Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) i a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC) / Examples of tubular organ systems like the mammalian lungs and vascular system abound in the animal kingdom. In this study we used the Drosophila melanogaster tracheal system to study tubular organ development. In particular, we focused on taenidial folds, chitin structures surrounding the tubular lumen that give mechanical strength to the tracheal tubes. Formed by the secretion of chitin into the apical extracellular matrix, these folds extend beyond the limits of a single cell spanning through multiple cells. This implies a high level of intra and intercellular coordination. There are a number of genes in the absence of which taenidial folds are disturbed. Among these, we focused on Blimp-1 and pri. In the absence of each of these genes, taenidial folds are disrupted while other aspects of tracheal development are unaffected. We have analyzed the expression pattern of Blimp-1 and pri and found that both genes are expressed in Drosophila tracheal cells during embryonic development. Taenidial folds are still formed in the absence of Blimp-1 or pri but they are not organized correctly, thereby indicating that Blimp-1 and pri contribute to their proper formation. Actin structures contributing to chitin organization have been reported for many systems in Drosophila, like denticle belts at the epidermis and the lumenal structure in the tracheal system. In Blimp-1 mutants, apical actin rings fail to form whereas in pri mutants they are formed but misoriented, suggesting that the function of Blimp-1 and pri is required for F-actin assembly. Interestingly, when we impair either chitin synthesis or chitin organization the apical F-actin is disorganized and does not form bundles. For the first time, we show that during tracheal system development there is a crosstalk between F-actin organization and chitin structures. By rescuing the mutant phenotype in single cells, we studied how individual cells contribute to generate a supra-cellular structure. Results of our analysis reveal that the orientation of taenidial folds is not cell-autonomously regulated and that it depends highly on the taenidial folds formed by the neighboring cells. Finally, we show that impairing cell-cell junctions, via down-regulation of α-catenin, gives rise to tracheal cells that form their taenidial folds independently. / En el reino animal hay numerosos ejemplos de sistemas de órganos tubulares, como los pulmones y el sistema vascular de los mamíferos. En este estudio hemos usado el sistema traqueal de Drosophila melanogaster para estudiar el desarrollo de este tipo de órganos. En particular, nos centramos en los pliegues taenidiales, estructuras de quitina que rodean el lumen tubular y dan resistencia mecánica a los tubos traqueales. Formados por la secreción de quitina en la matriz extracelular apical, estos pliegues se extienden más allá de los límites de una sola célula, abarcando múltiples células. Esto implica un alto nivel de coordinación intra e intercelular. Hay una serie de genes cuya ausencia produce perturbaciones en los pliegues taenidiales. De éstos, nuestro estudio se centra en Blimp-1 y pri. En ausencia de cada uno de estos genes, los pliegues taenidiales no se desarrollan correctamente mientras que otros aspectos del desarrollo traqueal no se ven demasiado afectados. Hemos analizado el patrón de expresión de Blimp-1 y pri, y hemos encontrado que ambos genes se expresan en las células traqueales de Drosophila durante el desarrollo embrionario. Los pliegues taenidiales todavía se forman en ausencia de Blimp-1 o pri, pero no están organizados correctamente, lo que indica que Blimp-1 y pri contribuyen a su adecuada formación. Existen varios sistemas en Drosophila en que estructuras de actina contribuyen a la organización de la quitina, como los dentículos de la epidermis y el lumen el sistema traqueal. En los mutantes Blimp-1, no se forman los anillos de actina apical, que si que lo hacen en los mutantes pri pero con una mala orientacion, lo que indica que la función de Blimp-1 y pri se requiere para el ensamblaje de la F-actina. Por otra parte, nuestros resultados indican que perturbar la síntesis de quitina o su organización, desorganiza la F-actina apical que no forma haces. Por lo tanto, durante el desarrollo del sistema traqueal se establece una interacción mútua entre la organización de la F-actina y de las estructuras de quitina. Mediante la expresión de la forma silvestre del gen en una sola célula en un fondo mutante, hemos estudiado cómo las células individuales contribuyen a generar una estructura supra-celular. Los resultados de nuestro análisis revelan que la orientación de los pliegues taenidiales no es regulada de manera autónoma y que depende en gran medida de los pliegues taenidiales formados por las células vecinas. Por último, mostramos que perturbar las uniones entre células, a través de la reducción de los niveles de α-catenina, da lugar a que las células traqueales formen su pliegues taenidiales de forma independiente a sus vecinas.

