Orientador: Bruno Geloneze Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T03:40:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MariaSaude_M.pdf: 4379495 bytes, checksum: b6a2152a8da2c7dc1bd4d9f45131cba5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Objetivo: Estimar o impacto do envelhecimento e do diabetes na sensibilidade à insulina, função da célula beta, adipocitocinas e produção de incretina Métodos: Foram realizados clamps hiperglicêmicos, testes de arginina e testes de refeição padrão em 50 pacientes não obesos para medir a sensibilidade à insulina e secreção de insulina, assim como os níveis plasmáticos do glucagon, GLP-1 e GIP. Os pacientes com diabetes e do grupo controle saudáveis foram divididos nos seguintes grupos: meia idade com diabetes tipo 2 (MI-DM2), idosos com diabetes tipo 2 (I-DM2), meia idade ou idosos com tolerância normal à glicose (MI-TNG, I-TNG). Resultados: A sensibilidade à insulina (SI), determinada pelo modelo de avaliação da homeostase, taxa de infusão de glicose e pela sensibilidade à insulina a glicose oral, foi reduzida no grupo de idosos e nos grupos com DM2, comparados com o grupo de meia idade com tolerância normal à glicose, mas foi similar no grupo MI-DM2 e grupo I-DM2. O índice insulinogênico, a primeira e segunda fase de secreção de insulina e o índice de disposição, com exceção da resposta da insulina à arginina, foram reduzidos com o envelhecimento e nos grupos com DM2. A produção pós-prandial média de glucagon no tempo total de 0 - 180 minutos foram maiores no grupo de DM2 comparado ao grupo de TNG, sendo que na primeira hora da produção de glugagon o grupo de I-DM2 apresentou uma média mais elevado em relação ao grupo de MI-DM2. Embora a produção de GLP-1 tenha sido reduzida no grupo I-DM2, nenhuma diferença entre os grupos foi observada em relação à produção de GIP. Conclusão: O diabetes e o envelhecimento desencadearam uma redução da sensibilidade à insulina em pacientes não obesos. A produção de insulina foi reduzida com o envelhecimento e exacerbada pela condição do diabetes. As deficiências associadas ao envelhecimento se sobrepõe a fisiopatologia do diabetes, particularmente relacionada à produção de GLP-1. Por outro lado, a secreção de insulina independente da glicose foi preservada. O entendimento desta complexa relação entre envelhecimento e diabetes poderia ajudar no desenvolvimento de terapias farmacológica baseada em fisiopatologia / Abstract: Objective: To estimate the impact of aging and diabetes on insulin sensitivity, beta-cell function, adipocytokines, and incretin production. Methods: Hyperglycemic clamps, arginine tests and meal tolerance tests were performed in 50 non-obese subjects to measure insulin sensitivity (IS) and insulin secretion as well as plasma levels of glucagon, GLP-1 and GIP. Patients with diabetes and healthy control subjects were divided into the following groups: middle-aged type 2 diabetes (MA-DM), elderly Type 2 diabetes (E-DM) and middle-aged or elderly subjects with normal glucose tolerance (MA-NGT or E-NGT). Results: IS (insulin sensitivity), as determined by the homeostasis model assessment glucose infusion rate and oral glucose insulin sensitivity, was reduced in the aged and DM groups compared with MA-NGT, but similar in MA-DM and E-DM groups. Insulinogenic index, first and second phase of insulin secretion and the disposition indices, except insulin response to arginine, were reduced in the elderly and DM groups. The average postprandial glucagon production on the interval of 0-180 min was higher in DM groups compared to NGT groups, furthermore noticed that in the first hour of glucagon secretion, group E-DM had a higher average value compared to group MA-DM. Whereas the GLP-1 