Aquesta tesi pretenia proporcionar noves perspectives sobre les relacions evolutives entre llagostes de l'infraordre Achelata utilitzant marcadors moleculars, tant d'evolució lenta com d'evolució ràpida, i calcular el temps de divergència entre taxa utilitzant el mètode del rellotge molecular relaxat. Alhora, es pretenia desenvolupar una genoteca per a la llagosta europea Palinurus elephas per tal d'obtenir un conjunt de marcadors microsatèl·lit polimòrfics i comparar les mesures de diversitat genètica i grandària efectiva obtingudes en les sis espècies descrites del gènere Palinurus. A més, es pretenia estudiar les relacions filogenètiques entre espècies del gènere Palinurus i testar el suport de les dades moleculars a diferents hipòtesis evolutives, utilitzant els mètodes clàssics basats en distàncies, i mètodes recents basats en la teoria de la coalescència, com la Computació Bayesiana Aproximada (ABC). Per últim, s'avaluarà l'estructura genètica de les poblacions de P. elephas dins i entre les conques atlàntica i mediterrània i s'estudiarà l'efecte de les diferents estructures oceanogràfiques sobre aquesta estructuració utilitzant el conjunt de marcadors microsatèl·lit prèviament desenvolupat.Els resultats obtesos ens premeten afirmar que les llagostes de l'infraordre Achelata formen un grup monofilètic de crustacis decàpodes compost de dues famílies principals: Palinuridae i Scyllaridae. L'anàlisi molecular confirma Synaxidae com un grup polifilètic, que s'hauria d'incloure dins de Palinuridae. Així, els Palinuridae estarien formats per tres llinatges principals: 1) els Silentes, incloent-hi l'anterior gènere synaxid Palinurellus; 2) un clade Linuparus/Justitia i 3) un clade principal de Stridentes, incloent-hi els gèneres Puerulus, Palinustus, Palinurus, Panulirus i l'anterior synàxid Palibythus. A més, els dos clades principals trobats dins del Scyllaridae estan d'acord amb la taxonomia actual basada en dades morfològiques. Finalment, la datació del temps de divergència del grup Achelata obtinguda amb un model de rellotge relaxat és compatible amb hipòtesis prèvies d'un origen Triassic d'aquest grup. Per tal d'estudiar els processos de divergència més recent dins del gènere Palinurus, s'ha aïllat un conjunt de marcadors microsatèl.lit altament polimòrfics per a P. elephas que, a més a més, també amplifiquen i són polimòrfics per a totes les espècies de Palinurus. Les espècies de Palinurus en aigües superficials semblen tenir unes grandàries poblacionals efectives i un grau de variabilitat en marcadors nuclears majors que les espècies d'aigües profondes, alhora que també semblen haver estat sotmeses a processos més recents de selecció en el mtDNA. L'anàlisi filogenètica dóna suport a un patró d'especiació Nord-Sud al gènere Palinurus, amb totes les espècies africanes formant un clade monofilètic. El patró d'especiació en Palinurus seria un exemple típic d'una sèrie d'esdeveniments d'especiació ràpids, amb branques molt curtes separant les diferents espècies. Curiosament, els temps de divergència obtinguts utilitzant les taxes de mutació estàndards, permeten relacionar els processos d'especiació als processos de canvi climàtic més destacats dels darrers 2 Mya. Finalment, els resultats obtinguts a partir de les dades microsatèl.lit i mtDNA mostren que l'estructuració genètica de les poblacions de llagosta europea és molt baixa. Tanmateix, les conques atlàntica i mediterrània mostren diferències significatives i per tant, es recomana tractar-les com a unitats de gestió diferenciades. Tot i la reducció dràstica en les captures per tota l'àrea de distribució de P. elephas, la grandària efectiva poblacional històrica de P. elephas sembla haver-se mantés constant. A més a més, cal tenir en compte que l'elevada grandària efectiva poblacional de P. elephas provocaria valors de Fst extremadament petits, fins i tot per a poblacions amb nivells de dispersió restringits. / THESIS SUMMARY:The present PhD thesis focus on Achelata lobsters' evolutionary genetics, shifting from ancient divergences to contemporary population genetics. Our results indicate that Achelata form a monophyletic group composed of two main families: Palinuridae and Scyllaridae. The molecular analysis confirms Synaxidae as a polyphyletic group, which should be included within Palinuridae. Therefore, Palinuridae family presents three main lineages: 1) the Silentes, including the former synaxid genus Palinurellus; 2) a Linuparus/Justitia clade and 3) a main clade of Stridentes, including Puerulus, Palinustus, Palinurus, Panulirus and the former synaxid lobster Palibythus. Moreover, the two main clades found within the Scyllaridae are in agreement with current taxonomy based on adult morphological data. Finally, the dating of divergence of Achelata obtained with a relaxed-clock model is compatible with previous hypotheses of a Triassic origin of the Achelata lobsters.A set of highly polymorphic microsatellite markers has been developed from P. elephas which also gives successful amplification and show polymorphism for all Palinurus species. Shallow-water Palinurus species show larger effective population size and genetic diversity for nuclear markers than their deep-water counterparts. At the same time, selection on the shallow-water species' mtDNA genome seems to have been stronger and more recent. Our within-genus phylogenetic analyses consistently supported a North-to-South pattern of speciation in Palinurus with all the South-African species forming a monophyletic clade. Therefore, the Palinurus speciation pattern is a typical example of a series of rapid speciation events occurring within a group, with very short branches separating the different species. Interestingly, divergence times obtained for Palinurus species using the standard rates agree with known glaciation-related processes during the last 2My.Finally, our results for the intraspecific analysis of Palinurus elephas show that no strong population genetic differentiation is present in the European spiny lobster. However, Atlantic and Mediterranean basins showed significant differences and should be treated as different management units. Even though over-fishing has reduced catches dramatically all over its distribution area, historical effective population size seems to have remained constant in the European spiny lobster. The large effective population size of P. elephas would cause Fst values to be extremely small even for populations with restricted levels of dispersal.