La situació actual de la problemàtica de la recombinació, quan es consideren les eficàcies biologiques independents de les freqüències (gèniques, cromosômiques, zigòtiques) i en un ambient, i per tant amb unes eficàcies, constant en l'espai i el temps, és aproximadament la següent:D'una banda els models deterministes rarament posen de manifest cap avantatge selectiu de la recombinaciô, la tendència general és la congelació del genotip. Certs models deterministes mostren que la tendència general serà l'increment progressiu de la freqüència d'un mecanisme que impideixi o dificulti la recombinaciô. Els mateixos models acostumen a portar associat un increment de l'eficàcia mitjana de la població amb un decreixement de les freqüències de recombinaciô. La sensació general que se'n desprèn és que les limitacions a la recombinaciô són un mecanisme d'adaptació ràpida i oportunista en un ambient estable.Altres models, sense discutir la dinàmica del mecanisme regulador de la recombinaciô, tambe troben associada una eficàcia mitjana superior a un lligament més intens. Quan s'analitza el paper del desequilibri en el lligament es posa de manifest que aquest és fonamental, tant a 1'adaptació ràpida com a 1'eliminació de mutacions deletêries, i és propiciat pel lligament intens i per les interaccions epistàtiques.Abans de discutir el quadre general dels models finits convindria fer alguns comentaris crítics sobre la validesa dels models deterministes a les situacions reals. Primerament es pot fer la crítica evident que sovint les suposicions (grandària infinita, aparellament a 1'atzar ...) en les que es basen, i que sempre representen idealitzacions de la realitat, no son vàlides; realment això no és cap argument decisiu contra aquests models, l'únic que es pot dir és que quan aproximadament es compleixin tais condicions, el model serà una descripció suficientment vàlida de la realitat. A més, sovint es reconeix que un model és una primera aproximació i que es pot anar complicant per fer-lo cada cop més adequat per analitzar la realitat.Una crítica més profunda a aquells treballs que es basen en dues menes de criteris: els criteris d'optimització (normalment de maximització de l'eficàcia mitjana), associada amb les posibles "estratègies" (recombinació, no recombinació p.e.) de les poblacions, i els criteris de selecció de grup (és adequat, és beneficiós, etc. per a la població, l'espècie ...). Ambdós tipus de criteris, relacionats entre ells, presenten nombrosos problemes lògics com a explicacions vàlides d'allò que s'observa a les poblacions. Wiens (1976) ha resumit els punts essencials d'aquesta qüestió. Quant als criteris d'optimització puntualitza que normalment suposen cert que: 1) el sistema població-ambient és en equilibri, 2) com a mínim una component de l'ambient es constantment limitant, 3) no hi ha cap relaxació temporal de les pressions de selecció que afavoreixen l'òptim, 4) l'ambient disponible es constantment i totalment ocupat, 5) l'òptim esestable (p.e. no canvia el fenotip òptim al llarg del temps), 6)l'òptim és realment assolible (p.e. no es té en compte cap possible efecte de la història passada del sistema, com ara un efecte fundador).Respecte als criteris de selecció de grup hi ha seriosos problemes per encaixar-los en la teoria clàssica de la selecció natural, basada en la selecció a nivell individual. En els models amb població finita no sembla que existeixi tal unitat quant als resultats. Cal remarcar que es tracten dos problemes diferents, d'una banda el manteniment del polimorfisme al·lèlic, i d'una altra la velocitat d'adaptació i d'eliminació d'al·lels deleteris. Ambdós però estan relacionats amb una qüestió més profunda: l'efectivitat de la selecció com a força oposada als efectes de la deriva genètica.L'anàlisi de la velocitat de substitució d'al·lels favorables i de la taxa d'eliminació de llast genètic (Felsenstein (1974), Felsenstein i Yokoyama (1976), Hill i Robertson (1966), etc. ...) coincidiesen a mostrar a la recombinació com un mecanisme afavoridor de la resposta selectiva ràpida, en oposició als resultats dels models deterministes, els quals freqüentment no inclouen la mutació (excepte Eshel(1971)), amb una població inicial en equilibri on ja són presents - tots els tipus (contràriament al cas finit), es lògic que un mecanisme preservador de la combinació al·lèlica afavorida i ja present a una freqüència inicial d'equilibri, mostri les propietats trobades als models deterministes : es tracta d'incrementar la freqüència del tipus cromosòmic més eficaç i de disminuir la dels altres, no de propiciar la seva aparició ni d'evitar que es perdi a causa de la deriva. Les dades experimentals semblen confirmar l'existència real de mecanismos d'aquest tipus, i l' anàlisi matemàtica realitzada amb models deterministes i aleatoris sembla que confirmi, en un context una mica diferent, aquestes idees. Els mateixos resultats es troben si s'analitza numèricament i mitjançant simulació un model segons un procés, en temps continu i estats finits, de naixement, mort, mutació i recombinació. Per tant, per grandàries poblacionals finites, es troba que el significat de la recombinació, a més de les condicions de desequilibri inicials , varia segons es consideri el temps fins a l'aparició del primer genotip mutant doble (recombinació favorable) o el temps fins a la fixació d'aquest genotip. (recombinació desfavorable). Apart de la possible artificiositat de les suposicions inicials d'eixos models, ja esmentada i que es discutiran més endavant, quant als models de simulació finits cal dir que usualment son deficients respecte al seu "realisme" a l'hora de representar els processos ge nètics. Concretament, la selecció i la gametogênesi de vegades no coincideixen gaire amb la seva descripció biològica. Tot això es discutirà mes a fons en parlar de les tècniques .de. simulació.. De moment cal tenir-ho present com un possible factor per explicar els resultats, que podrien no ser reflex d'una propietat biològica sinò d'una limitació del model de simulació.

Els dipòsits d'amiloide s'observen en els illots pancreàtics de la immensa majoria de persones que han sofert diabetis mellitus tipus 2, i constitueixen un fet característic en la història natural de la malaltia. El principal component d'aquest dipòsits és la amilina, un pèptid sintetitzat per la pròpia cèl.lula i secretat amb la insulina. La hipòtesi de treball del present projecte es basa en el fet que els dipòsits d'amiloide serien secundaris a una alteració en la expressió de l'amilina o bé en la síntesi del pèptid, i aquesta alteració podria estar determinada per un defecte genètic.