production was reduced in A-DM, no differences between groups were observed in GIP production. Conclusions: In non-obese subjects, diabetes and aging impair insulin sensitivity. Insulin production is reduced by aging, and diabetes exacerbates this condition. Aging associated defects superimposed diabetic physiopathology, particularly regarding GLP-1 production. On the other hand, the glucose-independent secretion of insulin was preserved. The knowledge of the complex relationship between aging and diabetes could support the development of physiopathological and pharmacological based therapies / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Ciências

Les ganglions de la base (GB) forment un réseau de structures sous-corticales impliquées dans la motricité volontaire, mais aussi dans des aspects plus cognitifs et motivationnels du comportement moteur. La dopamine est un neuromodulateur essentiel au bon fonctionnement de ce réseau. La synapse cortico-sous-thalamique (cortico-NST) est une synapse glutamatergique (excitatrice) transmettant les informations corticales au noyau sous-thalamique (NST), ce qui forme la première partie d’une des trois voies des GB : la voie hyperdirecte. La voie cortico-NST est impliquée dans des tâches de type « go-no-go » (arrêt d’un acte moteur débuté) et dans les effets bénéfiques de la stimulation cérébrale profonde du NST sur les symptômes de la maladie de Parkinson. Cependant, les propriétés des synapses cortico-NST ne sont pas connues. Ce manque d’informations provient, en partie, de l’anatomie particulière de cette voie, qui rend l’étude in vitro de la synapse cortico-NST difficile. L’utilisation de l’optogénétique nous a permis de contourner ce problème. En associant cette technique à l’électrophysiologie sur tranches de cerveaux de rongeur, nous avons mis en évidence un effet inhibiteur des récepteurs dopaminergiques D5 sur la transmission cortico-NST. Nous montrons également que les propriétés de plasticité à court terme de cette synapse lui permettent de réduire l’influence des messages corticaux à haute fréquence sur le NST. Les résultats obtenus au cours de cette thèse montrent que l’optogénétique est un bon moyen d’étudier la synapse cortico-NST in vitro et contribuent à améliorer la compréhension des propriétés de la cette synapse. / Basal ganglia (BG) are a group of subcortical nuclei involved in action selection and in cognitive and motivational aspects of motor behavior. Dopamine is essential for proper functioning of BG. The cortico-subthalamic (cortico-STN) synapse is a glutamatergic (excitatory) synapse involved in signal transmission from cortex to subthalamic nucleus (STN). The cortico-STN synapse is the first synapse in the hyperdirect pathway, one of the three pathways of BG. Even if the cortico-STN pathway is involved in “go-no-go” tasks (stopping of an already started motor act) and in the beneficial effects of the high frequency stimulation of the STN on Parkinsonian symptoms, properties of the cortico-STN synapse are not well described. The lack of data is due, at least in part, to the specific anatomy of the cortico-STN pathway which does not allow the use of standard methods in vitro. The use of optogenetics allowed us to circumvent this issue. By coupling this approach with electrophysiology on brain slices in rodents, we show that dopaminergic D5 receptors stimulation reduces glutamatergic transmission at cortico-STN synapses. We also show that short-term plasticity properties of this synapse reduce the influence of high frequency cortical inputs on the STN. Our findings indicate that optogenetics enables studying the cortico-STN synapse in vitro and contributes to improving our knowledge of the properties of the synapse.

