do NO durante esta patologia. Entretanto, há controvérsias a respeito se a utilização de inibidores desta enzima é uma opção efetiva e segura para o tratamento do choque séptico. A incubação in vitro de pulmões, retirados de animais controles ou injetados com LPS 24 h antes, com nitroprussiato de sódio (SNP), gerou um aumento de 20 vezes nos níveis de cGMP. Já em tecidos de animais injetados com LPS 8 h antes, o SNP falhou em aumentar os níveis de cGMP. Os níveis protéicos da sGC foram reduzidos no tempo de 8 h após a injeção de LPS e voltaram a valores normais em ratos injetados com LPS 24 h antes. A reposta vasoconstritora para fenilefrina foi reduzida em torno de 50 % em 8 e 24 h após a injeção de LPS. O azul de metileno (MeB), inibidor da sGC, restaurou a reatividade para fenilefrina em animais injetados com LPS 24 h antes, mas falhou em animais injetados 8 h antes. Para avaliar o efeito do azul de metileno sobre a mortalidade os animais foram submetidos ao procedimento de ligadura e perfuração do ceco (CLP). Quando os animais receberam MeB 8 h após o CLP, a mortalidade dos animais piorou. Entretanto, quando os animais receberam MeB no tempo de 20 h após o procedimento de CLP, ocorreu uma redução no índice de mortalidade. Portanto, o padrão de resposta da enzima sGC durante a sepse pode determinar o sucesso ou a falha do tratamento com seus inibidores. Assim, o azul de metileno pode ser uma estratégia terapêutica útil se administrado em uma janela correta de oportunidade.

As doenÃas cardiovasculares sÃo uma das principais causas de morte em todo o mundo e um dos fatores que contribui para isto està associado à produÃÃo e à aÃÃo da guanosina 3â-5â-monofosfato cÃclica (cGMP) em meio biolÃgico. Estudos recentes indicam que compostos orgÃnicos, tais como os derivados do indazol (YC-1 e a classe dos BAY), sÃo capazes de atuar na vasodilataÃÃo. Uma vez que a atuaÃÃo desses compostos orgÃnicos à dependente dos anÃis indÃlicos e azaindÃlicos, e sabendo que os mesmos contÃm pares de elÃtrons nÃo ligantes, foi sintetizado uma serie de complexos do tipo cis-[RuCl(L)(X-X)2]+, em que L à quinolina, 1H-indazol, 1H-indazol-6-caboxialdeÃdo, benzimidazol, 4-azaindol, 5azaindol ou 7-azaindol, enquanto X-X à 2,2-bipiridina ou 1,10-fenantrolina. A sÃntese e a caracterizaÃÃo dos complexos foram realizadas empregando-se anÃlise elementar, espectroscopia de ressonÃncia magnÃtica nuclear, de absorÃÃo molecular na regiÃo do ultravioleta-visÃvel, vibracional na regiÃo do infravermelho bem como voltametria cÃclica e a condutividade elÃtrica que sustentam a formulaÃÃo e a pureza dos compostos. Os dados de irradiaÃÃo de luz indicam que os complexos sÃo fotossensÃveis quando irradiados em 300 nm e 420 nm. Adicionalmente, tais complexos sÃo capazes de reagir com o Ãon superÃxido (IC50 na faixa de 45 a 86 Âmol L-1), comportamento este que permite que os complexos atuem como antioxidantes. Os complexos interagem tambÃm com albumina sÃrica bovina, o que pode facilitar a biodisponibilidade do fÃrmaco. Jà os ensaios de vasodilataÃÃo indicam que os complexos (IC50 entre 55 e 700 nmol L-1) sÃo mais eficientes no relaxamento da musculatura em anÃis de aorta de ratos, quando comparado aos ligantes nÃo coordenados (IC50 entre 560 e 8500 nmol L-1) e ao BAY-412272 (IC50 440). AlÃm disto, ensaios realizados com cis-[RuCl(5-ain)(bpy)2]+ mostram que o mesmo contribui para aumentar a produÃÃo do cGMP (cerca de 600 fmol mg-1 por proteÃna), indicativo que tal complexo pode estar estimulando a ativaÃÃo da guanilato ciclase solÃvel (sGC) ou bloqueando a proteÃna fosfodiasterase (PDE). Portanto, os dados obtidos indicam que este trabalho se mostra inovador na produÃÃo de fÃrmacos, proveniente de complexos, que atuam na vasodilataÃÃo. / Cardiovascular disease is a leading cause of death in the world and one of the factors contributing to this is associated with production and action of cyclic guanosine 3'-5'-monophosphate (cGMP) in a biological environment. Recent studies indicate that organic compounds such as YC-1 and BAY class, are able to act on the vasodilatation Once the performance of these organic compounds is dependent on the indole and azaindole rings and knowing they contain nonbonding pair of electrons, a series of complex type cis-[RuCl(L)(X-X)2]+wherein L is quinoline, 1H-indazole, 1H-indazole-6-caboxyaldehyde, 1Hbenzimidazole, 4-azaindole, 5-azaindole, or 7-azaindole, whereas X-X is 2,2-bipyridine or 1,10-phenanthroline, was prepared. The synthesis and characterization of these complexes was performed using elemental analysis, nuclear magnetic resonance spectroscopy, molecular absorption spectroscopy in the ultraviolet-visible, vibrational spectroscopy in the infrared region and conductivity and cyclic voltammetry supporting the