La comunicación entre células es esencial para integrar las órdenes necesarias para que un organismo pueda desarrollarse correctamente desde el estadio de una célula hasta el mantenimiento del estado adulto. El número de vías de señalización que las células necesitan para comunicarse es relativamente bajo y por ello dichas vías se reutilizan varias veces durante el desarrollo de los organismos. El organismo modelo empleado en este trabajo es la planaria de agua dulce Girardia tigrina. Las planarias son especialmente interesantes por su gran plasticidad morfológica y gran habilidad para regenerar las partes perdidas del cuerpo. Con esta tesis se intenta dilucidar el papel en la regeneración de una vía de proteínas señalizadoras en particular, la vía Wnt, que rige múltiples funciones durante el desarrollo normal de los organismos. En concreto se describe el aislamiento de un homólogo de la subfamilia Wnt-5, del regulador negativo de la vía, la GSK-3 (glicógeno sintasa quinasa-3), y de uno de los efectores nucleares de la familia TCF (T-cell factor). Asímismo se analiza el patrón de expresión de los dos primeros, hallándose un máximo en el sistema nervioso central. Además, se detallan experimentos de RNA de interferencia realizados por distintas metodologías para provocar fenotipos de pérdida de función. Estas metodologías consistieron por un lado en la inyección de RNA de doble cadena diseñado a partir del gen que específicamente se pretendía bloquear y, por otro lado, en la ingestión de bacterias que expresaban la doble cadena de RNA del gen en cuestión. Dichas aproximaciones fueron exitosas para el gen GSK-3, con resultados corroborados con drogas inhibidoras para dicha quinasa. Para el ligando Wnt-5 no se obtuvo fenotipo de falta de función, hipotetizándose así una posible redundancia entre posibles distintos Wnt existentes en planaria. Los fenotipos de pérdida de función de GSK-3, en cambio, indican un papel esencial para este gen en la regeneración de la parte más anterior del organismo y en la determinación cefálica. / DOCTORAL THESIS: "FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF CONSERVED ELEMENTS OF THE WNT PATHWAY IN THE CEPHALIC REGENERATION OF PLANARIANS"Communication between cells is essential to integrate the orders that an organism needs to develop properly from a one-cell stage to the maintenance of the adult stage. The number of signalling pathways that cells use to comunicate to each other is relatively low, therefore these cascades are re-used several times during development of organisms. The model system in this work has been the fresh-water planarian, Girardia tigrina. Planarians are specially interesting for their high morphological plasticity and huge hability to regenerate lost parts of the body. With this doctoral thesis, we have tried to elucidate the role during regeneration of a particular signalling pathway, the Wnt pathway, which drives multiple functions during normal development of organisms both at early and late stages. More precisely, we describe the isolation of a Wnt-5 ligand, as well as the negative regulator of the pathway, GSK-3 (glycogen synthase kinase-3), and an homologue of a nuclear transciptional factor, TCF-4 (T-cell factor-4). The expression patterns are also analyzed and a maximum is found at the central nervous system, at least for the two first genes. Besides, we show different RNAinterference experiments performed by two methods to acquire loss of function phenotypes. One of the techniques consisted of the injection of double-strand RNA specific for the gene we wanted to knock-down and the other consisted of the ingestion of bacterially expressed double-strand RNA of the gen. Both approaches were succesful for the GSK-3 homologue, giving rise to similar results that had been obtained with drugs against the same kinase. However, no loss of function phenotypes were obtained with RNAi for Wnt-5, so the hypothesis was redundancy with other Wnt members possibly present in the planarian genome. Instead, GSK-3 loss of function phenotypes indicate an essential role for this enzyme in regeneration of the most anterior part of the organism and in the cephalic determination.

Tesi realitzada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB)-CSIC / Heterotrimeric G proteins are masters regulators of cell homeostasis. They coordinate the signaling between G protein coupled receptors (GPCRs) and their intracellular effectors. Heterotrimeric G proteins are composed of three subunits: G-alpha, G-beta, G-gamma. They function as a switches between an inactive GDP-bound state and an active GTP•bound state. Upon receptor activation, the G-alpha subunit undergoes a conformational change that leads to the exchange of GTP for GDP and the dissociation of the G-alpha subunit from the G-beta-gammadimer, allowing the subunits to activate their downstream effectors. The signal is terminated when the G-alpha subunit hydrolyzes its bound GTP to GDP and re-associates with G-beta-gamma. There are four subfamilies of G proteins: G-alpha (i), G-alpha(q), G-alpha(s) and G-alpha(12). Each subfamily can activate a different subset of effectors and signaling pathways. The subfamily of the G-alpha(12) protein is composed of two members: G-alpha(12) and G-alpha(13). They are involved in different processes such as embryonic development, cell growth, cell migration, angiogenesis processes and apoptosis. G-alpha(12) and G-alpha(13) have been linked to cellular events such as cytoskeletal