The origin of animal multicellularity is a major evolutionary transition and a poorly understood one. In recent years, the sequencing of the genomes of several earlybranching metazoans, such as sponges and cnidarians, has allowed to define a common and exclusive molecular toolkit of animal multicellularity. Most of these genes are involved in cell adhesion, cell-cell communication and control of cell proliferation and differentiation, all of them essential functions for a multicellular organism. The access to genomic data of close unicellular relatives of animals, such as the choanoflagellates, has revolutionized the comparative genomic studies to understand the origin of animals and the molecular toolkit of the Urmetazoa (the common ancestor of all animals), showing that some genes that were considered exclusive to animals are, in fact, present in their unicellular relatives and were later co-opted to function in a multicellular context. The sequencing of the genome of the unicellular holozoan Capsaspora owczarzaki offers a new opportunity for further studying this topic. Thus, the main objectives of this thesis have been: first, to perform comparative genomic studies to reconstruct the evolutionary history of animal molecular toolkit; second, to study the functional conservation of some of the genes identified in Capsaspora owczarzaki by performing heterologous expression in model systems such as Xenopus laevis and Drosophila melanogaster; and finally, to study the life cycle and cell biology of Capsaspora owczarzaki to further understand the unicellular functional context in which this genetic toolkit of the multicellularity can act and may have evolved first. One of the main results of our comparative genomic studies is the presence of a complete integrin adhesome in Capsaspora owczarzaki and an almost full adhesome (including integrins) in the more distantly related Thecamonas trahens. This results allowed us to reconstruct the step-wise evolutionary assembly of this key machinery of animal multicellularity. Another important result is the finding of several transcription factors (essential tools for regulating cell differentiation and cell proliferation in animals) in Capsaspora owczarzaki previously considered exclusive to animals, for example NFkappaB, Myc/Max, Mef2, T-box, Runx,... Finally, we found in Capsaspora owczarzaki homologs of the components of the Hippo signalling pathway, an essential mechanism controlling cell proliferation and organ size in animals. Through heterologous expression studies we could study in detail the functional conservation of two of these machineries discovered in Capsaspora owczarzaki by comparative genomic studies. First, we studied the Capsaspora owczarzaki homolog of Brachyury (CoBra) using Xenopus laevis, the classical model system for studying Brachyury function. Brachyury is a T-box transcription factor involved in gastrulation and mesoderm specification in metazoans. We demonstrated that CoBra is functionally conserved and that it has similar DNA binding sites to those of animal T-box genes. Second, we used Drosophila melanogaster to demonstrate the functional conservation of three components of Capsaspora owczarzaki's Hippo pathway. One the most striking morphological features of Capsaspora owczarzaki is the presence of long filopodia. Using this organism and the choanoflagellate Salpingoeca rosetta we studied the origin and evolution of metazoan filopodia and microvilli and the associated molecular toolkit. We found that most components are innovations of animals and these two close unicellular lineages and that the microvilli originated in the common ancestor of animals and choanoflagellates. Finally, we studied the life cycle of Capsaspora owczarzaki using microscopy, flow cytometry and comparative transcriptomics of different life stages. We demonstrated the existence of an aggregative pluricellular stage in Capsaspora owczarzaki and that the transition between this and other stages is tightly regulated at the level of gene expression and alternative splicing. We also found evidence that the integrin adhesome is expressed in the aggregative stage, we an extracellular matrix is produced between the cells. The study of Capsaspora owczarzaki has provided valuable insights into the origin of animal multicellularity and emphasizes the fact that gene co-option was a major mechanism to generate to multicellular molecular toolkit of animals. / El origen de la multicelularidad animal es una de las mayores transiciones evolutivas de la historia de la vida. La secuenciación, en los últimos años, de genomas de animales basales como esponjas y cnidarios ha permitido establecer la maquinaria genética común a todos los animales. La mayoría de estos genes son aquellos involucrados en la adhesión celular, la comunicación celular y el control de la proliferación y la diferenciación. El acceso a datos genómicos de organismos unicelulares muy cercanos a los animales, como Capsaspora owczarzaki, es esencial para entender mejor esta transición. Los objetivos principales de esta tesis ha sido estudiar la presencia de genes de multicelularidad y su conservación funcional en Capsaspora owczarzaki, así como su ciclo vital. Analizando su genoma, descubrimos una completa maquinaria de adhesión por integrinas en C.owczarzaki. Hemos podido reconstruir en detalle la historia evolutiva de este mecanismo crucial de adhesión y comunicación celular. También hemos encontrado un amplio repertorio de factores de transcripción, elementos esenciales para regular la diferenciación y la proliferación en los animales, que se creían exclusivos de animales en el genoma de C.owczarzaki; por ejemplo, genes NFkappaB, T-box o p53. Por último, hemos descrito que una importante vía de señalización en animales, la llamada vía Hippo, también está presente en C.owczarzaki. Este mecanismo es esencial para controlar la proliferación y el tamaño de los órganos en los animales. Mediante estudios de función heteróloga en Xenopus y Drosophila demostramos la conservación funcional de los homólogos del gen Brachyury (un factor de transcripción de la clase T-box) y de la vía Hippo de C.owczarzaki. C.owczarzaki y el coanoflagelado Salpingoeca rosetta nos sirvieron para estudiar la evolución y el origen de los filopodios y microvilli animales y su maquinaria molecular. Por último, el estudio de la biología y el ciclo de C.owczarzaki, mediante el uso de técnicas microscopias, citometría y transcriptómica comparada de los distintos estadios vitales del organismo. Demostramos la existencia de un estadio de pluricelularidad agregativa y que la transición entre éste y otros estadios está finamente regulada a nivel de expresión génica y de splicing alternativo. El estudio de C.owczarzaki nos ha dado valiosos ejemplos de cómo, más allá de la innovación génica, la co-opción de maquinaria pre-existente en un contexto unicelular fue un mecanismo esencial para el origen de la multicelularidad animal.

