Les bicycles peptidiques possèdent des propriétés structurales et pharmacologiques très attrayantes pour le développement de composés bioactifs et sont d’excellents candidats pour la création de chimiothèques visant la découverte d’agents thérapeutiques. Ce type de structure se retrouve dans de nombreux produits naturels démontrant des activités biologiques très variées. Malgré leur grand potentiel, peu d’approches synthétiques efficaces et donnant accès à une grande diversité moléculaire ont été décrites jusqu’à maintenant dans la littérature. Ce mémoire décrit le développement d’une nouvelle approche synthétique sur support solide utilisant la réaction multicomposante de Ugi-Smiles pour préparer des bicycles peptidiques inspirés du Bouvardin et de ses analogues, une famille de produits naturels des plantes Rubiaceae avec des activités anticancéreuses et antimicrobiennes. L’approche présentée donne accès à des systèmes bicycliques complexes et permet l'introduction d’une grande diversité moléculaire. Dans un premier temps, la réaction de Ugi-Smiles a été utilisée pour simultanément ancrer et coupler les deux premiers acides aminés à une résine par leur chaîne latérale. Une étude sur les réactifs et les paramètres a permis d’effectuer les ajustements fonctionnels et structurels sur les composantes qui étaient nécessaires pour une réaction de Ugi-Smiles permettant le clivage de la résine en milieu acide. Par la suite, une première macrocyclisation tête-à-queue suivi de l’élongation du peptide devait permettre une seconde macrocyclisation pour générer un bicycle peptidique pouvant être clivé de la résine. Or,il a été observé que la première cyclisation ne se déroule pas comme prévu et que le système bicyclique désiré n’a pas été obtenu. Une étude a permis d’identifier les éléments problématiques de l’approche et des ajustements sont proposés pour éviter les difficultés de la première macrocyclisation. Malgré tout, des avancements importants ont pu être effectués dans ce projet et l’application des correctifs proposés dans ce mémoire permettra de générer les bicycliques peptidiques ciblés. / Peptide bicycles display very attractive structural and pharmtacological properties for the development of bioactive compounds and are excellent candidates for the creation of chemical libraries for the discovery of therapeutic agents. This type of structure is found in a great number of natural products with a wide variety of biological activities. Despite their great potential, very few effective synthetic approaches giving access to a large molecular diversity have been described in the literature. This document describes the development of a new synthetic approach on solid support using a Ugi-Smiles multicomponent reaction to prepare peptide bicycles inspired by Bouvardin and its analogs, a family of natural products from Rubiaceae plants with antitumoral and antimicrobial activities. The described approach gives access to complex bicyclic systems and allows the introduction of a large molecular diversity. In a first step, the Ugi-Smiles reaction is used to simultaneously anchor and link the first two amino acids to a resin by their side chain. A study on the reagents and reaction parameters made it possible to carry out functional and structural adjustments on the components allowing the Ugi-Smiles reaction and the cleavage from the resin in an acid medium. Subsequently, a first head-to-tail macrocyclization followed by the elongation of the peptide was supposed to allow a second macrocyclization to generate a peptide bicycle, which can be cleaved from the resin. However, the first cyclization did not go as planned and the desired bicyclic system has not been obtained. A study has identified the problematic elements of the approach and adjustments are proposed to avoid the difficulties of the first macrocyclization. Despite this failure, significant progress has been made in this project and application of the corrections proposed in this document will surely allow the successful synthesis of the targeted bicyclic peptides.