formulation and purity of these compounds. Light irradiation data at 300 nm and 420 nm indicated these complexes are photosensitive. Furthermore, such complexes are capable of reacting with superoxide ion (IC50 in the range of 45 to 86 mmol L-1), this behavior that allows the complex to act as antioxidants. There is evidence that the complexes interact with bovine serum albumin, which might improve bioavailability of the drug. Vasodilation assays indicated that these complexes (IC50 between 55 and 700 nmol L-1) are efficient in rat aortic rings when compared to free ligands (IC50 between 560 and 8500 nmol L-1) and BAY-412 272 (IC50 440 nmol L-1). Moreover, assay carried out with the complex cis-[RuCl(5- ain)(bpy)2] + shows that it contributes to increase production of cGMP (about 600fmol per mg protein-1 ), indicative that this complex may be stimulating the activation of soluble guanylate cyclase (sGC) or inhibiting phosphodiesterase (PDE). Therefore, the overall data showed novel strategy is suitable to prepare pharmaceutical compounds for cardiovascular disease.

O segundo mensageiro cGMP está envolvido em diversas funções celulares incluindo a visão em mamíferos. Embora trabalhos anteriores mostrassem variações nos níveis de cGMP durante o ciclo de vida de Blastocladiela emersonii e evidências da existência de enzimas específicas envolvidas na sua síntese (guanilato ciclase) e degradação (cGMP fosfodiesterase), nenhum genoma de fungo publicado até o momento mostrou a existência de genes codificando estas enzimas. Este fato é atribuído por evolucionistas à completa perda de motilidade dos fungos em geral, já que cGMP está primordialmente associado a células com cílios. Blastocladiomicetos, como Blastocladiella, apresentam células móveis em pelo menos um estágio do seu ciclo de vida, o que poderia explicar a existência dessa via nesses fungos. Uma investigação no banco de ESTs de B. emersonii revelou a existência de cDNAs codificando parte de prováveis guanilato ciclases (BeGC1, BeGC2 e BeGC3) e uma possível cGMP fosfodiesterase (BePDE). Assim, este trabalho buscou confirmar a existência destas enzimas e caracterizar a sinalização por cGMP em B. emersonii. A proteína recombinante selvagem correspondente ao domínio catalítico de BePDE mostrou atividade de degradação sobre cGMP e a mutação E389A foi capaz de alterar a especificidade por cGMP. Com o sequênciamento do genoma de B. emersonii obteve-se as sequências completas das guanilato ciclases. Em BeGC2 não foi possível identificar o ligante responsável por sua ativação. Em BeGC3, a presença de um domínio Heme-Pas sugeriu sua ativação por óxido nítrico. A presença de um domínio rodopsina em BeGC1 sugeriu sua ativação por luz. Experimentos de microscopia por imunofluorescência localizaram BeGC1 no \"eyespot\", BeGC2 no capacete nuclear e BeGC3 no citoplasma de zoósporos de B. emersonii. Verificamos também que zoósporos realizam fototaxia em direção à luz verde e que a adição de hidroxilamina, inibidor de rodopsina, ou do inibidor de guanilato ciclase LY83583 tem efeito negativo na fototaxia, bem como impede o aumento dos níveis de cGMP observado em zoósporos expostos à luz verde. O bloqueio da síntese de retinal por Norflurazon também inibiu a fototaxia sendo esta restaurada quando adicionamos retinalA1. Estes dados, juntamente com o fato de o domínio rodopsina de BeGC1 ser a única rodopsina presente no genoma, indicam que BeGC1 é responsável pela fototaxia nos zoósporos de B. emersonii. O genoma do fungo apresenta ainda um possível canal de potássio ativado por cGMP (BeCNG1) localizado na membrana plasmática de zoósporos, similar ao canal regulado por cGMP envolvido na visão em humanos. Ensaios de microfluorimetria também evidenciaram a presença de um canal ativado por cGMP relacionado com o influxo de potássio e a motilidade dos zoósporos. Um modelo para a via de sinalização da fototaxia em B.emersonii foi proposto e comparado com a sinalização presente na visão de mamíferos, destacando a existência de cGMP e rodopsina em ambos os processos e sugerindo uma possível origem comum. Portanto, os resultados obtidos suportam a existência da sinalização por cGMP em B. emersonii, além de indicar o papel dessa sinalização na fototaxia dos zoósporos, sendo esta a primeira via de sinalização por cGMP caracterizada em fungos. / The second messenger cyclic GMP is involved in a wide array of cellular processes including vision in mammals. Although previous studies demonstrated changes in cGMP levels during the life cycle of Blastocladiela emersonii and evidences of specific enzymes involved in its synthesis (guanylyl cyclase) and hydrolysis (cGMP-phosphodiesterase), no fungal genome published so far shows the presence of genes encoding these enzymes. Evolutionists