RTK/Ras/MAPK signaling is one of the most common pathways for intercellular communication during development and in the adult organism. In addition, abnormal RTK signaling is associated with many pathological conditions, including cancer. Taking advantage of the available genetic tools of Drosophila, we use the DV axis specification as a model to study the molecular mechanisms by which RTK signaling regulates gene expression and how the same signaling pathway is interpreted differently in distinct tissues. Specifically, we have studied the mechanisms by which the localized activation of the RTK EGFR signaling pathway in the dorsal region of the follicular epithelium restricts pipe gene expression to ventral positions. pipe encodes a sulfotransferase enzyme which is essential for transfering DV polarity from the egg chamber to the embryo. Our results have shown that EGFR activity on pipe is mediated by Mirror, a homeodomain transcription factor induced by the pathway in dorsal-anterior cells. Mirror acts as a direct repressor of pipe by binding to a conserved motif (r1) in the pipe regulatory region. We also have characterized an additional aspect of pipe regulation that depends on Capicua (Cic), a HMG-box transcription factor post-transcriptionally downregulated by RTK/Ras/MAPK signaling. We have shown that the role of Cic is to support pipe expression in ventral follicle cells by repressing mirror in this region. On the other hand, we have analyzed the relevance of the negative post-transcriptional regulation of Cic by EGFR/Ras/MAPK signaling in the establishment of the initial DV asymmetries during oogenesis. Our results suggest a competition mechanism between Cic-mediated repression and EGFR-dependent and –independent activation of mirr, which leads to graded expression of mirr in dorsal and lateral follicle cells. We propose a model where the EGFR-dependent downregulation of Cic modulates the spatial distribution of Mirror protein in the lateral and dorsal-posterior follicle cells, where low, but functional Mirr activity defines the precise position at which the pipe expression border is formed. Finally, we have studied in collaboration with S. Y. Shvartsman group, the function of Cic in response to the RTK Torso signaling pathway in the early embryo. Together with previous results, our work has shown that Cic also participates in the DV subdivision of the embryo acting as a repressor of dorsal zygotic genes, as zerknüllt (zen), and that this activity is inhibited at the poles by Torso signaling. Taking together this result and other previous studies in collaboration with S. Y. Shvartsman group, we have proposed in a new model of gene regulation based in MAPK substrate competition. Molecular competition among MAPK substrates affects the expression of genes such as zen, reveals a new mechanism of integrating anterior, dorso-ventral and terminal systems. To summarize, in this thesis we show that different RTK/Ras/MAPK pathways with key roles in Drosophila development operate through common mechanisms that involve the post-transcriptional downregulation of Cic. By downregulating Cic activity, RTK signals create gradients or boundaries of Cic repressor activity that are then translated into complementary patterns of target gene expression. Since different Cic targets are regulated in different contexts, our results support the view that RTK specificity arises mainly at the level of downstream enhancers responding to general RTK effectors (including Cic) and additional ubiquitous and tissue-specific factors. / La vía RTK/Ras/MAPK es una de las cascadas de señalización evolutivamente conservadas más común durante el desarrollo de los metazoos. En concreto, la vía de EGFR es una de las más destacadas en la inducción de respuestas espacialmente localizadas en Drosophila. Concretamente, en esta tesis hemos estudiado el modo en que la activación localizada de la vía RTK de EGFR en la región dorsal del epitelio folicular restringe la expresión del gen pipe a posiciones ventrales. Pipe codifica para un enzima con actividad sulfotransferasa que resulta esencial para la transmisión de información posicional desde el ovario hasta el embrión. Nuestros resultados han mostrado que la actividad de EGFR sobre pipe está mediada por el factor Mirror, el cual actúa como represor directo de pipe uniéndose a las secuencias reguladoras del gen. Además, hemos caracterizado un aspecto adicional de la regulación de pipe que depende de Capicua (Cic), un factor de transcripción inhibido por señales RTK en diversos sistemas. Así, hemos demostrado que Capicua mantiene la expresión de pipe en la región ventral del epitelio folicular reprimiendo a su vez a Mirror en esa región. Por otro lado, hemos analizado la relevancia de la regulación post-transcripcional negativa de Cic en respuesta a la señal de EGFR para el establecimiento de esta polaridad inicial durante la oogénesis. Proponemos un modelo en el que la regulación negativa de Cic por la vía de EGFR modula la distribución espacial de Mirror en las células foliculares laterales definiendo la posición precisa del borde de expresión de pipe. Finalmente, hemos estudiado la función de Capicua en respuesta a la señal RTK de Torso en el embrión temprano. Junto con resultados previos, nuestro trabajo ha mostrado que Capicua también participa en la subdivisión dorsoventral del embrión actuando como represor de genes cigóticos dorsales como zerknüllt, y que esta actividad se encuentra inhibida en regiones terminales por la vía de Torso.