rearrangements and cell proliferation through the activation of the small GTPase RhoA and moreover, they activate Rho principally through direct interaction with Rho-specific guanine nucleotide exchange factors (RhoGEFs). A growing number of RhoGEFs have recently been identified, with a majority as a members of the Dbl family of RhoGEF proteins. This proteins share in common a DH domain, the catalytic domain, and a PH domain, a pleckstrin homology domain. There are four RhoGEFs to be directly stimulated by the G-alpha(12/13) subfamily: p115RhoGEF, LARG, PDZRhoGEF and AKAP-Lbc. Three of them form the RH-RhoGEF subfamily because they share in common a RGS homology domain which is the implicated in their interaction with G12 proteins. GEF-Hl was discovered as a microtubule associated protein and belongs to the AKAP-Lbc subfamily. It has been reported to be regulated by its binding to microtubules, while microtubule-bound GEF-Hl is associated to have low activity its release from them leads to GEF-Hl activation and consequently, the activation of the small RhoGTPase RhoA. GEF-Hl can also be regulated by phosphorylation and several kinases can phosphorylate GEF-Hl in different moments of the cell. For instance, during cytokinesis GEF-Hl is phosphorylated by Aurora kinases and Cdk/Cyclin 8 in order to regulate its activity towars RhoA, due to be a high controlled spatiotemporal process. GEF-Hl is also considered a key player in the cross-talk of microtubules to actin dynamics and is reported to be involved in a variety of normal biological situations such as cell cycle regulation, and cell morphology, polarity and motility. Conventionally G proteins have been linked with the plasma membrane where they exert their functions. However, several studies during the last years have shown that Gproteins can also regulate processes in other cellular compartments. Previous results showed that G-alpha(12) was important for cell division. Indeed, the results obtained during this thesis indicate that G-alpha(12) is associated with the spindle apparatus in the late stages of mitosis and also located at the midbody during cytokinesis. Interestingly, perturbation of GUn function results in aberrant mitosis with different phenotypes such as multi nucleation, apoptosis or failed cytokinesis. On the other hand, the results obtained shown that GEF•Hl would be a possible downstream effector for GUn signaling in mitosis due to the fact that GUn interacts and activates GEF-Hl. The interaction takes place trough the DH-PH domains of GEF-Hl and GUn was able to promote the release of GEF-Hl from microtubules, where GEF•Hl is found in its inactive form, and to stimulate GEF activity of GEFHI. Furthermore, colocalization experiments showed that GU12 and GEF-Hl are located in the midbody during cytokinesis. So, we propose a mechanism for the interaction between GEF-Hl and G-alpha(12) during cytokinesis where sequentially G-alpha(12) would activate GEF-Hl in first place, and secondly G-alpha(12) would activate LARG, which is needed to complete the absicission process and is also stimulated by GUn. / Les proteïnes G heterotrimèriques són reguladores de l'homeòstasi cel•lular. Coordinen la senyalització entre els receptors acoblats a proteïnes G (GPCR) i els seus efectors intracel.lulars. Hi ha 4 subfamflies de proteïnes G: G-alfa(i), G-alfa(q), G-alfa(s) y G-alfa(12), on cada família és capaç d'activar unes vies de senyalització diferents. Dintre de la subfamília de la G12 hi ha dos membres: G-alfa(12, i G-alfa(13), Estan implicades en diferents processos cel•lulars com poden ser la remodelació del citoesquelet d'actina i la proliferació ceJ.1ular a través de l'activació de la proteïna RhoA. RhoA és una GTPasa monomèrica que és activada per les proteïnes G12 a través de la interacció amb els factors bescanviadors de nucleòtid guanina específics de Rho (RhoGEF). La família de les Dbl-RhoGEFs és probablement la millor estudiada. Es caracteritzen per compartir un domini catalític OH i un domini PH. Dintre d'aquesta família hi ha la subfamília RH•RhoGEFs, on els seus membres poden ser estimulats directament per les proteïnes Gl2 a través del domini RH. Per altra banda, la GEF-Hl és una RhoGEF que pertany a una subfamília evolutivament propera a les RH-RhoGEFs on alguns dels seus membres poden ser estimulats per les proteïnes G. La GEF•Hl és una proteïna associada als microtúbuls on es troba en la seva forma inactiva, i l'alliberament dels microtúbuls promou un augment en la seva activitat catalítica envers a Rho. La GEF-HI participa en diferents processos cel.lulars com pot ser la regulació de la mitosi. Clàssicament les proteïnes G s'han associat a la membrana plasmàtica on desenvolupen les seves funcions, però resultats obtinguts en els últims anys han demostrat que també poden estar localitzades en altres compartiments cel•lulars. Resultats obtinguts durant el transcurs de la present tesi indiquen la proteïna G-alfa(12) es localitza en el fus mitòtic al final de la mitosi i es concentra al cos intermedi durant la citocinesi. A més a més, la pertorbació de la seva funció provoca defectes en les mitosis. També es proposa la GEF•Hl com una possible proteïna efectora de la G-alfa(12) en la mitosi ja que s'ha trobat que ambdues proteïnes colocalitzen al cos intermedi durant la citocinesi. Els resultats obtinguts han permès caracteritzar la interacció entre la proteïna G-alfa(12) i la GEF-H1 així com demostrar que la G-alfa(12) pot activar la GEF•H1.

