Mi trabajo de tesis está compuesto por dos estudios diferenciados. Por un lado, el análisis molecular de la Osteocondromatosis Múltiple (MO) en pacientes españoles y latinoamericanos. El uso combinado de dos métodos complementarios en la búsqueda de mutaciones (detección de la dosis génica y análisis de la secuencia de ADN) ha permitido descubrir la causa de MO en el 95% de los pacientes españoles y en el 83% de los pacientes latinoamericanos analizados. Se han genotipado los exones y las regiones intrónicas flanqueantes de los genes causantes de la MO, EXT1 y EXT2, en 39 pacientes españoles y 27 latinoamericanos. Se ha identificado la mutación causal en 37 de los pacientes españoles, 29 en EXT1 y 8 en EXT2, 18 de las cuales no habían sido descritas previamente. Tras el análisis mutacional en los pacientes latinoamericanos se ha identificado la mutación causal en 18 de ellos. El análisis mediante MLPA ha permitido descubrir mutaciones de tipo mosaico y se ha confirmado que este tipo de mutaciones también pueden dar lugar a MO. También se ha realizado un estudio de la correlación genotipo-fenotipo en estos pacientes. Este estudio ha permitido determinar que los pacientes españoles con mutaciones missense tienen menor número de osteocondromas que los pacientes con otro tipo de mutaciones. En los pacientes latinoamericanos no se ha podido establecer ninguna correlación entre el grado de severidad de la MO y el gen mutado. Por otra parte, mi tesis aborda el estudio genético molecular del fenotipo alta masa ósea (HBM) en probandos españolas. Se encontraron 13 casos con este fenotipo en los que se analizaron los exones relevantes del gen LRP5, descrito como causante de la HBM y de su inhibidor DKK1. No se encontraron mutaciones en las regiones analizadas del gen LRP5. En una probando con HBM se ha identificado un cambio missense en DKK1 (p.Y74F), no descrito previamente, que podría ser la causa del fenotipo. Se realizó un estudio de 55 loci autosómicos asociados con la densidad mineral ósea (DMO) para comprobar si las probandos tienen un mayor número de alelos protectores frente a la pérdida de masa ósea. En la mayoría de los casos de HBM estudiados, los niveles de DMO se distribuyen inversamente al número de alelos de riesgo de osteoporosis. El único caso en el que esto no se cumple es el que presenta el mayor valor de Z-score y su alta masa ósea podría explicarse por una variante genética rara y penetrante. Por otro lado, se pudo disponer de osteoblastos primarios de dos probandos con HBM y de 5 muestras control y se realizó un análisis transcriptómico de estas células para analizar la expresión diferencial de genes relevantes en el metabolismo óseo en este tipo celular. En el estudio de expresión en osteoblastos primarios se ha observado una correlación negativa entre el valor de Z-score y la expresión de IL6R, DLX3, TWIST1 y PPARG. Este estudio transcriptómico apunta a que tanto un aumento en los niveles de RUNX2 como una disminución en la cantidad de SOX6 podrían tener un papel en algunos casos de HBM. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se propone un modelo de heterogeneidad genética para la HBM, en la que hay casos debidos a efectos pequeños y aditivos de diversos genes y otros causados principalmente por mutaciones en un único gen. / There are two different studies that compose my thesis. The first one is a molecular analysis of multiple osteochondromas (MO) in Spanish and Latin American patients. MO is a genetically heterogeneous disease caused by mutations in two genes: EXT1 and EXT2. On sequencing all exons and flanking regions of those two genes in the samples of 39 unrelated patients, 37 pathogenic mutations were identified. Twenty-nine different mutations were found in the EXT1 gene, while 8 were found in EXT2. Eighteen out of the 37 mutations were novel. After the mutational analysis in Latin American patients the causative mutation in 18 of them has been identified. MLPA analysis has revealed mosaic mutations and it has been confirmed that such mutations can also lead to MO. Also a study of genotype-phenotype correlation in these patients was made. On the second one, my thesis addresses the molecular genetic study of high bone mass phenotype (HBM). Thirteen cases were found with this phenotype and the relevant exons of LRP5, described as HBM causative gene, and DKK1, that is LRP5 inhibitor, were sequenced. No mutations in the relevant exons of LRP5 were found. A rare missense change in DKK1 was found in one woman (p.Y74F). Fifty-five BMD SNPs were genotyped in the HBM cases to obtain risk scores for each individual. Z-scores were negatively correlated with these risk scores, with a single exception, which may be explained by a rare penetrant genetic variant. An expression analysis in primary osteoblasts from two HBM cases and five controls was carried out. It showed that IL6R, DLX3, TWIST1 and PPARG were negatively related to Z-score. One HBM case presented with high levels of RUNX2, while the other displayed very low SOX6. In conclusion, we provide evidence of heterogeneity and the additive effects of several genes for the HBM phenotype.