Die vorliegende Dissertation verfolgt das Ziel, die von Nervenzellen maximal erreichte Signalrate zu bestimmen. Außerdem werden die bislang weitgehend unbekannten Anpassungen einer Synapse an die Anforderungen hochfrequenter Signalübertragung untersucht. Die maximale Übertragungsrate spielt im zentralen Nervensystem eine wichtige Rolle für die Codierung und Verarbeitung von Informationen. Neben den Grundlagen der synaptischen Übertragung und der neuronalen Informationscodierung werden in der Einleitung die anatomischen Gegebenheiten der Kleinhirnrinde und der Moosfaser-Körnerzell-Synapse vorgestellt. Präsynaptische patch-clamp-Messungen von Moosfaserboutons und die erstmals durchgeführten Messungen von präsynaptischen Boutons und postsynaptischen Körnerzellen („Paarableitungen“) werden erläutert. Mit Hilfe dieser Methoden wird gezeigt, dass die Kommunikation zwischen Nervenzellen mit Raten von bis zu einem Kilohertz stattfinden kann. Hierbei ist die präsynaptische Freisetzung von Botenstoffen schneller und effizienter als bisher bekannt. Ein einzigartiges Repertoire präsynaptischer Mechanismen wird charakterisiert und bildet die Grundlage der nachgewiesenen, hochfrequenten Informationsübertragung.:Abbildungsverzeichnis .......................................................................................... III Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ IV 1 Bibliographische Zusammenfassung .......................................................... 1 2 Einführung ..................................................................................................... 2 2.1 Der cerebelläre Cortex und die Moosfaser-Körnerzell-Synapse ............... 2 2.2 Grundlagen der synaptischen Übertragung .............................................. 5 2.3 Informationscodierung im Nervensystem .................................................. 6 2.4 Etablierung von Ableitungen an der Moosfaser-Körnerzell- Synapse .................................................................................................... 9 2.5 Quellen der Einführung ........................................................................... 13 3 Ziele der Arbeit ............................................................................................ 16 4 Publikationsmanuskript .............................................................................. 16 5 Zusammenfassung ...................................................................................... 29 6 Anlagen ........................................................................................................ 34 6.1 Supplemental Material ............................................................................ 34 6.2 Erklärung über den wissenschaftlichen Beitrag des Promovenden zur Publikation ............................................................................................... 54 6.3 Selbstständigkeitserklärung .................................................................... 55 6.4 Lebenslauf ............................................................................................... 56 6.5 Publikationen ........................................................................................... 58 6.6 Danksagung ............................................................................................ 59

Kardiovaskuläre Erkrankungen in Deutschland führen die Todesursachenstatistik an (19,1 % 2013) und verursachen die höchsten Krankheitskosten (14,5 % 2008) (Statistisches Bundesamt, 2015a,b). Im Rahmen von ischämischen Ereignissen am Herzen kann es zu Rhythmusstörungen kommen. In der Therapie dieser Störungen werden traditionell klassische Antiarrhythmika mit Wirkort Ionenkanal eingesetzt, welche jedoch stets ein proarrhythmisches Potenzial aufweisen. Im Fokus der Forschung der letzten Jahre stehen deswegen Peptide wie AAP10 (Antiarrhythmisches Peptid 10), welche direkt an den Gap Junctions ansetzen. In Radioligandenbindungsstudien konnte gezeigt werden, dass Desipramin AAP10 von seinem Rezeptor verdrängen kann. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Desipramin auf die Gap Junction-Leitfähigkeit in adulten humanen atrialen Kardiomyozyten bestimmt (Jozwiak 2012). Die Bestimmung der Leitfähigkeit erfolgte durch die Technik des Double-Cell-Voltage-Clamp. Es konnte gezeigt werden, dass Desipramin die elektrische Kopplung in humanen Kardiomyozyten, welche vorab durch CO2-induzierte Azidose partiell entkoppelt wurden, erhöht. Weiterhin wurde in der Mapping-Analyse mit dem Langendorff-System gezeigt, dass Desipramin in ischämischen Gebieten am ganzen Kaninchenherzen eine Reduktion der Homogenität und eine Steigerung der Dispersion verhindern kann. In anschließend hergestellten Western Blots aus Gewebeproben derselben Kaninchenherzen ließ sich eine verminderte Dephosphorylierung von Connexin 43 in ischämischen Gebieten unter Desipramin nachweisen. Ebenso vermag Desipramin eine Lateralisierung des Connexin 43 entlang der Zellmembran zu verhindern. Die Ergebnisse zeigen, dass Desipramin die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von Herzrhythmusstörungen unter ischämischen Bedingungen signifikant verringern und damit möglicherweise zur Senkung der Morbidität und Mortalität von Herzkreislauferkrankungen beitragen kann.

