Escherichia coli produit diverses entérotoxines thermolabiles et thermostables. STb est une toxine de faible poids moléculaire résistant à la chaleur chargée de la diarrhée chez les animaux de la ferme. Une étude antérieure a montré que les cellules ayant internalisé la toxine STb provoquent un dysfonctionnement de la barrière épithéliale par des changements dans les protéines des jonctions serrées (TJ). Ces modifications contribuent probablement à la diarrhée observée. Pour mieux comprendre le mécanisme de l'augmentation de la perméabilité intestinale, nous avons traité les cellules du côlon humain (T84) avec la toxine purifiée STb une fois que les cellules ont été récoltées et les protéines extraites. Après l'utilisation d'une solution contenant 1% de Nonidet P-40 (un détergent non dénaturant, non ionique), nous avons étudié la distribution de la claudine -1, une protéine majeure des TJs, responsable de l'imperméabilité de l'épithélium, entre la membrane (NP40-insoluble) et le cytoplasme (NP40-soluble). En utilisant l’immunoblot et la microscopie confocale, nous avons observé que le traitement des monocouches de cellules T84 avec STb induit la redistribution de la claudine-1. Après 24h, les cellules cultivées en milieu faible en Ca+ (5 uM) et traitées par STb, ont montré qu’environ 40 % de plus de la claudine-1 se sont délogées dans le cytoplasme par comparaison au contrôle. En passant d’un milieu faible à un milieu contenant des quantités physiologiques de Ca++ (1,8 mM) nous avons observé une augmentation du taux de claudine- 1 délogé, comme la délocalisation comparable et ce, après 6h. Un milieu supplémenté avec la même concentration de Mg++ ou Zn++ n'a pas affecté le taux de délogement comparé au milieu contenant une faible teneur en Ca++. En utilisant des anticorps anti-phosphosérine et anti-phosphothréonine, nous avons observé que la perte des claudines-1 de la membrane a été accompagnée par une déphosphorylation de cette protéine des TJs. Dans l'ensemble, nos résultats ont montré une importante redistribution de la claudine-1 dans les cellules traitées par la toxine STb. La perte de la claudine-1 phosphorylée de la membrane est susceptible d'être impliquée dans la perméabilité accrue observée. Les mécanismes par lesquels ces changements sont provoqués restent à élucider. / Enterotoxigenic Escherichia coli produce various heat-labile and heat-stable enterotoxins. STb is a low molecular weight heat-resistant toxin responsible for diarrhea in farm animals. A previous study demonstrated that cells having internalized STb toxin induce epithelial barrier dysfunction through changes in tight junction (TJ) proteins. These modifications contribute probably to the diarrhea observed. To gain insight into the mechanism of increased intestinal permeability we treated human colon cells (T84) with purified STb toxin after which cells were harvested and proteins extracted. Using a 1% Nonidet P-40 (a non-ionic, non-denaturing detergent)-containing solution we investigated the distribution of claudin-1, a major TJ protein responsible for the epithelium impermeability, between membrane (NP40-insoluble) and the cytoplasmic (NP40- soluble) location. Using immunoblot and confocal microscopy, we observed that treatment of T84 cell monolayers with STb induced redistribution of claudin-1. After 24h, cells grown in low Ca++-containing medium (5 μM) treated with STb, showed about 40% more claudin-1 in the cytoplasm compare to the control. Switching from low to physiological Ca++-containing medium (1,8 mM) increased the dislodgement rate of claudin-1, as comparable delocalization was observed after 6h. Medium supplemented with the same concentration of Mg++ or Zn++ did not affect the dislodgement rate compare to the low Ca++-containing medium. Using anti- phosphoserine and anti-phosphothreonine antibodies we observed that the loss of membrane claudin-1 was accompanied by dephosphorylation of this TJ protein. Overall, our findings showed an important redistribution of claudin-1 in cells treated with STb toxin. The loss of phosphorylated TJ membrane claudin-1 is likely to be involved in the increased permeability observed. The mechanisms by which these changes are brought about remain to be elucidated.