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2019-2020 / Les maladies inflammatoires chroniques sont un fardeau de santé important à travers le monde. Les traitements actuellement disponibles soulagent la douleur et l’inflammation, mais leurs effets secondaires rendent leur utilisation à long terme risquée. À la lumière de cette problématique, la communauté scientifique s’intéresse au potentiel d’anti-inflammatoires naturels comme les endocannabinoïdes. Les endocannabinoïdes sont des lipides endogènes qui activent les récepteurs cannabinoïdes (CB1 et CB2). Ils régulent ainsi divers processus physiologiques tels l’appétit, l’adipogénèse et la nociception. Les deux endocannabinoïdes les mieux caractérisés, le 2-AG et l’AEA, peuvent également moduler l’inflammation en activant le récepteur CB2 à la surface des cellules immunitaires. Les souris déficientes pour le récepteur CB2 présentent un phénotype inflammatoire exacerbé, suggérant que ce récepteur est anti-inflammatoire. Cependant, le rôle des endocannabinoïdes dans l’inflammation est beaucoup plus complexe puisqu’ils peuvent être métabolisés en une grande variété de médiateurs lipidiques de l’inflammation. Leur voie de dégradation principale est leur hydrolyse en acide arachidonique (AA), qui sert de précurseur à la biosynthèse d’éicosanoïdes pro-inflammatoires comme le leucotriène B4 et la prostaglandine E2. Ils peuvent également être métabolisés directement par certaines enzymes impliquées dans la synthèse d’éicosanoïdes, pour générer des médiateurs comme les prostaglandines-glycérol (PG-G). Par conséquent, les endocannabinoïdes peuvent générer un profil unique d’effets pro- et anti-inflammatoires. Des stratégies thérapeutiques visant à bloquer l’hydrolyse des endocannabinoïdes pour amplifier leurs effets anti-inflammatoires ont été étudiées, mais une très grande proportion de cette recherche a été effectuée sur des animaux. Les façons dont les endocannabinoïdes sont synthétisés et dégradés par les leucocytes humains, ainsi les effets de leurs métabolites sur les fonctions de ces cellules, sont mal définis. Bien que les résultats obtenus dans des modèles animaux soient prometteurs, ces mécanismes doivent être mieux caractérisés chez l’humain avant qu’il ne soit envisageable de les manipuler afin de traiter les maladies inflammatoires. Le premier objectif de mon doctorat était de caractériser les voies de dégradation et de biosynthèse des endocannabinoïdes chez les leucocytes humains. Nous avons documenté l’expression de toutes les lipases hydrolysant le 2-AG, chez plusieurs types leucocytaires. Ces résultats ont souligné que chaque leucocyte exprime plusieurs 2-AG hydrolases et que les inhibiteurs sélectifs actuellement disponibles n’inhibent que partiellement l’hydrolyse du 2-AG chez ces cellules. Ces données ont également démontré que les leucocytes humains hydrolysent très efficacement le 2-AG, une découverte qui nous a permis de mettre en évidence une nouvelle voie de biosynthèse du 2-AG par les leucocytes. En présence d’inhibiteurs d’hydrolyse, les neutrophiles, éosinophiles et monocytes stimulés avec de l’AA ont produit des quantités de 2-AG environ 1000 fois supérieures aux niveaux rapportés dans la littérature. Ils ont également transformé d’autres acides gras polyinsaturés en leurs endocannabinoïdes-glycérol respectifs. Nous avons démontré que cette voie de biosynthèse est dépendante de la réacylation des acides gras dans les phospholipides membranaires, et que leur métabolisme subséquent en endocannabinoïdes implique possiblement l’acide lysophosphatidique comme intermédiaire. Cette étude est la première à rapporter une biosynthèse significative d’endocannabinoïdes par les leucocytes humains, et à démontrer que cette biosynthèse est indépendante de la voie classique de biosynthèse du 2-AG. Nous avions également pour objectif de caractériser l’impact du 2-AG et des PG-G sur les fonctions des leucocytes humains. Nous avons démontré qu’en présence d’IL-5, une cytokine impliquée dans l’inflammation éosinophilique présente dans l’asthme, le 2-AG induit une migration importante des éosinophiles. Cet effet du 2-AG requiert à la fois l’activation du récepteur CB2 et l’hydrolyse du 2-AG en AA pour produire des métabolites de la 15-lipoxygénase. Ceci souligne que l’hydrolyse du 2-AG permet la production de médiateurs causant des effets pro-inflammatoires et qu’il serait souhaitable de bloquer cette hydrolyse in vivo. Finalement, nous avons étudié l’effet de la PGE2-G sur les fonctions des neutrophiles et démontré qu’elle inhibe plusieurs fonctions effectrices de ces cellules. Cet effet inhibiteur nécessite l’hydrolyse de la PGE2-G en PGE2 par les neutrophiles, et l’activation du récepteur EP2 à leur surface. Nos travaux permettront de mieux comprendre la façon dont l’hydrolyse des endocannabinoïdes devrait être bloquée chez les humains, ainsi que tous les effets biologiques qui en découleront. Le but ultime est de développer de nouveaux traitements contre les maladies inflammatoires chroniques, qui maximiseront les effets analgésiques et anti-inflammatoires des endocannabinoïdes tout en limitant leurs effets néfastes. / Chronic inflammatory diseases are an important health burden worldwide. The currently available treatments