This thesis studies a group of aquatic beetles (Agabus brunneus complex) that present important differences in the size of their geographic ranges. This complex is composed by an insular species (A. rufulus), a continental species with restricted range (A. ramblae) and another continental species (A. brunneus) that posses a wide range of distribution (A. brunneus) with the aim of study the factors implied in those differences. For this purpose we integrated the phylogeny/ phylogeography of the group and the evolution of the ecological niche together with morphological study and thermal tolerance of species. This complex of species diversified at the end of Pleistocene in Iberian Peninsula probably after the colonization of A. ramblae from Morocco. One of the resultant species (A. brunneus) at some point of the diversification acquired the ability to resist colder temperatures and was able to disperse to colder climates. To understand range variability from another perspective we used population proteomics to analyse the response of several populations for A. ramblae and A. bruneus facing temperatures that they might experience on field. We decided to analyse the variability at several levels in two populations of (A. ramblae) when working with natural populations obtaining satisfactory results for the reproducibility of our experimental methodology. When we analysed globally two populations for each species (one from Morocco and one from Iberian peninsula for each) we saw that the diversification observed in the phylogeny was encompassed with changes at the proteomic response. The more common proteins identified belong to energetic metabolism and stress proteins. The latter were detected to express differentially between the two species studied, showing a different response to thermal stress. This work address the possibility of employing population proteomics in natural populations of non-model species and being able of recovering the stress response facing an environmental factor like temperature. We show as well that differences in range size can be encompassing with the acquisition of capacity to face thermal stress. / Esta tesis parte del estudio de un grupo de especies de escarabajos acuáticos (Agabus brunneus complex) que poseen diferencias importantes en el tamaño de sus rangos geográficos, contando con una especie insular (A. rufulus), una continental de rango restringido (A. ramblae) y una continental de rango amplio (A. brunneus) para estudiar los factores implicados en esas diferencias. Este complejo de especies diversificó a finales del Pleistoceno en la península ibérica posiblemente tras la colonización de A. ramblae desde Marruecos. Una de las especies resultantes A. brunneus en algún momento de la diversificación desarrolló la capacidad de resistencia a bajas temperaturas lo que le facilitó el poder extender su rango hacia climas más fríos. Se empleó la proteómica de poblaciones para analizar la respuesta de varias poblaciones de A. brunneus y A. ramblae frente a temperaturas que pueden experimentar en la naturaleza. Al estudiar la variabilidad a distintos niveles entre dos poblaciones naturales de A. ramblae obtuvimos una buena reproducibilidad de nuestros experimentos. Al analizar de forma global dos poblaciones para cada especie (Marruecos y península ibérica para ambas) descubrimos que la diversificación de la filogenia ha ido acompañada de cambios en la respuesta a nivel de expresión proteínica. La mayoría de las proteínas identificadas están relacionadas con el metabolismo energético y con proteínas del estrés, estas últimas se expresan diferencialmente entre las dos especies analizadas, indicando una diferente respuesta al estrés térmico. El presente trabajo abre la posibilidad de realizar este tipo de experimentos empleando poblaciones naturales de especies no modelo y demuestra que la respuesta frente al estrés de un factor ambiental, en este caso la temperatura, puede recuperarse empleando para ello la proteómica. Así mismo las diferencias en el tamaño del rango pueden ir acompañadas de la adquisición de distinta capacidad de respuesta frente al estrés térmico.

Sanfilippo C syndrome is a lysosomal storage disorder that presents an autosomal recessive inheritance pattern and is caused by mutations in the HGSNAT gene, identified in 2006 in the chromosome 8. This gene codes for a lysosomal transmembrane protein, acetyl-CoA α-glucosaminide N-acetyltransferase, which acetylates the terminal glucosamine in the heparan sulfate chain during its degradation, a crucial step previous to the action of the next enzyme of the pathway. Heparan sulfate is a glycosaminoglycan localized in the extracellular matrix being part of proteoglycans and participate in several and important cellular processes. The HGSNAT protein dysfunction promotes the storage of partially degraded heparan sulfate chains inside the lysosomes, causing an alteration in many different cellular processes and affecting especially neurons. This fact promotes the progressive and severe neurodegeneration that appears during childhood as the main phenotypic feature in patients. This thesis represents an important study on the molecular basis of Sanfilippo C syndrome. Firstly, a mutational analysis has been performed, identifying the mutations causing the disease in 15 patients from different origins. A total of 13 different mutations have been found, seven of which were not previously described. The pathogenicity of four missense mutations identified has been proved by measuring the enzyme activity after in vitro expression of the proteins. Also, the pathogenicity of five mutations affecting different conserved splice sites has been demonstrated since they were shown to alter the splicing process. It has been established that two prevalent mutations in Spanish patients accounts for almost the 70% of the total and, using a haplotype analysis, a single origin for each of them has been suggested. Secondly, some therapeutic approaches have been tested, as a first step in the pursuit of an effective therapy that to date does not exist for this disease. The use of modified U1 snRNAs that present a higher complementarity to the mutated splice site sequences than the wild type U1 snRNA has been proved to partially restore the normal splicing process for one of the splicing mutations analyzed. In the case of missense mutations or