La Retinosi Pigmentària (RP), la causa de ceguesa més freqüent en adults (1:4000), està originada per mutacions en més de 50 gens. Un d’aquests és CERKL, gen identificat l’any 2004 pel grup, l’estudi funcional del qual constitueix el tema d’aquesta Tesi Doctoral. Fins el moment, s’han descrit vàries mutacions en CERKL causants d’RP o de distròfia de cons i bastons (CRD). A nivell proteic, CERKL presenta un 50% de similitud amb la proteïna quinasa de ceramides (CERK) i comparteix el domini diacilglicerol quinasa (DAGK). Endemés, CERKL presenta diferents dominis proteics coneguts (senyals de localització (NLS) i d’exportació (NES) nuclear, així com un domini d’homologia a plextrina (PH)). Tot i que s’han identificat mutacions que indubtablement causen degeneració retinal, encara resta per descriure la seva funció fisiològica, així com la seva contribució a la patologia. L’objectiu principal d’aquest treball ha estat la caracterització funcional del gen i la proteïna CERKL a partir d’assaigs in vitro, combinant estratègies in silico, cel•lulars i moleculars, profunditzant en les anàlisis quantitatives i qualitatives dels principals esfingolípids. Finalment, també s’ha construït i analitzat un model animal murí knockout, Cerkl -/-. Els principals resultats obtinguts en aquest treball s’enumeren a continuació: 1.- A nivell transcripcional, s’han caracteritzat de forma exhaustiva les isoformes produïdes per CERKL en retina humana i murina, revelant un nivell de complexitat inesperat, amb més de 20 isoformes, degudes principalment a empalmament alternatiu, així com a la presència de, com a mínim, quatre promotors diferents amb especificitat tissular. 2.- Estudis cel•lulars de sobreexpressió mostren que CERKL exerceix un efecte protector davant l’apoptosi causada per estrès oxidatiu, mentre que les formes mutants no retenen aquesta funció. Encara que els mecanismes de protecció es desconeixen, aquests resultats apunten a una funció neuroprotectora a curt termini de CERKL als fotoreceptors, els quals estan sotmesos de manera continuada a estrès lumínic i oxidatiu. 3.- Estudis exhaustius i detallats mitjançant tècniques de TLC, HPLC i UPLC per l’anàlisi de lípids han demostrat que CERKL no fosforila les ceramides ni cap dels esfingolípids identificats fins el moment, sota les condicions utilitzades. Tampoc s’ha pogut observar una funció quinasa de proteïnes. Els resultats obtinguts en aquest treball apunten a que CERKL ha d’exercir una altra funció a la cèl•lula, molt probablement lligada al transport de lípids o a la regulació d’altres processos cel•lulars. 4.- La localització subcel•lular ha determinat que CERKL localitza, principalment, al reticle endoplasmàtic i a l’aparell de Golgi i, de manera minoritària, al nucli, mostrant una localització extremadament dinàmica que recolza la contribució de CERKL en processos de transport i senyalització, així com una multiplicitat funcional. 5.- Un dels aspectes claus d’aquesta Tesi ha estat el disseny, generació i estudi fenotípic a nivell transcripcional, cel•lular, morfològic, electroretinogràfic i lipidòmic del model animal Cerkl-/-. El ratolí Cerkl-/- és viable i fèrtil, i els nostres estudis preliminars no mostren una degeneració de retina severa. El fenotip dels ratolins KO mostra una alteració significativa i consistent dels potencials oscil•latoris als electroretinogrames, els quals indiquen una afectació de les cèl•lules ganglionars i/o amacrines. Aquestes dades concorden amb les anàlisis immunohistoquímiques i d’hibridació in situ en retines de ratolí WT i KO, on la màxima expressió de CERKL es detecta en les cèl•lules ganglionars, i de manera més moderada, en la capa nuclear interna i fotoreceptors. En resum, CERKL és un gen que mostra una gran complexitat transcripcional i funcional. Els pròxims objectius abordaran l’estudi en detall del model animal generat, així com d’altres models en vies de construcció. / The main aim of this thesis was the transcriptional and functional characterisation of CERKL, one of the many genes described so far that are responsible for Retinitis Pigmentosa (RP), the main genetic cause of blindness in adults (prevalence 1:4.000). In particular, we aimed to: i) characterise the complex CERKL transcription in human and mouse retinas, ii) analyse the subcellular localisation of the CERKL encoded proteins, including the truncated isoform R257X, generated by the most frequent mutant allele; iii) characterise the substrate and possible enzymatic role of the CERKL protein; iv) describe the role of CERKL in the protection against oxidative stress; and last but not least, v) design, create and initially characterise a mouse Cerkl-/- model (knockout) at the transcriptional, histological, immunohistochemical and lipidomic levels, focussing on the retina. Our results showed a high transcriptional complexity of the CERKL gene in the human and murine retina, with an extremely dynamic subcellular localisation, indicating the possibility of different functional roles in each compartment. The overexpression of CERKL protects cells from induced oxidative stress, suggesting that CERKL might play an important role in the initial response against oxidative injuries. CERKL harbours a conserved lipid kinase domain and the high homology with CERK has suggested a possible involvement in the sphingolipid metabolism. However, up to date, no kinase activity has been detected and the CERKL function remains unclear. In order to elucidate the CERKL physiological function, study its role in the retina, and whether it is (or not) related to sphingolipid metabolism, a knockout mouse was generated. The murine model resulted in a knockdown more than a knockout model, as alternative previously unreported promoters directed basal expression of Cerkl. Initial characterisation of the animal model phenotype showed a consistent and non-progressive alteration of the oscillatory potentials in the electroretinograms, an increase of apoptosis and GFAP protein (gliosis marker), as well as a decrease in Brn3a protein (ganglion cell marker), although no gross morphological changes were detectable. All together, these results point to clear signs of functional alteration at the ganglion cell layer. To determine the CERKL involvement in the sphingolipid metabolism, lipidomic quantification was performed and the analyses of the results are currently in progress.