In the present Thesis, we observed that vitrifying-warming porcine embryos had detrimental effects. Indeed, vitrification and warming were seen to reduce developmental ability and quality of in vitro produced porcine blastocysts, with increased levels of DNA fragmentation, raised levels of reactive oxygen species and alterations in the expression of pluripotency and thermal shock-related genes. This suggested that establishing effective cryopreservation methods was required. Following this, we found that embryo cryotolerance did not only depend on the cryopreservation procedures but also on the composition of the culture medium. On the other hand, beneficial effects were also obtained from exposing embryos to antioxidants. Specifically, L-ascorbic acid addition during culture and/or vitrification and warming enhanced embryo survival, redox status and thermal stress response / En aquesta tesi s’ha observat que els processos de vitrificació i escalfament sotmeten els embrions porcins produïts in vitro a situacions d’estrès. Els resultats obtinguts quant a la capacitat dels embrions a l’hora de sobreviure a la criopreservació i a la qualitat dels embrions vitrificats, amb augments en els nivells de fragmentació del DNA i en les espècies reactives d’oxigen i amb alteracions en el perfil d’expressió de gens involucrats en la pluripotencialitat i en la resposta al xoc tèrmic, suggereixen la necessitat d’incrementar l’efectivitat dels mètodes de criopreservació. S’ha determinat, a més, que la criotolerància embrionària no només depèn dels processos de criopreservació sinó també de la composició dels medis de cultiu. Finalment, s’ha observat que l’exposició dels embrions a molècules antioxidants desencadena efectes beneficiosos. Concretament, l’addició d’àcid ascòrbic en els medis de cultiu i vitrificació-escalfament millora la supervivència, l’estat d’oxidació/reducció i la resposta a l’estrès tèrmic

Dugesia is a genus of free-living flatworms which species inhabit freshwater bodies across a wide distribution range that includes Africa, Madagascar, Eurasia and Australasia. They do not survive in salt water or under desiccation conditions. All Dugesia species have a characteristic triangular-shaped head with two eyes and an elongated and dorsoventrally flattened body. This general shape makes them recognizable to non-experts that also know them because of their regeneration capabilities. The two first works of this thesis are focused on the Dugesia historical biogeography. In first place we studied its species on Greece, because of its complex and well-known geological history and the high diversity of species known on the area. The results showed interesting evidences of the diversification of the genus on the area driven by its history of geological breakage since the Neogene, by the contact and severing of ancient freshwater bodies, and probably by changes in the sea level of the Mediterranean. We also observed patterns of dispersion in the Greek mainland and the Peloponnese. In a second work we included the whole Dugesia distribution range. The aim was to test the previous hypotheses on the antiquity and dispersal routes of the genus to its present geographical distribution. The last hypothesis proposed an African origin in a Gondwanan scenario during the Mesozoic period followed by a dispersion in Eurasia through the impact of the Indian subcontinent or through the impact of the Arabian plate. Our results suggest an older origin, being the genus already present on Pangaea before its breakage. Taking into account this old origin and the internal and external homogeneity of the Dugesia genus species, this is probably a case of long-term or extreme morphological stasis. The copulatory apparatus is essential for Dugesia species description and identification. However, fissiparous specimens do not have this organ, making impossible to know which species are we dealing with. In other cases the inner morphology is very similar or identical among different species, hindering the species identification. In these cases the use of molecular species delimitation methods are of major interest in order to try to overcome these morphology associated drawbacks. In a third work we used one of these methods called General Mixed Yule-Coalescent (GMYC) together with morphological data in an integrative taxonomy framework in order to describe new species from Greece and to give more support to those already described. We formally described four new Dugesia species and the new genus Recurva containing two species and a putative third one. For those clades delimited by the GMYC method for which we did not have any or incomplete morphological data we proposed two different categories: Unconfirmed or Confirmed Candidate Species. The use of molecular species delimitation methods seems to be very convenient when dealing with freshwater flatworms. At the beginning of this thesis we aimed to obtain more molecular markers by the obtention of complete mitogenomes from different triclad species. Unfortunately, this work was delayed and finally we did not succeed in the obtention of a Dugesia mitogenome but of Crenobia alpina (Planariidae) and Obama sp. (Geoplanidae). We took advantatge of these new free-living flatworm mitogenomes and we carried out an evolutionary analysis comparing them with those of parasitic flatworms in order to test if, as previously thought, the different lifecycles have had a selective effect on the nucleotide composition of the mitogenomes. Surprisingly, our results showed a more relaxed selection in the Geoplanoidea species (Dugesia, Obama and Schmidtea) in comparison with the parasitic platihelminths and Crenobia. / Dugesia és un gènere de planàries de vida lliure que habita en les l'aigües dolces d'Àfrica, Madagascar, Eurasia i Australàsia. Són organismes fràgils que no poden sobreviure en aigua salada ni en condicions de dessecació. Les Dugesia tenen un cap triangular amb dos ulls molt característic i un cos allargat i aplanat dorsoventralment. Són conegudes popularment per les seves capacitats de regeneració. Els dos primers treballs d'aquesta tesi s'ha centrat en la biogeografia històrica de les Dugesia. Primerament vam fer un estudi de les espècies que habiten a Grècia, degut a la seva història geològica complexa i ben coneguda. Els resultats mostraren evidències de la diversificació del gènere com a conseqüència de la fragmentació d'aquesta regió, del contacte i aïllament històric dels diferents cossos d'aigua dolça i dels canvis eustàtics. El segon treball de biogeografia històrica inclou tota la distribució de Dugesia, amb el propòsit de testar les hipòtesis prèvies que han volgut explicar l'antiguitat i rutes de dispersió del gènere fins a ocupar la distribució actual. Els nostres resultats descarten un origen sobre Gondwana, com s'havia proposat anteriorment, seguit per una dispersió a Eurasia a través de l'Índia o per la península Aràbiga. Dugesia s'hauria originat al supercontinent Pangea abans del seu trencament. En un tercer treball hem emprat el mètode molecular de delimitació d'espècies General Mixed Yule-Coalescent (GMYC) sobre Dugesia gregues. Vam combinar-ne els resultats amb els d'anàlisis morfològiques per identificar i descriure diverses espècies. Aquells clades delimitats pel GMYC pels quals no disposavem de dades morfològiques o bé eren incompletes van ser proposats com a espècies candidates confirmades o per confirmar. Vam descriure formalment quatre espècies de Dugesia i el nou gènere Recurva. En un treball diferent vam obtenir els mitogenomes de Crenobia alpina (Planariidae) i Obama sp. (Geoplanidae). Malgrat no aconseguir un mitogenoma de Dugesia vam aprofitar la disponibilitat de les noves molècules per realitzar una anàlisi evolutiva comparant-les amb les de platihelmints paràsits per comprovar si, tal i com s'havia proposat, els diferents tipus de vida tenen un efecte selectiu sobre la composició dels nuclèotids. Sorprenentment els nostres resultats mostren una selecció més relaxada en planàries de vida lliure.