Un défi majeur en cancérologie est le traitement des tumeurs mammaires dites triple-négatives (ER-, PR-, HER2-). Elles sont le plus souvent résistantes aux traitements conventionnels et présentent un haut risque de récidive. De plus, l’absence de cibles thérapeutiques ne permet pas le développement de thérapie spécifique. 78% de ces tumeurs expriment faiblement la claudine 1 et sont de très mauvais pronostic. Cette protéine est impliquée dans l'adhérence des cellules entre elles et pourrait jouer un rôle suppresseur de tumeur dans les cancers mammaires. Dans ce contexte, nous étudions si sa réexpression pourrait être une piste de traitement. Au laboratoire, nous avons développé des dérivés de la famille des thiazolidinediones (TZD) qui stimulent l’expression de la claudine 1 et induisent l’apoptose des cellules cancéreuses mammaires. Les objectifs de ma thèse ont consisté 1) à déterminer l’implication de la claudine 1 dans l’effet pro-apoptotique de ces composés 2) à l’étude de leurs mécanismes d’action 3) évaluer si l’expression de la claudine 1 pourrait sensibiliser les cellules cancéreuses triple-négatives aux agents de chimiothérapie. Au cours de cette thèse, nous avons montré que la surexpression de la claudine 1 et le composé Δ2-TGZ induisent l’apoptose des cellules triple-négatives « claudin 1-low » MDA-MB-231 et Hs578T. De plus, la claudine 1 est impliquée dans l’effet pro-apoptotique de la Δ2-TGZ dans les cellules MDA-MB-231. Par ailleurs, nous avons démontré que les dérivés TGZ, la Δ2-TGZ et l’AB186, agissent de manière précoce en modifiant la morphologie des cellules suivie d’une réexpression de la claudine 1 membranaire et d’une inhibition de la migration cellulaire avant même d’induire la mort cellulaire par apoptose. De plus, la surexpression de la claudine 1 inhibe la migration cellulaire associée à la perte des fibres de stress et la formation des jonctions intercellulaires. Nous avons également montré que la réexpression de la claudine 1 sensibilise les cellules MDA-MB-231 à l’agent de chimiothérapie, le 5-FU. L’ensemble des résultats de thèse a permis de mieux comprendre le mécanisme d’action de la Δ2-TGZ et de l’AB186 sur les cellules cancéreuses mammaires mais aussi d’identifier la claudine 1 comme cible potentielle prometteuse dans les cellules triple-négatives « claudin 1-low » / A major challenge in oncology is the treatment of triple-negative breast cancer (ER-, PR-, HER2-) as no targeted therapy are available. These tumors present often a chemotherapy resistance and a higher relapse incidence. 78% of them do not express claudin 1 and display a poor prognosis. Claudin 1 is involved in cell-cell adhesion and may be a tumor suppressor gene in breast cancer. In this context, we study if claudin 1 re-expression could be a possible approach. In the laboratory, we developed derivatives thaziolidinediones (TZD) compounds, which increase claudin 1 expression and lead to apoptosis of breast cancer cells. The goals of my thesis is 1) to characterize the involvement of claudin 1 in their pro-apoptotic effect 2) to study their mechanism of action 3) to determine if claudin 1 could sensitize the TNBC cells to the chemotherapy agents. During my thesis, we showed that claudin 1 overexpression and the compound Δ2-TGZ induce apoptosis of TNBC « claudin 1-low » MDA-MB-231 and Hs578T cells. Claudin 1 is involved in the pro-apoptotic effect of Δ2-TGZ in MDA-MB-231 cells. Then, we demonstrated that Δ2-TGZ and AB186 lead to early action through a modification of cell morphology followed an expression of claudin 1 at the membrane and an inhibition of cell migration before the apoptosis process. In addition, claudin 1 overexpression decreases the cell migration through the loss of stress fibers and the formation of cell junctions. We showed that claudin 1 overexpression potentialize the pro-apoptotic effect of Δ2-TGZ in MDA-MB-231 cells. Finally, we observed that claudin 1 sensitize the MDA-MB-231 cells to 5-FU. In fine, our data allowed a better understanding of Δ2-TGZ and AB186 mechanism of action and identification of claudin 1 as a promising target in TNBC « claudin 1-low »