mutations that result in the loss of some amino acids, this work suggests the possibility to use glucosamine as a chaperone to prevent the incorrect folding of the protein and to facilitate the trafficking process of the protein from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus. Finally, the use of siRNAs to inhibit important genes in the heparan sulfate synthetic pathway, specifically the EXTL genes, has been suggested as a possible substrate reduction therapy, with the best results obtained on the inhibiton of EXTL2 expression. Finally, during this thesis, a neuronal model for Sanfilippo C syndrome has been obtained. This represents an important progress in the study of this disease since to date, neither cellular nor animal model exists. To achieve this goal, fibroblasts from two different Sanfilippo C patients have been reprogrammed to produce induced pluripotent cells that later have been differentiated to neurons. It has been demonstrated that these neurons present the typical phenotypic features of the disease such as the lack of enzyme activity, the heparan sulfate storage, the increased size and number of lysosomes, an alteration in the autophagy process and an increase in the number of apoptotic cells. Using specific experiments to study the neuronal activity in these cultures, a progressive decrease in the patients’ neurons activity and problems in the maintenance of the developed neuronal networks has been detected. This model will be a good platform to study profoundly the molecular, cellular and brain basis of the disease and to develop and test different therapeutic approaches for Sanfilippo C syndrome in the cellular type most affected in patients. / La síndrome de Sanfilippo és una malaltia monogènica hereditària que presenta una severa i progressiva neurodegeneració que s’inicia durant els primers anys de vida dels pacients. Està causada per mutacions en el gen HGSNAT, identificat l’any 2006 en el cromosoma 8, el qual codifica per l’enzim acetil-CoA α-glucosaminida N-acetiltransferasa, una proteïna de membrana lisosomal. La seva funció és acetilar les glucosamines terminals de les cadenes de heparà sulfat que estan sent degradades. Quan la proteïna està mutada, es promou l’acumulació de cadenes d’heparà sulfat parcialment degradades en els lisosomes, les quals augmenten en nombre i mida, provocant la seva disfunció. Per aquesta raó, la síndrome de Sanfilippo es classifica com a malaltia d’acumulació lisosòmica, en concret com a una mucopolisacaridosi, degut a la naturalesa del substrat acumulat. L’heparà sulfat és un dels glicosaminoglicans, anteriorment coneguts com a mucopolisacàrids, que es troba en la matriu extracel·lular formant part dels proteoglicans. Aquestes molècules participen en diferents i importants funcions cel·lulars com ara la migració i l’adhesió. La desregulació de la seva homeòstasi provoca una disfunció de múltiples processos cel·lulars. Aquesta tesi contribueix de manera important a l’estudi molecular de la malaltia. S’ha portat a terme un anàlisi mutacional i la conseqüent caracterització de les mutacions identificades per tal d’aprofundir en el coneixement de la malaltia. Per altra banda, s’han provat diferents possibles aproximacions terapèutiques com un primer pas en l’obtenció d’una teràpia exitosa per a aquesta devastadora malaltia neurodegenerativa per la qual encara no hi ha un tractament efectiu. Finalment, s’ha generat un model neuronal utilitzant cèl·lules mare pluripotents induïdes. Aquest model serà d’utilitat per estudiar i entendre els processos moleculars i cel·lulars que contribueixen al desenvolupament de la malaltia a nivell de la neurona i representarà una ajuda molt valuosa en la cerca de tractaments efectius.

Severe mental disorders, such as Major Depressive Disorder (MDD), Bipolar Disorder (BD) and Schizophrenia (SCZ), represent a huge burden to society, reflecting the limited efficacy of current drug treatments. Although the progress in development of pharmacological treatments is one of the great successes of modern psychiatry, it should not be forgotten that a very high percentage of patients do not receive and/or seek the proper treatment for their disease. Individual differences in clinical response to psychotropic drugs have long been recognized as a fundamental problem in the treatment of the seriously mentally ill patient. This variability in individual response ranges from patients who experience complete symptom remission to a subset of patients often describes as “treatment refractory”, as well as a marked variability in susceptibility to adverse drug effects. In this sense, the overall objective of pharmacogenetics is to determine the genetic basis of the variability in drug efficacy and safety, and to use this information to benefit the patient detecting a priori those patients that could not respond to a drug and/or present drug side effects. The present dissertation hypothesizes that lack of response to psychotropic drugs will be associated to genetic variability at genes coding for proteins involved directly or indirectly in the mechanism of action of these drugs. In this sense three different studies have been carried out. The first study analyses genetic variability at genes of the endocannabinoid system in clinical response and/or remission to citalopram treatment in MDD patients. The second study analyses genetic variability at genes related to phosphoinositide (PI), glycogen synthetase kinase-3 (GSK3), hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) and glutamatergic pathways in clinical response to lithium in BD patients. The third study analyses genetic variability at genes related to neurotrophic factors and HPA in clinical response to clozapine in patients with SCZ. Our results focused in the analyses of genetic variability at genes coding for proteins involved in the mechanism of action of psychotropic drugs let us to detect some minor and moderate effects of genetic variants that could explain, at least, part of the lack of response to these drugs. The results of our study in relation to citalopram response in MDD showed that genetic variability at genes related to the endocannabinoid system could play a role in the understanding of clinical response to this drug treatment. Specifically, we found an association between CNR1 gene and clinical remission at 12th week and an effect of CNR1 gene on