Tesi realitzada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB - CSIC) / La ciencia básica ha de engarzarse con las necesidades sociales. Así, nuestro laboratorio esta involucrado en identificar genes específicamente modulados durante el proceso de cicatrización mediante estudios transcriptómicos en colaboración con diversos grupos. En esta línea, en esta Tesis se han perseguido una serie de objetivos concretos: 1) Realización de un análisis funcional de nuevos genes implicados en cicatrización (discos imaginales). 2) Comparación de los genes identificados en cicatrización en Drosophila con genes identificados en modelos de cicatrización en vertebrados. Más en detalle: • Estudio y descripción de la cicatrización en discos imaginales de Drosophila in vitro. • Identificación de genes cuya expresión cambia en las células activas en el proceso de cicatrización. • Caracterización fenotípica de genes que afectan al proceso de cicatrización (definición de categorías fenotípicas) • Caracterización detallada de un subset de genes involucrados en la regulación del proceso de cicatrización • Identificación de reguladores de cicatrización conservados en la filogenia. • Análisis del papel del citoesqueleto de actina en el proceso de cicatrización (el papel del complejo TCP1 (una chaperonina esencial) • Exploración del papel del complejo TCP1 en la regulación del citoesqueleto de actina y tubulina A lo largo de este trabajo hemos alcanzado las siguientes conclusiones: 1. La cicatrización in vitro requiere la actividad de la cascada de señalización de la JNK que controla la formación de contactos transitorios entre los epitelios 2. Han sido identificados una serie de nuevos genes modulados transcripcionalmente durante el proceso de cicatrización. 3. El análisis por interferencia o sobreexpresión de estos genes ha permitido identificar aquellos funcionalmente relevantes en la fusión de los discos imaginales y en la reparación del tejido imaginal. 4. El agrupamiento fenotípico de estos genes ha permitido definir a nivel celular las etapas requeridas para la reparación precisa de los discos imaginales. 5. Las clases principales de genes involucrados en el proceso de cicatrización son las de los reguladores del citoesqueleto de actina y transductores de señales. 6. La caracterización funcional de un subset de genes involucrados en cicatrización analizando marcadores específicos ha permitido definir la red de interacciones entre ellos y su coordinación espaciotemporal. 7. El complejo TCP1 es esencial para la cicatrización de los discos imaginales. 8. La interferencia en la expresión de distintas subunidades del complejo TCP1 demuestra su papel en la fusión de discos imaginales, cicatrización y control del citoesqueleto (actina y tubulina) en Drosophila. 9. Estudios comparativos entre Drosophila y vertebrados a nivel transcriptómico ha permitido identificar una serie de genes conservados entre distintos phila y regulados a nivel transcripcional durante la cicatrización. 10. Análisis funcionales de estos genes demuestran un papel conservado a lo largo de la filogenia apuntando a candidatos potenciales para estudios translacionales.