En la siguiente tesis se presentan tres estudios centrados en diferentes aspectos estructurales y funcionales de los dominios efectores presentes en los reguladores epigenéticos y sus consecuencias para la interpretación biológica de las modificaciones de las histonas: (i) Propiedades estructurales y patrón de distribución de los dominios de interacción con la cromatina; (ii) La modulación funcional mediante variaciones locales en el centro activo y en la transición desorden-orden experimentada por la cola de las histonas tras su unión a los dominios efectores; y (iii) Los patrones de splicing alternativo de los reguladores epigenéticos y su posible impacto funcional De la caracterización funcional y estructural de los dominios de interacción presentes en las enzimas modificadoras/remodelantes de la cromatina, podemos extraer que existen diferentes factores que afectan la especificidad de dichos dominios hacia una determinada modificación de la histona. Como por ejemplo, la distribución desigual de los dominios de interacción entre las diferentes familias de reguladores epigenéticos, las variabilidades estructural y química globales, y la transición desorden-orden experimentada por la cola de la histona en su unión a los dominios de interacción. Además, la caracterización estructural de los dominios de interacción sugiere diferentes clases en función de características estructurales comunes: flat-groove, narrow-groove y cavity-insertion. En relación a la variabilidad funcional introducida por los eventos de splicing alternativo en las diferentes familias de reguladores epigenéticos estudiadas, podemos extraer que los eventos de splicing tienen una ocurrencia considerable y los cambios introducidos pueden ordenarse en tres categorías: (a) reducciones drásticas de tamaño, (b) cambios en los dominios catalíticos y (c) cambios en los dominios de interacción; a cada una de ellas le corresponde una interpretación funcional que sugiere un efecto regulador importante por parte del splicing alternativo. / This thesis consists of three studies focused in different structural and functional aspects about the effector modules of the epigenetic regulators and its consequences for the biologic interpretation of histone modifications. (i) Structural properties and distribution pattern of the interaction domains among chromatin-modifying enzymes; (ii) Functional modulation through local variation of the binding site and in the transition disorder-order of the histone tail upon binding with effector modules; and (iii) The alternative splicing patterns of the epigenetic regulators and its functional impact. According the functional and structural characterization of the interaction domains of chromatin-modifying/remodeling enzymes, we identified some substrate specificity determinants towards different histone modifications. For instance, unequal distribution of the interaction domains among different families of epigenetic regulators, global structural and chemical variability of the effector modules, and the disorder-order transition of the histone tails. Additionally, structural characterization of the effector modules that recognize histone modifications suggests a classification according common structural features: flat-groove, narrow-groove y cavity-insertion. According the functional variability introduced by alternative splicing, we observe that splicing events have a high ocurrence in the epigenetic regulators and the changes introduced can be classified according to the functional role of the domain: (a) drastic sequence changes, (b) changes in the catalytic domains and (c) changes in the interaction domains. Our results show that alternative splicing is likely to have a substantial impact on the epigenetic regulation of large sets of genes, by regulating the function of chromatin-modifying enzymes.

El retard de creixement pot ser secundari en un percentatge indeterminat de pacients a un problema genètic. En aquest treball s'analitza el gen de l'hormona de creixement (GH1) i s'estudien els canvis en la seqüència que produeixin un ARN missatger anòmal o una proteïna que no sigui funcional. S'ha estudiat el mapa polimòrfic del gen GH1 en una població control (n=307), per definir el mapa de SNPs. Alhora s'ha buscat un model en el qual poder estudiar l'expressió d'aquest gen. S'ha aïllat l'ARN de leucòcits de sang perifèrica tant de pacients com de controls, i s'ha amplificat el missatger de GH1. També s'ha posat a punt un model cel·lular en el qual poder estudiar la bioactivitat de les proteïnes recombinants portadores dels canvis detectats en pacients (Phe25Tyr i Val173Leu).Les conclusions del treball han estat les següents:1. Els nostres resultats han confirmat i ampliat la descripció de la variabilitat estructural del gen GH1. Han permès descriure el mapa complet per primera vegada, en una població adulta amb talla normal, compresa entre -2 i +2 SDS (n=307).2. En les poblacions amb retard crònic de creixement (n=728) s'han detectat en un 11% de pacients canvis en la seqüència del gen GH1 diferents dels SNPs del mapa control. Entre els canvis, l'11,3% correspon a canvis puntuals d'un aminoàcid (1% del total de pacients índex).3. L'expressió de GH1 en leucòcits de controls no és constitutiva ni constant en quant a les variants de splicing observades. Aquesta metodologia no permet detectar de forma fiable mutacions en pacients. En canvi, ens ha permès confirmar l'expressió de mutants com en el cas d'una substitució predictora de canvi d'aminoàcid, així com descartar o confirmar anomalies de splicing en al·lels portadors de canvis intrònics.4. La utilització d'eines informàtiques ha permès realitzar una aproximació teòrica a l'efecte que dos canvis d'aminoàcid (Phe25Tyr i Val173Leu) a la proteïna GH tenen sobre la seva estructura i interacció amb GHR. L'anàlisi d'homologia de les proteïnes mutants amb les dels altres gens del clúster de la GH ha permès concloure que la substitució Phe25Tyr es pot haver generat per recombinació gènica amb el gen GH2, mentre que no és el cas per a la proteïna amb el canvi Val173Leu.5. Les proteïnes recombinants obtingudes al laboratori (WT i mutants) han estat aptes per al seu estudi in vitro (inmunoreactivitat, proliferació cel·lular i bioactivitat).6. Les GHs mutants Phe25Tyr i Val173Leu presenten una inmunoactivitat i una bioactivitat disminuïdes. Els models cel·lulars de les línies HepG2 i C-28/I 2 no han permès obtenir resultats, mentre que el model de cultiu primari de condròcits fetals humans ha permès detectar que les dues GHs mutants estimulen amb menor intensitat la transcripció de IGF1 mentre que provoquen un augment en l'expressió de GHR i IGF1R.7. El canvi d'aminoàcid Phe25Tyr incorporat en un al·lel de GH1 portat en heterozigosi per dues famílies no relacionades es manifesta com a retard