El objetivo principal del trabajo es caracterizar al nivel molecular la variabilidad poblacional de la abeja doméstica, Apis mellifera Linneo, 1758, corroborando de esta manera varias hipótesis de trabajo. Una de ellas se refiere a la estructura poblacional de las abejas en la Región de Murcia y al efecto racial que se deriva de la importación de reinas y del proceso de la trashumancia de las colmenas. Otra hipótesis se refiere a la singularidad de las abejas de las Islas Canarias, cuyos antecesores se sitúan en el norte de África (poblamiento antiguo de las islas por causas naturales) o en la Península Ibérica (poblamiento antrópico a partir del siglo XVI). Se trata de determinar si existe una raza peculiar de estas islas y sus posibles ancestros. / The main objective of this thesis is to characterise at the molecular level, the population variability of Apis mellifera Linné, 1758, and to corroborate in this way several hypotheses. One of them is related with the structure of the honeybee populations from Murcia and the racial effect derived from the queen importation and the migrating movements. Other hypothesis to be corroborated is referred to Canarian honeybees, whose origin could be either Northern Africa (due to natural events) or the Iberian Peninsula (due to human activities from XVI century). The existence of an endemic honeybee race from the Canaries will be investigated.

Ralstonia solanacearum is a soil-borne beta-proteobacterium that causes wilting disease on a wide range of plants with economic importance like tomato, potato, pepper, eggplant and banana. Each year, bacterial wilt pose important threats to agriculture by producing significant economic losses to small-scale producers in developing countries and, lately, the geographical distribution of the pathogen is spreading to temperate regions of the globe. The long-term aim of the work developed was the determination of the genetic program used by R. solanacearum during plant colonization and at the different stages of disease, in order to provide a biologically relevant understanding of the repression/activation regulatory switches controlling R. solanacearum pathogenicity. We noticed that new molecular tools for functional genetic studies adapted to R. solanacearum were needed, because the widely used mutants obtained bytransposon mutagenesis contain gene disruptions rendering, in some cases, bacteria with affected virulence, pathogenicity and unable to multiply inside susceptible plants. In addition, a common issue in R. solanacearum studies was the difficulty to trans-complement gene disruptions. So far, the only alternative available was the use of plasmids, which provided a means of overexpression rather than stoichiometrical complementation, Moreover, the use of antibiotics to maintain plasmids during plant infection is not an option due to the complexity of the system. In this thesis we developed a novel system – pRC, after Ralstonia chromosome –, based in targeted and stable insertions in a precise and permissive location of the bacterial chromosome. We proposed the use of our versatile set of suicide plasmids for the study of transcriptional output (promoter probing) during plant infection, effector overexpression and purification, and monocopy gene complementation in any R. solanacearum strain. The use of the pRC system in any strain will allow the standardization of the genetic studies made in the field. We also investigated gene activities in planta. To that end, we successfully applied a luminescent reporter in the bacterial chromosome to visualize and quantify in real time the activity of pathogenicity-related promoters. We fused the promoter regions controlling two major virulence determinants to the luxCDABE reporter and followed light emission at different stages of plant infection. This strategy allowed us to establish both the timing and the exact location in the plant where these bacterial genes were expressed. Our main finding was that the T3SS is active throughout plant infection and not only at the first colonization stages. It is likely that during plant infection many overlapping signals are perceived by the bacteria, adding complexity to the gene regulatory model proposed in the literature. Together with the two articles published in peer-review journals, two additional drafts, describing the current progress of two other projects are also provided. The first draft reports a novel regulatory feedback loop governing hrpB expression when R. solanacearum is grown in the presence of plant cells. This work is part of a collaboration with Stéphane Genin (Laboratoire des Interactions Plantes Micro-organismes (LIPM, INRA-CNRS, Castanet Tolosan, France).The second draft reports the use of the pRC system to decipher “cool-adaptation” on strain UW551. This work is part of a collaboration with Caitilyn Allen research group (University of Wisconsin – Madison, Wisconsin, USA). / Ralstonia solanacearum es una bacteria Gram-negativa que causa una enfermedad de plantas conocida como marchitez bacteriana. El espectro de plantas huéspedes afectadas es amplio, incluyendo algunas especies con relevancia económica, como por ejemplo el tomate, la patata, el pimiento, la berenjena y el plátano. El objetivo a transversal de la investigación desarrollada en esta tesis de doctorado es la determinación del programa genético utilizado por R. solanacearum durante diferentes etapas de colonización de las plantas. Describimos un novedoso sistema - pRC, basado en el uso de inserciones específicas y estables en un punto específico del cromosoma bacteriano. Proponemos el uso de nuestra versátil colección de plásmidos suicidas para el estudio de la actividad de promotores de genes de patogenicidad y virulencia, la sobreexpresión y purificación de proteínas efectoras y la complementación de genes. El uso del sistema de pRC en cualquier cepa de R. solanacearum permitirá la estandarización de los estudios genéticos realizados en el campo de investigación. En esta tesis también se describe la utilización un reportero luminiscente, integrado en el genoma de la bacteria para visualizar y cuantificar en tiempo real la actividad de promotores de genes de patogenicidad durante la infección. Esta estrategia nos permitió determinar el momento y el lugar exacto de la planta donde se expresan los genes bacterianos. Nuestro principal hallazgo fue que el sistema de secreción de tipo III se transcribe a lo largo del proceso infeccioso y no sólo en las primeras etapas de colonización. Junto con los dos artículos publicados en revistas internacionales, se incluyen también dos manuscritos, que describen el progreso actual de dos otros proyectos. En el primer manuscrito se describe un nuevo proceso de regulación de la expresión de hrpB, cuando R. solanacearum se cultiva en presencia de las células vegetales. Este trabajo es parte de una colaboración con Stéphane Genin, del “Laboratoire des Plantes Interacciones Microorganismos” (LIPM, INRA-CNRS, Castanet Tolosan, Francia). El segundo proyecto describe el uso del sistema pRC para descifrar la capacidad de infección de la cepa UW551 a temperaturas bajas. Este trabajo es parte de una colaboración con el grupo de investigación de Caitilyn Allen (Universidad de Wisconsin - Madison, Wisconsin, EE.UU.)