La MCH es una de las enfermedades cardíacas hereditarias más comunes. La complejidad clínica que caracteriza a la MCH tiene su base en su heterogeneidad genética. Tras varios años de investigación, la identificación de mutaciones en 13 genes que codifican proteínas del sarcómero ha llevado a la definición de la MCH primaria como una enfermedad del sarcómero. Las mutaciones en los genes MYBPC3 y MYH7 están involucrados en la génesis de la enfermedad en aproximadamente la mitad de los pacientes índice con MCH, mientras que las mutaciones en los genes TNNT2, TNNI3, TPM1, ACTC, MYL2 y MYL3 suponen entre un 1 a un 5% de los casos. Dada la dificultad de predecir el riesgo de eventos adversos, como la MS, a partir de los datos clínicos, la investigación genética ha perseguido desde el principio determinar la relación entre el gen mutado o el tipo de mutación y la evolución de la enfermedad. Una correlación entre el genotipo y el fenotipo bien demostrada tendría implicaciones muy importantes para el tratamiento y la prevención de los eventos adversos en estos pacientes. Así en último término, los estudios moleculares y su correlación genotipo-fenotipo podrían ser herramientas útiles para ayudar al cardiólogo a tomar decisiones sobre los tratamientos a aplicar y el seguimiento individualizado de afectados y portadores asintomáticos. A pesar de los avances en el campo de la Genética, en la actualidad no hay consenso definitivo sobre el grado de determinismo asignable a las mutaciones conocidas en los diferentes genes. Por tanto, son necesarios estudios poblacionales con grandes series de pacientes a partir de los cuales poder establecer conclusiones definitivas sobre la relación genotipo-fenotipo. La información sobre genotipo-fenotipo y pronóstico de las diferentes mutaciones en el gen de la troponina T (TNNT2) es escasa y en ocasiones contradictoria, por su baja prevalencia (3-5%) en las series publicadas. Clásicamente se han relacionado las mutaciones en TNNT2 con un alto riesgo de muerte súbita (MS) en jóvenes con HVI leve. En consonancia con todo lo expuesto nos propusimos los objetivos de esta Tesis Doctoral: 1. Estudiar la penetrancia de la miocardiopatía hipertrófica en 9 familias portadoras de una idéntica mutación en el gen TNNT2. 2. Describir las variables morfológicas, clínicas y valor pronóstico de los pacientes portadores de la mutación Arg92Gln en el gen TNNT2 en nuestra serie, y comparación con las publicadas. 3. Comparar las características clínicas y pronósticas de esta población con una cohorte de pacientes con MCH no portadores de esta mutación, especialmente pacientes con otras mutaciones identificadas en TNNT2, otras mutaciones en genes sarcoméricos y pacientes con mutación no identificada. 4. Evaluar la prevalencia de mutaciones en genes sarcoméricos en pacientes con MCH de nuestra comunidad. 5. Demostrar un efecto fundador de la mutación Arg92Gln en la población de estudio. Para ello, desde noviembre del 2007 hasta febrero 2012 se evaluan 210 pacientes consecutivos no emparentados con diagnóstico de MCH. En todos los probandos se realiza estudio cardiológico completo, y se recoge muestra sanguínea para análisis genético. A los familiares de primer grado se les ofrece la realización de screening familiar consistente en evaluación cardiológica y genética (si hallazgo de mutación en el probando). En todos los pacientes se recogen una serie de variables en relación a la caracterización del fenotipo. La penetrancia de la enfermedad la determinamos en base a los criterios eléctricos y ecocardiográficos. En 8 probandos se identificó una idéntica mutación de tipo missense en heterocigosis en el gen TNNT2: Arg92Gln, localizada en el exón 9. Posteriormente se analizó la presencia de dicha mutación en los familiares, y se buscó un posible efecto fundador. Se realiza un exhaustivo análisis de resultados en cuanto a las variables clínicas y genéticas analizadas, prestando especial atención a los marcadores de mal pronóstico y/o muerte súbita en estos pacientes. Nuestro estudio concluye lo siguiente: 1. Las mutaciones en el gen de la troponina T son responsables de un 11.4% de casos de MCH en nuestra población insular, muy superior al de otras series. 2. El origen insular de la población de estudio, y la endogamia asociada habitualmente a este tipo de poblaciones, ha influido probablemente en la alta prevalencia de estas mutaciones. 3. Se constata un efecto fundador causal de los numerosos casos de MCH por la mutación Arg92Gln, localizada geográficamente en el noroeste de Mallorca, que no explica todos los casos, pero sí la mayoría. 4. La mutación TNNT2 Arg92Gln se asocia a miocardiopatía de desarrollo precoz, a menores edades que el resto de mutaciones. La probabilidad que el 50% de los portadores expresen el fenotipo se alcanza a los 37 años de edad. 5. La MCH por mutación TNNT2 Arg92Gln se caracteriza por una alta penetrancia, un alto riesgo de MS en jóvenes, en la mayoría como 1ª manifestación de la enfermedad, precisando el 38% implante de DAI como prevención primaria, con casos de MCH con hipertrofia sólo leve o moderada o en muchos otros casos con MCD al diagnóstico. 6. La mutación Arg92Gln produce alta frecuencia de fenotipo mixto: MCH con hipertrofia leve o moderada, y/o MCD, incluso dentro de la misma familia y a edades similares. Asimismo presentan disfunción sistólica en un porcentaje elevado (45%). 7. Los sujetos índice portadores de la mutación TNNT2 Arg92Gln presentan un perfil de riesgo significativamente peor comparado con el resto de pacientes con MCH y otras mutaciones o mutación no identificada. Existe una peor supervivencia libre de muerte cardiovascular asociada a esta mutación. La supervivencia media es de 54 años. A los 50 años la probabilidad de supervivencia es del 50%.