L'esquizofrènia és una de les psicosis més comunes que té una prevalença d'un 1% en la població mundial i una etiologia desconeguda. Una de les hipòtesis etiopatològiques més recolzades per l'esquizofrènia és la teoria del neurodesenvolupament la qual postula que l'origen de la esquizofrènia tindria lloc per alteracions de la neurogènesi i gliogènesi en les etapes del desenvolupament perinatal. Nombrosos estudis han descrit diverses alteracions de la mielina (substància blanca del cervell) en pacients esquizofrènics. La mielinització dels axons és important per una correcta transmissió del senyal entre neurones. Les cèl·lules responsables de sintetitzar mielina per embolcallar el axons en el cervell són els oligodendròcits. En humans els majors pics del procés de mielinització ocorren en la etapa perinatal, infantesa i adolescència. En aquesta última etapa és on es manifesten majoritàriament els primers símptomes de l'esquizofrènia.Diversos estudis de lligament apunten a que a la regió cromosòmica 6p hi podria haver un gen o gens de susceptibilitat per l'esquizofrènia. El nostre grup va escollir un gen d'aquesta regió, el gen que codifica pel Receptor Domini Discoidina 1 (DDR1), com a candidat per l'esquizofrènia. Se sap que DDR1 és un receptor tirosina quinasa que s'expressa de forma molt important en zones proliferatives durant el neurodesenvolupament del cervell de rata i ratolí i també s'ha vist que s'expressa en cervell humà. DDR1 té com lligant el col·lagen, el qual promou la diferenciació i proliferació de les cèl·lules neuroepitelials en rates. El nostre grup ha observat una important expressió de DDR1 en la substància blanca i en concret en els oligodendròcits durant el desenvolupament pre i postnatal en ratolins. A demés l'expressió d'aquest receptor segueix un patró espacio-temporal al procés de mielinització. En la present tesi doctoral hem estudiat per primera vegada en detall el patró d'expressió gènica i proteïca del receptor DDR1 en cervell humà mitjançant tècniques específiques d'hibridació in situ, immunohistoquímica i de quantificació d'RNAm. Hem trobat que existeix una associació positiva tan a nivell gènic com haplotípic de DDR1 amb l'esquizofrènia mitjançant un estudi d'anàlisi de variants tipus SNPs en una mostra de casos i control. També hem descrit per primera vegada que DDR1 és una proteïna de la mielina en cervell humà i que entre les 5 diferents isoformes que es coneixen només les isoformes DDR1c i DDR1a es relacionen amb la mielina. D'aquesta tesi es deriven les següents aportacions científiques: - Roig B, Virgos C, Franco N, Martorell L, Valero J, Costas J, Carracedo A, Labad A, Vilella E. The discoidin domain receptor 1 as a novel susceptibility gene for schizophrenia. Molecular Psychiatry. 2007. doi: 10.1038/sj.mp.4001995. IF: 11.8- Roig B, Franco-Pons N, Martorell L, Tomàs J, Costas J, Vogel WF, Vilella E. Identification of the tyrosine kinase receptor discoidin domain 1 (DDR1) as a novel myelin protein. Sotmés a revisió a la revista Glia. IF: 4.1- Roig B, Franco-Pons N, Martorell L, Vilella E. Quantitative analysis of DDR1 mRNA expression in normal and schizophrenic brain. Manuscrit en preparació. / Schizophrenia is one of the most common psychoses in the world today. It has a prevalence of 1% in the population and is of unknown etiology. One of the most widely accepted etiopathogenic hypotheses for schizophrenia is neurodevelopmental theory, which postulates that schizophrenia originates from a variety of neurogenetic and gliogenetic disorders during perinatal development. Many studies have reported that schizophrenic patients have alterations in their myelin (white matter of the brain). Axons must be myelinated if signals are to be properly transmitted between neurons. The cells that form the myelin sheaths of the axons in the CNS are the oligodendrocytes.In humans, the myelination process peaks in the perinatal, childhood and adolescence stages. It is during this last stage that the symptoms of schizophrenia become manifest. Several linkage studies indicate that the 6p chromosomal region may contain one or more susceptibility genes for schizophrenia. Our group chose a gene in this region, the gene encoding the discoidin domain receptor 1 (DDR1), as a candidate gene for schizophrenia.DDR1 is known to be a receptor tyrosine kinase which is highly expressed in proliferative areas during murine brain development, and has also been shown to be expressed in human brain. The DDR1 ligand is collagen, which promotes the proliferation and differentiation of the neurophitelial cells in rats. Our group has observed that DDR1 is significantly expressed in the white matter and particularly in oligodendrocytes during pre- and postnatal development in mice. Furthermore, the expression of this receptor follows a spatial-temporal pattern similar to the process of myelination.In this doctoral thesis we have made the first detailed study of the pattern of gene and protein expression of DDR1 in human brain, using specific techniques such as in situ hybridization, immunohistochemistry and quantification of RNAm. We found a positive association of DDR1 with schizophrenia in a case-control association study using markers of the SNP (single nucleotide polymorphism) type.We have also reported for the first time that DDR1 is a myelin protein in the human brain and that of the five different isoforms that are known only isoforms DDR1c and DDR1a are related to the myelin.The following scientific articles have been written as a result of this doctoral thesis:- Roig B, Virgos C, Franco N, Martorell L, Valero J, Costas J, Carracedo A, Labad A, Vilella E. The discoidin domain receptor 1 as a novel susceptibility gene for schizophrenia. Molecular Psychiatry. 2007. doi: 10.1038/sj.mp.4001995. IF: 11.8- Roig B, Franco-Pons N, Martorell L, Tomàs J, Costas J, Vogel WF, Vilella E. Identification of the tyrosine kinase receptor discoidin domain 1 (DDR1) as a novel myelin protein. Submitted to Glia. IF: 4.1- Roig B, Franco-Pons N, Martorell L, Vilella E. Quantitative analysis of DDR1 mRNA expression in normal and schizophrenic brain. Manuscript in preparation.