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La locomotion spontanée a une forte influence sur l’état du réseau hippocampique et joue un rôle crucial lors de l’intégration de l'information spatiale. Différents états d'attention ou de comportement au cours de l'éveil peuvent modifier la réponse des neurones aux stimuli sensoriels ainsi que les performances dans les tâches associées. Au cours du mouvement (mov.) le potentiel de champ local de l’hippocampe est caractérisé par des oscillations de fréquence thêta et les cellules pyramidales (CPs) présentent une décharge spécifique à la localisation de l'animal dans un environnement donné. Cependant, les déterminants intracellulaires liés à l'activation des cellules pyramidales de CA1 pendant du mov. sont peu connus. Dans ce travail de thèse, nous avons enregistré le potentiel de membrane (Vm) des CPs de CA1 chez des souris qui alternaient spontanément entre des périodes de mov. et des périodes d’immobilité lors d’une tâche de navigation spatiale virtuelle. Nous avons trouvé une modulation opposée du Vm entre les CPs de CA1 qui déchargeaient de manière régulière par rapport à celles qui déchargeaient en bouffées de potentiels d’action. Les cellules qui déchargeaient de manière régulière étaient plus dépolarisées et déchargeaient plus pendant le mov.comparé à l’immobilité. Les cellules déchargeant en bouffées de potentiels d’action, préférentiellement inhibées pendant les sharp wave-ripples, étaient hyperpolarisées de façon dépendante à la vitesse pendant le mov.. Cette inhibition dépendante de la vitesse pourrait permettre d’augmenter le rapport signal sur bruit afin de coder l’information spatiale de manière plus efficace pendant le mov.. / Spontaneous locomotion strongly influences the state of the hippocampal network and is critically important for spatial information coding. In neocortex, different attentional or behavioral states during arousal can modify neurons responses to sensorial stimuli and associated task performance. During locomotion, the local field potential of the hippocampus is characterized by theta frequency oscillations (5-12 Hz) and the pyramidal neurons present a specific discharge to the localization of the animal in environments. However, the intracellular determinants of CA1 pyramidal cells activation during locomotion are poorly understood. Here we recorded the membrane potential of CA1 pyramidal cells (PCs) while non-overtrained mice spontaneously alternated between periods of movement and immobility during a virtual spatial navigation task. We found opposite membrane polarization between bursting and regular firing CA1 PCs during movement. Regular firing CA1 PCs were more depolarized and fired at higher frequency during movement compared to immobility while bursting CA1 PCs, preferentially inhibited during sharp wave ripples, were hyperpolarized during movement in a speed dependent manner. This speed-dependent suppression of a subpopulation of CA1 PCs could enhance signal to noise ratio for efficient spatial coding during locomotion.

