Les bicycles peptidiques possèdent des propriétés structurales et pharmacologiques très attrayantes pour le développement de composés bioactifs et sont d’excellents candidats pour la création de chimiothèques visant la découverte d’agents thérapeutiques. Ce type de structure se retrouve dans de nombreux produits naturels démontrant des activités biologiques très variées. Malgré leur grand potentiel, peu d’approches synthétiques efficaces et donnant accès à une grande diversité moléculaire ont été décrites jusqu’à maintenant dans la littérature. Ce mémoire décrit le développement d’une nouvelle approche synthétique sur support solide utilisant la réaction multicomposante de Ugi-Smiles pour préparer des bicycles peptidiques inspirés du Bouvardin et de ses analogues, une famille de produits naturels des plantes Rubiaceae avec des activités anticancéreuses et antimicrobiennes. L’approche présentée donne accès à des systèmes bicycliques complexes et permet l'introduction d’une grande diversité moléculaire. Dans un premier temps, la réaction de Ugi-Smiles a été utilisée pour simultanément ancrer et coupler les deux premiers acides aminés à une résine par leur chaîne latérale. Une étude sur les réactifs et les paramètres a permis d’effectuer les ajustements fonctionnels et structurels sur les composantes qui étaient nécessaires pour une réaction de Ugi-Smiles permettant le clivage de la résine en milieu acide. Par la suite, une première macrocyclisation tête-à-queue suivi de l’élongation du peptide devait permettre une seconde macrocyclisation pour générer un bicycle peptidique pouvant être clivé de la résine. Or,il a été observé que la première cyclisation ne se déroule pas comme prévu et que le système bicyclique désiré n’a pas été obtenu. Une étude a permis d’identifier les éléments problématiques de l’approche et des ajustements sont proposés pour éviter les difficultés de la première macrocyclisation. Malgré tout, des avancements importants ont pu être effectués dans ce projet et l’application des correctifs proposés dans ce mémoire permettra de générer les bicycliques peptidiques ciblés. / Peptide bicycles display very attractive structural and pharmtacological properties for the development of bioactive compounds and are excellent candidates for the creation of chemical libraries for the discovery of therapeutic agents. This type of structure is found in a great number of natural products with a wide variety of biological activities. Despite their great potential, very few effective synthetic approaches giving access to a large molecular diversity have been described in the literature. This document describes the development of a new synthetic approach on solid support using a Ugi-Smiles multicomponent reaction to prepare peptide bicycles inspired by Bouvardin and its analogs, a family of natural products from Rubiaceae plants with antitumoral and antimicrobial activities. The described approach gives access to complex bicyclic systems and allows the introduction of a large molecular diversity. In a first step, the Ugi-Smiles reaction is used to simultaneously anchor and link the first two amino acids to a resin by their side chain. A study on the reagents and reaction parameters made it possible to carry out functional and structural adjustments on the components allowing the Ugi-Smiles reaction and the cleavage from the resin in an acid medium. Subsequently, a first head-to-tail macrocyclization followed by the elongation of the peptide was supposed to allow a second macrocyclization to generate a peptide bicycle, which can be cleaved from the resin. However, the first cyclization did not go as planned and the desired bicyclic system has not been obtained. A study has identified the problematic elements of the approach and adjustments are proposed to avoid the difficulties of the first macrocyclization. Despite this failure, significant progress has been made in this project and application of the corrections proposed in this document will surely allow the successful synthesis of the targeted bicyclic peptides.

Le cruor bovin, la matière solide du sang, est un déchet des abattoirs produit en très grande quantité dans le monde. Ce coproduit est composé principalement d'hémoglobine, une protéine riche en peptides bioactifs après son hydrolyse enzymatique. Cependant, lors de l'hydrolyse conventionnelle par la pepsine, des agents chimiques sont nécessaires pour ajuster et réguler le pH de la solution et, les hydrolysats finaux produits contiennent des niveaux élevés en sels minéraux. Pour pallier ces inconvénients, il a été proposé d'appliquer dans cette étude, pour la première fois, une technologie verte, appelée électrodialyse avec membrane bipolaire (EDMB), comme méthode alternative à l'hydrolyse enzymatique conventionnelle de l'hémoglobine afin d'obtenir des peptides bioactifs purifiés. Les objectifs de cette thèse étaient de tester la faisabilité de ce nouveau procédé pour la production de peptides bioactifs à partir d'hémoglobine bovine, d'établir les conditions optimales, d'éviter le colmatage membranaire et d'appliquer un nouveau procédé original d'EDMB à « multiple-étapes » permettant la production de peptides bioactifs déminéralisés sans ajout de produits chimiques. Des configurations bipolaires/monopolaires (anioniques ou cationiques) utilisant les ions H⁺ et OH⁻ générés par les membranes bipolaires pour réguler le pH ont été étudiées et comparées à un procédé conventionnel utilisant des acides et des bases chimiques. La configuration d'EDMB formée avec les membranes cationiques a permis la production d'hydrolysats contenant une faible concentration en sels minéraux mais avec la présence d'un colmatage sur la membrane cationique, alors que la configuration d'EDMB utilisant des membranes anioniques a permis la production d'hydrolysats sans colmatage mais avec une concentration en sel similaire à celle de l'hydrolyse conventionnelle (contrôle). En se basant sur ces résultats, une nouvelle configuration d'EDMB à trois compartiments a été mise en place et étudiée pour dénaturer l'hémoglobine, inactiver la réaction enzymatique et déminéraliser l'hydrolysat peptidique en simultané. Une déminéralisation de 85% a été atteinte. Cependant, un colmatage a encore été observé sur la membrane anionique en raison de la précipitation de l'hème. Pour cette raison, une étape supplémentaire de décoloration a été réalisée avant la déminéralisation pour éviter le colmatage en utilisant l'acide électro-généré. Les peptides décolorés et déminéralisés récupérés ont montré une activité antioxydante, une activité antibactérienne contre plusieurs souches bactériennes (Gram+ et Gram-) et pour la première fois une activité antifongique contre de nombreuses souches de moisissures et de levures. Dans un contexte d'économie circulaire, cette technologie durable s'avèrerait efficace pour effectuer plusieurs opérations simultanément et présente un potentiel important au niveau industriel pour l'hydrolyse du sang, puisqu'elle produit des bio-peptides purifiés ayant une faible teneur en sels minéraux et pouvant être utilisés comme conservateurs naturels sur la viande. / Bovine cruor, a slaughterhouse waste, is produced in large quantities all around the world. This co-product is mainly composed of hemoglobin, a protein rich in bioactive peptides after its enzymatic hydrolysis. However, during conventional hydrolysis, chemical agents are necessary to adjust or regulate the pH of the solution and the final hydrolysates produced contain high levels of mineral salts. Therefore, in this study we applied for the first time a green technology named electrodialysis with bipolar membrane (EDBM) as an alternative method to the conventional enzymatic hydrolysis of hemoglobin to obtain purified bioactive peptides. The main objectives of the present thesis were to test the feasibility of this new process to produce bioactive peptides from bovine hemoglobin, to establish the optimal conditions while avoiding membrane fouling and to apply a new original « multiple-step » EDBM process allowing the production of demineralized bioactive peptides without the addition of chemical salts. Bipolar and monopolar (anionic or cationic) configurations using the H⁺ and OH⁻ generated by the bipolar membranes to regulate the pH were investigated and compared to a conventional process using chemical acid and base. The EDBM configuration formed with cationic membranes allowed the production of hydrolysates containing a low concentration of mineral salts but with fouling formation on the cationic membrane, while EDBM configuration formed with anionic membranes allowed the production of hydrolysates without fouling but with a salt concentration similar to the control. Based on these results, a new three-compartment EDBM configuration was carried-out to denaturate the hemoglobin, inactivate the enzymatic reaction, and demineralize the hemoglobin hydrolysate simultaneously. A demineralization level of 85% has been achieved. However, fouling was still observed on the anionic membrane due to hem precipitation. For this reason, an additional step of discoloration was tested before the demineralization to avoid fouling using the electrogenerated acid. The discolored and demineralized peptides recovered showed antioxidant activity, antibacterial activity against multiple bacterial strains (Gram+ and Gram-), and for the first time, antifungal activity against several molds and yeasts strains. Moving towards a circular economy, this sustainable technology was found to be effective in performing multiple operations simultaneously and has a great potential for industrial hydrolysis of blood, since it produces purified biopeptides with a low mineral content that can be used as natural preservatives on meat.