La trisomia del cromosoma 21 humà o síndrome de Down (SD) genera un fenotip molt complex que inclou més de 80 trets fenotípics característics. Es tracta, d'una malaltia multifactorial molt variable en la seva expressió fenotípica. Per tant, sembla evident que per poder fer front a la complexitat i variabilitat inherents a la SD, serà necessari l'ús d'estratègies metodològiques diferents. El treball realitzat en aquesta tesi doctoral mitjançant l'estudi de l'expressió diferencial en cervells fetals d'individus Down ha permès posar de manifest l'expressió alterada dels gens FABP7 i PRDX2, cap d'ells situat al cromosoma 21. Experiments d'hibridació substractiva supressora (SSH) sobre cervells fetals Down van desvetllar la subexpressió de PRDX2 als individus Down. Aquesta subexpressió es va confirmar mitjançant: i) anàlisi de transferència Northern (5 disòmics i 5 trisòmics) i ii) RT-PCR quantitativa a temps real (6 disòmics i 7 trisòmics), amb uns valors de 0.7 i 0.73 vegades, respectivament.Per avaluar els efectes de la subexpressió de PRDX2 a nivell cel.lular es van transfectar de manera estable cèl.lules de neuroblastoma (SH-SY5Y) amb cDNA antisentit de PRDX2. D'acord amb la funció antioxidant de PRDX2 es va analitzar la viabilitat cel.lular i els nivells d'apoptosi, tant en condicions estàndards, com en presència de diferents agents citotòxics (peròxid d'hidrogen, etoposide i timerosal). Per tal d'aconseguir una sobreexpressió de SOD1 es va transfectar cèl.lules SH-SY5Y amb cDNA sentit de SOD1. La inclusió de SOD1 com a control en aquesta aproximació es deu a que els individus Down presenten, com a resultat de la trisomia del cromosoma 21, una sobreexpressió d'aquest gen. Les mesures de viabilitat cel.lular sobre les dues línies transfectades demostren un descens en condicions basals, així com en presència de peròxid d'hidrogen, però no en presència d'etoposide. D'altra banda, el timerosal sembla afectar més la viabilitat dels clons que subexpressen PRDX2. Els resultats mesurant els nivells d'apoptosi sobre ambdues línies transfectades indiquen un increment en els nivells d'apoptosi via caspasa-3 en condicions basals i un menor increment, respecte al comportament control, en presència d'H2O2. Donat que en els experiments de viabilitat cel.lular no s'observa aquest "efecte protector", es dedueix que la subexpressió de PRDX2, o la sobreexpressió de SOD1, en presència d'H2O2, indueixen, majoritàriament, una mort cel.lular independent de la caspasa-3.En conjunt, tots aquests resultats apunten cap a una possible implicació de PRDX2 en l'estrés oxidatiu neuronal associat a la SD.Mitjançant l'anàlisi SSH, es va detectar també la sobreexpressió de FABP7 en cervells fetals d'individus Down. Aquesta sobreexpressió es va confirmar mitjançant anàlisi de transferència Northern (5 disòmics i 5 trisòmics) i RT-PCR quantitativa a temps real (7 disòmics i 9 trisòmics), amb un valors d'1.3 i 1.63 vegades, respectivament.Per determinar la relació entre la trisomia del cromosoma 21 i la sobreexpressió de FABP7 es va aïllar i clonar, la regió promotora de FABP7. La seqüenciació d'aquesta regió va confirmar la conservació d'un domini d'unió dels factors Pbx/POU descrit prèviament a ratolins. Les proteïnes PBX formen complexes amb altres homeobox, com és el cas de PKNOX1, que mapa a 21q22.3. Mitjançant RT-PCR quantitativa a temps real es va confirmar la sobreexpressió de PKNOX1 en cervells fetals humans (1.8 vegades més). Experiments d'electroforesi de retardament de bandes (EMSA) van demostrar la unió de la proteïna PKNOX1 a la seqüència promotora de FABP7. Finalment, els experiments d'assaig luciferasa sobre cèl.lules en cultiu de neuroblastoma revelaren una transactivació de FABP7 deguda a la sobreexpressió de PKNOX1. Els nostres resultats indiquen clarament que la sobreexpressió de FABP7 en individus Down és, molt probablement, causada per la sobreexpressió de PKNOX1, degut a l'efecte de dosi gènica associat a la trisomia del cromosoma 21.