La metilación del ADN es una de las modificaciones epigenéticas más estudiadas y cuyo mecanismo de acción es más conocido. Consiste en la transferencia enzimática de un grupo metilo a la posición 5' de la citosina. Resulta la principal modificación epigenética en mamíferos, donde se encuentra restringida principalmente a la citosina del dinucleótido CpG, y está relacionada con el silenciamiento transcripcional. Tiene un papel clave en la regulación epigenética y por tanto, su análisis es de gran interés para entender procesos biológicos tan importantes como la replicación del DNA, la expresión génica, la diferenciación celular o las bases moleculares de muchas enfermedades, incluyendo el cáncer. Por este motivo, se han desarrollado numerosas técnicas para el estudio de la metilación del ADN, tanto a nivel regional como global y genómico. No obstante, el análisis masivo del genoma humano presenta un alto coste y dificultad, por lo que la mayoría de estudios a escala genómica utilizan diseños que reducen la complejidad del análisis. Para ello, se analiza únicamente una pequeña porción de las regiones genómicas de interés, una o unas pocas CpGs, y se extrapolan los resultados. Con la aparición de los primeros datos de células humanas obtenidos mediante Whole Genome Bisulfite Sequencing es posible evaluar la exactitud de los diferentes abordajes de complejidad reducida. En el presente trabajo se ha determinado la concordancia entre la metilación de las dianas HpaII y las islas CpG que las contienen. Para ello, se han utilizado datos públicos de dos estudios WGBS de muestras humanas. La diana HpaII se ha seleccionado dada su presencia en el 94% de las islas CpG del genoma. No en vano, la diana de restricción de HpaII (CCGG) es la más utilizada en estudios de metilación del ADN. Nuestros análisis muestran que la metilación de aquellas dianas HpaII que están dentro de islas CpG, resultan excelentes indicadores de la metilación global de las islas. Las dianas HpaII tienen un alto valor predictivo a nivel cualitativo asignando correctamente a la isla CpG como metilada o desmetilada con un alto porcentaje de acierto. Además, cuando las islas CpG disponían de dos o más dianas HpaII las predicciones resultaban extremadamente exactas para el valor de metilación de la isla. Estos resultados proporcionan una validación global de las estrategias basadas en el uso de la enzima de restricción sensible a metilación HpaII. Esta validación puede extenderse a otras aproximaciones de reducción de la complejidad similares. Su principal ventaja radica en la drástica reducción de costes, tanto del trabajo experimental como del análisis computacional. A pesar de la alta homogeneidad existente en la metilación de las islas CpG existen otros escenarios donde no es raro observar diferencias de metilación importantes entre dos CpGs próximas. La disponibilidad de un creciente número de metilomas ha permitido identificar un conjunto de zonas con patrones de metilación diferenciales, DMRs. Estas regiones se han encontrado asociadas a cambios observados en la expresión génica entre estos tipos celulares. En el presente trabajo se han analizado posiciones individuales con una metilación discordante respecto a su entorno. Se han evaluado aquellas que se mantienen desmetiladas cuando su entorno está totalmente metilado. Dada la metilación general del genoma, estos patrones representan anomalías que difícilmente puedan ser azarosas. Así, se han encontrado secuencias anómalas que presentan características asociadas a zonas de alta actividad transcripcional y pueden representar puntos de regulación génica. Además, algunas de ellas se sitúan cerca de genes importantes en la regulación de enfermedades, como el cáncer. Aunque aún son necesarias validaciones experimentales, aproximaciones in silico como la aquí presentada permiten encontrar posiciones de discordancia epigenética que pueden representar dominios funcionales putativos. / DNA methylation consists in the enzymatic transference of a methyl group to the 5’ position of a cytosine. In humans, it mostly occurs in the CpG dinucleotide. It is related to transcriptional silencing and it has a key role in biological processes such as DNA replication, genetic expression or the molecular basis of a lot of diseases, including cancer. For these reasons, many techniques have been developed to analyze it. However, the whole genomic determination of this epigenetic mark results in difficult and expensive analysis. To circumvent this issue, many techniques use a few positions and extrapolate the results. However, no global validation of this hypothesis has been performed. We have determined the correlation between the methylation of HpaII restriction sites and the CpG islands that contain them. We have used Whole Genome Bisulfite Sequencing data from human samples. Our results show that the methylation of the HpaII sites within CpG islands are excellent reporters of the global CpG island methylation, at both the quantitative and qualitative level. The prediction values were improved when the island contained more than one HpaII site. Our results represent a global validation for methylation analysis techniques based on the use of HpaII restriction enzyme. Although the high observed homogeneity in DNA methylation, there are some scenarios where it is not uncommon to observe important methylation differences between two close CpG positions. Many of these regions have been found to be associated to differences in gene expression among different cell types. We have analyzed individual positions with a discordant methylation compared to its closest neighbor CpGs. Using them as indicators, we have found sequences that have characteristics associated to high transcriptional activity and they can represent genetic regulation points. Some of them are close to important disease-associated genes. These positions can represent putative functional domains