Plusieurs études ont rapporté l'activité antimicrobienne et anti-oxydante d'extraits de sous-produits végétaux. Le recours à l'utilisation de ces extraits dans les produits alimentaires pourrait constituer une stratégie innovante et prometteuse. Les résidus de fruits et légumes peuvent être une source potentielle de composés bioactifs. L'enjeu de cette étude était d'initier des recherches qui pourront aboutir au développement d'agents anti-oxydants-antimicrobiens à partir des sous-produits végétaux destinés à la conservation des aliments, comme une alternative aux produits chimiques synthétiques. L'étude initiale a été d'identifier des extraits de fruits et légumes qui possèdent à la fois de grandes propriétés antimicrobiennes et anti-oxydantes. Enfin, des moyens simples pour augmenter l'activité antimicrobienne de ces extraits ont été étudiés. Environ 160 extraits aqueux de sous-produits de fruits et légumes ont été criblés pour évaluer leur potentiel antimicrobien et anti-oxydant. L'activité antimicrobienne a été déterminée par l'inhibition de la croissance d'Escherichi coli et de Bacillus subtilis. L'activité anti-oxydante a été mise évidence par le test au DPPH (2,2-diphenyl -1-picrylhydrazyl). L'étude a conduit à l'identification des extraits présentant à la fois un potentiel antimicrobien et des propriétés anti-oxydantes. Les propriétés bioactives des extraits sont influencées par le pH de l'extrait, le type de tissu (fruits, feuilles et racines) et le type physiologique des fruits (climactérique). Les résultats ont montré l'existence d'une relation entre les propriétés anti-oxydantes et antimicrobiennes des extraits de plantes. De ce fait, l'indice anti-oxydant-antimicrobien développé pourrait être utile dans le choix des sources végétales bioactives. Les extraits de plantes aux propriétés antimicrobiennes et anti-oxydantes présentent un potentiel comme agent de conservation sécuritaire, bénéfique pour la santé et économique. La considération de la vitesse de piégeage des radicaux (facteur du temps) pour définir l'efficacité réelle (capacité) du système anti-oxydant a été considérée comme la meilleure manière d'exprimer avec plus de fiabilité le pouvoir anti-oxydant réel. La nouvelle expression, le pouvoir antiradicalaire - ARP, produite à partir du test DPPH, peut être plus utile pour identifier l'activité anti-oxydante des échantillons biologiques. Certains échantillons présentaient une valeur ARP élevée tels que les extraits de rambutan, feuille de canneberge, feuille de bleuet, feuille de vigne (sauvage), feuille de framboise, feuille de bétel, avocat, grenade et cherimoya. Les extraits de feuilles possèdent, en général, une valeur d'ARP supérieure à celle des fruits tandis que, les extraits de racines présentent les plus faibles ARP. De plus, cette étude montre également que le nombre moyen d'oxydation du carbone de mélanges complexes tels que des extraits de plantes peut prédire leur pouvoir anti-oxydant, en dépit de la disparité entre les tissus de feuilles et de fruits. Le spectre d'activité anti-radicalaire d'extraits sélectionnés a été exploré. L'activité anti-oxydante a été évaluée par différentes méthodes incluant, capacité anti-oxydante équivalente de Trolox (TEAC), essai de radicaux libres (DPPH), test du pouvoir réducteur d'ion ferrique (FRAP), mesure du potentiel d'oxydoréduction, réduction du peroxyde d'hydrogène, du radical hydroxyle, d'anion superoxyde, d'oxyde nitrique et de l'activité de chélation du fer. Les teneurs totales en composés phénoliques (TPC) et en flavonoïdes (TFC) des extraits ont également été déterminées. Les extraits de feuille de bétel, fruit de bleuet, feuille de cassis, feuille de canneberge ont montré une bonne activité de piégeage des radicaux (essai TEAC); ceux de pomme, oseille, vigne rouge et racine de pissenlit étaient efficaces contre SOA; ceux de feuilles de canneberge, feuille de bleuet, cassis et romarin contre le radical hydroxyle; ceux de bette à carde, panais, brocoli et orange contre H2O2; et ceux de pomme de terre, banane, oseille, feuille d'argousier contre l'oxyde nitrique. Les extraits de feuille et fruit de bleuet, grenade, cassis et feuille de bétel ont montré un bon pouvoir réducteur d'ion ferrique. Les extraits possédant la capacité élevée de chélation du fer étaient: feuille d'argousier, radis, panais, feuille de bétel et mangoustan. L'extrait de feuille de bétel présentait des activités élevées, y compris de fixation du fer et de piégeage de divers radicaux, à l'exception de l'oxyde nitrique, où l'activité était néanmoins modérée. Les essais de TEAC, de DPPH et de FRAP fournissent essentiellement la même réponse concernant l'activité anti-oxydante des extraits de plantes, ce qui suggère que l'un de ces essais serait suffisant pour évaluer leur capacité anti-radicalaire. / Cette étude suggère également que l'activité anti-oxydante d'une substance, déterminée par un ou plusieurs essais, ne donne pas une image complète de son efficacité contre les diverses espèces de radicaux oxygénés; et elle montre que la détermination du spectre de l'activité anti-radicalaire serait nécessaire. L'activité antimicrobienne des extraits de plantes sélectionnés a été évaluée en détail par turbidimétrie en milieu liquide et par diffusion en milieu solide (gel). L'activité antimicrobienne a été exprimée dans la première méthode par l'inhibition de la croissance (GI), par la concentration minimale inhibitrice (MIC) et par une nouvelle expression, dénommée index antimicrobien (AMI). Dans la seconde méthode, l'activité a été exprimée en zone d'inhibition. L'AMI prend en compte les trois phases de croissance des bactéries. Bien que les méthodes turbidimétriques soient fiables dans l'évaluation de l'activité antimicrobienne des substances, la nouvelle expression (AMI) semble être plus significative car, elle comprend l'information sur l'interaction entre la substance et le micro-organisme et sa vitesse de croissance en présence de cette substance. De plus, l'AMI démarque l'activité des échantillons, même ceux qui sont très actifs. Le spectre d'activité antimicrobienne des extraits de plantes sélectionnés a été également étudié. Seulement quelques extraits ont montré un spectre d'activité antimicrobienne assez large. En effet, seul l'extrait de feuille de bétel a un large spectre d'activité contre les bactéries, les levures et les champignons, suivis des extraits de grenade et de fruits d'argousier qui semblent être efficaces contre les bactéries et les levures. L'extrait de cassis est effectivement une substance antibactérienne. Finalement, différentes stratégies pour améliorer l'activité antimicrobienne d'extraits anti-oxydants-antimicrobiens sélectionnés ont été explorées. Trois approches, incluant l'extraction par solvants sélectifs, le mélange binaire des extraits et l'addition de composés végétaux, ont été étudiées. L'activité anti-oxydante-antimicrobienne et le profil phytochimique ont été analysés. Le résultat montre que l'eau chaude peut être utilisée comme solvant pour l'extraction d'agents anti-oxydants-antimicrobiens d'origine végétale, bien qu'un solvant polaire extrait en préférence les substances phénoliques et modestement les substances non polaires comme les terpénoïdes. Toutefois, compte tenu du rendement et de l'activité des extraits, l'eau semble être appropriée, et elle peut être considérée comme un solvant efficace pour les fruits qui sont riches en substances phénoliques. Néanmoins, d'autres solvants sélectifs doivent être considérés pour l'extraction des substances actives non-polaires issues de matière première végétale comme les feuilles. Certaines augmentations de l'activité antimicrobienne sont possibles par le mélange de deux extraits de plantes ou par l'addition de composés végétaux. On a aussi observé que la composition des mélanges peut être importante, car les interactions synergiques ou antagonistes se retrouvent dans certaines proportions. Le mélange des extraits de grenade et cassis d'une part et le mélange des extraits de thé vert et pomme de cajou d'autre part ont montré une amélioration d'activité. L'ajout de glyoxal de méthyle et mono-caprine a également produit une augmentation de l'activité des extraits de plantes. L'addition de glyoxal de méthyle à 25 % (p/p) a amélioré l'activité des extraits de grenade et de cassis. Dans l'ensemble, ce travail a exploré le potentiel des extraits des sous-produits de fruits et de légumes comme agent anti-oxydant-antimicrobien. Les extraits de plantes montrant des potentiels anti-oxydants et antimicrobiens regroupent: olive, canneberge, noni, feuille de bétel, cassis, grenade, citronnelle, épinard, raisin vert (vin), cassis (résidu), aubergine, ramboutan, prune indienne, feuille de canneberge, feuille de romarin, feuille de vigne (sauvage), thé vert, mangoustan et feuille de framboise. Cependant, de cette liste, seuls quelques extraits (feuille de bétel, grenade, résidus de cassis) présentent un large spectre d'activité anti-oxydante et antimicrobienne. En outre, cette étude a introduit de nouvelles expressions pour l'activité anti-oxydante (ARP) et antimicrobienne (AMI) des mélanges complexes tels que les extraits de plantes. Ces expressions peuvent être utiles pour le criblage de matériels d'origine végétale dans la recherche de ces activités. Un autre enseignement de cette étude est que l'amélioration de l'activité antimicrobienne des extraits de plantes ne peut pas être possible simplement par le mélange d'extraits, en raison des interactions potentielles entre les composants des extraits. La connaissance de la composition phytochimique est essentielle pour comprendre de telles interactions, dans la sélection des mélanges et pour déterminer les approches possibles pour améliorer l'activité antimicrobienne. / Les sous-produits de végétaux peuvent être une source potentielle d'antioxydant-antimicrobiens pour une application dans la conservation des aliments, comme alternative aux agents synthétiques, mais beaucoup de travaux sont encore nécessaires pour atteindre ce but, ce qui nécessiterait une approche systémique. / There is a growing interest in the development of strategies to use agricultural and industrial residues as a source of high value-added, including bioactive products. The residues of fruits and vegetables may be a potential source of bioactive compounds. The major objective of this work is to conduct studies to pave the way for the development of antioxidant-antimicrobials from plant by-products for use in food preservation, as alternative to synthetic chemicals. The starting point was the identification of extracts of fruit and vegetable extracts exhibiting high antimicrobial and antioxidant properties. The selected extracts were then characterized for their spectrum of antioxidant and antimicrobial activities. Finally, simple ways of enhancing the antimicrobial activity of the selected extracts were examined. Aqueous extracts of about 160 fruit and vegetable by-products were evaluated for their potential as antimicrobial and antioxidant agents. The growth inhibiting activity of all the 160 extracts were tested against Escherichia coli, and Bacillus Subtilis; and the antioxidant activity was determined by DPPH radical scavenging assay. The pH of the extract, type of tissue (fruit, leaf and root) and physiological type of fruits (climacteric) had impact on the bioactive properties. There was some relationship between antioxidant and antimicrobial properties of the plant extracts. The proposed antioxidant-antimicrobial index may be useful in the selection of plant sources of bio-actives. Consideration of rate of radical quenching (time factor) to define actual efficacy (capacity) of antioxidant system was found to be a better and reliable way of expressing the real antioxidant power. The new expression, antiradical power - ARP, generated from DPPH assay may be more useful in identifying the antioxidant activity of biological samples. Some samples exhibited high ARP value such as rambutan, cranberry leaf, blueberry leaf, grape leaf (wild), raspberry leaf, betel leaf, avocado, pomegranate and custard apple. Leaf extracts possess, in general, higher ARP than fruits, and root extracts possess low ARP. In addition, this study also suggests that average carbon oxidation number of complex mixtures such as plant extracts may portend their antioxidant power, in spite of the disparity between leaf and fruit materials. In chapter 4, plant extracts selected from the original 160 were investigated for their spectrum of anti-radical activity. The antioxidant activity was evaluated by Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), DPPH free radical assay (DPPH), ferric reducing power assay (FRAP), redox potential measurement, hydrogen peroxide, hydroxyl radical, superoxide anion, nitric oxide and iron chelating activities. Their total phenolic content (TPC) and total flavonoid content (TFC) were also determined. Betel leaf, blueberry fruit and black currant and cranberry leaf showed high radical scavenging activity (TEAC assay); apple, sorrel, red grape and dandelion root were effective against SOA; cranberry leaf, blueberry leaf, black currant and Rosemary against hydroxyl radical; rainbow chard, parsnip, broccoli and orange against H2O2; and potato, banana, sorrel, sea buckthorn leaf against nitric oxide. Blueberry leaf and fruit, pomegranate, black currant and betel leaf showed high ferric ion reducing power. The extracts showing high iron binding capacity were: sea buckthorn leaf, radish, parsnip, betel leaf and mangosteen. Betel leaf extract exhibited high activities, including iron binding and scavenging of various radicals except nitric oxide, where the activity was moderate. TEAC, DPPH and FRAP assays provide essentially the same response with respect to the antioxidant activity of plant extracts, suggesting that any one of them would be adequate to evaluate their anti-radical capacity. This study also suggests that antioxidant activity of a substance, determined by one or more related assays, does not give the complete picture of its effectiveness against various species of oxygen radicals; and emphasizes that determination of the spectrum of the anti-radical activity would be necessary. In chapter 5, the antimicrobial activity of selected plant extracts was evaluated in detail by turbidimetric methods in liquid medium, and by well-diffusion method in gel medium. The antimicrobial activity was expressed in the former by growth inhibition, minimum inhibitory concentration - MIC and by a new expression, the antimicrobial index – AMI; and in the latter, expressed by zone of inhibition. AMI takes into account all the three growth phases of the bacteria. Although the turbidimetric methods were in good agreement in the assessment of the activity of the substances, the new expression, AMI, appears to be more meaningful since it carries the information regarding interaction between the substance and the microorganism and the growth rate in the presence of