Les proteïnes HP1 (Heterocromatin protein 1) estan conservades als eucariotes, on la majoria de les espècies contenen vàries isoformes. A partir de les propietats de l'HP1a de Drosophila, s'ha proposat que les proteïnes HP1 uneixen la metilació de l'H3K9 i recluten factors involucrats en l'ensamblatge de l'heterocromatina i el silenciament. No se sap, però, si aquest model és aplicable a totes les isoformes d'HP1 i tots el contextos funcionals. En aquest article aportem que l'HP1c regula l'expressió gènica, ja que (1) localitza a dominis de cromatina activa, on colocalitza abastament amb la forma pausada de la RNA polimerasa II (RNApolII), PolIIser5, i amb la trimetilació de l'H3K4, suggerint una contribució a la regulació transcripcional; (2) la seva localització ectòpica a un gen reporter no indueix el seu silenciament, ans el contrari, incrementa la seva expressió, i (3) interacciona amb dues proteïnes que contenen varis Zn-fingers, WOC (without children) i ROW (Relative of WOC, que són putatius factors de transcripció. També mostrem que tot i que l'HP1c s'uneix eficientment a la metilació de l'H3K9 in vitro, la seva unió a la cromatina in vivo depèn estrictament de WOC i ROW. A més a més, les anàlisis d'expressió realitzades indiquen que HP1c, WOC i ROW regulen un programa d'expressió gènica comú, el qual és executat en part, en el context del sistema nerviós. A partir d'aquestes dades, que revelen la contribució de factors que uneixen ADN a la funcionalitat i el reclutament de l'HP1c, les proteïnes HP1 emergeixen com una família de proteïnes reguladores de la cromatina cada cop més diversa. / Heterochromatin protein 1 (HP1) proteins are conserved in eukaryotes, with most species containing several isoforms. Based on the properties of Drosophila HP1a, it was proposed that HP1s bind H3K9me2,3 and recruit factors involved in heterochromatin assembly and silencing. Yet, it is unclear whether this general picture applies to all HP1 isoforms and functional contexts. Here, we report that Drosophila HP1c regulates gene expression, as (1) it localizes to active chromatin domains, where it extensively colocalizes with the poised form of RNApolymerase II (RNApol II), Pol IIoser5, and H3K4me3, suggesting a contribution to transcriptional regulation; (2) its targeting to a reporter gene does not induce silencing but, on the contrary, increases its expression, and (3) it interacts with the zinc-finger proteins WOC (without children) and Relative-of-WOC (ROW), which are putative transcription factors. Here, we also show that, although HP1c efficiently binds H3K9me2,3 in vitro, its binding to chromatin strictly depends on both WOC and ROW. Moreover, expression profiling indicates that HP1c, WOC, and ROW regulate a common gene expression program that, in part, is executed in the context of the nervous system. From this study, which unveils the essential contribution of DNA-binding proteins to HP1c functionality and recruitment, HP1 proteins emerge as an increasingly diverse family of chromatin regulators.