longitudinal response (along the 12th week follow-up). The results of our study in relation to lithium response in BD showed that genetic variability at INPP1, IMPA2, GSK3B and GRIK2 genes could play a role in the understanding of lithium response. Finally, the results in relation to clozapine response in SCZ showed that genetic variants at FKBP5 and NTRK2 genes may play a role in clozapine response. The detection of individual genetic differences in the response to psychotropic drugs may provide new strategies for the treatment of mental disorders, as well as, new knowledge about the aetiology of these disorders. / Los trastornos mentales graves, como son la depresión mayor (DM), el trastorno bipolar (TB) y la esquizofrenia (SCZ), se han convertido en los últimos años en un importante problema de salud en los países desarrollados. Aunque el avance alcanzado en el desarrollo de tratamientos farmacológicos ha constituido uno de los grandes logros de la psiquiatría moderna, no debemos olvidar que hay un porcentaje muy alto de pacientes que no reciben el tratamiento adecuado para su enfermedad. En este sentido, la farmacogenética tiene como objetivo identificar y caracterizar los factores genéticos que se encuentran en la base de las diferencias existentes entre individuos en la respuesta clínica al tratamiento farmacológico. La presente tesis pretende estudiar variación genética basada en genes que codifican para moléculas implicadas directamente o indirectamente en los mecanismos de acción del tratamiento con citalopram (DM), carbonato de litio (TB) y clozapina (SCZ) que nos explicará parte del riesgo para la no respuesta clínica y la no remisión del episodio tratado farmacológicamente. Los resultados nos permitieron identificar variación genética asociada a la respuesta al tratamiento. Concretamente, nuestros resultados indicaron que variabilidad genética relacionada con el sistema endocannabinoide se asociaba con la respuesta a citalopram en DM. Por otro lado, genes involucrados con el sistema de fosfoinositoles podrían explican parte de la variación en la respuesta al litio en el TB. En referencia al estudio de la respuesta a clozapina en pacientes con SCZ, los resultados sugieren que variantes genéticas en los genes FKBP5 y NTRK2 pueden jugar un papel en la respuesta. En este sentido, nuestro estudio proporciona evidencia de la implicación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA) y de factores neurotróficos en la modulación de la respuesta a clozapina. La detección de diferencias genéticas individuales en la respuesta a los fármacos psicotrópicos puede proporcionar nuevas estrategias para el tratamiento de trastornos mentales, así como, nuevos conocimientos sobre la etiología de estos trastornos.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / Arabidopsis thaliana seedling growth and development is influenced by both external (such as light and temperature) and internal (like hormones or circadian clock) factors. In short-day (SD) growing conditions, it is known that both light and clock have a pivotal role in the regulation of hypocotyl elongation, as mutations in members of the two pathways result in altered lengthening of the hypocotyl. The main objective of the thesis was to determine the function of PIF transcription factors, as light-signaling pathway intermediates, in the regulation of hypocotyl elongation of SD-grown seedlings, together with the possible interplay between them and TOC1 protein, a central component of the circadian clock. Phenotypic and molecular data obtained along the thesis allowed us to conclude that PIF1 and PIF3 proteins, together with the other members PIF4 and PIF5 which had previously been related with the process, act as positive regulators of hypocotyl growth at the end of the dark period in SD conditions. Moreover, several phenotypic studies, gene expression and protein accumulation analysis, together with chromatin immunoprecipitation assays performed in multiple combinations of PIFs and TOC1 mutants allows us to determine that there is a previously unknown direct crosstalk point between light and circadian clock in the regulation of hypocotyl elongation. Together, the work indicates the existence of a new regulatory mechanism by which clock gates hypocotyl elongation at the end of the dark period in SD-grown seedlings by repressing the transcriptional activity of PIF3 protein during the rest of the night. / El desenvolupament i creixement de plàntules d’Arabidopsis thaliana està influenciat tant per factors ambientals, com la llum o la temperatura, com per factors interns, com per exemple les hormones o el rellotge circadià. Es coneix que, en condicions de dia curt (cicles de 8h de llum i 16h de foscor), tant la llum com el rellotge circadià realitzen un paper clau en la regulació de l’elongació de l’hipocòtil ja que mutacions en components de les dues vies tenen com a conseqüència alteracions en la llargada d’aquest òrgan. L’objectiu principal d’estudi en aquesta tesi ha estat determinar la funció dels factors de transcripció PIF, intermediaris de la via de senyalització lumínica, en la regulació de l’elongació de l’hipocòtil en plàntules crescudes en dia curt i la connexió que existeix entre aquestes proteïnes i la proteïna TOC1, component central del rellotge circadià. Les dades fenotípiques i moleculars obtingudes al llarg de la tesi ens han permès concloure que les proteïnes PIF1 i PIF3, conjuntament amb PIF4 i PIF5 les quals ja havien estat prèviament involucrades en el procés, actuen com a reguladors positius de l’elongació de l’hipocòtil al final del període de foscor en condicions de dia curt. A més, diferents estudis fenotípics i anàlisis genòmics i bioquímics, conjuntament amb experiments d’immunoprecipitació de la cromatina, realitzats en diferents combinacions de mutants PIFs i TOC1 han permès determinar que existeix un nou punt de relació directa entre la llum i el rellotge circadià en la regulació de l’elongació de l’hipocòtil. Aquest treball ha permès demostrar l’existència d’un nou mecanisme de regulació pel qual el rellotge circadià restringeix el creixement de l’hipocòtil just al final del període de foscor en plàntules crescudes en condicions de dia curt. Tal mecanisme regulatori es basa en la repressió feta per la proteïna TOC1 sobre l’activitat transcripcional de la proteïna PIF3 durant la primera meitat del període de foscor.