Les distròfies retinianes son patologies de la visió causades per defectes a la retina, un teixit que es troba formant part de l'ull i que s'encarrega de convertir en senyals elèctriques la constant entrada d'energia lluminosa que contínuament capten els nostres ulls. El senyal elèctric generat és enviat posteriorment al cervell, i aquest s'encarrega de traduir-lo a una imatge amb colors, formes i volums. Les cèl.lules afectades en aquestes patologies son concretament les cèl.lules fotoreceptores i l'epiteli pigmentari d'aquesta retina, que a més de facilitar factors tròfics crítics pel manteniment d'aquests fotoreceptors, participa en la renovació constant de fragments d'aquestes cèl.lules, a més d'intervenir en el reciclatge de proteïnes dins el fotoreceptor. Les patologies de la retina les podem dividir en maculars, si és la regió central de l'ull la inicialment afectada en aquestes patologies, o per contra, si la part inicialment afectada és la retina més perifèrica, podem parlar de patologies d'inici perifèric. El gen ABCA4 és el gen que codifica per una proteïna anomenada ABCR que transporta substrats a través de membranes amb despesa d'ATP dins les cèl.lules fotoreceptores. Aquest gen s'ha trobat mutat tant en pacients afectats de patologies maculars com són la malaltia de Stargardt, el Fundus flavimaculatus, la distròfia de cons i bastons, i fins i tot ha estat considerat un factor genètic que podria predisposar a desenvolupar la degeneració macular associada a l'edat en edats avançades de la vida; com en pacients afectats de patologies que s'inicien amb defectes a la retina més perifèrica com ha estat la Retinosis pigmentaria. L'anàlisi del gen ABCA4 en diferents pacients afectats de diferents patologies de la retina ens ha permès observar un nombre considerable de variants patogèniques en aquest gen i ens ha portat a proposar un model de correlacions genotip-fenotip per ABCA4 . En aquest model la severitat de les diferents patologies causades per defectes en aquest gen pot ser explicada per la diferent severitat de mutacions en ABCA4 , o el què és el mateix la quantitat d'activitat residual de la proteïna ABCR. A més, hem pogut ampliar el model amb una nova entitat clínica, la distròfia macular en patró de l'epiteli pigmentari, que és una distròfia retiniana més lleu que la malaltia de Stargardt, i que podria ser explicada per mutacions de tipus lleu en aquest gen. Aquestes dades han demostrat l'heterogeneïtat al.lèlica d' ABCA4 . També s'ha pogut ampliar l'heterogeneïtat genètica descrita per la Retinosis pigmentaria, mitjançant l'anàlisi de diferents gens i loci vinculats a casos recessius d'aquesta patologia. Una vegada més s'ha pogut observar que l'heterogeneïtat genètica descrita en aquesta patologia es pot explicar pel gran nombre de gens descrits com a responsables d'un o uns pocs casos de la Retinosis, on actualment amb els gens coneguts només s'ha pogut explicar com a màxim un 50% dels casos clínics descrits.

Els animals estan agrupats en grans grups o files. Aquestes agrupacions representen organismes que presenten característiques que els hi són pròpies i diferents a les que presenten altres organismes. Aquest treball es centra en l'estudi dels cordats; format pels subfiles dels urocordats, els cefalocordats i els vertebrats. Els elements transposables són un conjunt molt heterogeni de seqüències que es caracteritzen per la seva capacitat de moure's al llarg d'un genoma i per la presència en múltiples còpies per genoma. Aquests elements, a conseqüència de les característiques que els hi són pròpies poden produir efectes deleteris en el genoma que els allotja tot i que si es troben regulats per mecanismes de control de l'hoste poden arribar a ser beneficiosos ja que n'augmenten el potencial evolutiu. Els estudis d'aquests elements en els cordats gnatostomats com l'home han evidenciat la seva massiva presència. Ja que aquests elements deuen haver condicionat l'evolució dels genomes dels gnatostomats, en aquest treball es va voler establir la participació dels elements transposables de tipus non-LTR en els organismes que es troben en la transició dels cordats pre-vertebrats cap als vertebrats. Així, utilitzant aproximacions in vitro i in silico s'ha determinat el tipus i nombre d'aquests elements en els genomes de l'ascidi Ciona intestinalis, el cefalocordat Branchiostoma floridae i l'àgnat Myxine glutinosa. Les diferents metodologies ens han permès determinar clarament l'estructura de 5 retrotransposons non-LTR en el genoma de l'ascidi, 6 en el de l'amfiox i 1 en el de la mixina. Els baixos números de còpies observats (<200 còpies/genoma haploid) en l'ascidi i l'amfiox mostren com la gran explosió d'aquests elements es va produir en els vertebrats ja que el vertebrat basal M. glutinosa ja presenta valors significativament elevats (~50000 còpies per genoma haploid). A més l'absència de metilació del elements de l'ascidi i l'amfiox però no en la mixina suggereix que la utilització d'aquest marcador epigenètic de l'expressió gènica hauria estat una coopció exclusiva dels vertebrats i no pas de tots els cordats. Per altra banda, evidències indirectes de l'activitat d'aquests elements suggeririen que aquests elements podrien ser actius en tots els genomes que s'han analitzat en aquest treball. / The animal kingdom is divided in huge groups of animals or phyla. These groups represent animals which share some particular traits that make them distinguishable from other animals. This work is based on the study of the chordates, which include the urochordate, cephalochordate and vertebrate subphyla. The transposable elements are an heterogeneous array of sequences characterized by their capacity of self mobilization along the host genome and to be present in multiple copies. These elements, as a consequence of their characteristics, could be deleterious to the host but the presence of control mechanisms by the host or the element itself might allow a beneficial relationship as these elements increase the evolbability of the genome. The studies of transposable elements in gnathostomate vertebrates, as humans, have revealed their massive presence on the host genome. As these elements should have participated in the evolution of gnathostomate subphylum, this work has tried to elucidate the role of non-LTR retrotransposons in the evolution of the organisms that appeared during the transition from the prevertebrate chordates to the vertebrates. Using in vitro and in silico approaches, we have determined the kind and number of these elements in the genome of an ascidian (Ciona intestinalis), the cephalochordate amphioxus (Branchiostoma floridae) and the agnathan hagfish (Myxine glutinosa). These approaches allowed us to clearly determine the structure of 5 non-LTR retrotransposon in the ascidian genome, 6 in amphioxus and 1 in hagfish. The low copy number observed for these elements in the genomes of the ascidian and amphioxus (less than 200 copies per haploid genome) clearly shows that the great increase of these elements occurred in the vertebrates, because the hagfish shows a number of copies similar to those in other fishes (~50000 copies per haploid genome). In addition, the absence of methylation in the non-LTR retrotransposons of the ascidian and amphioxus, but not in hagfish, suggests that the use of this epigenetic marker should be coopted in the vertebrate lineage. Even more, indirect results point to the presence of active elements in the host genome of the three studied subphyla.