L'objectiu general d'aquest treball ha estat l'estudi dels canvis a llarg termini del polimorfisme cromosòmic per inversions de Drosophila subobscura en poblacions europees, i la seva possible relació amb el canvi climàtic global del planeta.El polimorfisme cromosòmic de D. subobscura, constitueix un mecanisme genètic d'adaptació ràpida a l'ambient que dóna a l'espècie una flexibilitat adaptativa, com va posar de manifest el fet que a les poblacions colonitzadores de Nord-amèrica i Sud-amèrica s'establissin clines latitudinals per les freqüències de determinades inversions seguint el mateix patró que les existents a la regió paleàrtica. Per tant és probable que aquest polimorfisme respongui a algun factor o factors ambientals correlacionats amb la latitud, com pot ser la temperatura. Així doncs s'ha volgut comprovar si aquest polimorfisme es pot considerar un bon marcador genètic dels canvis en els ecosistemes tant d'origen natural com provocats per l'acció humana.Es van seleccionar tretze poblacions europees que ja haguessin estat mostrejades com a mínim 15 anys enrera, i es van obtenir les mostres de cadascuna en la mateixa localitat i època de l'any que la mostra antiga. Es va determinar la composició i diversitat d'espècies del gènere Drosophila en dotze de les mostres obtingudes, per tal d'obtenir una estimació de la biodiversitat. Per altra part, es van caracteritzar les poblacions mitjançant les freqüències de les inversions o ordenaments existents en cada cromosoma i per a cada població es va comparar el polimorfisme cromosòmic actual amb el de les mostres antigues. En analitzar la variació en l'espai d'aquest polimorfisme, es va comprovar l'existència de clines latitudinals en les mostres noves, equivalents a les trobades en les mostres antigues. Quan es va estudiar el polimorfisme cromosòmic en les mostres noves es van trobar tres noves inversions (U13, E22 i E23) que no havien estat descrites anteriorment. També es van detectar per primera vegada ordenaments al continent europeu que fins aleshores només s'havien trobat al nord d'Àfrica, a les Canàries i a Madeira. En comparar el polimorfisme entre les mostres noves i velles per cada població es van trobar diferències significatives en les freqüències dels ordenaments per tots els cromosomes excepte pel J. Les diferències significatives d'aquest polimorfisme detectades en l'espai entre poblacions, tant en les mostres antigues com en les noves és deguda a les clines latitudinals que presenten els diversos ordenaments cromosòmics. Es va observar que la distància genètica entre les mostres noves era menor que entre les antigues, la qual cosa indica que les diferències entre poblacions han tendit a fer-se menors al llarg del temps. Es va voler comprovar si a cada població havia disminuït la freqüència d'aquells ordenaments típics de latituds fredes i, de manera corresponent, si havia augmentat la freqüència d'aquells típics de les latituds càlides, a fi i efecte de relacionar aquests canvis amb el possible escalfament global del planeta. El conjunt de totes les poblacions presentava aquesta tendència clarament, i també quan les poblacions s'agrupaven en atlàntiques, mediterrànies i centreeuropees.Es pot concloure que el polimorfisme cromosònic de D. subobscura ha canviat sistemàticament durant els darrers 14 a 47 anys, i que els canvis poden ser deguts a canivs en factors climàtics correlacionats amb la latitud, molt probablement la temperatura.

Scp160 és una proteïna de Saccharomyces cerevisiae que conté 14 dominis KH de tipus I, un domini conservat present en un gran nombre de proteïnes. Scp160 presenta homologia amb la proteïna de metazous coneguda com a vigilina. Aquestes proteïnes es troben conservades en el grup dels fongs i els metazous. Les vigilines han sigut associades en diferents processos cel·lulars entre els que cal destacar: la regulació general de la síntesi proteica, la estabilització de mRNAs específics i la contribució a la segregació dels cromosomes en mitosi.La vigilina de Drosophila melanogaster, la proteïna DDP1, va ser aïllada en el nostre laboratori com una proteïna associada a la heterocromatina pericentromèrica d'aquest organisme. Donada la conservació d'aquestes proteïnes entre els fongs i els metazous ens em plantegat l'estudi de la possible contribució de la proteïna Scp160 en la formació i manteniment de la heterocromatina de S. Cerevisiae.Les cèl·lules mutants scp160 presenten, en ser analitzades per FACS, nivells de ploidia aberrants suggerint la presencia de problemes en el procés de segregació cromosómica d'aquestes cèl·lules. Consistent amb la presencia de alteracions en al procés de segregació cromosòmica les cèl·lules scp160 presenten hipersensibilitat a drogues desestabilitzadores de microtubuls com el benomyl. La expressió de la proteïna DDP1 de forma ectópica en cèl·lules de S. Cerevisiae es capaç de complementar la manca de la proteïna Scp160 indicant que ambdues proteïnes no només són homòlegs estructurals, sinó que també són homòlegs funcionals.Per tal de analitzar la contribució de la proteïna Scp160 a la estructuració de la heterocromatina als diferents loci silenciats que hi ha en el genoma de S. Cerevisiae, per això hem realitzat la deleció del gen SCP160 en soques que portaven marcadors inserits en les regions telomèriques, els locus silenciats del mating type i el locus del rDNA, observant-se que la deleció del gen SCP160 es comporta com un supressor de variegació en les seqüències telomèriques i en el locus del mating type, preo no té cap efecte en el silenciament del locus del rDNA.Consistent amb el efecte de desrepresió observat en les seqüències telomèriques la mutació scp160 presenta una desregulació en la longitud de les seqüències telomèriques, suggerint una implicació d'aquesta proteïna en el manteniment d'aquestes seqüències.Per tal de aprofundir en el defecte de silenciament que presenten les cèl·lules mutants scp160 hem estudiat mitjançant CHIP la presència de la proteïna Sir3 en les regions telomèriques de les cèl·lules mutants, observant-se una disminució significativa dels nivells de Sir3 en comparació amb cèl·lules wild type. Consistent amb aquest efecte la sobreexpresió de la proteïna Sir3 es capaç de recuperar la pèrdua de silenciament telomèric observat en les cèl·lules scp160. Així mateix el fenotip de desrepresió associat a la deleció del gen SCP160 no s'estableix en cèl·lules que sobreexpressen Sir3 o que presenten mutacions que reforcen el silenciament telomèric, com la mutació de la histona desacetilasa Rpd3 o de les proteïnes telomèriques Rif1 i Rif2.Tots aquest resultats no ens permeten discernir entre una implicació directa de la proteïna Scp160 en aquest processos o una acció indirecta deguda a la regulació d'altres processos cel·lulars. La proteïna Scp160 presenta una localització perinuclear compatible amb la presència d'aquesta proteïna a les seqüències heterocromàtiques de S. Cerevisiae, però no ha pogut ser localitzada en les regions telomèriques d'aquest organisme mitjançant CHIP. Són necessaris estudis posteriors per a determinar la presència d'aquesta proteïna en les regions heterocromàtiques d'aquest organisme.ENGLISH / Vigilins are highly conserved proteins found in fungi and metazoan. Vigilins contains 14-15 KH domains, a protein domain involved in single stranded nucleic acids binding.Drosophila melanogaster vigilin, the protein DDP1, was isolated in our lab as a protein associated with pericentric heterochromatin. As these proteins are conserved among fungi and metazoan, we wanted to study the possible implication of Scp160, Saccharomyces cerevisiae vigilin, in the formation and maintenance of heterochromatin.Mutants cells scp160 shows aberrant DNA content upon analysis with FACS. Consistent with alterations in the chromosome segregation process, these cells show hypersensitivity to benomyl, a microtubule depolymerising drug. Ectopic expression of Drosophila DDP1 in yeast cells was able to complement scp160 mutation in yeast. In order to analyse the contribution of Scp160 to heterochromatin formation we have deletes SCP160 gene in strains bearing markers at different loci that are silenced in the Saccharomyces cerevisiae genome: telomeric regions, mating type locus and rDNA locus. We have seen that SCP160 deletion behaves like a suppressor of variegation in telomeric and mating type region, but not in rDNA region.Scp160 protein shows perinuclear localization compatible with its presence in heterochromatic regions, but we could not detect this protein in the telomeric regions by chromatin immunoprecipitation experiments.