that substance. In addition, AMI demarcates the activity of samples, even those found to be highly active. Furthermore, the spectrum of antimicrobial activity of selected plant extracts was also examined. Only a few extracts showed some broad spectrum in their activities. In effect, only betel leaf extract showed a broad spectrum of antimicrobial activity against bacteria, yeasts and fungi; whereas pomegranate and sea buckthorn fruit extracts appear to be effective against both bacteria and yeasts. Black currant extract is effectively an antibacterial substance. In chapter 6, various ways of enhancing the antimicrobial activity of selected antioxidant-antimicrobial extracts were explored. Three approaches, including selective solvent extraction, binary blending of extracts and addition of plant compounds were investigated. Antioxidant, antimicrobial activity and the profile of phytochemical classes were analyzed. The results showed that hot water could be used for solvent extraction of antioxidant-antimicrobials from plant materials, albeit a polar solvent that extracts phenolic substances preferably and only modestly non-polar substances such as terpenoids. However, considering the yield of the extracts and the activity, water appeared to be an effective solvent solvent for fruit sources that are rich in phenolic substances. Other selective solvents must be considered for extraction of active non-polar substances for plant sources such as leaves. Some enhancement in antimicrobial activity was possible by either mixing plant extracts or by the addition of plant compounds. It was also observed that the composition of blends or mixtures might be important, since synergistic or antagonistic interactions occurred at certain proportions. Pomegranate and black currant extract blends and green tea and cashew apple extract blends showed enhancement in activity. The addition of methyl glyoxal and mono-caprin also showed enhancement in the activity of plant extracts. Methyl glyoxal at 25 % (w/w) addition improved the activity of pomegranate and black currant extracts. Overall, this work explored the potential of extracts of fruit and vegetable by-products as anti-oxidant-antimicrobials. Some plant extracts having potential as antioxidant-antimicrobial agents. They include: olive, cranberry, noni, betel leaf, black currant, pomegranate, lemon grass, spinach, green grape (wine), black currant (residue), egg plant, rambutan, Indian plum, cranberry leaf, rosemary leaf, grape leaf (wild), green tea, mangosteen and raspberry leaf. However, the list is reduced to a few (betel leaf, pomegranate, black currant residue), should broad antioxidant and antimicrobial activities are taken into account. In addition, this study introduces new expressions for antioxidant (ARP) and antimicrobial (AMI) activities of complex mixtures such as plant extracts, and they can be useful in the screening of plant materials for these activities. The knowledge of the phytochemical composition is essential to understand such interactions, in the selection of mixtures and to determine possible approaches to enhance the antimicrobial activity. Plant by-product can be a potential source of antioxidant-antimicrobial for use in food preservation, as alternative to synthetic agents, but much work is needed to realize this goal, and that would require a systemic approach.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2019-2020 / Les maladies inflammatoires chroniques sont un fardeau de santé important à travers le monde. Les traitements actuellement disponibles soulagent la douleur et l’inflammation, mais leurs effets secondaires rendent leur utilisation à long terme risquée. À la lumière de cette problématique, la communauté scientifique s’intéresse au potentiel d’anti-inflammatoires naturels comme les endocannabinoïdes. Les endocannabinoïdes sont des lipides endogènes qui activent les récepteurs cannabinoïdes (CB1 et CB2). Ils régulent ainsi divers processus physiologiques tels l’appétit, l’adipogénèse et la nociception. Les deux endocannabinoïdes les mieux caractérisés, le 2-AG et l’AEA, peuvent également moduler l’inflammation en activant le récepteur CB2 à la surface des cellules immunitaires. Les souris déficientes pour le récepteur CB2 présentent un phénotype inflammatoire exacerbé, suggérant que ce récepteur est anti-inflammatoire. Cependant, le rôle des endocannabinoïdes dans l’inflammation est beaucoup plus complexe puisqu’ils peuvent être métabolisés en une grande variété de médiateurs lipidiques de l’inflammation. Leur voie de dégradation principale est leur hydrolyse en acide arachidonique (AA), qui sert de précurseur à la biosynthèse d’éicosanoïdes pro-inflammatoires comme le leucotriène B4 et la prostaglandine E2. Ils peuvent également être métabolisés directement par certaines enzymes impliquées dans la synthèse d’éicosanoïdes, pour générer des médiateurs comme les prostaglandines-glycérol (PG-G). Par conséquent, les endocannabinoïdes peuvent générer un profil unique d’effets pro- et anti-inflammatoires. Des stratégies thérapeutiques visant à bloquer l’hydrolyse des endocannabinoïdes pour amplifier leurs effets anti-inflammatoires ont été étudiées, mais une très grande proportion de cette recherche a été effectuée sur des animaux. Les façons dont les endocannabinoïdes sont synthétisés et dégradés par les leucocytes humains, ainsi les effets de leurs métabolites sur les fonctions de ces cellules, sont mal définis. Bien que les résultats obtenus dans des modèles animaux soient prometteurs, ces mécanismes doivent être mieux caractérisés chez l’humain avant qu’il ne soit envisageable de les manipuler afin de traiter les maladies inflammatoires. Le premier objectif de mon doctorat était de caractériser les voies de dégradation et de biosynthèse des endocannabinoïdes chez les leucocytes humains. Nous avons documenté l’expression de toutes les lipases hydrolysant le 2-AG, chez plusieurs types leucocytaires. Ces résultats ont souligné que chaque leucocyte exprime plusieurs 2-AG hydrolases et que les inhibiteurs sélectifs actuellement disponibles n’inhibent que partiellement l’hydrolyse du 2-AG chez ces cellules. Ces données ont également démontré que les leucocytes humains hydrolysent très efficacement le 2-AG, une découverte qui nous a permis de mettre en évidence une nouvelle voie de biosynthèse du 2-AG par les leucocytes. En présence d’inhibiteurs d’hydrolyse, les neutrophiles, éosinophiles et monocytes stimulés avec de l’AA ont produit des quantités de 2-AG environ 1000 fois supérieures aux niveaux rapportés dans la littérature. Ils ont également transformé d’autres acides gras polyinsaturés en leurs endocannabinoïdes-glycérol respectifs. Nous avons démontré que cette voie de biosynthèse est dépendante de la réacylation des acides gras dans les phospholipides membranaires, et que leur métabolisme subséquent en endocannabinoïdes implique possiblement l’acide lysophosphatidique comme intermédiaire. Cette étude est la première à rapporter une biosynthèse significative d’endocannabinoïdes par les leucocytes humains, et à démontrer que cette biosynthèse est indépendante de la voie classique de biosynthèse du 2-AG. Nous avions également pour objectif de caractériser l’impact du 2-AG et des PG-G sur les fonctions des leucocytes humains. Nous avons démontré qu’en présence d’IL-5, une cytokine impliquée dans l’inflammation éosinophilique présente dans l’asthme, le 2-AG induit une migration importante des éosinophiles. Cet effet du 2-AG requiert à la fois l’activation du récepteur CB2 et l’hydrolyse du 2-AG en AA pour produire des métabolites de la 15-lipoxygénase. Ceci souligne que l’hydrolyse du 2-AG permet la production de médiateurs causant des effets pro-inflammatoires et qu’il serait souhaitable de bloquer cette hydrolyse in vivo. Finalement, nous avons étudié l’effet de la PGE2-G sur les fonctions des neutrophiles et démontré qu’elle inhibe plusieurs fonctions effectrices de ces cellules. Cet effet inhibiteur nécessite l’hydrolyse de la PGE2-G en PGE2 par les neutrophiles, et l’activation du récepteur EP2 à leur surface. Nos travaux permettront de mieux comprendre la façon dont l’hydrolyse des endocannabinoïdes devrait être bloquée chez les humains, ainsi que tous les effets biologiques qui en découleront. Le but ultime est de développer de nouveaux traitements contre les maladies inflammatoires chroniques, qui maximiseront les effets analgésiques et anti-inflammatoires des endocannabinoïdes tout en limitant leurs effets néfastes. / Chronic inflammatory diseases are an important health burden worldwide. The currently available treatments alleviate pain and inflammation, but their numerous adverse effects make their long term use difficult. Therefore, the scientific community is studying the anti-inflammatory potential of mediators such as endocannabinoids. Endocannabinoids are endogenous lipids that activate the cannabinoid receptors, namely CB1 and CB2. In doing so, they regulate various physiological functions and cognitive processes functions such as appetite, adipogenesis and nociception. The two best-characterized endocannabinoids, 2-AG and AEA, also exert effects on immune cell functions, leading to the modulation of immunity and inflammation. They do so by activating the CB2 receptor, which is expressed in the periphery, notably on immune cells. Notably, it was shown that mice lacking the CB2 receptor display an exacerbated inflammatory phenotype, suggesting that CB2 activation by endocannabinoids is anti-inflammatory. However, the biological effects of endocannabinoids are far more complex, given that they can be metabolized into a wide variety of bioactive lipids. The main degradation pathway for 2-AG and AEA is their hydrolysis into arachidonic acid (AA), a fatty acid that acts a precursor for the biosynthesis of several pro-inflammatory eicosanoids such as leukotriene B4 and prostaglandin E2. They can also be directly metabolized by eicosanoid-biosynthetic enzymes, which generates mediators such as glyceryl-prostaglandins (PG-Gs). Therefore, endocannabinoids can generate an intriguing profile of pro- and anti-inflammatory effects, depending on the balance between their catabolic pathways and receptor activation. Therapeutic strategies aiming at blocking endocannabinoid hydrolysis to amplify their anti-inflammatory effects have been extensively studied. However, most of these studies were conducted in animals. Endocannabinoid metabolism by human leukocytes, as well as the effects of their metabolites on human leukocytes functions, are poorly defined. Although the data obtained from animal models is promising, these mechanisms must be characterized in humans before they can be manipulated to treat inflammatory diseases. Our first aim was to characterize endocannabinoid biosynthetic and hydrolytic pathways in human leukocytes. We documented the expression of several 2-AG hydrolases in human neutrophils, eosinophils, monocytes, lymphocytes and alveolar macrophages. The data we obtained underscored that each cell type expresses several 2-AG hydrolases, and that the selective inhibitors that are currently available only partially block 2-AG degradation by leukocytes. Our results also show that human leukocytes are experts at hydrolyzing 2-AG, a finding that allowed us to establish a novel 2-AG biosynthetic pathway in human leukocytes. In the presence of 2-AG hydrolysis inhibitors, neutrophils, eosinophils and monocytes stimulated with AA produced 2-AG in amounts ~ 1000 times greater than those previously reported. They also converted other polyunsaturated fatty acids into their glycerol-containing endocannabinoid counterparts. We showed that this endocannabinoid biosynthetic pathway depends on fatty acid reacylation into membrane phospholipids, and that their subsequent metabolism into endocannabinoid likely requires the production of a lysophosphatidic acid intermediate. This study is the first one to report a significant endocannabinoid synthesis by human leukocytes, and to show that this biosynthesis is independent from the classical 2-AG biosynthetic pathway. We also aimed to characterize the impact of 2-AG and PG-Gs on human leukocyte functions. We showed that in the presence of IL-5, a cytokine involved in the eosinophilic inflammation found in asthma, 2-AG induces eosinophil migration. This requires the activation of the CB2 receptor, as well as 2-AG hydrolysis into AA to produce 15-lipoxygenase metabolites. This underscores that 2-AG hydrolysis by eosinophils allows for the synthesis of mediators that have pro-inflammatory effects, and that blocking this hydrolysis in vivo may be beneficial. We also studied the biological effects of PGE2-G and found that it inhibits several effector functions of human neutrophils. This inhibitory effect requires PGE2-G hydrolysis into PGE2 by neutrophils, and the activation of the EP2 receptor on their surface. Our work will allow a better understanding of how endocannabinoid hydrolysis should be blocked in humans, and of the biological effects that will result from this inhibition. The goal is to develop new treatments against chronic inflammatory diseases, which will enhance the analgesic and anti-inflammatory effects of endocannabinoids while limiting their deleterious effects.

En raison de la perception du caractère santé des jus de fruits par les consommateurs, il serait intéressant de développer des jus de fruit fonctionnels par l'ajout de composés bioactifs. Or, nombreux sont les composés bioactifs qui sont sensibles aux procédés de transformation des aliments et à leurs conditions d'entreposage. Une technique originale d'encapsulation par emulsion multiple (E1/H/E2) pour différents composés bioactifs a été développée. Le type d'émulsifiant, leur concentration, les ratios d'eau et d'huile, les conditions d'agitation (temps, vitesse, température) et les caractéristiques des emulsions produites (viscosité, microscopie, granulométrie laser) ont été étudiés. La cinétique de stabilisation de la tension interfaciale et la concentration micellaire critique (CMC) ont été déterminées. De façon à valider le choix des concentrations optimales en émulsifiants, les isothermes de compression de Langmuir ont été mesurés. Des gouttelettes multiples (E1/H) d'un diamètre volumétrique d'environ 90 um contenant des gouttelettes aqueuses (E1) inférieures à 1 um ont été obtenues. Après 25 jours à température ambiante, le diamètre des gouttelettes multiples a atteint 110 um, indiquant une coalescence limitée. Les emulsions multiples protègent les acides gras oméga-3 et les composés hydrosolubles comme la vitamine C. Cependant, une portion de la vitamine C des emulsions multiples est instable physiquement et serait relarguée de la phase interne des emulsions vers la phase externe (dans le jus). L'effet de la température d'entreposage a montré que, quelque soit le type de composé encapsulé, il s'avère nécessaire de réfrigérer les jus à 4°C pour améliorer l'effet protecteur des emulsions.