La degradació de proteïnes mitjançant el sistema de les ubiquitines i el proteasoma (UPS) és un procés altament regulat, en el qual diverses famílies enzimàtiques s'encarreguen de la correcte conjugació i deconjugació de molècules d'ubiquitina a un determinat substrat. Una d'aquestes famílies és la dels enzims deubiquitinitzants (DUBs), de la qual se n'han descrit, en humans, més de 90 membres. USP25 (21q11.2) codifica per un enzim deubiquitinitzant i produeix tres isoformes per splicing alternatiu. Una d'elles, generada per la inclusió de l'exó 19a entre el 18 i el 19b, presenta una expressió restringida a múscul esquelètic i cor (USP25m). Mitjançant un assaig de dos híbrids en llevat varem determinar que USP25m interacciona amb una proteïna d'unió a la miosina (MyBPC1), amb l'actina 1 (ACTA1) i amb la filamina C (FLNC). Totes aquestes proteïnes són sarcomèriques, regulen la diferenciació i el manteniment de les cèl.lules musculars i han estat implicades en diverses patologies humanes.Assajos bioquímics realitzats per aprofundir en la rellevància funcional d'aquestes interaccions ens mostren que els nivells de MyBPC1 estan regulats pel proteasoma, i que USP25m és capaç d'abolir seva degradació. En canvi, ACTA1 i FLNC són proteïnes estables, suggerint que la seva interacció amb USP25m està relacionada amb mecanismes reguladors de l'estructura i la funció del sarcòmer, i no amb la seva degradació. USP25 conté tres dominis d'unió a ubiqüitina implicats en el reconeixement de substrats i pot ser modificada per diversos tipus de modificació posttraduccional com la ubiqüitinació, la sumoïlació, la fosforilació i l'acetilació. El fet que sigui una proteïna multimodificada suggereix que la seva activitat enzimàtica ha d'estar finament regulada.Per últim, la sobreexpressió d'USP25 és capaç d'induïr una aturada en el cicle cel·lular, per mecanismes encara desconeguts. / USP25 is a deubiquitinating enzyme (DUB) that generates a muscle-specific isoform, USP25m, by alternative splicing. USP25m interacts with several sarcomeric proteins, but similarly to most DUBs, the contribution of different protein domains to enzymatic activity and substrate recognition remains to be ascertained. In silico analysis revealed the position of the catalytic signatures and predicted three ubiquitin binding domains (UBDs): one ubiquitin-associated domain (UBA) and 2 ubiquitin-interacting motifs (UIMs). By generating serial and combinatorial deletions of these domains, we analyzed their contribution to USP25m catalytic activity, substrate recognition, subcellular localization, and post-translational modifications, such as ubiquitination and sumoylation. Our results indicate that ablation of these motifs do not abrogate USP25 deubiquitinating activity, neither promoted any significant alteration in subcellular localization of the enzyme nor ubiquitin. However, USP25 UBDs contribute to specific substrate recognition, as interaction with each substrate requires a different combination or number of UBDs, in an additive or synergistic manner. USP25m is sumoylated in vitro and ubiquitinated, although the UBDs are not required for these post-translational modifications. In addition, USP25m is phosphorylated in Tyr, Ser/Thr residues and acetylated. The physiological relevance of all these modifications remains to be ascertained. USP25 overexpression causes cell cycle arrest, most probably at the G1/S transition.