Mikrobielle Rhodopsine sind lichtsensitive Proteine, die von Mikroorganismen exprimiert werden um Licht wahrzunehmen oder dessen Energie zu nutzen. Ionen-transportierende mikrobielle Rhodopsine begründeten das Feld der Optogenetik. Hier erlauben sie transmembrane Ionenflüsse lichtsensitiv zu machen und neuronale Aktivität mit Licht zu steuern. Eine zielführende Nutzung beruht auf ihrer molekularen Charakterisierung, um sie dem Experiment anzupassen und es sinnvoll zu entwerfen. Teil I der Arbeit beschäftigt sich mit dem rotverschobenen Kanalrhodopsin ReaChR. Obwohl es mit breitem, nicht gaussförmigen Aktionsspektrum mit maximalen Strömen um 600 nm publiziert wurde, zeigte das Blitzlichtspektrum hier maximale Aktivität bei 535 nm ohne Besonderheiten. Mit steigender Intensität und längeren Pulsen verbreiterte sich das Spektrum; sehr ähnlich zum publizierten Spektrum. Dieses einzigartige Verhalten wird durch sekundäre Photochemie erklärt, welche zu einem komplexen Photozyklus mit lichtinduzierten Übergangen führt. Mutationen an Schlüsselpositionen wurden genutzt, um ReaChR über die publizierten Daten hinaus zu charakterisieren und neue Eigenschaften zu generieren. In Teil II wurde die auswärtsgerichtete Natriumpumpe KR2 elektrophysiologisch charakterisiert, was zuvor von schlechter Membranständigkeit in Säugetierzellen verhindert wurde. Ein verbessertes KR2 mit höherer Membranständigkeit und 60-fach größeren Photoströmen erlaubte Selektivitätsmessungen, welche zeigten, dass der Strom von Natriumionen getragen wird, wohingegen nichts auf Protonentransport hindeutete. Bei ausreichender Substratkonzentration war der Strom anders als bei Chlorid- oder Protonenpumpen von der Membranspannung unabhängig. Die Expression in Mausneuronen ermöglichte die reversible Unterdrückung von Aktionspotentialen mit Licht, wobei der Ausstrom von Kationen einen komplementären Weg zur neuronale Aktivitätsunterdrückung bietet, wenn etablierte Werkzeuge schlecht oder nicht funktionieren. / Microbial rhodopsins are photosensitive proteins utilized by fungi, algae, and prokaryotes to sense light or harness its' energy. Ion transporting microbial rhodopsins initiated the field of optogenetics, where they are applied to render transmembrane ion fluxes light sensitive and control neuronal activity with light. Part I of the thesis focused on the electrophysiological characterization of the red-shifted channelrhodopsin ReaChR. Although published with a broad, non-Gaussian shaped action spectrum peaking around 600 nm, the flash action spectra of ReaChR recorded here had a maximum at 535 nm without peculiarities. Increasing intensities and prolonging illumination broadened the spectrum, which finally peaked around 600 nm. This unique behavior stems from pronounced secondary photochemistry leading to a complex photocycle with various light-induced transitions especially under constant illumination. Mutations at key positions like the central gate, DC-pair or counter ions were employed to characterize the properties of ReaChR beyond published data and engineer new features. In part II an electrophysiological characterization of the outward Na+ pump KR2 was pursued, which was hindered by poor membrane targeting in mammalian cells before. Engineering of eKR2 improved membrane targeting and lead to 60-fold larger photocurrents than in the wild type. Selectivity measurements revealed that the stationary photocurrent is primarily carried by sodium with no evidence for proton transport. At sufficient substrate concentration stationary photocurrents were independent of the membrane voltage distinguishing eKR2 from proton and chloride pumps. Finally, eKR2 reliably and reversibly inhibited action potential firing already at 0.5 mW/mm2 green illumination in cultured hippocampal mouse neurons. Inhibiting action potential firing through cation extrusion poses a complementary way of neuronal silencing in contexts where established tools are unfavorable or even impossible to use.