Le brocoli est une excellente source de composés nutraceutiques ayant de nombreux effets sur la santé tels que les propriétés anticancéreuses, anti-diabétiques, antioxydantes et antimicrobiennes. Les glucosinolates, les polyphénols, les vitamines, les minéraux et les fibres alimentaires sont les principales molécules présentes dans le brocoli. La production annuelle mondiale de brocoli est de 21 millions de tonnes. On estime que 35 à 40% des cultures horticoles sont perdues en raison de pratiques agricoles inadéquates, générant d'énormes quantités de déchets agricoles. Ces cultures perdues pourraient être utilisées comme matières premières pour l'extraction et la purification d'ingrédients bioactifs destinés à l'industrie nutraceutique et alimentaire. L'objectif principal de ce projet était de développer une technique économique et respectueuse de l'environnement pour la fabrication d'un extrait riche en glucoraphanine à partir de rejets industriels de brocoli, en fournissant une voie alternative pour sa valorisation. Ce travail se concentre principalement sur l'identification, la caractérisation et la quantification des glucosinolates et des polyphénols présents dans 10 lots rejetés de graines de brocoli et de résidus industriels de brocoli tels que les fleurons, les tiges et le mélange de fleurons et de tiges. De plus, le procédé d'extraction de la glucoraphanine a été optimisé en utilisant des solvants verts tels que l'éthanol et l'eau. En outre, la glucoraphanine provenant d'extraits de brocoli bruts a été purifiée en utilisant des résines échangeuses d'ions par une Méthodologie de Surface de Réponse, basé sur le Box-Behnken Design (BBD) et l'Analyse des Composants Principaux. Enfin, des expériences pilotes ont été réalisées en utilisant les paramètres optimisés pour vérifier leur adéquation pour une application industrielle. La caractérisation et la quantification simultanées par UPLC MS/MS ont indiqué la présence de 12 glucosinolates (principalement de la glucoraphanine) et de 5 polyphénols dans les sous-produits du brocoli. La teneur en glucosinolates variait de 0,2 à 2% de matière sèche (MS), tandis que les polyphénols étaient inférieurs à 0,02% de MS. L'abondance relative de la glucoraphanine dans les sous-produits du brocoli a fait un matériau de départ prometteur pour la fabrication de compléments alimentaires fonctionnels. De plus, un procédé d'extraction de la glucoraphanine écologique et à base de solvant a été optimisé pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un extracteur à agitation magnétique unique a maximisé l'extractibilité de la glucoraphanine. Les paramètres d'extraction optimisés étaient de 50% et 70% d'éthanol aqueux extraits pendant 60 et 30 minutes à 60 et 23°C pour les sous-produits de graines et de fleurons, respectivement, en utilisant un rapport matière/solvant de 1:20. Le procédé vert optimisé a donné un rendement de glucoraphanine de 55,5 g/kg MS de graines et de 4,3 g/kg MS de fleurons. Le procédé vert développé dans cette étude a fourni 37 et 81 fois plus d'extractibilité de la glucoraphanine que la technique analytique standard basée sur le méthanol. Enfin, un procédé de purification de la glucoraphanine respectueux de l'environnement et industriellement réalisable a été développé en utilisant des résines échangeuses d'ions par approche de surface de réponse pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un ensemble de 27 essais, 3 niveaux dans le BBD ont été proposés pour les résines cationiques et anioniques en série, pour maximiser les réponses du processus. La purification de la glucoraphanine à partir de l'extrait de graines de brocoli en utilisant une résine cationique a permis une récupération maximale de 94% et une pureté de 14% en utilisant 1:5 du rapport matière/résine pendant 91 min à 80 rpm/min. Dans le cas de la résine anionique, les variables expérimentales de 1:5, 140 min, 160 rpm/min et 7% d'hydroxyde d'ammonium dans de l'éthanol à 70% ont donné un rendement de 72% et une pureté de 37%... / Le brocoli est une excellente source de composés nutraceutiques ayant de nombreux effets sur la santé tels que les propriétés anticancéreuses, anti-diabétiques, antioxydantes et antimicrobiennes. Les glucosinolates, les polyphénols, les vitamines, les minéraux et les fibres alimentaires sont les principales molécules présentes dans le brocoli. La production annuelle mondiale de brocoli est de 21 millions de tonnes. On estime que 35 à 40% des cultures horticoles sont perdues en raison de pratiques agricoles inadéquates, générant d'énormes quantités de déchets agricoles. Ces cultures perdues pourraient être utilisées comme matières premières pour l'extraction et la purification d'ingrédients bioactifs destinés à l'industrie nutraceutique et alimentaire. L'objectif principal de ce projet était de développer une technique économique et respectueuse de l'environnement pour la fabrication d'un extrait riche en glucoraphanine à partir de rejets industriels de brocoli, en fournissant une voie alternative pour sa valorisation. Ce travail se concentre principalement sur l'identification, la caractérisation et la quantification des glucosinolates et des polyphénols présents dans 10 lots rejetés de graines de brocoli et de résidus industriels de brocoli tels que les fleurons, les tiges et le mélange de fleurons et de tiges. De plus, le procédé d'extraction de la glucoraphanine a été optimisé en utilisant des solvants verts tels que l'éthanol et l'eau. En outre, la glucoraphanine provenant d'extraits de brocoli bruts a été purifiée en utilisant des résines échangeuses d'ions par une Méthodologie de Surface de Réponse, basé sur le Box-Behnken Design (BBD) et l'Analyse des Composants Principaux. Enfin, des expériences pilotes ont été réalisées en utilisant les paramètres optimisés pour vérifier leur adéquation pour une application industrielle. La caractérisation et la quantification simultanées par UPLC MS/MS ont indiqué la présence de 12 glucosinolates (principalement de la glucoraphanine) et de 5 polyphénols dans les sous-produits du brocoli. La teneur en glucosinolates variait de 0,2 à 2% de matière sèche (MS), tandis que les polyphénols étaient inférieurs à 0,02% de MS. L'abondance relative de la glucoraphanine dans les sous-produits du brocoli a fait un matériau de départ prometteur pour la fabrication de compléments alimentaires fonctionnels. De plus, un procédé d'extraction de la glucoraphanine écologique et à base de solvant a été optimisé pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un extracteur à agitation magnétique unique a maximisé l'extractibilité de la glucoraphanine. Les paramètres d'extraction optimisés étaient de 50% et 70% d'éthanol aqueux extraits pendant 60 et 30 minutes à 60 et 23°C pour les sous-produits de graines et de fleurons, respectivement, en utilisant un rapport matière/solvant de 1:20. Le procédé vert optimisé a donné un rendement de glucoraphanine de 55,5 g/kg MS de graines et de 4,3 g/kg MS de fleurons. Le procédé vert développé dans cette étude a fourni 37 et 81 fois plus d'extractibilité de la glucoraphanine que la technique analytique standard basée sur le méthanol. Enfin, un procédé de purification de la glucoraphanine respectueux de l'environnement et industriellement réalisable a été développé en utilisant des résines échangeuses d'ions par approche de surface de réponse pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un ensemble de 27 essais, 3 niveaux dans le BBD ont été proposés pour les résines cationiques et anioniques en série, pour maximiser les réponses du processus. La purification de la glucoraphanine à partir de l'extrait de graines de brocoli en utilisant une résine cationique a permis une récupération maximale de 94% et une pureté de 14% en utilisant 1:5 du rapport matière/résine pendant 91 min à 80 rpm/min. Dans le cas de la résine anionique, les variables expérimentales de 1:5, 140 min, 160 rpm/min et 7% d'hydroxyde d'ammonium dans de l'éthanol à 70% ont donné un rendement de 72% et une pureté de 37%. Alors que pour les rejets industriels de fleurons de brocoli, les paramètres optimisés pour la purification de la glucoraphanine étaient un ratio matière/résine de 1:1.87, un temps de contact de 30 min, une vitesse d'agitation de 80 rpm/min et un solvant d'élution de 100% eau. La purification subséquente de l'extrait cationique en utilisant la résine anionique a été réalisée en utilisant les paramètres expérimentaux optimisés du rapport matière/résine de 1:1.3 pendant 170 min à 140 rpm/min et éluée en utilisant 7% d'hydroxyde d'ammonium dans 70% d'éthanol, fournissant une récupération de 78% et pureté de 5%. Enfin, les paramètres du processus d'extraction et de purification optimisés à l'échelle du laboratoire ont été extrapolés à l'échelle pilote pour la fabrication d'extraits en poudre, indiquant que le procédé optimisé était très efficace pour récupérer la glucoraphanine avec une grande pureté même à grande échelle. Par conséquent, la présente étude a mis au point un procédé écologique efficace et industriellement viable pour la fabrication d'extraits de rejets industriels de brocoli. Le processus optimisé a fourni une voie alternative économiquement viable pour la valorisation de la récolte perdue qui nous rapproche de la sécurité alimentaire et la durabilité environnementale. / Le brocoli est une excellente source de composés nutraceutiques ayant de nombreux effets sur la santé tels que les propriétés anticancéreuses, anti-diabétiques, antioxydantes et antimicrobiennes. Les glucosinolates, les polyphénols, les vitamines, les minéraux et les fibres alimentaires sont les principales molécules présentes dans le brocoli. La production annuelle mondiale de brocoli est de 21 millions de tonnes. On estime que 35 à 40% des cultures horticoles sont perdues en raison de pratiques agricoles inadéquates, générant d'énormes quantités de déchets agricoles. Ces cultures perdues pourraient être utilisées comme matières premières pour l'extraction et la purification d'ingrédients bioactifs destinés à l'industrie nutraceutique et alimentaire. L'objectif principal de ce projet était de développer une technique économique et respectueuse de l'environnement pour la fabrication d'un extrait riche en glucoraphanine à partir de rejets industriels de brocoli, en fournissant une voie alternative pour sa valorisation. Ce travail se concentre principalement sur l'identification, la caractérisation et la quantification des glucosinolates et des polyphénols présents dans 10 lots rejetés de graines de brocoli et de résidus industriels de brocoli tels que les fleurons, les tiges et le mélange de fleurons et de tiges. De plus, le procédé d'extraction de la glucoraphanine a été optimisé en utilisant des solvants verts tels que l'éthanol et l'eau. En outre, la glucoraphanine provenant d'extraits de brocoli bruts a été purifiée en utilisant des résines échangeuses d'ions par une Méthodologie de Surface de Réponse, basé sur le Box-Behnken Design (BBD) et l'Analyse des Composants Principaux. Enfin, des expériences pilotes ont été réalisées en utilisant les paramètres optimisés pour vérifier leur adéquation pour une application industrielle. La caractérisation et la quantification simultanées par UPLC MS/MS ont indiqué la présence de 12 glucosinolates (principalement de la glucoraphanine) et de 5 polyphénols dans les sous-produits du brocoli. La teneur en glucosinolates variait de 0,2 à 2% de matière sèche (MS), tandis que les polyphénols étaient inférieurs à 0,02% de MS. L'abondance relative de la glucoraphanine dans les sous-produits du brocoli a fait un matériau de départ prometteur pour la fabrication de compléments alimentaires fonctionnels. De plus, un procédé d'extraction de la