alleviate pain and inflammation, but their numerous adverse effects make their long term use difficult. Therefore, the scientific community is studying the anti-inflammatory potential of mediators such as endocannabinoids. Endocannabinoids are endogenous lipids that activate the cannabinoid receptors, namely CB1 and CB2. In doing so, they regulate various physiological functions and cognitive processes functions such as appetite, adipogenesis and nociception. The two best-characterized endocannabinoids, 2-AG and AEA, also exert effects on immune cell functions, leading to the modulation of immunity and inflammation. They do so by activating the CB2 receptor, which is expressed in the periphery, notably on immune cells. Notably, it was shown that mice lacking the CB2 receptor display an exacerbated inflammatory phenotype, suggesting that CB2 activation by endocannabinoids is anti-inflammatory. However, the biological effects of endocannabinoids are far more complex, given that they can be metabolized into a wide variety of bioactive lipids. The main degradation pathway for 2-AG and AEA is their hydrolysis into arachidonic acid (AA), a fatty acid that acts a precursor for the biosynthesis of several pro-inflammatory eicosanoids such as leukotriene B4 and prostaglandin E2. They can also be directly metabolized by eicosanoid-biosynthetic enzymes, which generates mediators such as glyceryl-prostaglandins (PG-Gs). Therefore, endocannabinoids can generate an intriguing profile of pro- and anti-inflammatory effects, depending on the balance between their catabolic pathways and receptor activation. Therapeutic strategies aiming at blocking endocannabinoid hydrolysis to amplify their anti-inflammatory effects have been extensively studied. However, most of these studies were conducted in animals. Endocannabinoid metabolism by human leukocytes, as well as the effects of their metabolites on human leukocytes functions, are poorly defined. Although the data obtained from animal models is promising, these mechanisms must be characterized in humans before they can be manipulated to treat inflammatory diseases. Our first aim was to characterize endocannabinoid biosynthetic and hydrolytic pathways in human leukocytes. We documented the expression of several 2-AG hydrolases in human neutrophils, eosinophils, monocytes, lymphocytes and alveolar macrophages. The data we obtained underscored that each cell type expresses several 2-AG hydrolases, and that the selective inhibitors that are currently available only partially block 2-AG degradation by leukocytes. Our results also show that human leukocytes are experts at hydrolyzing 2-AG, a finding that allowed us to establish a novel 2-AG biosynthetic pathway in human leukocytes. In the presence of 2-AG hydrolysis inhibitors, neutrophils, eosinophils and monocytes stimulated with AA produced 2-AG in amounts ~ 1000 times greater than those previously reported. They also converted other polyunsaturated fatty acids into their glycerol-containing endocannabinoid counterparts. We showed that this endocannabinoid biosynthetic pathway depends on fatty acid reacylation into membrane phospholipids, and that their subsequent metabolism into endocannabinoid likely requires the production of a lysophosphatidic acid intermediate. This study is the first one to report a significant endocannabinoid synthesis by human leukocytes, and to show that this biosynthesis is independent from the classical 2-AG biosynthetic pathway. We also aimed to characterize the impact of 2-AG and PG-Gs on human leukocyte functions. We showed that in the presence of IL-5, a cytokine involved in the eosinophilic inflammation found in asthma, 2-AG induces eosinophil migration. This requires the activation of the CB2 receptor, as well as 2-AG hydrolysis into AA to produce 15-lipoxygenase metabolites. This underscores that 2-AG hydrolysis by eosinophils allows for the synthesis of mediators that have pro-inflammatory effects, and that blocking this hydrolysis in vivo may be beneficial. We also studied the biological effects of PGE2-G and found that it inhibits several effector functions of human neutrophils. This inhibitory effect requires PGE2-G hydrolysis into PGE2 by neutrophils, and the activation of the EP2 receptor on their surface. Our work will allow a better understanding of how endocannabinoid hydrolysis should be blocked in humans, and of the biological effects that will result from this inhibition. The goal is to develop new treatments against chronic inflammatory diseases, which will enhance the analgesic and anti-inflammatory effects of endocannabinoids while limiting their deleterious effects.