La découverte d’un candidat médicament repose sur l’identification de hits, présentant des propriétés physico-chimiques adéquates pour leur optimisation. Le criblage à haut débit et l’approche par fragments sont deux techniques couramment utilisées lors de cette étape d’identification et elles ont été mises en œuvre au cours de ma thèse dans le but de découvrir de nouveaux composés ciblant d’une part le complexe CD81/CLDN-1 pour empêcher l’entrée du virus de l’hépatite C (VHC) dans les hépatocytes et d’autre part EthR2, un régulateur transcriptionnel mycobactérien, afin de potentialiser l’activité d’un antituberculeux sur les souches résistantes de M. tuberculosis.Dans une première partie, un criblage à haut débit sur le complexe CD81/CLDN-1 a permis d’identifier des modulateurs en série thiéno[2,3-c]pyrazole. Ces composés ont été pharmacomodulés et un composé spécifique de l’étape d’entrée du VHC, non toxique et présentant une activité submicromolaire a pu être ainsi identifié. Cette sonde pharmacologique permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le processus d’entrée virale.Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés à la conception de nouveaux fragments dits privilégiés. Ainsi, le développement des voies de synthèse, sous irradiation micro-onde, de deux entités moléculaires, le noyau 1,4-benzodiazepine-2,5-dione et le noyau spirohydantoïne, nous a permis d’obtenir 34 composés originaux. Afin d’évaluer le potentiel de cette stratégie, une librairie virtuelle de fragments a été générée et son criblage in silico sur la protéine MDM2 a été effectué. La mesure in vitro de l’activité des hits identifiés permettra de valider l’intérêt de cette approche pour la découverte de nouveaux ligands ciblant les interactions protéine-protéine.Dans une troisième partie, des inhibiteurs d’un répresseur transcriptionnel mycobactérien impliqué dans la potentialisation de l’activité de l’éthionamide ont été développés. A l’issue d’un criblage de 960 fragments, l’identification d’un hit en série tropinone, et sa cocristallisation avec la protéine EthR2, a permis d’entamer une optimisation rationnelle qui a conduit à l’obtention rapide de composés présentant de meilleures activités. / The discovery of drug candidates is based on the identification of hits with appropriated physico-chemical properties for further development. High throughput screening and fragment-based drug discovery approaches are two strategies commonly used for this identification. These strategies were applied during my PhD research work for identifying not only new modulators of the CD81/CLDN-1 complex to prevent entry of the Hepatitis C virus (HCV) into hepatocytes but also inhibitors of the mycobacterial transcriptional repressor, called EthR2, to boost ethionamide antibacterial activity against resistant strains of M. tuberculosis.Firstly, a high throughput screening assay was developed to identify molecules bearing a thieno[2,3-c]pyrazole scaffold that modulate the CD81/CLDN-1 complex. The structure-activity relationships allowed us to design and synthesize one non-toxic compound that inhibits viral entry with an IC50 in the submicromolar range. This best analog will be used as pharmacological tool to understand the molecular mechanism involving the CD81/CLDN-1 interaction during virus entry.Secondary, we worked on the design and synthesis of a new generation of fragments called privileged fragments. We focused our interest on the 1,4-benzodiazepine-2,5-dione and spirohydantoin scaffolds and using microwave-assisted conditions 44 original privileged fragments have been synthesized. To further illustrate the potential of our privileged fragments, a virtual focused library has been generated and screened in silico on MDM2 protein. The in vitro evaluation of the identified hits will allow us to validate our approach and to show the potential of our privileged fragments for the discovery of new hits against protein-protein interactions.Finally, inhibitors of a new mycobacterial transcriptional repressor involved in the boosting of ethionamide activity have been developed. Screening of 960 fragments allowed us to identify a hit bearing a tropinone scaffold which was cocrystallized with EthR2. A rational design from this cocrystal structure led rapidly to more potent ligands.