attribute the absence of cGMP signaling pathways in higher fungi to the sedentary life style of these organisms, since cGMP is primarily associated with ciliated cells. However, blastocladiomycetes like Blastocladiella, have motile cells in at least one stage of their life cycle, which could explain the existence of this pathway in these primitive fungi. Inspection of B. emersonii EST data bank, revealed cDNAs encoding part of three putative guanylyl cyclases (BeGC1, BeGC2 e BeGC3) and one possible cGMP phosphodiesterase (BePDE). Thus, the purpose of this study was to confirm the existence of these enzymes and characterize the cGMP signaling pathway in this model. The recombinant protein containing the wild type catalytic domain of BePDE presented activity towards hydrolysis of cGMP and the E389A mutation of this domain changed the cGMP specificity of this enzyme. The complete nucleotide sequence of the guanylyl cyclases were obtained by sequencing of B. emersonii genome. In BeGC2 we were unable identify the ligand responsible for its activation, but in BeGC3, the presence of a Heme-Pas domain suggested its activation by nitric oxide. The presence of a rhodopsin domain in BeGC1 suggested its activation by light. Immunofluorescence microscopy localized BeGC1 in the \"eyespot\" structure, BeGC2 in the nuclear cap and BeGC3 in the cytoplasm of zoospores of B. emersonii. We found that Blastocladiella zoospores performed phototaxis toward green light and photobleaching of rhodopsin function using hydroxylamine prevented both phototaxis and the increased cGMP levels observed when zoospores were exposed to green light. The same effect was observed using the guanylyl cyclase inhibitor LY83583. Inhibition of retinal synthesis using Norflurazon prevented the phototaxis response, which could be restored by zoospore complementation with retinalA1. The BeGC1 gene is the only rhodopsin found in the draft assembly of B. emersonii genome, which indicates that BeGC1 is responsible for phototaxis observed in zoospores. We also found in the genome a possible cGMP-activated potassium channel (BeCNG1), localized in the plasma membrane of the zoospores, which is similar to the cGMP-activated channel involved in human vision. In addition, microfluorimetry assays revealed the presence of a cGMP-activated potassium channel involved in potassium influx and zoospore motility. The signaling model of B. emersonii phototaxis was proposed and compared with the mammalian vision system, with cGMP and rhodopsin acting in both signaling pathways, suggesting a common origin. Altogether our data indicate that Blastocladiella emersonii has a cGMP signaling system involved in phototaxis, being the first cGMP signaling pathway characterized in fungi.

Recentemente, uma nova molécula de sinalização bacteriana, o AMP dimérico cíclico (c-di-AMP) emergiu como um regulador central dos processos fisiológicos essenciais, tais como a homeostase celular, verificação da integridade do DNA e virulência bacteriana, entre outros. O c-di-AMP é produzido a partir da condensação de duas moléculas de adenosina trifosfato (ATP) por proteínas denominadas diadenilato ciclases, que contém o domínio DisA_N, também denominado DAC. Existem 2842 sequências de proteínas que contém o domínio DAC, provenientes de 2386 organismos encontradas no banco de dados Protein Families Database (Pfam). Essas proteínas são divididas em subfamílias sendo as três subfamílias mais abundantes: DacA (69,1%), proteínas de membrana associadas a sinalização intracelular de alterações decorrentes do meio externo; DisA (24,1%), primeira diadenilato ciclase a ser amplamente estudada, é uma proteína intracelular encontrada na forma de octâmeros ativos em solução, a qual, indiretamente, controla a divisão celular através da verificação da integridade do DNA e DacB (5,5%), proteínas citoplasmáticas expressa, particularmente, durante a formação de esporos bacterianos. Uma característica interessante é que a maioria dos organismos contém uma única e essencial proteína com domínio DAC. Os organismos que contém duas ou mais proteínas-DAC, tais como Clostridium e Bacillus spp., são uma exceção. Em Staphylococcus aureus (S. aureus), um patógeno humano oportunista e responsável por inúmeras doenças infecciosas, uma única diadenilato ciclase é encontrada pendurada na porção interna da membrana celular (Sau_DacA). A atividade desta proteína é potencialmente regulada através da interação direta com uma proteína YbbR-like, que contém um domínio sensor extracelular. Sau_DacA conserva todos os elementos-chave de uma diadenilato ciclase bacteriana, e por ser a única presente em S. aureus, revela-se um excelente alvo de estudo para o desenvolvimento de novos fins terapêuticos. No entanto, até o presente