Plusieurs études ont rapporté l'activité antimicrobienne et anti-oxydante d'extraits de sous-produits végétaux. Le recours à l'utilisation de ces extraits dans les produits alimentaires pourrait constituer une stratégie innovante et prometteuse. Les résidus de fruits et légumes peuvent être une source potentielle de composés bioactifs. L'enjeu de cette étude était d'initier des recherches qui pourront aboutir au développement d'agents anti-oxydants-antimicrobiens à partir des sous-produits végétaux destinés à la conservation des aliments, comme une alternative aux produits chimiques synthétiques. L'étude initiale a été d'identifier des extraits de fruits et légumes qui possèdent à la fois de grandes propriétés antimicrobiennes et anti-oxydantes. Enfin, des moyens simples pour augmenter l'activité antimicrobienne de ces extraits ont été étudiés. Environ 160 extraits aqueux de sous-produits de fruits et légumes ont été criblés pour évaluer leur potentiel antimicrobien et anti-oxydant. L'activité antimicrobienne a été déterminée par l'inhibition de la croissance d'Escherichi coli et de Bacillus subtilis. L'activité anti-oxydante a été mise évidence par le test au DPPH (2,2-diphenyl -1-picrylhydrazyl). L'étude a conduit à l'identification des extraits présentant à la fois un potentiel antimicrobien et des propriétés anti-oxydantes. Les propriétés bioactives des extraits sont influencées par le pH de l'extrait, le type de tissu (fruits, feuilles et racines) et le type physiologique des fruits (climactérique). Les résultats ont montré l'existence d'une relation entre les propriétés anti-oxydantes et antimicrobiennes des extraits de plantes. De ce fait, l'indice anti-oxydant-antimicrobien développé pourrait être utile dans le choix des sources végétales bioactives. Les extraits de plantes aux propriétés antimicrobiennes et anti-oxydantes présentent un potentiel comme agent de conservation sécuritaire, bénéfique pour la santé et économique. La considération de la vitesse de piégeage des radicaux (facteur du temps) pour définir l'efficacité réelle (capacité) du système anti-oxydant a été considérée comme la meilleure manière d'exprimer avec plus de fiabilité le pouvoir anti-oxydant réel. La nouvelle expression, le pouvoir antiradicalaire - ARP, produite à partir du test DPPH, peut être plus utile pour identifier l'activité anti-oxydante des échantillons biologiques. Certains échantillons présentaient une valeur ARP élevée tels que les extraits de rambutan, feuille de canneberge, feuille de bleuet, feuille de vigne (sauvage), feuille de framboise, feuille de bétel, avocat, grenade et cherimoya. Les extraits de feuilles possèdent, en général, une valeur d'ARP supérieure à celle des fruits tandis que, les extraits de racines présentent les plus faibles ARP. De plus, cette étude montre également que le nombre moyen d'oxydation du carbone de mélanges complexes tels que des extraits de plantes peut prédire leur pouvoir anti-oxydant, en dépit de la disparité entre les tissus de feuilles et de fruits. Le spectre d'activité anti-radicalaire d'extraits sélectionnés a été exploré. L'activité anti-oxydante a été évaluée par différentes méthodes incluant, capacité anti-oxydante équivalente de Trolox (TEAC), essai de radicaux libres (DPPH), test du pouvoir réducteur d'ion ferrique (FRAP), mesure du potentiel d'oxydoréduction, réduction du peroxyde d'hydrogène, du radical hydroxyle, d'anion superoxyde, d'oxyde nitrique et de l'activité de chélation du fer. Les teneurs totales en composés phénoliques (TPC) et en flavonoïdes (TFC) des extraits ont également été déterminées. Les extraits de feuille de bétel, fruit de bleuet, feuille de cassis, feuille de canneberge ont montré une bonne activité de piégeage des radicaux (essai TEAC); ceux de pomme, oseille, vigne rouge et racine de pissenlit étaient efficaces contre SOA; ceux de feuilles de canneberge, feuille de bleuet, cassis et romarin contre le radical hydroxyle; ceux de bette à carde, panais, brocoli et orange contre H2O2; et ceux de pomme de terre, banane, oseille, feuille d'argousier contre l'oxyde nitrique. Les extraits de feuille et fruit de bleuet, grenade, cassis et feuille de bétel ont montré un bon pouvoir réducteur d'ion ferrique. Les extraits possédant la capacité élevée de chélation du fer étaient: feuille d'argousier, radis, panais, feuille de bétel et mangoustan. L'extrait de feuille de bétel présentait des activités élevées, y compris de fixation du fer et de piégeage de divers radicaux, à l'exception de l'oxyde nitrique, où l'activité était néanmoins modérée. Les essais de TEAC, de DPPH et de FRAP fournissent essentiellement la même réponse concernant l'activité anti-oxydante des extraits de plantes, ce qui suggère que l'un de ces essais serait suffisant pour évaluer leur capacité anti-radicalaire. / Cette étude suggère également que l'activité anti-oxydante d'une substance, déterminée par un ou plusieurs essais, ne donne pas une image complète de son efficacité contre les diverses espèces de radicaux oxygénés; et elle montre que la détermination du spectre de l'activité anti-radicalaire serait nécessaire. L'activité antimicrobienne des extraits de plantes sélectionnés a été évaluée en détail par turbidimétrie en milieu liquide et par diffusion en milieu solide (gel). L'activité antimicrobienne a été exprimée