Les Metal·lotioneïnes (MTs) configuren una família de proteïnes de baix pes molecular àmpliament distribuïdes entre els éssers vius (des dels protozous i plantes als metazous), riques en cisteïnes (Cys), que uneixen metalls pesants com el Zn, Cu, Cd, Hg,... Tot i que se'ls ha atribuit un paper en la detoxificació metàl.lica, i se n'ha estudiat estructuralment alguns dels seus membres (principalment MTs de vertebrats i fongs) es coneix poc quina és la relació estructura-funció en aquestes MT, i queden encara molts àmbits funcionals per explorar. Aquesta tesi té per objectiu estudiar la relació entre la estructura i la funció de MTs d'Invertebrats, Protozous i Plantes. Amb aquest objectiu s'ha estudiat el comportament coordinatiu les MT de diversos organismes model per a les MT.Les MT estudiades s'han estat sintetitzat heteròlogament en medis rics en Zn, Cd o Cu, i els agregats metall-MT obtinguts han estat analitzats mitjançant diverses tècniques espectroscòpiques i espectromètriques (ICP-AES, ESI-MS, CD, UV, Raman, IR, GC-FPD) i valoracions in vitro de substitució del Zn per Cd o Cu. Quan ha estat necessari, s'han construit formes quimèriques de les MT mitjançant teconologies d'ADN recombinant. Amb aquestes dades s'ha descrit el comportament coordinatiu de cada MT, que s'ha posat en relació amb dades estructurals i/o funcionals. Les MT MTNA, MTNB, MTNC i MTND de Drosophila melanogaster mostren preferència coordinativa per el Cu, tot i que les 3 darreres semblen tenir especificitat funcional per el Cd. La MT de la planta Quercus suber (QsMT) presenta dos dominis cisteínics separats per un espaiador, i elements d'estructura secundària. L'estudi de quimeres de QsMT demostra que l'espaiador participa en la detoxificació in vivo de Cd i Cu en llevats, i en la unió de Cd mitjançant un residu histidina. La MT CeMT2 de Caenorhabditis elegans presenta preferència coordinativa per el Zn. L'estudi de formes mutades indica que CeMT2 és capaç de formar dímers mitjançant la seva His situada a C-terminal, i que el seu plegament no es dòna en dos dominis 9Cys+9Cys en coordinar Zn o Cu. La MT TpMT1 de Tetrahymena pyriformis presenta preferència coordinativa per els metalls divalents, presenta resistència a substituir el Zn per Cd o Cu, i conté elements d'estructura secundària del tipus hèlix alfa en agregats amb Zn o Cd. La MT MT-10-IV de Mytilus edulis presenta un comportament coordinatiu compatible amb un rol homeostàtic, més que no pas amb un paper detoxificador, més atribuible a la seva subfamília homòloga, MT-20. La MT SpMTA de Strongylocentrotus purpuratus presenta propietats funcionals molt diferenciades respecte les MT de mamífer, tot i assemblar-s'hi molt des d'un punt de vista estructural: SpMTA mostra especificitats funcionals envers el Cu, que l'asocien a un paper homeostàtic més que no pas detoxificador. L'estudi d'aquests agregats ha permès també descriure que en la coordinació metàl.lica en MTs i la determinació de les propietats funcionals, a més de la cisteïna, hi intervenen també altre lligands (per exemple, histidina i ions clorur) i nivells estructurals (estructures secundària i quaternària). A més, els anàlisis amb GC-FPD han permès detectar per primer cop la presència de ions sulfur en agregats metall-MT. Des d'un punt de vista metodològic, aquesta tesi ha aportat al camp de recerca nous procediments (com l'ICP-AES àcid, la detecció de dímers per ESI-MS i les covaloracions) i tècniques (com l'estudi de l'estructura mitjançant Raman i IR, i la mesura i detecció de ions sulfur en agregats metall-MT mitjançant tinció de plata, GC-FPD, CD, UV i Raman). / "STUDY OF THE STRUCTURE-FUNCTION RELATIONSHIP IN METALLOTHIONEINS OF INVERTEBRATES, PROTOZOANS AND PLANTS."TEXT:Metallothioneins (MTs) are widely-distributed, low molecular weight, Cys-rich proteins, which present the ability to bind heavy metals (Zn, Cd, Cu, Hg,...)Most of the studies have been centred on their detoxification-role and the structural features of vertebrate and fungal members of this family. The goal of this PhD thesis is to study the structure-function relationship in MTs from Invertebrates, Protozoans and Plants, MT groups traditionally ignored from the functional and structural points of view.The coordinative behaviour of several MTs of these groups has been studied by means of heterologous synthesis of metal-MT aggregates in Zn, Cd, or Cu-rich media and subsequent characterization of the in vivo-synthesized purified aggregates (ICP-AES, ESI-MS, CD, UV, Raman, IR, GC-FPD) and titrations with Cu+ or Cd2+ ions. The MT-forms studied in this thesis are D.melanogaster MTNA, MTNB, MTNC, MTND, Q.suber QsMT, C.elegans CeMT2, M.edulis MT-10 IV, T.pyriformis TpMT1, S.purpuratus SpMTA, and some chimerical forms of these MTs, generated by recombinant DNA techniques.The study of the aggregates obtained have demonstrated that other factors than cystein amount and distribution are of importance in the determination of the functional properties, both at the metal-binding (histidine, clorur ions) and structural (secondary and quaternary structures) levels. Moreover, GC-FPD analyses have allowed detecting for the first time the presence of sulphide ions in metal-MT aggregates. This grows unexpectedly the functional and structural possibilities of the MT family. From a methodological point of view, this thesis have generated new analysis processes (as the acid ICP-AES, the detection of MT-dimeric forms or the co-titrations) and technical possibilities (as the structural study by means of Raman and IR spectroscopies or the measurement and detection of sulphide ions in Metal-MT aggregates by Ag staining, GC-FPD, CD. UV and Raman).