glucoraphanine écologique et à base de solvant a été optimisé pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un extracteur à agitation magnétique unique a maximisé l'extractibilité de la glucoraphanine. Les paramètres d'extraction optimisés étaient de 50% et 70% d'éthanol aqueux extraits pendant 60 et 30 minutes à 60 et 23°C pour les sous-produits de graines et de fleurons, respectivement, en utilisant un rapport matière/solvant de 1:20. Le procédé vert optimisé a donné un rendement de glucoraphanine de 55,5 g/kg MS de graines et de 4,3 g/kg MS de fleurons. Le procédé vert développé dans cette étude a fourni 37 et 81 fois plus d'extractibilité de la glucoraphanine que la technique analytique standard basée sur le méthanol. Enfin, un procédé de purification de la glucoraphanine respectueux de l'environnement et industriellement réalisable a été développé en utilisant des résines échangeuses d'ions par approche de surface de réponse pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un ensemble de 27 essais, 3 niveaux dans le BBD ont été proposés pour les résines cationiques et anioniques en série, pour maximiser les réponses du processus. La purification de la glucoraphanine à partir de l'extrait de graines de brocoli en utilisant une résine cationique a permis une récupération maximale de 94% et une pureté de 14% en utilisant 1:5 du rapport matière/résine pendant 91 min à 80 rpm/min. Dans le cas de la résine anionique, les variables expérimentales de 1:5, 140 min, 160 rpm/min et 7% d'hydroxyde d'ammonium dans de l'éthanol à 70% ont donné un rendement de 72% et une pureté de 37%. Alors que pour les rejets industriels de fleurons de brocoli, les paramètres optimisés pour la purification de la glucoraphanine étaient un ratio matière/résine de 1:1.87, un temps de contact de 30 min, une vitesse d'agitation de 80 rpm/min et un solvant d'élution de 100% eau. La purification subséquente de l'extrait cationique en utilisant la résine anionique a été réalisée en utilisant les paramètres expérimentaux optimisés du rapport matière/résine de 1:1.3 pendant 170 min à 140 rpm/min et éluée en utilisant 7% d'hydroxyde d'ammonium dans 70% d'éthanol, fournissant une récupération de 78% et pureté de 5%. Enfin, les paramètres du processus d'extraction et de purification optimisés à l'échelle du laboratoire ont été extrapolés à l'échelle pilote pour la fabrication d'extraits en poudre, indiquant que le procédé optimisé était très efficace pour récupérer la glucoraphanine avec une grande pureté même à grande échelle. Par conséquent, la présente étude a mis au point un procédé écologique efficace et industriellement viable pour la fabrication d'extraits de rejets industriels de brocoli. Le processus optimisé a fourni une voie alternative économiquement viable pour la valorisation de la récolte perdue qui nous rapproche de la sécurité alimentaire et la durabilité environnementale. / Le brocoli est une excellente source de composés nutraceutiques ayant de nombreux effets sur la santé tels que les propriétés anticancéreuses, anti-diabétiques, antioxydantes et antimicrobiennes. Les glucosinolates, les polyphénols, les vitamines, les minéraux et les fibres alimentaires sont les principales molécules présentes dans le brocoli. La production annuelle mondiale de brocoli est de 21 millions de tonnes. On estime que 35 à 40% des cultures horticoles sont perdues en raison de pratiques agricoles inadéquates, générant d'énormes quantités de déchets agricoles. Ces cultures perdues pourraient être utilisées comme matières premières pour l'extraction et la purification d'ingrédients bioactifs destinés à l'industrie nutraceutique et alimentaire. L'objectif principal de ce projet était de développer une technique économique et respectueuse de l'environnement pour la fabrication d'un extrait riche en glucoraphanine à partir de rejets industriels de brocoli, en fournissant une voie alternative pour sa valorisation. Ce travail se concentre principalement sur l'identification, la caractérisation et la quantification des glucosinolates et des polyphénols présents dans 10 lots rejetés de graines de brocoli et de résidus industriels de brocoli tels que les fleurons, les tiges et le mélange de fleurons et de tiges. De plus, le procédé d'extraction de la glucoraphanine a été optimisé en utilisant des solvants verts tels que l'éthanol et l'eau. En outre, la glucoraphanine provenant d'extraits de brocoli bruts a été purifiée en utilisant des résines échangeuses d'ions par une Méthodologie de Surface de Réponse, basé sur le Box-Behnken Design (BBD) et l'Analyse des Composants Principaux. Enfin, des expériences pilotes ont été réalisées en utilisant les paramètres optimisés pour vérifier leur adéquation pour une application industrielle. La caractérisation et la quantification simultanées par UPLC MS/MS ont indiqué la présence de 12 glucosinolates (principalement de la glucoraphanine) et de 5 polyphénols dans les sous-produits du brocoli. La teneur en glucosinolates variait de 0,2 à 2% de matière sèche (MS), tandis que les polyphénols étaient inférieurs à 0,02% de MS. L'abondance relative de la glucoraphanine dans les sous-produits du brocoli a fait un IV matériau de départ prometteur pour la fabrication de compléments alimentaires fonctionnels. De plus, un procédé d'extraction de la glucoraphanine écologique et à base de solvant a été optimisé pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un extracteur à agitation magnétique unique a maximisé l'extractibilité de la glucoraphanine. Les paramètres d'extraction optimisés étaient de 50% et 70% d'éthanol aqueux extraits pendant 60 et 30 minutes à 60 et 23°C pour les sous-produits de graines et de fleurons, respectivement, en utilisant un rapport matière/solvant de 1:20. Le procédé vert optimisé a donné un rendement de glucoraphanine de 55,5 g/kg MS de graines et de 4,3 g/kg MS de fleurons. Le procédé vert développé dans cette étude a fourni 37 et 81 fois plus d'extractibilité de la glucoraphanine que la technique analytique standard basée sur le méthanol. Enfin, un procédé de purification de la glucoraphanine respectueux de l'environnement et industriellement réalisable a été développé en utilisant des résines échangeuses d'ions par approche de surface de réponse pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un ensemble de 27 essais, 3 niveaux dans le BBD ont été proposés pour les résines cationiques et anioniques en série, pour maximiser les réponses du processus. La purification de la glucoraphanine à partir de l'extrait de graines de brocoli en utilisant une résine cationique a permis une récupération maximale de 94% et une pureté de 14% en utilisant 1:5 du rapport matière/résine pendant 91 min à 80 rpm/min. Dans le cas de la résine anionique, les variables expérimentales de 1:5, 140 min, 160 rpm/min et 7% d'hydroxyde d'ammonium dans de l'éthanol à 70% ont donné un rendement de 72% et une pureté de 37%. Alors que pour les rejets industriels de fleurons de brocoli, les paramètres optimisés pour la purification de la glucoraphanine étaient un ratio matière/résine de 1:1.87, un temps de contact de 30 min, une vitesse d'agitation de 80 rpm/min et un solvant d'élution de 100% eau. La purification subséquente de l'extrait cationique en utilisant la résine anionique a été réalisée en utilisant les paramètres expérimentaux optimisés du rapport matière/résine de 1:1.3 pendant 170 min à 140 rpm/min et éluée en utilisant 7% d'hydroxyde d'ammonium dans 70% d'éthanol, fournissant une récupération de 78% et pureté de 5%. Enfin, les paramètres du processus d'extraction et de purification optimisés à V l'échelle du laboratoire ont été extrapolés à l'échelle pilote pour la fabrication d'extraits en poudre, indiquant que le procédé optimisé était très efficace pour récupérer la glucoraphanine avec une grande pureté même à grande échelle. Par conséquent, la présente étude a mis au point un procédé écologique efficace et industriellement viable pour la fabrication d'extraits de rejets industriels de brocoli. Le processus optimisé a fourni une voie alternative économiquement viable pour la valorisation de la récolte perdue qui nous rapproche de la sécurité alimentaire et la durabilité environnementale. / Le brocoli est une excellente source de composés nutraceutiques ayant de nombreux effets sur la santé tels que les propriétés anticancéreuses, anti-diabétiques, antioxydantes et antimicrobiennes. Les glucosinolates, les polyphénols, les vitamines, les minéraux et les fibres alimentaires sont les principales molécules présentes dans le brocoli. La production annuelle mondiale de brocoli est de 21 millions de tonnes. On estime que 35 à 40% des cultures horticoles sont perdues en raison de pratiques agricoles inadéquates, générant d'énormes quantités de déchets agricoles. Ces cultures perdues pourraient être utilisées comme matières premières pour l'extraction et la purification d'ingrédients bioactifs destinés à l'industrie nutraceutique et alimentaire. L'objectif principal de ce projet était de développer une technique économique et respectueuse de l'environnement pour la fabrication d'un extrait riche en glucoraphanine à partir de rejets industriels de brocoli, en fournissant une voie alternative pour sa valorisation. Ce travail se concentre principalement sur l'identification, la caractérisation et la quantification des glucosinolates et des polyphénols présents dans 10 lots rejetés de graines de brocoli et de résidus industriels de brocoli tels que les fleurons, les tiges et le mélange de fleurons et de tiges. De plus, le procédé d'extraction de la glucoraphanine a été optimisé en utilisant des solvants verts tels que l'éthanol et l'eau. En outre, la glucoraphanine provenant d'extraits de brocoli bruts a été purifiée en utilisant des résines échangeuses d'ions par une Méthodologie de Surface de Réponse, basé sur le Box-Behnken Design (BBD) et l'Analyse des Composants Principaux. Enfin, des expériences pilotes ont été réalisées en utilisant les paramètres optimisés pour vérifier leur adéquation pour une application industrielle. La caractérisation et la quantification simultanées par UPLC MS/MS ont indiqué la présence de 12 glucosinolates (principalement de la glucoraphanine) et de 5 polyphénols dans les sous-produits du brocoli. La teneur en glucosinolates variait de 0,2 à 2% de matière sèche (MS), tandis que les polyphénols étaient inférieurs à 0,02% de MS. L'abondance relative de la glucoraphanine dans les sous-produits du brocoli a fait un matériau de départ prometteur pour la fabrication de compléments alimentaires fonctionnels. De plus, un procédé d'extraction de la glucoraphanine écologique et à base de solvant a été optimisé pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un extracteur à agitation magnétique unique a maximisé l'extractibilité de la glucoraphanine. Les paramètres d'extraction optimisés étaient de 50% et 70% d'éthanol aqueux extraits pendant 60 et 30 minutes à 60 et 23°C pour les sous-produits de graines et de fleurons, respectivement, en utilisant un rapport matière/solvant de 1:20. Le procédé vert optimisé a donné un rendement de glucoraphanine de 55,5 g/kg MS de graines et de 4,3 g/kg MS de fleurons. Le procédé vert développé dans cette étude a fourni 37 et 81 fois plus d'extractibilité de la glucoraphanine que la technique analytique standard basée sur le méthanol. Enfin, un procédé de purification de la glucoraphanine respectueux de l'environnement et industriellement réalisable a été développé en utilisant des résines échangeuses d'ions par approche de surface de réponse pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un ensemble de 27 essais, 3 niveaux dans le BBD ont été proposés pour les résines cationiques et anioniques en