Les distròfies de retina (DR) engloben un conjunt de patologies caracteritzades per la degeneració dels fotoreceptors i les cèl•lules de l’epiteli pigmentari de la retina, i representen la major causa de ceguesa hereditària. Són malalties altament heterogènies clínica i genèticament. La retinosi pigmentària (RP) és la DR més freqüent, amb una prevalença d'1:4000 i més d'un milió d'afectats arreu del món. Fins l'actualitat, s'han descrit gairebé 200 gens i loci responsables de DR, però s'estima que aquests expliquen poc més de la meitat dels casos. En els últims anys, s'han centrat molts esforços en la cerca de nous gens i mutacions, fonamental per tal d’oferir als pacients i als seus familiars un diagnòstic genètic acurat i, en alguns casos, una bona prognosi de la malaltia. No obstant, una vegada identificada la causa molecular, l'estudi funcional no es presenta com una tasca trivial. Si bé l'estadi final de les DR és comú en la majoria dels casos, -la mort per apoptosi dels fotoreceptors-, els diferents gens DR participen en una gran diversitat de vies i aspectes cel•lulars dels fotoreceptors. En aquest context, és molt important combinar estratègies in silico, in vitro i in vivo per abordar-ne l'estudi acurat. El treball d'aquesta tesi doctoral s'ha basat en l'obtenció de models in vivo i in vitro per a l'estudi de dos gens causants de distròfies de retina, CERKL i RP2. El primer, va ser descrit pel nostre grup l'any 2004 com a causant de RP d’herència autosòmica recessiva. Malgrat les primers anàlisis de predicció varen revelar una elevada homologia amb la quinasa de ceramides (CERK), diversos estudis han fracassat a l'hora de validar l'activitat fosforilativa de CERKL. A l'inici d'aquesta tesi, CERKL es presentava com una proteïna òrfena de funció. Per aquesta raó, varem iniciar-ne l'aproximació funcional, basada primerament en l'estudi transcripcional en detall del gen a la retina. Els resultats varen mostrar una gran complexitat transcripcional, deguda principalment a l'splicing alternatiu i a l'ús de promotors alternatius. A més, es varen identificar promotors específics de teixit, fet que posava de manifest l’elevada regulació en l’expressió d’aquest gen. Pel que fa a la localització cel•lular de la proteïna, CERKL presenta un clar dinamisme cel•lular entre els compartiments citoplasmàtic i nuclear, amb una localització depenent de tipus cel•lular a la retina murina. Tot plegat, suggeria un paper multifuncional de CERKL. Per abordar la seva contribució a la degeneració retinal, es varen generar dos models animals. D’una banda, un ratolí knockout Cerkl-/- i, de l’altra, un model knockdown en peix zebra. L’estudi acurat del fenotip ens va revelar una disfunció a nivell ganglionar i/o amacrí en el cas del model murí, acompanyada d’un augment de l’estrès i mort cel•lular en la retina. D’altra banda, en el cas del model en peix zebra, els animals presentaven ulls de mida reduïda, juntament amb defectes en la laminació de la retina i en la formació dels segments externs dels fotoreceptors. Segons els nostres resultats, Cerkl no sembla contribuir en el desenvolupament primerenc de la retina d’aquest teleosti, si bé podria participar en processos de degeneració secundaris. En ambdós models es va posar de manifest la contribució de CERKL en les vies d’estrès i apoptosi cel•lular. En el futur, quan les teràpies gèniques estiguin ben establertes i els pacients puguin accedir a elles, serà fonamental el coneixement de les bases genètiques de la malaltia i l’impacte molecular de les mutacions descrites en cada cas. En aquest context, s’han realitzat estudis tant in vitro com in vivo de dues mutacions identificades als gens CERKL i RP2 en famílies espanyoles. Les diferents anàlisis ens han permès comprovar l’impacte patogènic d’aquestes mutacions sobre els productes gènics, basat en la degradació o formació aberrant de les isoformes del mRNA. A més, en el cas de RP2, responsable de RP lligada al cromosoma X, hem reportat per primera vegada un cas de semi-dominància degut a mutacions en aquest gen. L’estudi de les mostres de les dones portadores de la família ens han permès demostrar un biaix en l’expressió dels al•lels de RP2, segurament donada per la inactivació no atzarosa del cromosoma X, com a causa directa del fenotip. / Retinal dystrophies (RD), the major cause of incurable familial blindness in the Western world, are monogenic disorders characterized by progressive dysfunction of photoreceptor and retinal pigment epithelium cells. RD is a group of extremely heterogeneous diseases that show substantial clinical and genetic overlap. Highthroughput technologies have greatly improved our knowledge of the genetic basis of RD. Indeed, more than 180 RD genes have already been reported and this number is constantly increasing. However, although RD genes are known to be involved in a variety of celular and molecular processes in the retina, we are still far from understanding the contribution of most of them to the disease. In this context, we have aimed to study the contribution to the pathogenesis of two RD genes: CERKL and RP2. The first was identified by our group in 2004, as a responsible for autosomic recessive retintitis pigmentosa (RP). To shed light on the pathogenicity of the mutations in this gene, we aimed to characterize its transcriptional repertoire. Our results showed an unexpected multiplicity of CERKL transcriptional start sites plus a high variety of alternative splicing. In order to approach the function of the retinal dystrophy CERKL gene we generated a knockout mouse model. KO animals showed clear and consistent signals of gliosis and retinal stress, togheter with a non-progressive perturbation of ganglion cells. The failure to reproduce the human phenotype in the mouse, not unusual in other hereditary retinal disorders, prompted us to explore zebrafish as an alternative model. The phenotype resulted in abnormal eye development with lamination defects, failure to develop photoreceptor outer segments, increased apoptosis of retinal cells and small eyes. Our data supported that zebrafish Cerkl does not interfere with proliferation and neural differentiation during early developmental stages but is relevant for survival and protection of the retinal tissue. Finally, we have analized the pathogenicity of a new variant in RP2, a X-linked RP gene. The study of the RP2 splicing pattern in blood samples of patients and carrier females showed a aberrant mRNA transcript. High levels of variation observed for RP2-spliced products in female carriers supports X chromosome–skewed inactivation as the cause of the disease in the affected females.