dans la première méthode par l'inhibition de la croissance (GI), par la concentration minimale inhibitrice (MIC) et par une nouvelle expression, dénommée index antimicrobien (AMI). Dans la seconde méthode, l'activité a été exprimée en zone d'inhibition. L'AMI prend en compte les trois phases de croissance des bactéries. Bien que les méthodes turbidimétriques soient fiables dans l'évaluation de l'activité antimicrobienne des substances, la nouvelle expression (AMI) semble être plus significative car, elle comprend l'information sur l'interaction entre la substance et le micro-organisme et sa vitesse de croissance en présence de cette substance. De plus, l'AMI démarque l'activité des échantillons, même ceux qui sont très actifs. Le spectre d'activité antimicrobienne des extraits de plantes sélectionnés a été également étudié. Seulement quelques extraits ont montré un spectre d'activité antimicrobienne assez large. En effet, seul l'extrait de feuille de bétel a un large spectre d'activité contre les bactéries, les levures et les champignons, suivis des extraits de grenade et de fruits d'argousier qui semblent être efficaces contre les bactéries et les levures. L'extrait de cassis est effectivement une substance antibactérienne. Finalement, différentes stratégies pour améliorer l'activité antimicrobienne d'extraits anti-oxydants-antimicrobiens sélectionnés ont été explorées. Trois approches, incluant l'extraction par solvants sélectifs, le mélange binaire des extraits et l'addition de composés végétaux, ont été étudiées. L'activité anti-oxydante-antimicrobienne et le profil phytochimique ont été analysés. Le résultat montre que l'eau chaude peut être utilisée comme solvant pour l'extraction d'agents anti-oxydants-antimicrobiens d'origine végétale, bien qu'un solvant polaire extrait en préférence les substances phénoliques et modestement les substances non polaires comme les terpénoïdes. Toutefois, compte tenu du rendement et de l'activité des extraits, l'eau semble être appropriée, et elle peut être considérée comme un solvant efficace pour les fruits qui sont riches en substances phénoliques. Néanmoins, d'autres solvants sélectifs doivent être considérés pour l'extraction des substances actives non-polaires issues de matière première végétale comme les feuilles. Certaines augmentations de l'activité antimicrobienne sont possibles par le mélange de deux extraits de plantes ou par l'addition de composés végétaux. On a aussi observé que la composition des mélanges peut être importante, car les interactions synergiques ou antagonistes se retrouvent dans certaines proportions. Le mélange des extraits de grenade et cassis d'une part et le mélange des extraits de thé vert et pomme de cajou d'autre part ont montré une amélioration d'activité. L'ajout de glyoxal de méthyle et mono-caprine a également produit une augmentation de l'activité des extraits de plantes. L'addition de glyoxal de méthyle à 25 % (p/p) a amélioré l'activité des extraits de grenade et de cassis. Dans l'ensemble, ce travail a exploré le potentiel des extraits des sous-produits de fruits et de légumes comme agent anti-oxydant-antimicrobien. Les extraits de plantes montrant des potentiels anti-oxydants et antimicrobiens regroupent: olive, canneberge, noni, feuille de bétel, cassis, grenade, citronnelle, épinard, raisin vert (vin), cassis (résidu), aubergine, ramboutan, prune indienne, feuille de canneberge, feuille de romarin, feuille de vigne (sauvage), thé vert, mangoustan et feuille de framboise. Cependant, de cette liste, seuls quelques extraits (feuille de bétel, grenade, résidus de cassis) présentent un large spectre d'activité anti-oxydante et antimicrobienne. En outre, cette étude a introduit de nouvelles expressions pour l'activité anti-oxydante (ARP) et antimicrobienne (AMI) des mélanges complexes tels que les extraits de plantes. Ces expressions peuvent être utiles pour le criblage de matériels d'origine végétale dans la recherche de ces activités. Un autre enseignement de cette étude est que l'amélioration de l'activité antimicrobienne des extraits de plantes ne peut pas être possible simplement par le mélange d'extraits, en raison des interactions potentielles entre les composants des extraits. La connaissance de la composition phytochimique est essentielle pour comprendre de telles interactions, dans la sélection des mélanges et pour déterminer les approches possibles pour améliorer l'activité antimicrobienne. / Les sous-produits de végétaux peuvent être une source potentielle d'antioxydant-antimicrobiens pour une application dans la conservation des aliments, comme alternative aux agents synthétiques, mais beaucoup de travaux sont encore nécessaires pour atteindre ce but, ce qui nécessiterait une approche systémique. / There is a growing interest in the development of strategies to use agricultural and industrial residues as a source of high value-added, including bioactive products. The residues of fruits and vegetables may be a potential source of bioactive compounds. The major objective of this work is to conduct studies to pave the way for the development of antioxidant-antimicrobials from plant by-products for use in food preservation, as alternative to synthetic chemicals. The starting point was the identification of extracts of fruit and vegetable extracts exhibiting high