This thesis is about challenges that currently concern in vitro production (IVP), sex determination procedures and sex-related survival of in vitro-produced porcine embryos. Specifically, the current thesis develops a new suitable PCR-based procedure based on the amplification of repetitive sequences for determining the sex of porcine embryos at different developmental stages. Furthermore, this work establishes new culture conditions and provides new knowledge about physiology, development and sexual dimorphisms in survival rates and kinetics of the development of in vitro-produced porcine embryos under specific in vitro culture conditions. The presence of optimal concentrations of hyaluronic acid and specific energy substrates at the appropriate time of embryo development, as well as the timing of several events during the earliest stages of development, essentially the timing of the first embryonic cleavage, appear to be linked amongst them and are related to subsequent embryonic competence, influencing development in a sex related manner / Aquesta tesi tracta alguns dels reptes que actualment afecten la producció in vitro (PIV), la determinació del sexe i la supervivència relacionada amb el sexe dels embrions de porcí. Concretament, presenta una nova tècnica de PCR basada en l’amplificació de seqüències repetitives apte per a determinar el sexe d’embrions porcins a diferents estadis de desenvolupament. També estableix noves condicions de cultiu i ofereix nous coneixements sobre la fisiologia, el desenvolupament i els dimorfismes sexuals en les taxes de supervivència i en la cinètica del desenvolupament d’embrions de porcí PIV sota unes determinades condicions de cultiu. Concentracions òptimes d’àcid hialurònic, i de glucosa, piruvat i lactat com a substrats energètics, en el moment adequat del desenvolupament embrionari, així com també el moment en el qual té lloc la primera divisió embrionària, estan relacionats entre sí i condicionen el posterior desenvolupament embrionari, tendint a desviar la proporció de sexes

La regeneración de tejidos requiere la coordinación entre la proliferación de las células madre, su diferenciación y la muerte celular de aquellas células innecesarias. Así mismo, la producción de los tejidos debe copiar la identidad y proporción de los que se han perdido, de manera que las estructuras regenerantes se integren con las preexistentes y recuperen su funcionalidad. Para profundizar en el conocimiento de estos procesos, empleamos nuestra especie modelo, la planaria Schmidtea mediterranea, debido a su impresionante capacidad regenerativa. La presencia de una población de células madres, los neoblastos, y la capacidad de decodificar las señales producidas tras una herida, las hace capaces de regenerar un organismo nuevo, perfectamente proporcionado y funcional a partir de cualquier fragmento. Además, la regeneración de la planaria es especialmente destacable ya que es el único organismo capaz de regenerar completamente de novo su sistema nervioso central. La vía Wnt/ßcatenin se encarga de establecer el eje corporal Antero-Posterior durante el desarrollo embrionario de los Metazoa y también durante la regeneración de planarias. La señalización Wnt no canónica/ßcatenin-independiente comprende diferentes vías, de las cuales la más estudiada es la vía de la “Planar Cell Polarity” (PCP), que se encarga de garantizar la polaridad a lo largo de un plano, una propiedad fundamental de todas las células y tejidos, que es esencial para coordinar la morfogénesis tanto de estructuras determinadas como del embrión. La Jun-N-ternimal Kinase (JNK) es una proteína que forma parte de la superfamilia de las MAPKs, activada en respuesta al estrés para coordinar procesos celulares básicos, como la proliferación, la diferenciación y la muerte celular. Esta tesis analiza dos grandes bloques de procesos que ocurren durante la regeneración y el recambio tisular de la planaria: i) la aportación de información posicional por parte de la señalización de la vía Wnt no canónica durante la formación del sistema nervioso y durante la polarización y posicionamiento de los cilios y ii) la coordinación de la respuesta regenerativa temprana y del “remodeling” por parte de la vía JNK. Dentro del primer bloque, mostramos que Dvl-2 y otros dos componentes del complejo de la PCP, VanGogh y Diversin, controlan la polarización y el posicionamiento apical de los cuerpos basales ciliares a través de la remodelación del esqueleto de actina. Estos resultados demuestran la funcionalidad y conservación de la vía PCP en planarias y por lo tanto, su existencia en un organismo del superphylum de los lophotrocozoa. Además, demostramos que el ligando no canónico Wnt5 restringe la migración neuronal para posicionar el sistema nervioso a través de Dishevelled y de su receptor Ror y que junto con Slit, forman un sistema en el que mutuamente regulan el establecimiento de sus límites de expresión para así definir un corredor para la regeneración y mantenimiento del sistema nervioso. Por último, mostramos que la vía JNK es necesaria específicamente cuando la herida viene acompañada de pérdida de tejido y que coordina la inducción de la respuesta regenerativa, ya que modula la expresión de genes en respuesta a una amputación, activa la muerte celular por apoptosis y establece un control temporal de la entrada en mitosis de los neoblastos. Además, la inducción de la muerte celular apoptótica por parte de la JNK es necesaria para recuperar y mantener tanto las proporciones del organismo como la conformación de los órganos preexistentes tras la amputación o durante el decrecimiento. En resumen, esta tesis aporta información sobre la señalización molecular necesaria durante la inducción de la respuesta regenerativa y la adquisición del diseño corporal durante la regeneración y el recambio tisular homeostático de la planaria Schmidtea