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / After germination in darkness, Arabidopsis seedlings follow a dark specific developmental pattern called skotomorphogenesis or etiolation, characterized because the plant develops long hypocotyls together with a closed apical hook and cotiledons in order to protect the apical meristem while passing through the soil. The phytochrome (phy)-interacting basic helix-loop-helix transcription factors (PIFs) constitutively sustain the etiolated state of dark-germinated seedlings by actively repressing deetiolation in darkness. This action is rapidly reversed upon light exposure by phy-induced proteolytic degradation of the PIFs. Here, we combined a microarray-based approach with a functional profiling strategy and identified four PIF3-regulated genes misexpressed in the dark (MIDAs) that are novel regulators of seedling deetiolation. We provide evidence that each one of these four MIDA genes regulates a specific facet of etiolation (hook maintenance, cotyledon appression, or hypocotyl elongation), indicating that there is branching in the signaling that PIF3 relays. Furthermore, combining inferred MIDA gene function from mutant analyses with their expression profiles in response to light-induced degradation of PIF3 provides evidence consistent with a model where the action of the PIF3/MIDA regulatory network enables an initial fast response to the light and subsequently prevents an overresponse to the initial light trigger, thus optimizing the seedling deetiolation process. Collectively, the data suggest that at least part of the phy/PIF system acts through these four MIDAs to initiate and optimize seedling deetiolation, and that this mechanism might allow the implementation of spatial (i.e., organ-specific) and temporal responses during the photomorphogenic program. After deetiolation plants will develop depending on the surrounding environmental conditions ans short-day, long-day, or shade. Arabidopsis seedlings display rhythmic growth when grown under diurnal conditions, with maximal elongation rates occurring at the end of the night under short-day photoperiods. Current evidence indicates that this behavior involves the action of the growth-promoting bHLH factors PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4 (PIF4) and PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 5 (PIF5) at the end of the night, through a coincidence mechanism that combines their transcriptional regulation by the circadian clock with control of protein accumulation by light. To assess the possible role of PIF3 in this process, we have analyzed hypocotyl responses and marker gene expression in pif single- and higher-order mutants. The data show that PIF3 plays a prominent role as a promoter of seedling growth under diurnal light/dark conditions, in conjunction with PIF4 and PIF5. / Los reguladores transcripcionales PIF, factores de interacción con fitocromos de tipo bHLH, aseguran de manera constitutiva el estado etiolado de las plántulas germinadas en oscuridad mediante la represión activa del proceso de desetiolación. Tras la exposición a luz, los fitocromos revierten rápidamente esta acción induciendo la degradación proteolítica de los PIFs. Un análisis reciente del transcriptoma de un cuádruple mutante deficiente en PIF1, PIF3, PIF4 y PIF5 demuestra que los PIFs, en condiciones de oscuridad, regulan transcripcionalmente un grupo de genes que coincide ampliamente con genes regulados por luz en las líneas salvajes. Tales resultados establecen que la inducción de la desetiolación mediada por los fitocromos, implica la reversión del perfil transcripcional mantenido por los PIFs en oscuridad. En este trabajo, elucidamos, como los PIFs implementan la desetiolación de la planta combinando una aproximación basada en el análisis de expresión génica con una estrategia de descripción funcional. Como resultado identificamos también cuatro genes regulados por PIF3 como nuevos reguladores del desarrollo en oscuridad, los genes MIDA de “MISREGULATED IN DARK” (DESREGULADOS EN OSCURIDAD) y proporcionamos evidencia de que cada uno de estos cuatro MIDA, regula un aspecto diferente de la etiolación ( mantenimiento del gancho apical, cierre de los cotiledones o elongación del hipocotilo), sugiriendo así, una ramificación de la señal que PIF3 ejerce sobre estos genes. Además, tras los estudios con mutantes, combinamos la función inferida para los genes MIDA con sus perfiles de expresión en respuesta a la degradación por luz de PIF3 y evidenciamos consistentemente con un modelo, que la acción de la red reguladora PIF3/MIDAS posibilita, tras la exposición a luz, una primera respuesta que induciría rápidamente el proceso de desetiolación y una segunda que modularía los efectos de la primera optimizando el proceso de desetiolación de la plántula en función de las condiciones ambientales que la rodean. Los datos presentados sugieren colectivamente que al menos parte del sistema phy/PIF actúa a través de estos cuatro MIDAs para iniciar y optimizar la desetiolación de la plántula , y que éste mecanismo podría permitir la implementación de respuestas espaciales (específicas de órgano) y temporales durante el programa fotomorfogénico.

Còpia digital de l'exemplar imprès de la tesi dipositat a la Biblioteca de la Facultat de Biologia / Els objectius principals dels treballs que aquí es descriuran queden emmarcats dins de dues grans problemàtiques. Primerament, l'estudi estructural i funcional de l'enzim dins del gènere Drosophila, en un intent de determinació de l'esquema evolutiu dins del taxó, i les influències que sobre aquest esquema hagin pogut exercir diversos paràmetres ecològics. En segon lloc, un intent de clarificació de les reaccions de resposta de Drosophila sota unes condicions de "stress" d'alcohol, i el paper que l'ADH hi juga. Per diverses raons que s'esmentaran en el seu moment, l'espècie amb la qual s'han realitzat els estudis és “Drosophila hydei”, representant cosmopolita del grup Repleta. Els punts concrets d'aquest treball poden resumir-se en: (a) Visió general de les propietats de l'enzim ADH nadiu a diferents espècies de Drosophila. (b) Estudi estructural de l'enzim ADH de D. hydei. Comparació amb les dades de les espècies que ja havien estat estudiades en el Departament. (c) Estudi comparatiu dels mètodes més actuals d'aïllament i purificació de pèptids triptics. (d) Estudi del metabolisme dels alcohols i els seus productes d'oxidació en individus sotmesos a dietes riques en etanol i isopropanol. (e) Estudi dels enzims que intervenen en les reaccions enzimàtiques del catabolisme alcohòlic.