de creixement durant la infantesa que s'acompanya de resposta deficitària de secreció de GH i disminució de IGF1. La resposta al tractament amb GH és adequada i permet recomanar el tractament fins al final del creixement. El canvi Val173Leu detectat en una pacient amb talla baixa i RIUC, sense dèficit aparent de GH, permet suggerir que la detecció precoç de mutacions al gen GH1 quan la secreció aparenta ser normal, permetria un tractament més precoç que hagués millorat el seu pronòstic de talla final. L'anàlisi dels haplotips complets de GH1 permet interpretar l'efecte de la combinació de mutacions a la proteïna amb els genotips per als SNPs. / TITLE OF THE THESIS: "MOLECULAR CARACTERITZATION OF GH1 GENE IN CONTROL AND PATHOLOGIC POPULATIONS, EXPRESSION PATTERNS IN PERIPHERAL BLOOD LEUCOCYTES AND FUNCTIONAL STUDY OF MUTANT PROTEINS DETECTED IN PATIENTS"SUMMARY: The growth delay can be a secondary factor in front of a genetic problem in an indeterminate percentage of patients. In this work, it is analyzed the gene of growth hormone (GH1) and it is studied the changes in the sequence that produce an anomalous messenger ARN or a protein that is not functional. The polymorphic map of gene GH1 has been studied in a control population (n=307), to define the map of SNPs. At the same time, a model has been looked for, in which it could be possible to study the expression of this gene. The ARN of leucocytes of peripheral blood of patients and controls has been isolated, and the GH1 messenger has been amplified. Moreover, we have worked in a cellular model that allows us to study the bioactivity of recombinant proteins carrying the changes detected in patients (Phe25Tyr and Val173Leu). The conclusions of the work have been the following ones: 1. Our results have confirmed and extended the description of the structural variability of gene GH1. They have allowed us to describe the complete map for the first time, in an adult population with normal stature, between -2 and +2 SDS (n=307). 2. In the populations with chronic growth delay (n=728) in an 11% of the patients, changes have been detected in the sequence of gene GH1 different from the SNPs of the map control. Within these changes, 11.3% correspond to precise changes in an amino acid (1% of the total of index patients). 3. The expression of GH1 in leukocytes of controls is neither constitutive nor constant as far as the observed variants of splicing. This methodology does not allow detecting without doubt the mutations in patients. However, it has allowed us to confirm the expression of mutants as in the case of a predicting substitution of change in amino acid, as well as discarding or confirming anomalies of splicing in carrying alleles of intronic changes. 4. The use of computer tools has allowed us to make a theoretical approach to the effect that two changes in amino acid (Phe25Tyr and Val173Leu) in protein GH have on their structure and interaction with GHR. The homology analysis of mutant proteins with those of the other genes of the cluster of the GH has allowed us to conclude that the Phe25Tyr substitution can have been generated by genic recombination with gene GH2, whereas it is not the case for the protein with the Val173Leu change. 5. The recombinant proteins obtained in the laboratory (WT and mutants) have been suitable for their study in vitro (inmunoreactivity, cellular proliferation and bioactivity). 6. The mutant GHs Phe25Tyr and Val173Leu show a diminished inmunoactivity and bioactivity. The cellular models of lines HepG2 and C-28/I2 have not allowed us to obtain results; in contrast, the model of primary culture of human foetal chondrocytes has allowed us to detect that the two mutant GHs stimulate with smaller intensity the IGF1 transcription and they cause an increase in the expression of GHR and IGF1R. 7. The change of Phe25Tyr amino acid incorporated in one allele of GH1 taken to heterozygosity by two non-related families is shown as growth delay during childhood accompanied by deficiency secretion answer of GH and diminution of IGF1. The response to the treatment with GH is suitable and allows us to recommend the treatment until the end of the growth. The Val173Leu change detected in a patient with short stature and RIUC, without apparent GH deficiency, allows us to suggest that precocious detection of mutations in gene GH1 when the secretion pretends to be normal, would allow a precocious treatment that would have improved its prognosis of final stature. The analysis of the complete haplotypes of GH1 allows us to interpret the effect of the combination of mutations in the protein with the genotypes for the SNPs.

El sistema de fosforilació oxidativa mitocondrial (OXPHOS) genera la major part de l'energia que requereixen les cèl·lules eucariotes. Però també és la font principal de producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS).Les malalties mitocondrials degudes a mutacions en el DNA mitocondrial (mtDNA) afecten a polipèptids estructurals del sistema OXPHOS, caracteritzant-se per dèficits en la producció d'energia. Però altres factors deuen estar implicats amb l'àmplia manifestació fenotípica amb la que es manifesten aquestes patologies. L'objectiu del treball era determinar si les mutacions en el mtDNA indueixen la generació de ROS. Es diagnosticaren sis pacients portadors de les mutacions en el mtDNA A3243G, A8344G, G6930A, G5703A, G12334A i T14484C. A partir dels pacients portadors de la mutació en sang, es generaren línies de cíbrids transmitocondrials, on s'analitzà el sistema antioxidant com a indicador de la producció de ROS i de la capacitat detoxificadora cel·lular.Estudiàrem les activitats superòxid dismutasa, les activitats glutatió peroxidasa, i l'activitat catalasa en les línies portadores de les mutacions A3243G en el tRNALeu(UUR) (MELAS), la A8344G en el tRNALys (MERRF), i la G6930A en la subunitat I de la COX. Ambdues línies portadores de mutacions en tRNAs, MELAS i MERRF, presentaren totes les activitats antioxidants activades, suggerint que aquestes mutacions indueixen la producció de ROS. Aquest augment d'activitat es devia a un increment en els nivells protèics en els enzims superòxid dismutasa, però no en la catalasa. En canvi, en la línia portadora de la mutació G6930A (COX-I) no observàrem augment significatiu de cap de les activitats dels enzims antioxidants estudiats, resultats que suggeriren que dita mutació no indueix generació d'espècies reactives d'oxigen.Els resultats obtinguts suggereixen que les mutacions del mtDNA que afecten als complexos productors de ROS a la mitocòndria, els complexos I i III, indueixen la generació de ROS (com és en el cas de les cèl·lules MELAS i MERRF). L'estrés oxidatiu deu ser més important en algunes mutacions que en altres, i probable moduli el fenotip d'algunes mutacions en el mtDNA.