antimicrobial and antioxidant properties. The selected extracts were then characterized for their spectrum of antioxidant and antimicrobial activities. Finally, simple ways of enhancing the antimicrobial activity of the selected extracts were examined. Aqueous extracts of about 160 fruit and vegetable by-products were evaluated for their potential as antimicrobial and antioxidant agents. The growth inhibiting activity of all the 160 extracts were tested against Escherichia coli, and Bacillus Subtilis; and the antioxidant activity was determined by DPPH radical scavenging assay. The pH of the extract, type of tissue (fruit, leaf and root) and physiological type of fruits (climacteric) had impact on the bioactive properties. There was some relationship between antioxidant and antimicrobial properties of the plant extracts. The proposed antioxidant-antimicrobial index may be useful in the selection of plant sources of bio-actives. Consideration of rate of radical quenching (time factor) to define actual efficacy (capacity) of antioxidant system was found to be a better and reliable way of expressing the real antioxidant power. The new expression, antiradical power - ARP, generated from DPPH assay may be more useful in identifying the antioxidant activity of biological samples. Some samples exhibited high ARP value such as rambutan, cranberry leaf, blueberry leaf, grape leaf (wild), raspberry leaf, betel leaf, avocado, pomegranate and custard apple. Leaf extracts possess, in general, higher ARP than fruits, and root extracts possess low ARP. In addition, this study also suggests that average carbon oxidation number of complex mixtures such as plant extracts may portend their antioxidant power, in spite of the disparity between leaf and fruit materials. In chapter 4, plant extracts selected from the original 160 were investigated for their spectrum of anti-radical activity. The antioxidant activity was evaluated by Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), DPPH free radical assay (DPPH), ferric reducing power assay (FRAP), redox potential measurement, hydrogen peroxide, hydroxyl radical, superoxide anion, nitric oxide and iron chelating activities. Their total phenolic content (TPC) and total flavonoid content (TFC) were also determined. Betel leaf, blueberry fruit and black currant and cranberry leaf showed high radical scavenging activity (TEAC assay); apple, sorrel, red grape and dandelion root were effective against SOA; cranberry leaf, blueberry leaf, black currant and Rosemary against hydroxyl radical; rainbow chard, parsnip, broccoli and orange against H2O2; and potato, banana, sorrel, sea buckthorn leaf against nitric oxide. Blueberry leaf and fruit, pomegranate, black currant and betel leaf showed high ferric ion reducing power. The extracts showing high iron binding capacity were: sea buckthorn leaf, radish, parsnip, betel leaf and mangosteen. Betel leaf extract exhibited high activities, including iron binding and scavenging of various radicals except nitric oxide, where the activity was moderate. TEAC, DPPH and FRAP assays provide essentially the same response with respect to the antioxidant activity of plant extracts, suggesting that any one of them would be adequate to evaluate their anti-radical capacity. This study also suggests that antioxidant activity of a substance, determined by one or more related assays, does not give the complete picture of its effectiveness against various species of oxygen radicals; and emphasizes that determination of the spectrum of the anti-radical activity would be necessary. In chapter 5, the antimicrobial activity of selected plant extracts was evaluated in detail by turbidimetric methods in liquid medium, and by well-diffusion method in gel medium. The antimicrobial activity was expressed in the former by growth inhibition, minimum inhibitory concentration - MIC and by a new expression, the antimicrobial index – AMI; and in the latter, expressed by zone of inhibition. AMI takes into account all the three growth phases of the bacteria. Although the turbidimetric methods were in good agreement in the assessment of the activity of the substances, the new expression, AMI, appears to be more meaningful since it carries the information regarding interaction between the substance and the microorganism and the growth rate in the presence of that substance. In addition, AMI demarcates the activity of samples, even those found to be highly active. Furthermore, the spectrum of antimicrobial activity of selected plant extracts was also examined. Only a few extracts showed some broad spectrum in their activities. In effect, only betel leaf extract showed a broad spectrum of antimicrobial activity against bacteria, yeasts and fungi; whereas pomegranate and sea buckthorn fruit extracts appear to be effective against both bacteria and yeasts. Black currant extract is effectively an antibacterial substance. In chapter 6, various ways of enhancing the antimicrobial activity of selected antioxidant-antimicrobial extracts were explored. Three approaches, including selective solvent extraction, binary blending of extracts and addition of plant compounds were investigated. Antioxidant, antimicrobial activity and the profile of phytochemical classes were analyzed. The results showed that hot water could be used for solvent