momento, existem poucas informações em relação a estrutura proteica, ao mecanismo de síntese de c-di-AMP e regulação do mecanismo de síntese de nucleotídeo destas proteínas, sendo, portanto, neste aspectos que o presente trabalho pretendeu contribuir. Através de uma série de ensaios, estruturais, calorimétricos, espectroscópicos e bioquímicos, aliados a mutações sítio-dirigidas, identificou-se a relevância de uma conformação dimérica para a estabilidade conformacional e térmica para a proteína ser funcionalmente ativa, assim como a importância dos motivos conservados DGA (Aspartato-Glicina-Alanina) e RHR (Arginina-Histidina-Arginina) para a atividade da Sau_DacA. O loop L5 localizado entre o sítio ativo e a interface dimérica mostrou-se relevante, uma vez que nele é encontrado o motivo DGA - de ligação ao ATP - e o mesmo encontra-se estabilizado em uma posição favorável para ligação do ATP, apenas na conformação dimérica da proteína. Nossos resultados aliados a dados da literatura possibilitaram a proposição de um mecanismo de síntese de c-di-AMP que deve ocorrer via encontro face-a-face de dois sítios de ligação de ATP presentes em dímeros proteicos distintos, podendo a taxa de síntese de o nucleotídeo sofrer interferência via interação proteína-proteína com a proteína receptora de sinal Sau_YbbR. Desta forma, contribuímos para uma melhor compreensão da estrutura e função da Sau_DacA, possibilitando o uso desta como alvo para o desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que é sabido que a biossíntese de c-di-AMP é essencial para a maioria dos patógenos que o sintetizam. / Recently, a new bacterial signaling molecule, the dimeric cyclic AMP (c-di-AMP) has emerged as a central regulator of essential physiological processes, such as cell wall homeostasis, DNA integrity and bacterial virulence, among others. C-di-AMP is synthesized from two molecules of adenosine triphosphate (ATP) by proteins containing DisA_N domain, also called diadenilato cyclases (DACs). A survey in the Protein Families Database database (Pfam) found 2842 protein sequences containing the DAC domain, from 2386 different organisms. These proteins are divided into subfamilies and the three most abundant are: DacA (69,1%), a membrane protein associated with intracellular signaling resulting from an external environment change; DisA (24,1%), the first and most widely studied diadenilate cyclase, an intracellular protein found as active octamers in solution which indirectly controls cell division by DNA integrity verification; and DacB (5,5%), a cytoplasmic proteins, particularly expressed during bacterial spores formation. An interesting feature is that most organisms contain just a single and essential DAC-protein. Organisms containing two or more DAC-containing proteins, such as Clostridium and Bacillus spp., are exceptions. In Staphylococcus aureus (S. aureus), an opportunistic human pathogen responsible for some life-threating diseases, there is a single membrane attached diadenilate cyclase, hanging in the inner portion of the cell membrane (Sau_DacA). The activity of this protein is potentially regulated through direct interaction with YbbR, which contains an extracellular sensor domain. Sau_DacA conserves all key elements of bacterial di-adenylate cyclase, and for being the only di-adenylate cyclase from S. aureus, proves to be an excellent study target for new therapeutic purposes. However, to date, there is a lack of information about structure, c-di-AMP synthesis mechanism and regulation of nucleotide synthesis by Sau_DacA. Therefore, in this context the present work aims to contribute. Through a series of structural, calorimetric, spectroscopic and biochemical assays combined with site-directed mutations, we solved the structure of a soluble construct of Sau_DacA and identified a dimeric interface relevance for the conformational and thermal stability to the protein. This dimer is functionally active and highlights the importance of conserved motifs DGA (Aspartate-Glycine-Alanine) and RHR (Arginine-Histidine-Arginine) for the activity of Sau_DacA. The L5 loop, located between the active site and the dimer interface where is allocated the ATP binding motif (DGA), is stabilized in a favorable position for ATP binding, just in protein dimeric conformation. Our results combined with literary allowed us infer the synthesis of c-di-AMP occurs by face-to-face encounter of two distinct ATP binding site and its rate of synthesis could be regulated through direct protein interaction with. In this way, we contribute to a better understanding of Sau_DacA structure and function, assisting in its use as a target for new drugs development since it is known the biosynthesis of c-di-AMP is essential for most pathogens that synthesize.