La expresión de HER1 y HER2 (dos miembros de la familia de receptores con actividad quinasa de tirosinas HER) está alterada en diversos tumores de origen epitelial, entre ellos el cáncer de mama donde se correlacionan con un peor pronóstico. Consecuentemente, HER1 y HER2 están siendo exhaustivamente estudiados, tanto desde el punto de vista de la biología del cáncer como desde el punto de vista terapéutico. De hecho, se han desarrollado distintos fármacos dirigidos contra estos receptores, como por ejemplo Iressa, un compuesto sintético de bajo peso molecular que inhibe específicamente la quinasa de tirosinas de HER1. Otro ejemplo es Herceptin, un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra el ectodominio de HER2.En la primera parte de esta Tesis hemos explorado el espectro de actividad y el potencial terapéutico de Iressa. Para ello hemos investigado los efectos del Iressa sobre un panel de líneas celulares humanas de cáncer de mama, seleccionadas en base a sus niveles de expresión de HER1 y HER2. Como era predecible, nuestros hallazgos mostraron que Iressa inhibe el crecimiento de células con niveles elevados de expresión de HER1. Sin embargo, sorprendentemente, observamos que Iressa también inhibe el crecimiento de células, como las BT-474, que tienen bajos niveles de HER1 pero que sobreexpresan HER2. Además en esta línea celular, Iressa inhibe la activación de las vías de transducción de señal activadas por el EGF (un ligando que se une al EGFR) o la heregulina (un ligando que se une a HER3 y HER4 pero no a HER1 y HER2). Nuestros datos demuestran que Iressa bloquea esta activación mediante un mecanismo doble. Por un lado, Iressa inhibe directamente la quinasa de tirosinas de HER1; por otro, impide la formación de heterodímeros HER2/HER3 mediante el secuestro de los receptores HER2 y HER3 en heterodímeros inactivos HER1/HER2 y HER1/HER3. Conjuntamente, estos hallazgos desvelan un nuevo mecanismo de acción de los inhibidores de la quinasa de HER1 y sugieren que Iressa podría tener utilidad terapéutica para el cáncer de mama no solo en pacientes que presentan niveles elevados de HER1 sino también en pacientes cuyos tumores sobreexpresen HER2.En la segunda parte de esta Tesis hemos profundizado en la biología de los CTFs (Carboxy-Terminal Fragments, Fragmentos Caborxilo-Terminales). Los CTFs son una forma truncada de HER2 que se detecta en el 25% de las muestras de pacientes con cáncer de mama. De acuerdo a su movilidad electroforética, los CTFs contienen el dominio citoplasmático de HER2 incluyendo su dominio tirosina quinasa. Recientemente se ha demostrado que los CTFs correlacionan con metástasis en los ganglios linfáticos y peor pronóstico. A pesar de esto, el mecanismo de generación de estos CTFs y su posible papel en cáncer se desconocía.En este trabajo demostramos que los CTFs se generan mediante inicio alternativo de la traducción a partir de las metioninas 611 y 687 de HER2. Dichas metioninas están situadas justo delante y detrás del dominio transmembrana, respectivamente. Los CTFs están fosforilados y tienen actividad quinasa in vitro. Se localizan en el citoplasma y núcleo de las células que los expresan, tanto en cultivos celulares como en muestras de pacientes con cáncer de mama. Finalmente, mostramos que la inyección subcutánea de células que sobreexpresan los CTFs en ratones atímicos da lugar a tumores que son resistentes al tratamiento con Herceptin, pero que responden a inhibidores de la quinasa de tirosinas de HER2.Dado que un 60% de los pacientes con cáncer de mama que sobreexpresan HER2 (candidatos al tratamiento con Herceptin) sobreexpresan también los CTFs, nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión de los CTFs en estos pacientes pueda tener un papel en la resistencia que se desarrolla al tratamiento con Herceptin. / The HER1 and HER2 are frequently overexpressed in breast cancer, and their overexpression is associated with a more aggressive clinical behavior. As a consequence, different compounds targeting these receptors have been developed as a fruitful approach to the therapy of breast cancer. One example is Iressa, an oral nonpeptide compound that selectively inhibits the TK activity of HER1; or Herceptin, a monoclonal antibody that targets HER2. To characterize the potential role of Iressa in the treatment of breast cancer, we have studied its effects in a variety of breast carcinoma cell lines expressing different levels of HER1 and HER2 receptors. Our studies demonstrate that Iressa, despite being a specific inhibitor of the EGFR TK, is a potent inhibitor of HER2-over expressing breast cancer cells. We have demonstrated that these effects are explained by a novel and double mechanisms of action. Iressa inhibits the quinase activity of HER1 in one hand and promotes the formation of inactive (unphosphorylated) HER1/HER2 and HER2/ HER3 heterodimers on the other. In the second part of this work we have characterized the CTFs (Carboxi-terminal fragments) of HER2, a truncated form of the HER2 receptor encoding its cytoplasmic domain. CTFs are frequently found in human mammary tumors and associate with nodal metastasis and poor prognosis. However the mechanism of generation is not understood. Here we show that HER2 CTFs are generated by alternative initiation of translation from methionines located near the transmembrana domain of the full-length molecule. In vitro and in vivo, HER2 CTFs are found in the cytoplasm and nucleus. Expression of HER2 CTFs induces the growth of breast cancer xenografts in nude mice. Tumors dependent on CTFs are sensitive to inhibitors of the kinase activity but do not respond to Herceptin. Thus, the kinase domain seems necessary for the activity of HER2 CTFs and the presence of the CTFs could account for the resistance to treatment with Herceptin.