extraction of antioxidant-antimicrobials from plant materials, albeit a polar solvent that extracts phenolic substances preferably and only modestly non-polar substances such as terpenoids. However, considering the yield of the extracts and the activity, water appeared to be an effective solvent solvent for fruit sources that are rich in phenolic substances. Other selective solvents must be considered for extraction of active non-polar substances for plant sources such as leaves. Some enhancement in antimicrobial activity was possible by either mixing plant extracts or by the addition of plant compounds. It was also observed that the composition of blends or mixtures might be important, since synergistic or antagonistic interactions occurred at certain proportions. Pomegranate and black currant extract blends and green tea and cashew apple extract blends showed enhancement in activity. The addition of methyl glyoxal and mono-caprin also showed enhancement in the activity of plant extracts. Methyl glyoxal at 25 % (w/w) addition improved the activity of pomegranate and black currant extracts. Overall, this work explored the potential of extracts of fruit and vegetable by-products as anti-oxidant-antimicrobials. Some plant extracts having potential as antioxidant-antimicrobial agents. They include: olive, cranberry, noni, betel leaf, black currant, pomegranate, lemon grass, spinach, green grape (wine), black currant (residue), egg plant, rambutan, Indian plum, cranberry leaf, rosemary leaf, grape leaf (wild), green tea, mangosteen and raspberry leaf. However, the list is reduced to a few (betel leaf, pomegranate, black currant residue), should broad antioxidant and antimicrobial activities are taken into account. In addition, this study introduces new expressions for antioxidant (ARP) and antimicrobial (AMI) activities of complex mixtures such as plant extracts, and they can be useful in the screening of plant materials for these activities. The knowledge of the phytochemical composition is essential to understand such interactions, in the selection of mixtures and to determine possible approaches to enhance the antimicrobial activity. Plant by-product can be a potential source of antioxidant-antimicrobial for use in food preservation, as alternative to synthetic agents, but much work is needed to realize this goal, and that would require a systemic approach.

Le cruor bovin, la matière solide du sang, est un déchet des abattoirs produit en très grande quantité dans le monde. Ce coproduit est composé principalement d'hémoglobine, une protéine riche en peptides bioactifs après son hydrolyse enzymatique. Cependant, lors de l'hydrolyse conventionnelle par la pepsine, des agents chimiques sont nécessaires pour ajuster et réguler le pH de la solution et, les hydrolysats finaux produits contiennent des niveaux élevés en sels minéraux. Pour pallier ces inconvénients, il a été proposé d'appliquer dans cette étude, pour la première fois, une technologie verte, appelée électrodialyse avec membrane bipolaire (EDMB), comme méthode alternative à l'hydrolyse enzymatique conventionnelle de l'hémoglobine afin d'obtenir des peptides bioactifs purifiés. Les objectifs de cette thèse étaient de tester la faisabilité de ce nouveau procédé pour la production de peptides bioactifs à partir d'hémoglobine bovine, d'établir les conditions optimales, d'éviter le colmatage membranaire et d'appliquer un nouveau procédé original d'EDMB à « multiple-étapes » permettant la production de peptides bioactifs déminéralisés sans ajout de produits chimiques. Des configurations bipolaires/monopolaires (anioniques ou cationiques) utilisant les ions H⁺ et OH⁻ générés par les membranes bipolaires pour réguler le pH ont été étudiées et comparées à un procédé conventionnel utilisant des acides et des bases chimiques. La configuration d'EDMB formée avec les membranes cationiques a permis la production d'hydrolysats contenant une faible concentration en sels minéraux mais avec la présence d'un colmatage sur la membrane cationique, alors que la configuration d'EDMB utilisant des membranes anioniques a permis la production d'hydrolysats sans colmatage mais avec une concentration en sel similaire à celle de l'hydrolyse conventionnelle (contrôle). En se basant sur ces résultats, une nouvelle configuration d'EDMB à trois compartiments a été mise en place et étudiée pour dénaturer l'hémoglobine, inactiver la réaction enzymatique et déminéraliser l'hydrolysat peptidique en simultané. Une déminéralisation de 85% a été atteinte. Cependant, un colmatage a encore été observé sur la membrane anionique en raison de la précipitation de l'hème. Pour cette raison, une étape supplémentaire de décoloration a été réalisée avant la déminéralisation pour éviter le colmatage en utilisant l'acide électro-généré. Les peptides décolorés et déminéralisés récupérés ont montré une activité antioxydante, une activité antibactérienne contre plusieurs souches bactériennes (Gram+ et Gram-) et pour la première fois une activité antifongique contre de nombreuses souches de moisissures et de levures. Dans un contexte d'économie circulaire, cette technologie durable s'avèrerait efficace pour effectuer plusieurs opérations simultanément et présente un potentiel important au niveau industriel pour l'hydrolyse du sang, puisqu'elle produit des