/Tesi realitzada al Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona (CMRB) / IPSC are potent tools in the creation of disease models for both basic studies on the disease and testing of potential therapeutical drugs. In this context, it has been developed the derivation of iPSC from patient fibroblasts suffering from Gaucher Disease (GD) or Tay Sachs disease (TS). GD is a recessive autosomic disease which is characterized by the deficiency of the enzyme called glucocerebrosidase (GBA), which leads to the accumulation of its substrate glucosylceramide in macrophages and neurons. This disease has 3 forms of clinical presentation: type I, which is systemic; type II, the most severe with a neuronopathic acute presentation; type III, which is a combination of the former two, but without the severity of the type II. Tay Sachs is an autosomic recessive disease which is characterized by the Hexosaminidase A (HexA) deficiency, which leads to GM2 accumulation on the lysosomes of neurons. Patients present neurodegeneration and severe impairment of the brain which ultimately leads to their death. In this project iPSC derived from GD and TS patient fibroblasts. Pluripotent state of the derived iPSC has been characterized. Later, iPSC have been differentiated to neurons in order to confirm the disease phenotype on the in vitro differentiated tissue. In GD the phenotype was corroborated by enzymatic assays and GBA detection by Western blot. A lower GBA activity on GD neurons compared to WT was found, consistent with the minor GBA levels in GD neurons detected in the western blot. In TS, derived neurons were analyzed by immunofluorescence for Lamp2 (lysosome marker), observing an increase in size and number on the TS neurons in contrast to WT. Also, TS neurons were analyzed by transmission electron microscopy, presenting membranous lamellar bodies in the cytosol of TS. Both iPSC diseases have been used as a platform for testing therapeutical drugs efficiency on the iPSC derived neurons. / Las iPS (células pluripotentes inducidas) se han revelado como potentes herramientas en la creación de modelos de enfermedades humanas para su estudio y el testeo de potenciales drogas. En este marco hemos desarrollado un proyecto para derivar iPS de fibroblastos de pacientes de Gaucher y Tay Sachs, ambas enfermedades monogénicas recesivas. La enfermedad de Gaucher se caracteriza por la deficiencia de la glucocerebrosidasa (GBA), lo que conlleva la acumulación de su substrato, la glucosilceramida, en macrófagos y neuronas. Esta enfermedad tiene tres presentaciones I, que es sistémica; II, que es una forma neuronopática aguda, tiene efectos fatales ya que los pacientes rara vez sobreviven a los dos años de edad; y III, que es una mezcla de las dos anteriores, siendo neuronopática crónica, sin llegar a la severidad del tipo II. Tay Sachs es una enfermedad que se caracteriza por la deficiencia de la Hexosaminidasa A (HexA) lo que conlleva el almacenamiento en el lisosoma del gangliósido GM2. Los pacientes de esta enfermedad presentan daños neurológicos, provocando la muerte en la mayoría de los casos. En este proyecto se han desarrollado las iPS derivadas de fibroblastos de un paciente de Gaucher tipo II, y de otro de Tay Sachs. Las iPS resultantes de ambas enfermedades han sido caracterizadas para constatar su estado pluripotente y diferenciadas a neuronas para comprobar que presentan el fenotipo característico de las enfermedades. En el caso de Gaucher, mediante ensayos enzimáticos y detección de la GBA1 por western blot, detectando una menor actividad en las neuronas gaucher que en las WT, lo que es consecuente con la menor cantidad de GBA1 detectada. En el caso de Tay Sachs, las neuronas se han analizado mediante inmunohistoquímica, marcando Lamp2, típico de lisosomas y se ha observado un aumento de tamaño y cantidad respecto de las células WT diferenciadas en paralelo. También han sido analizadas por microscopía electrónica, presentando una acumulación de cuerpos laminares en los lisosomas y aumento de número y tamaño de éstos. Ambas enfermedades han sido utilizadas como modelos para probar compuestos en las neuronas derivadas de las iPS derivadas de fibroblastos del paciente y comprobar su eficacia.