Ziel dieser Arbeit war die elektrophysiologische Charakterisierung des vor kurzem erstmals von NIESLER et al. (2003) klonierten humanen 5-HT3A+E-Rezeptors. Da dieser Rezeptor-Subtyp ausschließlich im Gastrointestinaltrakt exprimiert wird, ist ein Einfluss auf Nausea und Emesis sehr wahrscheinlich. Es stellt sich demnach die Frage, ob funktionelle Unterschiede zum homomeren 5-HT3A-Rezeptor und zum heteromeren 5-HT3A+B-Rezeptor bestehen, und ob auf molekularer Ebene unterschiedliche Wirkungen emetogener bzw. antiemetischer Pharmaka festzustellen sind. Um die Wirkmechanismen und die Interaktionen eines Pharmakons mit den 5-HT3-Rezeptor-Subtypen beurteilen zu können, erfordert dies genaue Kenntnisse über das biophysikalische Verhalten und die pharmakologische Sensitivität der 5-HT3-Rezeptor-Untereinheiten. Die Experimente erfolgten in-vitro an heterolog in HEK293-Zellen exprimierten Rezeptoren, wobei alleinig die 5-HT3A-Untereinheit in der Lage ist, funktionelle homopentamere Rezeptoren auszubilden. Die 5-HT3E- und 5-HT3B-Untereinheiten können nur zusammen mit der 5-HT3A-Untereinheit an die Zelloberfläche exprimiert werden und funktionelle heteropentamere Rezeptoren bilden. Im Verlauf der Untersuchungen hat sich herausgestellt, dass bei der Transfektion die 5-HT3E- und die 5-HT3B-Untereinheiten im Verhältnis zur 5-HT3A-Untereinheit signifikant schwächer exprimiert werden. Mittels der experimentellen Methode der Patch-Clamp Technik im „excised-patch“ („outside-out“)- und im Ganzzell-Modus war es möglich, die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften des heteromeren 5-HT3A+E-Rezeptors im Vergleich mit dem homomeren 5-HT3A-Rezeptor und dem heteromeren 5-HT3A+B-Rezeptor zu analysieren. Bei den Experimenten zur Grundcharakterisierung des humanen 5-HT3A+E-Rezeptor-Subtyps zeigte die Agonisten-Konzentrations-Wirkungskurve mit einem Hill-Koeffizienten von 1,0 einen deutlichen flacheren Verlauf als die Kurve des 5-HT3A-Rezeptor-Subtyps, die einen Hill-Koeffizienten von 1,5 aufwies. Dies spricht für eine geringe Agonisten-Bindungskooperativität des 5-HT3A+E-Rezeptors. Kein Unterschied zeigte sich allerdings in der Affinität zu 5-HT, da die EC50-Werte von beiden Rezeptor-Subtypen im Bereich von ca. 7 µM lagen. Aus dem biphasischen Verlauf der Kurve konnte der Rückschluss gezogen werden, dass bei der Transfektion des heteromeren 5-HT3A+E-Rezeptors der homomere 5-HT3A-Rezeptor parallel exprimiert wird. Dasselbe Verhalten wurde auch schon für den heteromeren 5-HT3A+B-Rezeptor beschrieben (WALSTAB et al. 2008). Bei der Charakterisierung eines heteromeren Rezeptor-Subtyps ergibt sich dadurch die Schwierigkeit, dessen Eigenschaften nicht eindeutig von denen des homomeren Rezeptors unterscheiden zu können. Des Weiteren konnte im Vergleich zum homomeren 5-HT3A-Rezeptor eine schnellere Desensibilisierungszeitkonstante des heteromeren 5-HT3A+E-Rezeptors nachgewiesen werden. Insgesamt deuten die beschriebenen Ergebnisse auf eine erhöhte Sensitivität des Rezeptors für Serotonin hin. Da der 5-HT3A+E-Rezeptor ausschließlich im Gastrointestinaltrakt exprimiert wird, könnte dies ein Hinweis auf eine Beteiligung dieses Rezeptors bei der Vermittlung von Emesis sein. Bei der pharmakologischen Charakterisierung wurden der partielle 5-HT3-Rezeptoragonist Tryptamin, der volle 5-HT3-Rezeptorantagonisten Tropisetron sowie die partiellen 5-HT3-Rezeptorantagonisten Metoclopramid, Tubocurarin, Mirtazapin und der Cannabinoid-Rezeptoragonist Anandamid, welcher eine emetogene Wirkung aufweist, untersucht. Auffällig war ein deutlich flacherer Verlauf der Konzentrations-Wirkungskurve von Metoclopramid (5-HT3A+E-Rezeptor: Hill-Koeffizient = -0,8; 5-HT3A-Rezeptor: Hill-Koeffizient = -1,2) und von Mirtazapin (5-HT3A+E-Rezeptor: Hill-Koeffizient = -0,9; 5-HT3A-Rezeptor: Hill-Koeffizient = -1,3) am heteromeren 5-HT3A+E-Rezeptor. Des Weiteren konnte für Mirtazapin am 5-HT3A+E-Rezeptor ein IC50-Wert von 8,4 nM im Vergleich zu 25,4 nM am 5-HT3A-Rezeptor festgestellt werden. Diese deutlich höhere Potenz von Mirtazapin am untersuchten heteromeren Rezeptor-Subtyp sowie die geringere Bindungskooperativität von Mirtazapin und Metoclopramid am 5-HT3A+E-Rezeptor, stellen einen interessanten Ansatz für eine effektive Pharmakotherapie gastrointestinaler Erkrankungen dar. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmalig auf molekularer Ebene, die elektrophysiologischen Eigenschaften der humanen 5-HT3A+E-Rezeptoren sowie deren Beeinflussung durch emetogenen und antiemetische Pharmaka. Aufgrund der schwachen Expression der 5-HT3E-Untereinheit gilt es in Zukunft durch einen alternativen Weg der Transfektion, die Effizienz der Ausbeute von 5-HT3A+E-Rezeptoren zu erhöhen. / The aim of this doctor thesis was the electrophysiological characterization of the human 5-HT3A+E receptor which was recently cloned for the first time by NIESLER et al. (2003). Since the expression of this receptor subtype takes place exclusively in gastrointestinal tract, an influence on nausea and emesis is very likely. The question is if functional differences exist between homomeric 5-HT3A receptors and heteromeric 5-HT3A+B receptors, and whether different effects from emetic and antiemetic drugs can be detected at the molecular level. To assess the mechanisms and the interactions of a drug with the 5-HT3 receptor subtypes, knowledge of the biophysical characteristics and the pharmacological sensitivity of the 5-HT3 receptor subunit is required. The experiments were developed in-vitro on heterologous expressed receptors in HEK293-cells, whereat only the 5-HT3A subunit is able to form functional homopentameric receptors. The 5-HT3E and the 5-HT3B subunit can only be expressed on the cell surface and build functional heteropentameric receptors in combination with the 5-HT3A subunit. In the course of the investigations it became obvious that during transfection the 5-HT3E subunit and the 5-HT3B subunit are significantly lesser expressed than the 5-HT3A subunit. Using the patch-clamp technique in the excised-patch (outside-out) and whole-cell configuration it was possible to analyse the pharmacological and biophysical properties of the heteromeric 5-HT3A+E receptor compared with the homomeric 5-HT3A-receptor and the heteromeric 5-HT3A+B receptor. During the characterisation of the human 5-HT3A+E receptor subtype, the agonist concentration-response curve with the hillslope of 1,0 showed a significant flatter course than the graph of the 5-HT3A receptor subtype with a hillslope of 1,5. This indicates a diminished agonist binding-cooperativeness of the 5-HT3A+E receptor. No difference could be detected in the affinity to 5-HT, since the EC50 values of both receptor-subtypes were at the range of 7 µM. The biphasic course of the graph showed that by transfection of the heteromeric 5-HT3A+E receptor the homomeric 5-HT3A-receptor is expressed parallel. The same properties were described also for the 5-HT3A+B receptor (WALSTAB et al. 2008). Therefore it is difficult to distinguish the properties of a homomeric receptor by characterisation of a heteromeric receptor subtype. Furthermore, a faster desensitization of the heteromeric 5-HT3A+E-receptor could be demonstrated in comparison to homomeric 5-HT3A-receptor. Overall, the results described above indicate an increased sensitivity to the receptor for serotonin. As the 5-HT3A+E receptor is expressed exclusively in the gastro-intestinal tract, this could be an indication of involvement of this receptor in the mediation of emesis. During the pharmacological characterisation the partial 5-HT3 receptor agonist tryptamine, the full 5-HT3 receptor antagonist tropisetron as well as the partial 5-HT3 receptor antagonists metoclopramide, tubocurarin, mirtazapin and the cannabinoid receptor agonist anandamide, which has an emetic effect, were examined. The agonist concentration-response curve of metoclopramide (5-HT3A+E receptor: hillslope = -0,8; 5-HT3A receptor: hillslope = -1,2) and of mirtazapin (5-HT3A+E receptor: hillslope = -0,9; 5-HT3A receptor: hillslope = -1,3) showed a significant flatter course at the 5-HT3A+E receptor. Mirtazapin has an IC50 value of 8,4 nM at the 5-HT3A+E receptor in comparison to 25,4 nM at the 5-HT3A receptor. This significant higher potency of mirtazapin at the heteromeric 5-HT3 receptor subtype and the decreased binding-cooperativeness of mirtazapin and meteclopramide at the 5-HT3A+E receptor represent interesting approaches for an effective pharmacotherapy for gastrointestinal diseases. For the first time the results of this thesis showed the electrophysiological properties of the human 5-HT3A+E receptors and their interference by emetic and antiemetic drugs on the molecular level. Due to the decreased expression of 5-HT3E subunit, the goal for the future is to find an alternative way of transfection which increases the rate of yield for the 5-HT3A+E receptors.