série, pour maximiser les réponses du processus. La purification de la glucoraphanine à partir de l'extrait de graines de brocoli en utilisant une résine cationique a permis une récupération maximale de 94% et une pureté de 14% en utilisant 1:5 du rapport matière/résine pendant 91 min à 80 rpm/min. Dans le cas de la résine anionique, les variables expérimentales de 1:5, 140 min, 160 rpm/min et 7% d'hydroxyde d'ammonium dans de l'éthanol à 70% ont donné un rendement de 72% et une pureté de 37%. Alors que pour les rejets industriels de fleurons de brocoli, les paramètres optimisés pour la purification de la glucoraphanine étaient un ratio matière/résine de 1:1.87, un temps de contact de 30 min, une vitesse d'agitation de 80 rpm/min et un solvant d'élution de 100% eau. La purification subséquente de l'extrait cationique en utilisant la résine anionique a été réalisée en utilisant les paramètres expérimentaux optimisés du rapport matière/résine de 1:1.3 pendant 170 min à 140 rpm/min et éluée en utilisant 7% d'hydroxyde d'ammonium dans 70% d'éthanol, fournissant une récupération de 78% et pureté de 5%. Enfin, les paramètres du processus d'extraction et de purification optimisés à l'échelle du laboratoire ont été extrapolés à l'échelle pilote pour la fabrication d'extraits en poudre, indiquant que le procédé optimisé était très efficace pour récupérer la glucoraphanine avec une grande pureté même à grande échelle. Par conséquent, la présente étude a mis au point un procédé écologique efficace et industriellement viable pour la fabrication d'extraits de rejets industriels de brocoli. Le processus optimisé a fourni une voie alternative économiquement viable pour la valorisation de la récolte perdue qui nous rapproche de la sécurité alimentaire et la durabilité environnementale. / Le brocoli est une excellente source de composés nutraceutiques ayant de nombreux effets sur la santé tels que les propriétés anticancéreuses, anti-diabétiques, antioxydantes et antimicrobiennes. Les glucosinolates, les polyphénols, les vitamines, les minéraux et les fibres alimentaires sont les principales molécules présentes dans le brocoli. La production annuelle mondiale de brocoli est de 21 millions de tonnes. On estime que 35 à 40% des cultures horticoles sont perdues en raison de pratiques agricoles inadéquates, générant d'énormes quantités de déchets agricoles. Ces cultures perdues pourraient être utilisées comme matières premières pour l'extraction et la purification d'ingrédients bioactifs destinés à l'industrie nutraceutique et alimentaire. L'objectif principal de ce projet était de développer une technique économique et respectueuse de l'environnement pour la fabrication d'un extrait riche en glucoraphanine à partir de rejets industriels de brocoli, en fournissant une voie alternative pour sa valorisation. Ce travail se concentre principalement sur l'identification, la caractérisation et la quantification des glucosinolates et des polyphénols présents dans 10 lots rejetés de graines de brocoli et de résidus industriels de brocoli tels que les fleurons, les tiges et le mélange de fleurons et de tiges. De plus, le procédé d'extraction de la glucoraphanine a été optimisé en utilisant des solvants verts tels que l'éthanol et l'eau. En outre, la glucoraphanine provenant d'extraits de brocoli bruts a été purifiée en utilisant des résines échangeuses d'ions par une Méthodologie de Surface de Réponse, basé sur le Box-Behnken Design (BBD) et l'Analyse des Composants Principaux. Enfin, des expériences pilotes ont été réalisées en utilisant les paramètres optimisés pour vérifier leur adéquation pour une application industrielle. La caractérisation et la quantification simultanées par UPLC MS/MS ont indiqué la présence de 12 glucosinolates (principalement de la glucoraphanine) et de 5 polyphénols dans les sous-produits du brocoli. La teneur en glucosinolates variait de 0,2 à 2% de matière sèche (MS), tandis que les polyphénols étaient inférieurs à 0,02% de MS. L'abondance relative de la glucoraphanine dans les sous-produits du brocoli a fait un matériau de départ prometteur pour la fabrication de compléments alimentaires fonctionnels. De plus, un procédé d'extraction de la glucoraphanine écologique et à base de solvant a été optimisé pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un extracteur à agitation magnétique unique a maximisé l'extractibilité de la glucoraphanine. Les paramètres d'extraction optimisés étaient de 50% et 70% d'éthanol aqueux extraits pendant 60 et 30 minutes à 60 et 23°C pour les sous-produits de graines et de fleurons, respectivement, en utilisant un rapport matière/solvant de 1:20. Le procédé vert optimisé a donné un rendement de glucoraphanine de 55,5 g/kg MS de graines et de 4,3 g/kg MS de fleurons. Le procédé vert développé dans cette étude a fourni 37 et 81 fois plus d'extractibilité de la glucoraphanine que la technique analytique standard basée sur le méthanol. Enfin, un procédé de purification de la glucoraphanine respectueux de l'environnement et industriellement réalisable a été développé en utilisant des résines échangeuses d'ions par approche de surface de réponse pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un ensemble de 27 essais, 3 niveaux dans le BBD ont été proposés pour les résines cationiques et anioniques en série, pour maximiser les réponses du processus. La purification de la glucoraphanine à partir de l'extrait de graines de brocoli en utilisant une résine cationique a permis une récupération maximale de 94% et une pureté de 14% en utilisant 1:5 du rapport matière/résine pendant 91 min à 80 rpm/min. Dans le cas de la résine anionique, les variables expérimentales de 1:5, 140 min, 160 rpm/min et 7% d'hydroxyde d'ammonium dans de l'éthanol à 70% ont donné un rendement de 72% et une pureté de 37%. Alors que pour les rejets industriels de fleurons de brocoli, les paramètres optimisés pour la purification de la glucoraphanine étaient un ratio matière/résine de 1:1.87, un temps de contact de 30 min, une vitesse d'agitation de 80 rpm/min et un solvant d'élution de 100% eau. La purification subséquente de l'extrait cationique en utilisant la résine anionique a été réalisée en utilisant les paramètres expérimentaux optimisés du rapport matière/résine de 1:1.3 pendant 170 min à 140 rpm/min et éluée en utilisant 7% d'hydroxyde d'ammonium dans 70% d'éthanol, fournissant une récupération de 78% et pureté de 5%. Enfin, les paramètres du processus d'extraction et de purification optimisés à l'échelle du laboratoire ont été extrapolés à l'échelle pilote pour la fabrication d'extraits en poudre, indiquant que le procédé optimisé était très efficace pour récupérer la glucoraphanine avec une grande pureté même à grande échelle. Par conséquent, la présente étude a mis au point un procédé écologique efficace et industriellement viable pour la fabrication d'extraits de rejets industriels de brocoli. Le processus optimisé a fourni une voie alternative économiquement viable pour la valorisation de la récolte perdue qui nous rapproche de la sécurité alimentaire et la durabilité environnementale. / Broccoli is an excellent source of nutraceutical compounds with many health effects such as anticancerous, anti-diabetic, antioxidant and anti-microbial properties. Glucosinolates, polyphenols, vitamins, minerals, dietary fibers are the most important molecules present in broccoli. The global annual production of broccoli is 21 million tons. It is estimated that 35-40% of the horticultural crops are lost due to inadequate agricultural practices, generating huge quantities of agro-waste. These lost crops, could be used as raw materials for the extraction and purification of bioactive ingredients for the nutraceutical and food industry. The main objective of this project was to develop an economical and environmental friendly technique for the fabrication of an extract rich in glucoraphanin from broccoli industrial discards, providing an alternative route for its valorization. This work predominantly focuses on the identification, characterization and quantification of glucosinolates and polyphenols present in 10 rejected lots of broccoli seeds and broccoli industrial residues such as florets, stalks and the mixture of florets and stalks. Additionally, the glucoraphanin extraction process was optimized using green solvents such as ethanol and water. Further, the glucoraphanin from crude broccoli extracts were purified using ion exchange resins by Response Surface Methodology, based on Box-Behnken Design (BBD) and Principle component analysis. Finally, pilot experiments were performed using the optimized parameters to verify their industrial applicability. The simultaneous characterization and quantification by UPLC MS/MS indicated the presence of 12 glucosinolates (predominantly glucoraphanin) and 5 polyphenols in broccoli by-products. The glucosinolates content varied from 0.2 to 2% dry weight (DW), whereas, the polyphenols were less than 0.02% DW. The relative abundance of glucoraphanin in broccoli by-products makes it a promising starting material for the fabrication of functional food supplements. Further, an eco-friendly, solvent based glucoraphanin extraction process was optimized for broccoli seeds and florets by-products. A single batch magnetically stirred extractor was found to maximize glucoraphanin extractability. The optimized extraction parameters were 50% and 70% aqueous ethanol extracted for 60 and 30 minutes at 60 and 23°C for seeds and florets by-products, respectively, using a feed to solvent ratio of 1:20. The optimized green process provided a glucoraphanin yield of 55.5 g/Kg DW seeds and 4.3 g/kg DW florets by-products. The green process developed in this study provided 37 and 81 times more glucoraphanin extractability than the standardized methanol based analytical technique. Finally, an environmental friendly and industrially feasible glucoraphanin purification process was developed using ion exchange resins by response surface approach for broccoli seeds and florets by-products. A 27 run, 3 level BBD, were proposed for cationic and anionic resins in series, to maximize the process responses. Glucoraphanin purification from broccoli seeds extract using cationic resin provided a maximal recovery of 94% and purity of 14% using 1:5 of feed to resin ratio for 30 min, at 80 rpm agitation speed and eluting solvent concentration of 100% water. For anionic resin, the experimental variables of 1:5, 140 min, 160 rpm and 7% ammonium hydroxide in 70% ethanol provided a process efficiency of 72% and a purity of 37%. Whereas, for broccoli florets industrial discards, the optimized process parameters for the purification of glucoraphanin were a feed to resin ratio of 1:1.87, contact time of 30 min, agitation speed of 80 rpm and eluting solvent of 100% water. Subsequent purification of the cationic extract using the anionic resin was performed using the optimized experimental parameters of feed to resin ratio of 1:1.3 for 170 min at 140 rpm and eluted using 7% ammonium hydroxide in 70% ethanol, providing a recovery of 78% and purity of 5%. Finally, the laboratory scale optimized extraction and purification process parameters was extrapolated onto the pilot scale for the fabrication of powdered extracts, indicated that the optimized process was highly efficient in recovering glucoraphanin with high purity even on large scale operation. Hence, the present study developed an efficient, industrially viable green process, for the fabrication of extracts from broccoli industrial discards. The optimized process provided an economically feasible alternative route for the valorization of the lost crop bringing us closer to food security and environmental sustainability.