mediterranea. / Regeneration of lost tissues depends on the precise interpretation of signals that coordinate the onset of proliferation, cellular differentiation and cell death. Moreover, tissue production must mimic the identity and proportion of the missing ones in order to integrate the regenerated and preexisting structures and recover functionality. To get more insights about these processes, we use our model organism, the planarian Schmidtea mediterranea, due to its amazing regenerative abilities. The presence of adult pluripotent stem cells combined with the ability to decode signaling after wounding enable planarians to regenerate a complete and proportioned animal from any tiny fragment. The Wnt/β-catenin branch is essential for the establishment of the antero-posterior body axis during metazoan embryogenesis and also during planarian regeneration. Wnt/β-catenin independent signaling encompasses several pathways, of which the most studied is the planar cell polarity (PCP), which is responsible for planar polarization of cell and structures within a plane. Jun-N-ternimal Kinase (JNK) is a protein that belongs to the MAPKs superfamily and regulates essential cellular processes, such as stem cell proliferation, differentiation and cell death, in response to stress. This thesis analyzes two groups of processes that occurs during planarian regeneration and tissue renewal: - 1. The positional information given by the non canonical Wnt pathway during nervous system regeneration and the polarization and positioning of the cilia. Here we show that the non canonical Wnt5 ligand restricts neuronal migration to position nervous tissues through Dishevelled and its receptor Ror. Additionally, we demonstrate the conservation of the PCP pathway within the lophotrocozoan superphylum, since the PCP components Dvl-2, VanGogh and Diversin control polarization and apical positioning of the cilia basal bodies through actin remodeling. - 2. The coordination of wound healing response and remodeling by the JNK pathway. Here we show that JNK modulates the expression of wound-related genes, triggers apoptosis and attenuates the onset of mitosis in stem cells specifically after tissue loss. Furthermore, JNK-induced apoptosis is required to recover and maintain proportionality and organ conformation. Summing up, this thesis gives information about the molecular signaling coordinating wound healing and patterning during planarian regeneration and tissue renewal.

Les planàries d'aigua dolça s’han convertit en un bon model per estudiar la regeneració a nivell genètic i molecular, gràcies a la seva capacitat de reconstruir qualsevol fragment danyat a conseqüència d’una amputació, des de qualsevol eix corporal i formar un nou organisme adult en un termini de temps molt curt. Al mateix temps, durant l’estadi adult en l’absència d’una ferida, les planàries són capaces de reemplaçar les cèl•lules diferenciades dels teixits vells mitjançant una proliferació i diferenciació constant de les cèl•lules mare o neoblasts. Tenim al nostre abast un ampli coneixement sobre diverses rutes de senyalització que controlen l’estricte procés de la regeneració en les planàries. D’altra banda, avui dia encara es desconeix la funció d’algunes de les vies principals i queden molts elements desconeguts per entendre el fenomen de la regeneració. En aquesta tesi doctoral, hem pogut analitzar la funció concreta de la via dels EGFR, sobretot durant la formació del blastema i la regulació del creixement i la diferenciació de les noves estructures anteriors. Mitjançant estudis funcionals a través de la tècnica d’interferència de l’ARN (ARNi) dels tres EGFR identificats, hem observat la participació d’aquesta via en múltiples processos biològics durant la regeneració de les planàries i la homeòstasi. Smed-egfr-1 és necessari per a la regeneració de les cèl•lules pigmentàries dels ulls i la faringe. A més a més, el seu silenciament ocasiona una clara hiperproliferació i la formació d’uns bonys dorsals característics, tant en animals intactes com regenerants. D’altra banda, no es manifesta cap efecte evident després de silenciar Smed-egfr-2. Finalment, podem concloure que Smed-egfr-3 és necessari per la formació del blastema i per la diferenciació de determinats tipus cel•lulars, generalment neuronals. En aquesta tesi ens hem centrat sobretot amb l’estudi del Smed-egfr-3. Amb l’objectiu d’identificar possibles gens diana d’aquest gen i caracteritzar la funció de la via dels EGFR en més detall durant la regeneració de les planàries, hem utilitzat l’eina DGE (“Digital Gene Expression”), que ens permet comparar el transcriptoma dels animals on s’ha silenciat un gen d’interès (en el nostre cas, Smed-egfr-3) amb el dels controls. Així, a partir d’anàlisis del DGE hem pogut conèixer i quantificar l’expressió de possibles gens diana regulats (tant “up” com “down-regulated”) per la via dels EGFR; un d’aquests gens “downregulated” després d’inhibir Smed-egfr-3 és l’egr-4, un membre de la família gènica dels “early growth response”. egr-4 s’expressa majoritàriament en el sistema nerviós central i s’indueix ràpidament després de qualsevol tipus de ferida. El seu silenciament inhibeix la regeneració anterior, mostrant defectes durant la formació dels blastemes anteriors, però sense afectar la regeneració posterior. Aquests organismes tractats exhibeixen uns ganglis cefàlics més petits o fins I tot en alguns casos absents. La diferenciació d’altres tipus cel•lulars presents en la regió anterior també es mostren alterats després de silenciar egr-4. Tot i així, l’expressió primerenca dels determinants de la polaritat que intervenen en el restabliment de la polaritat anterior es mostren inalterats. Experiments simultanis del silenciament d’egr-4 i elements de la via Wnt/beta-cat revelen que egr-4 és necessari per la diferenciació del primordi del cervell. A més a més, els resultats