S'ha caracterizat l'estructura de la regió genòmica del gen "Adh" a quatre espècies del gènere "Drosophila", pertanyents al subgrup "obscura": "D. ambigua", "D. subobscura", "D. madeirensis" i "D. guanche" amb els objectius d'analitzar l'organització i l'evolució d'aquesta regió genòmica dins d'aquest gènere i clarificar les relacions filogenètiques d'aquestes espècies. Per assolir aquestes fites, es van construir llibreries genòmiques de cada espècie que es van crivellar amb una sonda que contenia el gen "Adh" de "D. melanogaster", per tal d'aïllar seqüències homòlogues a aquest gen. Els clons positius es van caracteritzar primer per restricció i desprès per seqüenciació. També es va analitzar la seva localització citogenètica mitjançant hibridacions "in situ" sobre cromosomes politènics.En aquestes quatre espècies, el gen "Adh" és un gen de còpia única, d'expressió regulada per dos promotors diferents, amb una estructura comparable a la que presenta "D. melanogaster": tres exons de mida diferent separats per dos petits introns. A més, la seva seqüència es troba molt conservada en totes elles. Per altra part, immediatament adjacent a 3' del gen "Adh", es troba un altre gen, l' "Adh-dup", d'estructura també molt conservada inter-específicament, però que presenta la particularitat de una diferent localització del codó de terminació en diferents espècies, i per tant, la longitud de la proteïna codificada varia. Donada l'elevada similitud tant d'estructura com de seqüència entre els gens "Adh" i "Adh-dup", es confirma que ambdós gens haurien divergit a partir de la duplicació d'un gen ancestral.De les comparacions inter-específiques de seqüències es dedueix que no totes les regions evolucionen al mateix ritme, ja que es detecten diferències significatives en les taxes de divergència no només entre regions codificants i regions no codificants, sino també dins de cada tipus de regions. A les regions codificants, les substitucions silencioses són més frequents que les de reemplaçament, corn és d'esperar degut al constrenyiment funcional. Però, la distribució de les substitucions de reemplaçament no és a l'atzar al llarg de la regió codificant: quan es compara qualsevol espècie del subgrup "obscura" amb una del subgrupo "melanogaster", les substitucions de reemplaçament del gen "Adh" s'acumulen significativament en el tercer exó, mentre que, de forma inversa, quan es comparen espècies dins del subgrup "obscura", són les substitucions de reemplaçament del gen "Adh-dup" les que no es distribueixen a l'atzar. Aquests trets només es dóna quan en la comparació d'espècies s'empra el subgrup "obscura" i no quan es consideren espècies d'altres radiacions més llunyanes i, per tant, constituiria un tret de l'evolució d'aquest grup. Resumint, doncs, les posicions de reemplaçament del gen "Adh", serien la regió que s'hauria vist més afectada pels processos que es van produir en la radiació del grup "obscura" de la radiación "melanogaster". Inversament, la regió que reflecteix millor els canvis produïts dins de la pròpia radiació "obscura", són les posicions de reemplaçament del gen "Adh-dup". Podria tractar-se d'uns bons marcadors moleculars, informatius de les corresponents radiacions.S'han aïllat i caracteritzat seqüències addicionals al gen funcional, però que presenten homologia amb el gen "Adh", en el genoma de "D. subobscura", "D .madeirensis" i "D. guanche". Fet que concorda amb d'altres resultats, com ara la detecció de vàries localitzacions cromosòmiques i vàries bandes sobre "Southerns" de DNA genòmic total, amb homologia al gen "Adh". Les característiques que presenten aquestes seqüències addicionals són definitòries de retroseqüències, també anomenades gens processats, ja que no posseeixen introns, que han estat perfectament escindits, ni tampoc regions promotores reconeixibles, i en canvi, presenten "leader" i "trailer". De les seves característiques es dedueix que es tractaria de trànscrits del gen "Adh" que s'haurien retrotranscrit i integrat en el genoma, i posteriorment, han sofert un procés de multiplicació que ha afectat també a les regions genòmiques adjacents. També s'han detectat retrosequències en els genomes de "D. madeirensis" i "D. guanche". Immediatament adjacent a totes les retroseqüències aillades, s'ha trobat un DNA moderadament repetit en el genoma de "D. subobscura" que conté una repetició invertida de 196 pb i una regió intermèdia amb palíndroms i repeticions directes.Amb les dades moleculars obtingudes, s'ha intentat clarificar les relacions filogenètiques entre aquestes espècies. "D. guanche"," D. madeirensis" i "D. subobscura" formen una tríade estretament relacionada, éssent les dues últimes les més properes entre sí, amb una gran similitud de seqüència no només a les regions codificants, sino també en les no codificants. "D .guanche" sembla ésser l'espècie que està divergint més ràpidament dins d'aquest tríade i aquest fet concordaria amb la seva distribució geogràfica restringida, amb un nombre efectiu d'individus petit i que sofreix frequents colls d'ampolla. "D. ambigua" té una posició poc clara dins del subgrup "obscura", la seva filogènia varia segons les dades emprades, però semblaria situar-se més aprop de les espècies europees que de les americanes. A més, relativament, sembla divergir molt ràpidament dins d'aquest subgrup i això explicaria la dificultat de determinar la seva posció filogenètica, ja que estaria distorsionant la seva filogènia. / The structure of the genomic region of the "Adh" (alcohol dehydrogenase) gene has been analyzed and characterized in four species of the genus "Drosophila" belonging to the "obscura" subgroup: "D. ambigua","D. subobscura", "D. madeirensis and "D.guanche". Two different genes are located in this region, the "Adh" and the "Adh-dup" and both genes have diverged from a common ancestor. The inter-specific comparisons of the sequences of the two genes, which are very well conserved, have allowed detect differences in the divergence rates not only between, but rather within coding and non-coding regions. Furthermore, the distribution of the replacement substitutions along the coding sequence is significantly deviated from random. Additional sequences, homologous to the "Adh" gene, have been isolated and analyzed in the "D. subobscura" genome. Their features are definitory traits of retrosequences (processed genes). They have also been detected in the "D. madeirensis" and "D. guanche" genomes. This report, together with a very recent one from other authors, is the first to acknowledge the presence of these genetic elements in the genome of invertebrates. On the other hand, a middle repetitive DNA, which is located immediately adjacent of these retrosequences and contains an inverted repeat, has been characterized in the "D. subobscura" genome. Phylogenetically, "D. guanche", "D. madeirensis" and "D. subobscura" constitute a tightly related triad, being the latest two, the closest. "D. ambigua", instead, would have a less dear position in the subgroup "obscura". Eventually, it seems to locate nearer the European rather than the American species, although its rapid relative degree of divergence would distort its phylogeny."