La découverte et l'application de produits naturels bioactifs en médecine humaine continuent d'attirer l'attention des scientifiques. De plus en plus de données montrent que les produits naturels ayant une valeur médicinale ont un taux de réussite plus élevé que les drogues purement synthétiques. En plus, les produits naturels bioactifs possèdent des propriétés stéréochimiques complexes qui compliquent leur synthèse totale en laboratoire. Il existe donc un effort soutenu pour découvrir de nouvelles voies de biosynthèse de produits naturels provenant de différents environnements et/ou de producteurs naturels afin d'obtenir une bioactivité plus efficace ou nouvelle. De tels efforts sur des bactéries ont révélé que le métabolisme secondaire riche de Streptomyces produit les deux tiers des produits bactériens naturels connus ayant une valeur médicinale. Les enzymes liant la flavine sont connues pour jouer un rôle crucial dans la catalyse de réactions uniques et difficiles dans plusieurs voies de biosynthèse de produits naturels chez les bactéries, les champignons et les plantes. Récemment, nos collaborateurs ont élucidé les voies de biosynthèse menant aux produits naturels piericidine et à la xiamycine. Ces voies contiennent deux flavoenzymes intéressantes, PieE et XiaI, qui catalysent les réactions de monooxygénation impliquant certaines similitudes et certaines différences. Ce projet de thèse a été conçu pour étudier les propriétés structurelles et fonctionnelles sous-jacentes à ces deux flavoenzymes en utilisant la cristallographie aux rayons X et des dosage enzymatiques comme méthodes principales. PieE est classé en tant que monooxygénase dépendante de la flavine à un composant, par opposition à XiaI, qui est une monooxygénase à liaison à la flavine à deux composants. Naturellement, PieE utilise deux sous-sites distincts pour la réduction de la flavine (position OUT) et son utilisation ultérieure en monooxygénation (position IN). Nous observons en effet cette dynamique dans nos structures et ceci a également été rapporté auparavant pour d'autres protéines apparentées dans le groupe A des monooxygénases flavine-dépendantes. Cependant, une étude systématique des différentes structures cristallines de PieE en complexe avec flavin adenine nucleotide (FAD) et avec son substrat ainsi que d'autres monooxygénases flavine-dépendantes du groupe A nous a permis d'identifier la position «glissante» de FAD qui relie les positions OUT et IN qui n'avait pas été signalée auparavant. De plus, une analyse minutieuse de la structure de PieE et des enzymes qui s'y rapportent nous a amenés à identifier la présence d'un ion chlorure que l'on trouve près de la position IN de ces enzymes et qui avait déjà été confondu avec une molécule d'eau. Cet ion chlorure semble verrouiller la flavine dans cette position IN et inhiber sa réduction, comme le confirment les dosages enzymatiques en présence ou en l'absence de celle-ci. D'autre part, XiaI interagit avec la flavine d'une manière totalement différente. XiaI et les enzymes apparentées ont une plus grande affinité pour la flavine réduite par rapport à la flavine oxydée. Les déterminants structurels dictant cette différence n'avaient pas été observés auparavant. En déterminant la structure cristalline aux rayons X de XiaI dans différentes conditions réductrices, nous avons pu observer des changements significatifs dans les éléments de structure secondaire locaux de la protéine. Ces changements incluent la «fusion» d'une hélice C-terminale qui semble non seulement «ouvrir» le site de liaison de la flavine, mais également déclencher une structuration à l'échelle du tétramère des régions de boucle moyenne de la protéine. Ces événements semblent conduire à la réorganisation du site catalytique de l'enzyme. Nous avons également observé un mouvement de la région de boucle F123 avec un rôle potentiel d'accueil ou d'éjection de la flavine. Ces observations appellent des recherches plus approfondies sur la dynamique de XiaI et des enzymes de liaison à la flavine à deux composants apparentés en relation avec leur interaction différentielle avec le cofacteur de la flavine. Globalement, nous avons observé des évènements structurels uniques chez PieE et XiaI après la liaison avec leur substrat ou leur cofacteur. Ces observations soulignent l'importance de déterminer les structures cristallines et la activité d'une même protéine dans différentes conditions pour attraper des instantanés de possibles mouvements dynamiques fonctionnels qui pourraient autrement être manqués. Nos résultats fournissent les bases d'une étude plus approfondie de la dynamique dans ces deux systèmes, qui concerne d'autres protéines ayant une dynamique similaire mais des fonctions différentes. / The discovery and application of bioactive natural products in human medicine continues to attract scientific interest. Increasing amount of data show that natural products of medicinal value have more hit-rates than purely synthetic molecules and usually show complex stereo chemical properties that complicate their total laboratory synthesis. Hence, there is a sustained effort to discover new natural product biosynthetic pathways from different environments and/or natural producers to obtain more efficient or new bioactivities. Such efforts in bacteria revealed that the rich secondary metabolism of Streptomyces produces two-third of known bacterial natural products of medicinal value. Flavin-binding enzymes are known to play a crucial role in catalyzing unique and challenging reactions in numerous natural product biosynthetic pathways in Streptomyces, fungi and plants. Recently, our collaborators elucidated the biosynthetic pathways leading to the synthesis of piericidin A1 and xiamycin. The pathways contain two interesting flavoenzymes, PieE and XiaI that catalyze monooxygenation reactions involving some similarities and certain differences. This doctoral project was designed to investigate the underlying structural and functional properties of these two flavoenzymes using X-ray crystallography and enzymatic assays as the main experimental approaches. PieE is classified as a one-component flavin-dependent monooxygenase as opposed to XiaI which is a two-component flavin-binding monooxygenase. Naturally, PieE uses two distinct sub-sites forthe reduction of flavin (OUT position) and its subsequent use in monooxygenation (IN position). We indeed observed this dynamics in our structures and this has also been reported before for other related proteins in the group A flavin-dependent monooxygenases. However, a systematic investigation of different crystal structures of PieE in complex with FAD and with its substrate as well as other group A Flavin-dependent monooxygenases enabled us to identify a "sliding" position of FAD that bridges the OUT and IN positions that had not been reported before. Moreover, a careful analysis of the structure of PieE and related enzymes has led us to identify the presence of a chloride ion that is found near the IN position of these enzymes that has at times been mistaken for a water molecule in other group A monooxygenases. This chloride ion seems to lock the flavin in this IN position and inhibit its reduction as confirmed by enzymatic assays in its presence or absence. On the other hand, XiaI interacts with flavin in a totally different manner. XiaI's close relatives were reported to have higher affinity to reduced flavin compared to the oxidized one. The structural determinants dictating this difference have not been reported before. By determining the X-ray crystal structure of XiaI under different reducing an aerobic conditions, we were able to observe significant changes in local secondary structure elements of the protein. These changes include "melting" of a C-terminal helix that seems to not only "open up" the flavin binding-site but also to trigger a tetramer-wide structuring of middle loop regions of the protein. These events seem to lead to the reorganization of the catalytic site of the enzyme. We have also observed movement of the F123 loop region with a potential role of flavin welcoming or ejection. These observations call for further investigation of the dynamics in XiaI and related two-component flavin-binding enzymes in relation to their differential interaction with the flavin cofactor. Overall, we have observed unique structural events in both PieE and XiaI that follow substrate or cofactor binding. These observations point to the importance of determining crystal structures and activity of the same protein in different conditions to trap snap-shots of possible functional dynamic movements that could otherwise be difficult to predict. Our results lay the ground for further study of dynamics in both these systems as it relates to other proteins with similar dynamics but different functions.

Plusieurs milliards de dollars sont investis chaque année pour la recherche de molécules bioactives contre diverses maladies. De nos jours, la majorité de ces composés sont synthétisés par l’homme et se conforme à la règle de 5 de Lipinski qui analyse les propriétés physicochimiques d’une molécule bioactive et son potentiel à atteindre une cible thérapeutique. Or, plusieurs composés synthétisés sont extrêmement actifs, mais ne respectent pas la règle de Lipinski. L’aspect limitant pour plusieurs de ces molécules est leur faible caractère hydrophile qui diminue la solubilité physiologique. Dans la littérature, plusieurs méthodes ont été publiées pour améliorer cette caractéristique. Un exemple est la conjugaison de la molécule hydrophobe sur des macromolécules telles des polymères, des polysaccharides ou des peptides. En tenant compte de l’expertise de notre laboratoire, nous avons utilisé le dendrimère PEOT, un polymère monodisperse hyperbranché, comme plateforme pour améliorer les propriétés physicochimiques d’un composé bioactif, l’aminostéroïde AH-38, sur diverses lignées cancéreuses. Pour conjuguer l’AH-38 sur le PEOT, il a été nécessaire d’ajouter une méthode d’ancrage par la préparation d’une molécule d’espacement. L’idée initiale était d’utiliser un espaceur qui permettrait de lier de manière réversible l’aminostéroïde bioactif pour être libéré à la cible thérapeutique. La présence intrinsèque d’un groupement fonctionnel hydrophile dans la structure de la molécule d’espacement serait idéale pour une fonctionnalisation complète des terminaisons. De plus, la molécule d’espacement devrait pouvoir se conjuguer en périphérie du dendrimère par cycloaddition 1,3-dipolaire de Huisgen sans avoir recours à un catalyseur de cuivre. Plusieurs tentatives ont été effectuées sans succès pour fonctionnaliser une molécule d’espacement correspondant à ces critères. Finalement, nous avons choisi de ne pas avoir de fonction hydrophile dans l’espaceur et la conjugaison au dendrimère fait intervenir un catalyseur de cuivre. Dans ce mémoire de maîtrise, les avantages de la nanomédecine, le cheminement de pensée et les travaux effectués pour arriver aux molécules cibles sont présentés. / Each year, billions of dollars are invested in research to treat different illnesses using bioactive molecules. Nowadays, most drugs are synthesized by men; they usually comply with the Lipinski rule of 5 which analyses their physicochemical properties and their potential reach the biological target. However, there are still numerous extremely active compounds, but they do not act in accordance to the Lipinski’s rule. Many of those compounds are limited by their low hydrophilicity which reduces their physiological solubility. In the literature, many strategies have been published on ways to enhance this property. For example, a poorly water-soluble drug may be grafted onto a macromolecule such as a polymer, a polysaccharide or a peptide. Considering our laboratory area of expertise, we used the PEOT dendrimer -- a monodisperse hyperbranched polymer -- as carrier to enhance the physicochemical properties of the aminosteroid AH-38, a bioactive compound over multiple cancer cell lines. To graft the AH-38 onto the PEOT, a linker molecule must be used. In our preliminary research, we wanted to choose a structure that could link reversibly the bioactive aminosteroid to be released at the therapeutic target. In the linker’s structure, a hydrophilic functional group should be present, it would be ideal to completely functionalize the dendrimer’s terminis. Also, the linker should be able to graft onto the dendrimère using the Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition without any copper catalyst. Many attempts were made to synthesize a linker with following these criteria, but they all failed. Consequently, we opted for a linker that does not have a hydrophilic functional group and uses a copper catalyst to graft onto the dendrimer. In this master’s report, nanomedecine’s advantages, the entire thinking process and experiments that were performed in order to obtain the target’s molecules are presented.