Las señales receptor tirosina kinasa (RTK) controlan un amplio abanico de decisiones durante el desarrollo de un animal, como la proliferación celular, diferenciación, morfogénesis y supervivencia. Muchas de estas señales se transducen a través de la cascada de Ras-MAPK que en última instancia fosforilan un factor de transcripción regulando la expresión de distintos genes. Los mecanismos moleculares por los que la señalización por RTKs inducen repuestas tan diversas permanecen aún sin esclarecer. Los efectores de la vía más estudiados en Drosophila son Pointed y Yan donde en ausencia de señalización, los genes diana se mantienen reprimidos por Yan, mientras que la actividad de la vía fosforila Pointed y Yan, resultando en la activación transcripcional a través de la asociación de Pointed al ADN. Estudios más recientes han mostrado que otro de los factores fosforilado por la vía es Capicua (Cic). Cic es un represor materno que es fosforilado por la MAPK y esta fosforilación dirige la desactivación de la proteína. En este trabajo, hemos mostrado que las secuencias de unión a Cic en sus genes diana representan un mecanismo general de interpretación de la señal por Ras-MAPK. Hemos descrito el mecanismo por el que la vía de Torso regula los genes huckebein (hkb) y tailless (tll) a través de la desactivación de Cic en los polos del embrión en el estadio de blastodermo sincitial. La expresión restringida de tll y hkb a los polos del embrión por la proteína Cic, permite la expresión de genes del tronco para la correcta segmentación del eje A/P del animal. Además, hemos definido una nueva diana de Cic en el eje dorsoventral (D/V) del embrión, intermediate neuroblast defective (ind), que alberga la función de diferenciar la células que dan lugar a los neuroblastos intermedios del sistema nervioso central. Experimentos adicionales nos han permitido describir el mecanismo por el que Cic regula el gen argos en repuesta a la señalización por EGFR, en el disco imaginal de ala. En este contexto, al contrario que en los casos del embrión, la desactivación de la proteína Cic en respuesta a la vía de EGFR no es el único mecanismo por el que se induce el gen diana. Trabajos posteriores tendrán que explicar esta red de regulaciones más compleja. Además de la identificación de la secuencia de unión de Cic a los elementos reguladores de sus genes diana, hemos estudiado el papel del correpresor Groucho (Gro) en la regulación de hkb. Trabajos anteriores habían implicado a Gro en la regulación de los genes hkb y tll ya que embriones mutantes para gro muestran un patrón expandido de estos genes terminales. Este patrón, es muy similar al que se observa en embriones mutantes cic por lo que se ha sugerido que Gro podría actuar junto a Cic para la regulación de hkb y tll. Nosotros hemos podido demostrar que los lugares de unión de Cic en el enhancer de hkb son importantes para reclutar Gro al ADN. Este resultado nos indica que Gro está actuando a través de Cic para mediar la represión y no a través de otro factor que también pudiera regular la expresión de hkb. La señalización por EGFR en las células dorsoanteriores del ovario está implicada en el establecimiento del eje D/V a través de la represión del gen pipe (pip) en esta región. Nosotros hemos podido demostrar que esta regulación ocurre de manera análoga a la del embrión. Cic reprime los represores inducidos por la vía de señalización, Tll y Mirror (Mirr) en el embrión y ovario respectivamente, para posibilitar la expresión de sus genes diana, Kruppel (Kr) y pip, y así determinar las regiones que les corresponden como el tronco en el embrión y la región ventral en el ovario. Por otro lado hemos descrito un nuevo mecanismo por el que los substratos de la MAPK compiten entre ellos por la fosforilación por debajo de la vía de Torso. Así, hemos explicado la razón por la que aún habiendo más MAPK fosforilada en el polo anterior del embrión, existe una menor desactivación de Cic y cómo este efecto puede afectar la regulación de los genes diana. / The function of Capicua repressor in the interpretation of RTK-Ras-MAPK signaling in Drosophila Receptor tyrosine kinase (RTK) signaling pathways control multiple decisions during Drosophila development such as proliferation, differentiation, morphogenesis, and survival. Many RTKs signal through the very well conserved Ras-MAPK cassette that ultimately phosphorylate a nuclear factor altering the transcriptional output in many different contexts. The molecular mechanisms that lead to so many different outputs are still under study. In this work we have analyzed the molecular mechanism by which Capicua (Cic), a recently described downstream repressor of the pathway, regulates gene expression in different contexts. We found that the Cic binding sites represent a general mechanism of Ras-MAPK signaling interpretation. Cic is downregulated in the cells with active signaling pathway alleviating the repression on its target genes. In the cells with no active signaling, Cic is repressing its targets localizing their expression to restricted patterns. We showed that Cic regulates huckebein (hkb) and tailless (tll) expression at the poles of the blastoderm embryo allowing a correct A/P axis formation. hkb regulation by Cic requires the association to the global co-repressor Gro. We also found that Cic regulates intermediate neuroblast defective (ind) gene in the D/V axis of the embryo for the intermediate neuroblast formation and it regulates argos (aos) gene expression in the wing imaginal disc for a stereotyped wing vein pattern formation. We also showed that the mechanism by which the EGFR signaling pathway restricts pipe (pip) expression to the ventral follicle cells of the ovary is analogous to that occurring in the embryo: Cic restricts mirr expression to the cells with active EGFR signaling in the dorsoanterior follicle cells to allow the expression of its target, pip, in the ventral region. Finally, we also showed a novel mechanism by which MAPK substrates compete for the phosphorylation, and this mechanism explains why in the anterior pole of the embryo, containing higher concentration of phosphorylated MAPK, Cic protein concentration is higher.