d’aquests experiments suggereixen que egr-4 promou la regeneració cefàlica inhibint l’activitat de beta-catenin en condicions normals. A partir dels resultats obtinguts en aquesta tesi suggerim que egr-4 és un dels primers gens coneguts necessaris per la diferenciació del primordi del cervell durant la regeneració de la planària. En resum, suggerim una relació entre la diferenciació primerenca del cervell i la correcta progressió de la regeneració del cap en les planàries, que podria estar regulada gràcies a l’activació del gen egr-4 a través de la via EGFR, concretament Smed-egfr-3. / During freshwater planarians regeneration, polarity and patterning programs play essential roles in determining whether a head or a tail regenerates at anterior or posterior-facing wounds. This decision is made very soon after amputation. The pivotal role of the Wnt/beta-•catenin and Hh signaling pathways in re-establishing anterior4 posterior polarity has been well documented. However, the mechanisms that control the growth and differentiation of the blastema in accordance with its anteriorposterior identity are less well understood. Conserved signa ling pathways play important roles in morphogenesis in all animals. One such pathway is the epidermal growth factor receptor (EGFR) pathway, which regulates multiple biological processes including cell proliferation, differentiation, apoptosis and cell survival. In this thesis, we show that silencing of Smed-egfr4 3, a planarian homologue of epidermal growth factor receptors, impairs regeneration and blastema growth in these organisms, probably by disrupting cellular differentiation. In order to better characterize the function of the EGFR signaling pathway during planarian regeneration, we conducted "Digital Gene Expression" analyses to identify putative target genes of Smed-egfr-3. One of the isolated candidate genes that is downregulated after silencing Smed-egfr-3 is egr-4, a member of the early growth response gene family. egr-4 is mainly expressed in the central nervous system and rapidly induced after different types of injury. While early egr-4 expression after injury is independent of EGFR signa ling, it becomes Smed-egfr4 34 dependent from the second day of regeneration. Functional analyses based on RNA interference (RNAi) reveals that egr-4 is required for head regeneration but not for posterior regeneration; egr-4 silencing impairs the formation of anterior blastemas; these animals exhibit either small cephalic ganglia or a total absence of new brain tissue. Single and combinatorial RNAi to target different elements of the Wnt/beta-•catenin pathway, together with expression analysis of brain4 and anterior4 specific markers, reveal that egr-4 is necessary for the brain primordia differentiation in the early stages of regeneration and it appears to antagonize the activity of the Wnt/~-catenin pathway to allow head regeneration. Our results suggest that a conserved EGFRjegr pathway plays an important role in cell differentiation during planarian regeneration and indicate an association between early brain differentiation and the progression of head regeneration.

El sistema quimiosensorial (SQ) participa en la detección de nutrientes, depredadores y pareja, siendo -por tanto- fundamental en la supervivencia de los organismos y de las especies. En insectos, las primeras etapas de la quimiopercepción están mediadas por familias multigénicas que codifican: (i) proteínas extracelulares, como las Odorant-Binding Proteins (OBPs) y las Chemosensory Proteins (CSPs); (ii) proteínas quimiorreceptoras, como los Odorant (ORs), Gustatory (GRs) e Ionotropic Receptors (IRs). Dado que la eficacia biológica de los individuos depende de su correcta expresión, estas familias multigénicas constituyen un excelente modelo para estudiar procesos adaptativos a nivel molecular. La creciente disponibilidad de datos moleculares nos ha conferido la oportunidad de comprender el papel de la selección natural en la evolución transcripcional de los genes del SQ. No obstante, la naturaleza masiva e innovadora de estos datos ha hecho indispensable el desarrollo e implementación de nuevos métodos de genética de poblaciones y evolución molecular en las potentes herramientas bioinformáticas DnaSPv5, BadiRate y popDrowser. Utilizando éstas y otras herramientas, hemos determinado que los genes que codifican OBPs no están distribuidos aleatoriamente en el genoma de Drosophila, sino agrupados formando clústeres de genes. La conservación de estos clústeres está relacionada con la amplitud y el ruido transcripcional de sus integrantes, así como también con su estado de la cromatina (’transcription elongation’ y con la unión de la proteína JIL-1). Entre otras funciones, la JIL-1 libera la ARN polimerasa pausada en la región promotora, lo que produce una ráfaga de elongación de la transcripción génica que incrementa el ruido transcripcional. Debido a que las fluctuaciones de OBPs pueden alterar el comportamiento de los individuos, este ruido transcripcional puede generar una plasticidad fenotípica beneficiosa, especialmente en ambientes externos cambiantes. La arquitectura de la región promotora puede jugar un papel fundamental en pausar la actividad de la ARN polimerasa. En este sentido, hemos inferido que las regiones upstream de los aIRs y las CSPs están sometidas a una importante constricción funcional, mientras que las de los ORs y los GRs han experimentado un mayor impacto de la selección darwiniana. Aunque aún faltan más evidencias al respecto, la evolución de las regiones upstream de las OBPs podría estar vinculada con el impacto diferencial de la cromatina en su regulación transcripcional. De cualquier modo, no cabe duda que la selección natural (negativa y positiva) ha contribuido significativamente a la evolución transcripcional de las principales familias multigénicas del SQ, mediante los mecanismos