ANTECEDENTS:L'ApoA-II és la segona proteïna més abundant en l'HDL. La proteïna transferidora d' èsters de colesterol (CETP) actúa intercanviant èsters de colesterol per triglicèrids entre les partícules d'HDL i les lipoproteïnes que contenen apoB. El transportador ABCA1 és una proteïna reguladora del flux de colesterol. El transportador ABCG5-G8 és una proteïna reguladora de l'excreció biliar. Totes aquestes son proteïnes que intervenen en la estructura i metabolisme de l'HDL, però es desconeix el seu paper en el transport revers de colesterol específic de macròfags (TRC). HIPÒTESI DEL TREBALL:Estudis clínics i epidemiològics han demostrat l'existència d'una relació inversa entre la concentració en plasma de colesterol HDL i el risc de patir malalties cardiovasculars aterotrombòtiques. Aquest efectes cardioprotectors son atribuïts al paper de l'HDL en el TRC, i especialment el transport revers de colesterol específic de macròfags. L'expressió i/o inactivació selectiva de gens en ratolins ha permès d'obtenir una valuosa informació sobre el paper fisiològic d'aquestes proteïnes involucrades en aquest mecanisme potencial de prevenció de l'aterogènesi per part de les HDL. Així la modificació d'aquestes proteïnes en ratolins modificats genèticament ens permetrà estudiar com afecta el TRC i explicar així el paper aterogènic d'aquests ratolins.CONCLUSIONS:Del primer article vam concloure que malgrat la deficiència d'HDL que presentaven els ratolins transgènics d'apoA-II humana, el TRC des de macròfags a femtes in vivo funcionava de forma efectiva. Els nostres resultats també suggereixen que l'augment de les lesions arterioscleròtiques trobades en els ratolins transgènics d'apoA-II alimentats amb dieta rica en greixos no són degudes al bloqueig del TRC específic de macròfags. Resultats previs suggereixen que l'apoA-II podria exercir el seu efecte proaterogènic reduint les propietats antioxidants de l'HDL.Del segon article vam concloure que la deficiència del transportador ABCA-1 en ratolins knockout reduïa el TRC específic de macròfags in vivo. Aquest resultats demostren la importància d'ABCA-1 en aquesta funció antiaterogènica de les HDL i, demostren la possible relació entre la disminució del TRC depenent de macròfags i l'augment de la susceptibilitat a l'arteriosclerosi.Del tercer article vam concloure que l'expressió de CETP de macaco o humana en ratolins transgènics no afectava al TRC específic de macròfags in vivo ni les propietats antioxidants de l'HDL. L'efecte proaterogènic de l'expressió de CETP en ratolins sembla doncs degut a mecanismes independents d'aquestes dues funcions antiaterogèniques de les HDL.I finalment, en l'últim article vam concloure que la deficiència del transportador ABCG5/G8 en ratolins knockout no alterava el TRC des de macròfags a femtes in vivo. Tanmateix, l'expressió ABCG5/G8 és necessària per a la inducció del TRC específic de macròfags induït pels agonistes de LXR. Els nostres resultats donen suport a la hipòtesi que aquests transportadors tenen un paper determinant en la fase final d'aquesta via i els confirmen com a dianes moleculars de gran interès per a prevenir o tractar l'arteriosclerosi. / Epidemiological studies have demonstrated that increased HDL is a protective factor against atherosclerotic cardiovascular disease. The evaluation of antiatherogenic functions of HDL is an important area of research which includes the role of HDL in reverse cholesterol transport (RCT), especially macrophage-specific RCT, and its antioxidant and antiinflammatory roles.The development of transgenic and knockout mice provides us a lot of information about the role of some proteins that are important in these potencial antiatherogenic mechanisms.We studied four proteins that are important in the HDL metabolism: apoA-II is the second major HDL protein. The action of CETP results in a heteroexchange between HDL cholesteryl ester and VLDL- or chymolicron -triglycerides. The ABCA-1 transporter is a protein that regulates the cholesterol efflux. The ABCG5/G8 transporter is a crucial protein for hepatobiliary and intestinal sterol excretion. Thus, the modification of these proteins in genetical modified mice and the development of a new strategy to mesure the macrophage-specific RCT in vivo permit us to know the atherogenic role of these mice. We concluded that human apoA-II maintains effective RCT from macrophages to feces in vivo despite an HDL deficiency. These findings suggest that the increased atherosclerotic lesions observed in apoA-II transgenic mice fed an atherogenic diet are not due to impairment in macrophage-specific RCT. The results of the study with ABCA-1 knockout mice provide definitive in vivo evidence of the crucial role of ABCA1 in macrophage-specific RCT. This fact may also indicate, together with previous works, that ABCA1 exerts, at least in part, its antiatherogenic effect by promoting macrophage-specific RCT. The CETP overexpression in transgenic mice does not affect RCT from macrophages to feces in vivo or the protection conferred by HDL against LDL oxidative modification. Finally, the results of the study with ABCG5/G8 demonstrate that the presence of ABCG5/G8 transporters is required for LXR-mediated induction of macrophage-specific RCT, and support the hypothesis that these transporters play a key role in the final step of this pathway. These data also suggest that upregulation of ABCG5/G8 may be an effective strategy to increase macrophage-specific RCT and reduce atherosclerosis.