Els elements insulator són seqüències al genoma que aïllen i separen regions reguladores. Clàssicament han estat definits per presentar dues propietats característiques: d’una banda són capaços d’aïllar un transgèn dels efectes posicionals de l’entorn cromosòmic —com mantenir-lo aïllat dels efectes silenciadors si el transgèn està situat en una regió heterocromàtica—, i per altra són capaços d’impedir l’activació d’un promotor per part d’un enhancer si l’insulator es troba entremig de tots dos (enhancer-blocking). A la regió reguladora del gen homeòtic Abdominal-B s’hi troben alguns dels insulators més ben estudiats de Drosophila melanogaster (Mcp, Fab-7 o Fab-8) que separen dominis reguladors (cadascun dirigint l’expressió d’Abdominal-B en un segment diferent). Al laboratori s’havien identificat prèviament zones d’hipersensibilitat a DNAsaI entre els dominis iab-5 i iab-6. Nosaltres hem les hem caracteritzat i n’hem identificat una (Fab-6) com a insulator, i que a més també té propietats de PRE (Polycomb response element). El Fab-6, situat en un transgèn entre un enhancer i un gen mini-white, atenua l’efecte activador de l’enhancer sobre el promotor. La manca de CP190 (proteïna necessària pels insulators) fa disminuir aquesta atenuació, demostrant que l’efecte és degut a una seqüència insulator. També hem demostrat que el Fab-6 es transcriu malgrat no ser codificant, i ho fa en el mateix sentit que el gen al qual regula, Abdominal-B. En canvi aquesta transcripció no té lloc en cèl•lules on Abdominal-B està silenciat. Hem vist que l’efecte enhancer-blocking d’alguns insulators també disminueix en mosques mutants de JIL-1. JIL-1 és una quinasa que fosforila la serina 10 de la histona H3 a interfase i que està relacionada amb activació de la transcripció i amb cromatina localment descondensada. Així, la participació de JIL-1 en l’activitat insulator pot venir donada per la necessitat d’aquests de transcriure’s. Per tal d’identificar més proteïnes que puguin estar involucrades en l’activitat insulator vam realitzar una purificació del complex format per CP190. CP190 és una proteïna que es troba a la major part d’insulators identificats fins el moment, i que és comú a tot els tipus d’insulator de Drosophila. Un cop purificat el complex en vam analitzar els components per espectrometria de masses. Entre les proteïnes identificades amb més robustesa hi havia les proteïnes ja conegudes d’insulator (CTCF, Su(Hw), Mod(mdg4)). Hi havia també altres proteïnes ja conegudes però fins ara no relacionades amb CP190 com Nurf-38 (component del complex remodelador de la cromatina NURF) i Z4 (relacionada amb manteniment de l’estructura de la cromatina, amb regions eucromàtiques i amb JIL-1). I també vam identificar dues proteïnes no descrites fins al moment que hem anomenat Ibf-1 i Ibf-2 per Insulator Binding Factor 1 i 2. Vam veure que es tractava de proteïnes amb localització nuclear i que s’unien a la cromatina a cromosomes politènics formant un patró de bandes que es solapa majoritàriament amb bandes de CP190. N’hem realitzat ChIP-seq (immunoprecipitació de cromatina seguida de seqüenciació) i hem observat que no només colocalitzen a la cromatina amb CP190 sinó també —tot i que amb menor mesura— amb les demés proteïnes d’insulator conegudes a Drosophila: Su(Hw), CTCF i BEAF. Els llocs d’unió mostren força diversitat: des de regions intergèniques a promotors de gens i també a introns i exons. Hi ha un particular enriquiment a gens que contenen promotors alternatius i a promotors que tenen un altre promotor proper. A nivell funcional hem vist per microarray que la seva manca causa desregulació de l’expressió de varis gens no relacionats funcionalment entre si. També hem vist en assaigs transgènics que la manca d’Ibf-1 i Ibf-2 disminueix l’efecte enhancer-blocking d’alguns insulators. Per tot plegat concloem que hem identificat dues noves proteïnes d’activitat insulator a Drosophila. / "Identification and characterization of new factors associated to insulator elements in Drosophila melanogaster" Insulator elements are genomic sequences that serve as boundaries for proper gene regulation. These sequences are bound by specific chromatin-binding proteins that help insulate and separate different regulatory regions. They are classically defined by having two properties: on one hand they can act as barriers to heterochromatin that can therefore insulate a transgene from positional effects due to genomic environment; and on the other hand they can block the interaction between an enhancer and a promoter when they are positioned in between. In this case, the activating effect of the enhancer will be attenuated in the presence of the insulator. We have investigated the insulators present in the Abdominal-B homeotic gene regulatory region of Drosophila melanogaster. This large region is divided into several domains each one controlling Abdominal-B expression in a different body segment. Previous work in the lab had uncovered two DNaseI hypersensitive sites between domains iab-5 and iab-6. We have characterized them and identified one as the insulator Fab-6, that separates the two domains. This insulator is dependent on CP190 and is transcribed in those cells where Abdominal-B is transcribed. In order to identify new proteins involved in insulator activity we purified the complex formed by CP190, which is an already well characterized insulator protein found in every type of insulator known in Drosophila. Using Mass Spectrometry we identified the components of the complex. We found other known insulator proteins like CTCF, Su(Hw) or Mod(mdg4). We also identified Nurf-38 (a component of NURF complex) and Z4 (an euchromatin binding protein). And we identified two previously uncharacterized proteins that we named Ibf-1 and Ibf-2 after Insulator Binding Factor 1 and 2. We have studied these two proteins and showed that not only they colocalize in chromatin with CP190 (and partially with the other insulator proteins) but also they have enhancer-blocking activity and their lack causes a misregulation in gene expression of several genes. Overall our results show that we have identified two new Drosophila insulator proteins that form complex with CP190.