que implican elementos cis-reguladores y estados de la cromatina. / The chemosensory system is involved in the detection of food, predators and mates, being thus essential for the species survival. In insects, the first steps of chemoperception are mediated by multigene families encoding: (i) extracellular proteins, such as Odorant-Binding Proteins (OBPs) and Chemosensory Proteins (CSPs), as well as (ii) chemoreceptors, such as Odorant (ORs), Gustatory (GRs) and Ionotropic Receptors (IRs). Since the fitness of individuals depends on their correct expression, these multigene families are an excellent model to study adaptive processes at the molecular level. The increasing availability of molecular data gives us the opportunity to understand the role of natural selection in the transcriptional regulation of the chemosensory genes. However, the massive and innovative nature of these data makes crucial the development and implementation of new methods for population genetics and molecular evolution in powerful bioinformatics tools, such as DnaSPv5, popDrowser and BadiRate. Using these and other tools, we determined that genes encoding OBPs are clustered along the Drosophila genome. The conservation of these clusters is related to the transcriptional amplitude and noise of their members, as well as to its chromatin state ('transcription elongation' and binding of JIL-1 protein). Among other functions, the JIL-1 releases the RNA polymerase paused at the promoter region, inducing a transcriptional elongation burst that increases expression noise. Because OBPs fluctuations can alter the behavior of individuals, this noise can generate a beneficial phenotypic plasticity, especially in changing external environments. The architecture of the promoter region can play a key role in the RNA polymerase pausing. In this regard, we have inferred that the upstream regions of aIRS and CSPs are under strong functional constraints, whereas Darwinian selection is more pervasive at the ORs and GRs upstream regions. Although further studies are needed, the evolution of the OBP upstream regions may be linked to the differential impact of the high-order chromatin regulatory mechanisms in the OBP transcription. Anyway, it is certain that natural selection (negative and positive) has significantly contributed to the transcriptional evolution of the major chemosensory multigene families, through mechanisms involving cis- regulatory elements and high-order chromatin states.

Aunque se estima la proporción de casos de cáncer colorrectal (CCR) atribuibles a factores genéticos entre el 20 y 35%, gran parte de la herencia genética al CCR queda por descubrir. Dentro de ese conglomerado de casos de CCR con agregación familiar sin una causa subyacente clara, se encuentra el CCR familiar tipo X (CCRf-X). Estas familias cumplen los criterios clínicos más estrictos para el CCR hereditario no polipósico (criterios de Ámsterdam) pero no presentan defectos en el sistema de reparación de bases desapareadas, rasgo definitorio de los pacientes con SL. El estudio de dos de estas familias mediante secuenciación de exomas nos ha permitido identificar el gen causal de la predisposición. La primera familia ha resultado ser un caso de CCR asociado a MUTYH enmascarado bajo unas características fenotípicas y moleculares atípicas. Estas son: Herencia aparentemente dominante debido al riesgo que aportan las variantes monoalélicas en MUTYH, ausencia de pólipos y presencia de tumores con inestabilidad de microsatélites. En la segunda familia hemos identificado un nuevo gen de predisposición al CCR que podría explicar aproximadamente un 3% de las familias CCRf-X. La haploinsuficiencia de este gen podría causar una reparación defectuosa del ADN con la consiguiente acumulación de un tipo específico de errores. Se ha sugerido que mutaciones en el gen que codifica la glicosilasa GALNT12 confieren un riesgo incrementado a padecer CCR. Hemos estudiado el gen en 103 familias CCRf-X pero no se han identificado cambios relevantes que afecten la actividad enzimática, desestimando a GALNT12 como un gen de alta penetrancia para CCR. Por otro lado, hemos evaluado el papel de la longitud telomérica como modulador del riesgo a desarrollar cáncer en las formas de CCR hereditario no polipósico. Hemos observado que muestran un patrón distinto en función del estado de la maquinaria de reparación de bases desapareadas: Acortamiento para pacientes con SL y elongamiento para el CCRf-X. Además, descartamos el acortamiento de los telómeros como mecanismo molecular que explique el fenómeno de la anticipación genética observada en el SL. / Family history is thought to involve approximately 20% of all colorectal cancers (CRC). However, only a minority are explained by germline genetic mutations in well-known high penetrance genes. To identify novel hereditary CRC genes, we studied by exome sequencing two familial CRC of type X (fCRC-X) families. That is, Amsterdam-positive families with mismatch repair proficient tumors, and which genetic etiology is unknown. The first family examined resulted to be a case of MUTYH-associated CRC with an atypical phenotype. The analysis of the second family prompted us to the identification of a new CRC susceptibility gene that could explain ~3% of fCRC-X. Moreover, we have studied the gene GALNT12, suggested as a candidate gene that might cause a fraction of the unexplained familial CRC cases. Our results rule out GALNT12 as a major high penetrance gene for CRC. On the other hand, we have evaluated the role of blood telomere length in the risk of hereditary non-polyposis CRC. We have identified different patterns of telomere length according to the status of the MMR system: shortening for Lynch syndrome patients and elongation for fCRC-X. Additionally, we discard telomere length attrition as the common cause of genetic anticipation in Lynch syndrome.