Le but de ce travail était d'étudier si la réponse à l'inhibition métabolique était la même dans des cellules cardiaques en provenance de différentes régions du ventricule, soit de la région sous-endocardique et de celle sous-épicardique. En deuxième lieu, nous voulions confirmer la participation de"l'inward rectifier" dans l'augmentation de la composante sortante du courant de fond en inhibition métabolique. Nous avons donc trouvé une hétérogénéité n'étant pas reliée à l'arrangement des cellules en couches. Le courant de"l'inward rectifier" participe à la réponse à l'inhibition métabolique avec le I[indice inférieur k-ATP]. L'augmentation de la composante sortante d'I[indice inférieur k1] contribue au raccourcissement du potentiel d'action en conditions de stress énergétique. Toutefois, l'impossibilité de retrouver les niveaux de courants initiaux au-delà de -50 mV, suggère que dans nos préparations, le courant chlore sensible à l'étirement pourrait être impliqué dans cette réponse. Des extrapolations en vue d'expliquer l'impact de ces résultats in vivo doivent être faites avec précaution, car les mécanismes y sont beaucoup plus complexes. --Résumé abrégé par UMI.

The subfornical organ (SFO) is a sensory circumventricular organ, lacking a proper blood-brain barrier. Neurons of the SFO are exposed directly to the ionic environment and circulating signaling molecules in the plasma, providing a unique window for communication of physiological status from the periphery to the central nervous system (CNS). The SFO is recognized as a key site for hydromineral balance, cardiovascular regulation and energy homeostasis. Neuropeptide Y (NPY) is a potent stimulator of food intake when released centrally, and has well-documented pressor effects when released peripherally. It has been demonstrated that the SFO expresses NPY receptors, however the effects of NPY on SFO neurons has never been investigated. The aim of this study was to determine the effects of NPY on the electrophysiological properties of SFO neurons dissociated from Sprague Dawley rats. Using whole cell patch clamp techniques in the current-clamp configuration, we report that 300 nM NPY caused 16% of SFO neurons to depolarize and 26% to hyperpolarize. The remaining neurons were insensitive to NPY. These effects were dose-dependent with a combined EC50 of 3.7 nM. Specific NPY receptor antagonists were applied, suggesting that the Y5 receptor predominately elicited a hyperpolarizing effect, while the Y1 receptor had a mixed response that was predominately hyperpolarizing, and the Y2 receptor had a mixed response that was predominately depolarizing. Using the voltage-clamp configuration, it was also observed that NPY caused an increase in the voltage-gated K+ current density as well as a shift in membrane activation of the persistent Na+ current, mediating the hyperpolarizing and depolarizing effects, respectively. These findings indicate that NPY elicits electrophysiological changes on SFO neurons, suggesting that the SFO is a key site of action for NPY in mediating energy regulation and/or cardiovascular output. / February 2017