Titre de l'écran-titre (visionné le 15 décembre 2023) / Les peptides auto-assembleurs présentent des intérêts majeurs dans le secteur des nanotechnologies. Ils peuvent former des structures spécifiques capables de piéger des molécules bioactives et d'améliorer leur stabilité lors de la digestion gastro-intestinale. Plusieurs travaux ont montré que le peptide auto-assembleur f1-8 (β-Lg f1-8) généré par l'hydrolyse trypsique d'un isolat de protéines du lactosérum (IPL) formait un hydrogel après des étapes de concentration et de purification par filtration membranaire et lavage par centrifugation. Bien que ce procédé ne permettait pas de purifier le peptide β-Lg f1-8 avec le rendement attendu (~90%), un mélange peptidique complexe a été obtenu. Ces fractions peptidiques pourraient former des nanostructures capables de piéger des molécules bioactives. Une des applications ciblées serait donc d'utiliser ces fractions peptidiques pour la délivrance de composés bioactifs. Pour confirmer cette propriété, les interactions peptide-peptide impliquées dans la gélification des fractions peptidiques lors de la purification du peptide β-Lg f1-8 doivent être caractérisées afin de valider les mécanismes mis en jeu. Le premier objectif de cette thèse était de comprendre le processus de purification du β-Lg f1-8 et les interactions peptide-peptide impliquées. Pour cela, les fractions peptidiques obtenues lors des étapes de production du peptide β-Lg f1-8 ont été caractérisées en termes de profils peptidiques, de taux de pureté du peptide β-Lg f1-8 et de la capacité de gélification de chaque fraction. De manière générale, la pureté du β-Lg f1-8 était améliorée en augmentant le nombre de lavages. Néanmoins, malgré les faibles proportions en β-Lg f1-8 obtenues lors des premiers stades de lavage, la formation d'un hydrogel était tout de même constatée. Deux autres peptides (β-Lg f15-20 et β-Lg f41-60) identifiés dans des proportions importantes pourraient être impliqués dans la formation d'hydrogel. Il a été démontré qu'aux premiers stades de lavage, des interactions entre les différents peptides permettaient la formation d'un gel. À l'inverse, lorsque la pureté du β-Lg f1-8 était maximale, un cas particulier de gélification correspondant à l'auto-assemblage a été constaté. Le deuxième objectif de cette thèse visait à étudier l'impact de la concentration peptidique, de la température, du pH et de la concentration en β-Lg f1-8 sur la formation d'un hydrogel par une fraction peptidique issue de l'hydrolyse trypsique d'un isolat de protéines du lactosérum. De plus, l'impact des peptides β-Lg f15-20 et β-Lg f41-60 sur la formation de l'hydrogel par auto-assemblage du peptide β-Lg f1-8 a été déterminé. La formation d'hydrogel par les hydrolysats de protéines du lactosérum résultait d'un équilibre entre les liaisons hydrogène et les interactions hydrophobes et électrostatiques. Les interactions entre les peptides β-Lg f15-20 et β-Lg f41-60 et le peptide β-Lg f1-8 avaient un impact négatif sur l'auto-assemblage du β-Lg f1-8. Grâce aux résultats générés, un mécanisme pour la gélification des fractions peptidiques a été proposé. Le troisième objectif consistait à évaluer la capacité de l'hydrogel de peptide de lactosérum à piéger la curcumine, et à la protéger lors d'une digestion gastro-intestinale en système de digestion statique in vitro. Les résultats obtenus ont été comparés à ceux générés pour un gel d'isolat de protéines sériques (IPL). Une efficacité de piégeage de la curcumine de 91% dans l'hydrogel peptidique a été obtenue contre 99,9% pour le gel d'IPL. À la fin de la digestion intestinale, la rétention de la curcumine était de 98% dans l'hydrogel peptidique, alors qu'elle était de 90% pour le gel d'IPL. Contrairement à ce dernier, la préservation du réseau de nanofibres, et donc des interactions hydrophobes peptide-curcumine au cours de la digestion intestinale, pouvait expliquer cette plus faible libération de curcumine. Les travaux de cette thèse ont donc mis en évidence la capacité de formation d'hydrogel par des fractions peptidiques lors des étapes de purification du peptide β-Lg f1-8. Par ailleurs, la compréhension des mécanismes mis en jeu au cours de la formation d'hydrogel par des fractions peptidiques issues d'une hydrolyse d'un IPL a pu être significativement améliorée afin de proposer une application potentielle de ces fractions peptidiques comme système de piégeage de la curcumine. Finalement, cette étude a permis d'améliorer la compréhension de la libération de la curcumine par la β-lactoglobuline. En conséquence ces différentes conclusions représentent une contribution novatrice pour le développement de nanostructures issues de peptides naturels constituant des systèmes de délivrance de composés bioactifs. / Self-assembling peptides have recently attracted attention in the nanotechnology sector. They can form specific nanostructures with the ability to trap bioactive molecules and enhance their stability during gastro-intestinal digestion. Several works showed that the self-assembling peptide β-Lg f1-8 generated by the tryptic hydrolysis of a whey protein isolate (WPI) could form hydrogels after concentration and purification by membrane filtration and wash steps. Despite the non-optimized purification rate of β-Lg f1-8 reached during the different processing steps, a complex mixture of peptides was obtained. These peptide fractions formed nanostructures with entrapment capacity of bioactive molecules, particularly hydrophobic compounds. A possible application would be to use these peptide fractions for the bioactive compound delivery. To confirm this property, the peptide-peptide interactions involved in the gelation of peptide fractions during purification of the β-Lg f1-8 peptide need to be characterized in order to validate the mechanisms involved. The first objective of this thesis was to understand the purification process of β-Lg f1-8 and the peptide-peptide interactions involved. Thus, the peptide fractions obtained during the β-Lg f1-8 production were characterized for their peptide profiles, β-Lg f1-8 purity and the gelation capacity of each fraction. Overall, the relative proportion of β-Lg f1-8 was correlated with the number of wash steps. Nevertheless, despite the low proportions of β-Lg f1-8 obtained for early purification steps, hydrogel formation was observed. Two other peptides (β-Lg f15-20 and β-Lg f41-60) identified in significant proportions could be involved in hydrogel formation. At the beginning of the purification steps, interactions between peptides with the capacity to form gel were observed. On the contrary, when the purity of β-Lg f1-8 was maximal, gels were produced by self-assembling of β-Lg f1-8. The second objective of this thesis was to investigate the impact of peptide concentration, temperature, pH and β-Lg f1-8 concentration on hydrogel formation by a peptide fraction from the tryptic hydrolysis of a WPI. In addition, the impact of β-Lg f15-20 and β-Lg f41-60 peptides on the β-Lg f1-8 self-assembling was determined. Hydrogel formation by whey protein hydrolysates involved a balance between hydrogen bonds and hydrophobic and electrostatic interactions. The presence of the β-Lg f1-8 peptide initiated gelation by increasing the nanofiber density. Interactions between the β-Lg f15-20 and β-Lg f41-60 peptides and β-Lg f1-8 had a negative impact on β-Lg f1-8 self-assembling. Thanks to the results generated, a mechanism for the peptide fractions gelation was proposed. The third objective was to assess the ability of the whey peptide hydrogel to trap curcumin, widely used as a model hydrophobic bioactive compound, and to protect it from gastro-intestinal digestion in a static in vitro digestion system. The results obtained were compared with those obtained for a whey protein isolate gel. A curcumin entrapment efficiency of 91.0% was obtained in the peptide hydrogel versus 99.9% for the WPI gel. At the end of the intestinal digestion, curcumin retention was 98% in the peptide hydrogel, compared to 90% for the whey protein gel. In contrast to the whey protein gel, the preservation of the nanofiber network, and thus of hydrophobic peptide-curcumin interactions during intestinal digestion, could explain this lower curcumin release. The works carried out in this thesis showed that hydrogel formation occurred with peptide fractions obtained during the purification steps of β-Lg f1-8. Furthermore, understanding of the mechanisms involved in hydrogel formation by peptide fractions derived from hydrolysis of a WPI has been significantly improved to propose a potential application of these peptide fractions as curcumin trapping systems. Finally, this study has improved our understanding regarding the curcumin release from β-lactoglobulin. Consequently, this findings represent a relevant contribution to the development of nanostructures derived from natural peptides for bioactive compounds delivery systems.

L'objectif global de cette étude est de fonctionnaliser les surfaces d'alliage de titane Ti6Al4V ELI (Ti) par des molécules bioactives dans le but de prévenir les infections sur une prothèse d'amputation transcutanée intra-osseuse (ITAP). Dans cette optique, deux stratégies ont été élaborées : l'une pour promouvoir l'attachement des cellules de la peau autour de l'implant et l'autre pour prévenir l'adhésion bactérienne à l'interface matériau-tissu. En premier lieu, la surface de Ti a été modifiée par la fibronectine (Fn), une glycoprotéine d'adhésion présente dans la matrice extracellulaire (MEC), qui favorise l'adhésion cellulaire. La Fn a été adsorbée ou greffée sur la surface de Ti. Deux bras d'ancrage différents ont été employés afin de greffer la Fn, soit la dopamine/l'anhydride glutarique (TiDopGA[indice g]Fn) et les phosphonates (TiPhos[indice g]Fn). Ces dernières conduisent à des groupes terminaux d'acide carboxylique sur le substrat, permettant le greffage covalent avec les groupements fonctionnels (NH₂) de la Fn. Le succès de chaque étape de modification a été vérifié par XPS et angle de contact. La quantité de protéine et la disponibilité des sites d'adhésion RGD (arginine-glycine-acide aspartique) de la Fn adsorbée ou greffée sur chacun des bras d'ancrage ont été évaluées par ELISA. L'effet des surfaces modifiées avec la Fn a été évalué sur la prolifération et l'étalement des fibroblastes d'une part et sur la force d'attachement des feuillets dermiques d'autre part. La Fn greffée via les phosphonates a une plus grande bioactivité et une meilleure activité biologique que celle greffée via la dopamine/l'anhydride glutarique ou lorsqu'elle a été adsorbée. La force d'arrachement des feuillets dermiques était significativement plus élevée autour des surfaces greffées de Fn via les phosphonates, par rapport aux surfaces non traitées. Par conséquent, cette étude met en évidence l'importance d'une sélection appropriée du bras d'ancrage pour contrôler étroitement les interactions cellulaires à l'interface tissu/implant. Le second volet de ce projet repose sur la fonctionnalisation de la surface de Ti par la vancomycine (Vanc), une glycopeptide ayant des propriétés antibactériennes. La Vanc a été greffée de façon covalente via les phosphonates (TiPhos[indice g]Vanc) selon une méthodologie similaire à celle utilisée pour greffer la Fn. Le greffage et la stabilité de la Vanc ont été confirmés par XPS et angle de contact. La surface modifiée par la Vanc permet de réduire l'adhésion des bactéries Staphylococcus epidermidis, bactéries responsables de la majorité des cas d'infections cutanées pour les implants percutanés, comparativement à la surface de Ti non traitée. Ces résultats soutiennent l'effet antibactérien des surfaces de Ti lorsqu'elles sont fonctionnalisées par la Vanc de façon covalente. / The overall goal of this study is to functionalize titanium alloys materials (Ti6Al4V ELI) using biomolecules in order to prevent infections on Intraosseous Transcutaneous Amputation Prosthesis (ITAP). In this context, two strategies have been developed: one to promote attachment of skin cells around the implant and the other to reduce bacterial adhesion at the material-tissue interface. First of all, the Ti6Al4V ELI was modified by fibronectin (Fn), an adhesion glycoprotein found in most extracellular matrices, which promotes cell recognition and adhesion. Fn was adsorbed or grafted onto the surface of Ti6Al4V ELI. Two different linkers were used to graft the Fn, dopamine/glutaric anhydride (TiDopGA[subscript g]) and phosphonate (TiPhos[subscript g]). The linking arms lead to terminal carboxylic acid groups on the substrate, allowing covalent grafting with the amine functions of Fn. The success of each modification step was assessed by XPS and contact angle. The quantity of protein and the availability of RGD adhesion sites of the Fn adsorbed or grafted via the two investigated linking arms were evaluated by ELISA. The effect of the Fn-modified surfaces was evaluated on the proliferation and spreading of fibroblast cells and on the attachment strength of the dermal layers. It has been evidenced that Fn grafted via phosphonates has a greater bioactivity and a better biological activity than Fn grafted via dopamine/glutaric anhydride or when adsorbed. The peeling force of the dermal layers was also significantly higher around surfaces grafted with Fn via phosphonates, compared to untreated surfaces. Therefore, this study highlights the importance of appropriate selection of the anchor arm to closely control cellular interactions at the tissue/implant interface. The second part of this study is based on the functionalization of the Ti6Al4V ELI surface by vancomycin (Vanc), a glycopeptide with antibacterial properties. Vanc was covalently grafted via phosphonate (TiPhos[subscript g]Vanc) using a similar methodology to that used to graft Fn. The grafting and stability of the Vanc was confirmed by XPS and contact angle. The Vanc-modified surface reduces the adhesion of Staphylococcus epidermidis bacteria, the bacterium responsible for the majority of skin infections in percutaneous implants, compared to the surface of untreated Ti6Al4V ELI. These results confirm the antibacterial effect of the Ti6Al4V ELI surfaces when covalently functionalized by the Vanc.