Ammonia oxidation, the first and the rate-limiting step in nitrification, is one of the cornerstones of the cycle. Members from the bacterial and archaeal domains are key players in ammonia oxidation in many different environ- ments. Usually these organisms are found coexisting but the most recent studies suggests that archaeal ammonia oxidizers show an incredible ability to adapt and oxidize ammonia under different environmental conditions and have displaced their bacterial counterparts in terms of importance in the global biogeochemical cycle, providing an avalanche of AOA molecular data (16S rDNA and amoA gene sequences) from very diverse environments worldwide. As far as we don’t have enough genomic data to perform an holistic approach using population genomics and reverse ecology to unveil the ecological and evolutionary mechanisms driving the adaptation; we focused our experiments on the amoA gene sequence. Because ammonia monooxygenase is supposed to be the key enzyme in the ammonia oxidation, we applied a combination of community ecology and molecular evolution methods to understand the mechanisms of the diversification patterns observed in the amoA gene. Another unsolved question in the archaeal ammonia oxidation is the unusual biochemistry found in the genome sequences from cultured archaeal ammonia oxidizers. In archaea, all the elements of the bacterial ammonia oxidizing pathway are missing but the genes coding for the presumptive AMO. To unveil missing pathways in this process, we have developed a powerful approach based on graphical models to capture all the functional associations present in metagenomes based in their ecological co-ocurrence. The results of the analyses revealed for the first time a global picture of the phylogenetic community structure of ammonia- oxidizing assemblages. Our study unveiled larger phylogenetic richness in AOA with more dissimilar communities and clear monophyletic groups for the different habitats. The rates of diversification in AOA were higher than in AOB and the archaeal diversification dynamics showed an unusual feature, with an initial diversification process followed by a long period of stasis and a final burst of diversification. The variations observed between AOB and AOA in terms of community structure, phylogenetic diversity, diversification patterns, and habitat dispersion were unexpected just a very few years ago, and the community phylogenetics approach has nicely captured these differences. Understand the diversification processes observed in AOA and their successful performance under a myriad of different environmental conditions such as low pH, different ammonia concentrations, high hydrostatic pressures, high light exposure, low oxygen availability among others, needs however of a deeper insight adding the evolutionary processes. Individual changes at the level of nucleotides were translated to the global diversification patterns of archaeal ammonia oxidizers. Thus, this resulted in a step further from the results obtained after applying community phylogenetics methods providing precise evolutionary information behind the phylogenetic patterns observed within an ecological context. We will gain the full picture once the results can be integrated in a comparative genomics framework. After applying methods of reverse engineering of regulatory the associations between the known and the unknown fraction were reconstructed offering a pioneering fresh view for microbial ecology. One especially relevant result obtained from this approach on AOA was the reconstruction of the association network of the different AMO subunits to the other proteins previously reported in the marine AOA Nitrosopumilus. The information recovered from metagenomics combined with available genomes fuels hypothesis for the particular and yet unknown biochemistry of ammonia oxidation in Archaea. / La oxidación del amonio es una de las piezas clave del ciclo del Nitrógeno. Tanto las bacterias como las arqueas oxidadoras del amonio se pueden encontrar coexistiendo a lo largo de diferentes ambientes. Pero cuando la primera arquea oxidadora del amonio fue aislada, se puso en relevancia la importancia de estas en comparación con las bacterias en los ciclos biogeoquímicos globales. Desde entonces hemos sido inundados por una avalancha de secuencias génicas de estas arqueas, mostrando una gran capacidad de diversificación y adaptación a ambientes diferentes. Al no disponer de suficientes datos para realizar una aproximación holistica utilizando genómica de poblaciones y de ecología inversa para poder discernir los mecanismos ecológicos y evolutivos relacionados con la adaptación; nos hemos centrado en estudiar la secuencia del amoA. La amonio monooxigenasa es la enzima responsable de la oxidación del amonio, para su estudio hemos aplicado una combinación de técnicas de ecología de comunidades y de evolución molecular con el objetivo de entender los mecanismos de los patrones de diversificación observados. Por otra banda, otro de los misterios asociados a la oxidación del amonio por parte de las arqueas, es su inusual bioquímica para realizar la oxidación del amonio. En arqueas faltan todos los elementos necesarios para llevar a cabo la oxidación del amonio a excepción del AMO. Para poder aportar algo de luz a este misterio hemos desarrollado un potente método basado en modelos gráficos para capturar todas las asociaciones funcionales presentes en los metagenomas basado en sus co-ocurrencias ecológicas.

El grau de diferenciació poblacional de les espècies marines sembla estar altament relacionat amb la seva capacitat de dispersió. En aquest treball s'ha realitzat la comparació dels nivells d'estructura poblacional entre dues espècies de peixos mediterranis amb diferents capacitats de dispersió durant la seva fase larvària i amb capacitats de moviment de l'adult semblants. Amb l'objectiu de delimitar de forma correcta les àrees de distribució d'ambdues espècies, evitant així la presència de possibles espècies críptiques i per esclarir els processos que les han originat s'ha realitzat una filogènia molecular per ambdues espècies. S'han utilitzat loci microsatèl.lits altament polimòrfics per tal d'inferir els nivells de diferenciació poblacional per cada espècie, així doncs, dues genoteques enriquides s'han dut a terme, una per cada espècie. Com a conclusió s'ha observat un grau de diferenciació poblacional major per l'espècie amb una capacitat de dispersió menor en la seva fase larvària en front de la que tenia una major capacitat de dispersió, corroborant la hipòtesis inicial d'aquesta tesi.