Myogenesis is the differentiation process which encompasses the formation of skeletal muscle during development, regeneration and tissue homeostasis throughout life. Arising from embryonic or adult stem cells, the myogenic process comprehends the acquisition of a specialized cell identity and the loss of pluri/multipotent and proliferative capacities. Starting with the hypothesis that DNA methylation, together with other epigenetic mechanisms and the transcription factors, orchestrates the transcriptional program, this thesis provides a comprehensive picture of DNA methylation dynamics during murine myogenic progression, addresses their regulatory implications, and identifies relevant differentially methylated regions that define muscle cell identity. Initially, we performed a genome-scale DNA methylation study comparing embryonic stem cells (ESCs), primary myoblasts (MBs), differentiated myotubes (MTs), and mature myofibers (MFs) using AIMS-seq method. We identified 1,000 differentially methylated regions during muscle-lineage determination and terminal differentiation, mainly located in gene bodies and intergenic regions. As a whole, muscle lineage commitment was characterized by a major gain of DNA methylation, while muscle differentiation was accompanied by loss of DNA methylation in CpG-poor regions. Notably, hypomethylated sequences were enriched in enhancer-type chromatin regions, suggesting the involvement of DNA methylation in the regulation of cell-type specific enhancers. Importantly, we detected a demethylated region overlapping the super-enhancer of the cell-identity factor Myf5. We showed that the activation of My5 super-enhancer took place upon DNA demethylation exclusively in muscle-committed cells resulting in gene expression. ChIP analyses showed that the binding of the Upstream stimulatory factor 1 (Usf1) to Myf5 locus was DNA demethylation-dependent in myogenic committed cells. Moreover, Usf1 binding site contained an embedded CpG conserved in humans and demethylated in human MBs but not in human ESCs, altogether reinforcing the hypothesis that DNA methylation regulates gene expression by modulating transcription factor binding accessibility. Next, we analyzed by sodium bisulphite sequencing the DNA methylation state of reported regulatory regions (with and without CpG island) of key genes implicated in myogenesis. After analyzing myogenic and non-myogenic cells we concluded that the muscle cell identity comprehends DNA demethylation of lineage-specific CpG-poor regulatory regions leading to a transcriptionally poised or activated state, while myogenic CpG island promoters are totally unmethylated during myogenesis and are regulated by histone modifications. A collaborative work with Charles Keller’s Lab (Oregon Health & Science University, USA) allowed us to conclude that Rhabdomyosarcoma cell lines present a spurious methylation pattern at usually unmethylated CpG islands, consequently with the aberrant methylation associated to tumorigenesis. Furthermore, the study of pluripotency gene promoters during myogenesis pointed that CpG-poor promoters are repressed during differentiation by DNA methylation and by Polycomb complex at CpG island promoters. Interested in deepen in the DNA demethylation dynamics, we started a collaboration with Rita Perlingeiro’s Lab (University of Minnesota, USA) to study the DNA methylation changes in the myogenic inducible Pax7 ESC-derived model. We showed that the ESC-derived myoblast precursors recreated the DNA methylation signature of in vivo isolated muscle stem cells, supporting this model as a bona fide strategy to generate myogenic precursors in vitro with therapeutic purposes. Finally, we addressed the involvement of an active demethylating mechanism during myogenesis. Apobec2 down-regulation in inducible ESC-derived myoblast precursors with shRNA strategies affected dramatically the myogenic differentiation by impairing DNA demethylation of the Myogenin promoter and abolishing the expression of Myogenin and MHC proteins. Based on these results, we proposed that Apobec2 might be involved in the active muscle specific DNA demethylation along myogenesis. / Partint de la hipòtesi que la metilació de l’ADN, junt amb altres mecanismes epigenètics i els factors de transcripció, orquestra el programa transcripcional, aquesta tesi ofereix un estudi exhaustiu de les dinàmiques de l'ADN durant la progressió miogènica, aborda les seves possibles implicacions reguladores i identifica regions diferencialment metilades que defineixen la identitat de la cèl·lula muscular. L’anàlisi a escala genòmica els perfils de metilació en diferents estadis de la miogènesi va permetre identificar 1000 regions diferencialment metilades, localitzades principalment en regions intergèniques i intragèniques. La majoria de canvis observats eren guanys de metilació i ocorrien durant la determinació de llinatge. D’altra banda, certes regions amb perfils de cromatina associats a enhancers esdevenien desmetilades, suggerint que la metilació de l’ADN pot estar implicada en la regulació de enhancers específics de teixit. L’estudi de gens específics de múscul va mostrar que la identitat de la cèl·lula muscular requereix la desmetilació de l'ADN de regions reguladores pobres en CpGs, alhora que els gens miogènics amb illes CpG a la regió promotora es troben sempre desmetilats i són regulats per modificacions d’histones. Un exemple de la desmetilació específica de múscul és la regió super-enhancer de Myf5. Els assajos d'immunoprecipitació de la cromatina van demostrar que la unió del factor de transcripció Usf1 al locus Myf5 només es donava quan l’ADN estava desmetilat, reforçant la hipòtesi que la metilació de l'ADN regula l'expressió gènica mitjançant la modulació de l'accessibilitat dels factors de transcripció al seu lloc d’unió. Mitjançant l’estudi el perfil de metilació de l'ADN de gens miogènics en un model miogènic derivat de cèl·lules embrionàries, es va observar el mateix perfil observat en mioblasts primaris, indicant que aquest model és una bona estratègia per obtenir mioblasts in vitro amb finalitats terapèutiques. Finalment, el bloqueig de la deaminasa Apobec2 va afectar severament la diferenciació miogènica i la desmetilació de l'ADN del promotor de la Miogenina, indicant que la deaminasa Apobec2 podria estar implicada en la desmetilació activa de l'ADN.