bio-peptides purifiés ayant une faible teneur en sels minéraux et pouvant être utilisés comme conservateurs naturels sur la viande. / Bovine cruor, a slaughterhouse waste, is produced in large quantities all around the world. This co-product is mainly composed of hemoglobin, a protein rich in bioactive peptides after its enzymatic hydrolysis. However, during conventional hydrolysis, chemical agents are necessary to adjust or regulate the pH of the solution and the final hydrolysates produced contain high levels of mineral salts. Therefore, in this study we applied for the first time a green technology named electrodialysis with bipolar membrane (EDBM) as an alternative method to the conventional enzymatic hydrolysis of hemoglobin to obtain purified bioactive peptides. The main objectives of the present thesis were to test the feasibility of this new process to produce bioactive peptides from bovine hemoglobin, to establish the optimal conditions while avoiding membrane fouling and to apply a new original « multiple-step » EDBM process allowing the production of demineralized bioactive peptides without the addition of chemical salts. Bipolar and monopolar (anionic or cationic) configurations using the H⁺ and OH⁻ generated by the bipolar membranes to regulate the pH were investigated and compared to a conventional process using chemical acid and base. The EDBM configuration formed with cationic membranes allowed the production of hydrolysates containing a low concentration of mineral salts but with fouling formation on the cationic membrane, while EDBM configuration formed with anionic membranes allowed the production of hydrolysates without fouling but with a salt concentration similar to the control. Based on these results, a new three-compartment EDBM configuration was carried-out to denaturate the hemoglobin, inactivate the enzymatic reaction, and demineralize the hemoglobin hydrolysate simultaneously. A demineralization level of 85% has been achieved. However, fouling was still observed on the anionic membrane due to hem precipitation. For this reason, an additional step of discoloration was tested before the demineralization to avoid fouling using the electrogenerated acid. The discolored and demineralized peptides recovered showed antioxidant activity, antibacterial activity against multiple bacterial strains (Gram+ and Gram-), and for the first time, antifungal activity against several molds and yeasts strains. Moving towards a circular economy, this sustainable technology was found to be effective in performing multiple operations simultaneously and has a great potential for industrial hydrolysis of blood, since it produces purified biopeptides with a low mineral content that can be used as natural preservatives on meat.

En raison de la perception du caractère santé des jus de fruits par les consommateurs, il serait intéressant de développer des jus de fruit fonctionnels par l'ajout de composés bioactifs. Or, nombreux sont les composés bioactifs qui sont sensibles aux procédés de transformation des aliments et à leurs conditions d'entreposage. Une technique originale d'encapsulation par emulsion multiple (E1/H/E2) pour différents composés bioactifs a été développée. Le type d'émulsifiant, leur concentration, les ratios d'eau et d'huile, les conditions d'agitation (temps, vitesse, température) et les caractéristiques des emulsions produites (viscosité, microscopie, granulométrie laser) ont été étudiés. La cinétique de stabilisation de la tension interfaciale et la concentration micellaire critique (CMC) ont été déterminées. De façon à valider le choix des concentrations optimales en émulsifiants, les isothermes de compression de Langmuir ont été mesurés. Des gouttelettes multiples (E1/H) d'un diamètre volumétrique d'environ 90 um contenant des gouttelettes aqueuses (E1) inférieures à 1 um ont été obtenues. Après 25 jours à température ambiante, le diamètre des gouttelettes multiples a atteint 110 um, indiquant une coalescence limitée. Les emulsions multiples protègent les acides gras oméga-3 et les composés hydrosolubles comme la vitamine C. Cependant, une portion de la vitamine C des emulsions multiples est instable physiquement et serait relarguée de la phase interne des emulsions vers la phase externe (dans le jus). L'effet de la température d'entreposage a montré que, quelque soit le type de composé encapsulé, il s'avère nécessaire de réfrigérer les jus à 4°C pour améliorer l'effet protecteur des emulsions.

Plusieurs milliards de dollars sont investis chaque année pour la recherche de molécules bioactives contre diverses maladies. De nos jours, la majorité de ces composés sont synthétisés par l’homme et se conforme à la règle de 5 de Lipinski qui analyse les propriétés physicochimiques d’une molécule bioactive et son potentiel à atteindre une cible thérapeutique. Or, plusieurs composés synthétisés sont extrêmement actifs, mais ne respectent pas la règle de Lipinski. L’aspect limitant pour plusieurs de ces molécules est leur faible caractère hydrophile qui diminue la solubilité physiologique. Dans la littérature, plusieurs méthodes ont été publiées pour améliorer cette caractéristique. Un exemple est la conjugaison de la molécule hydrophobe sur des macromolécules telles des polymères, des polysaccharides ou des peptides. En tenant compte de l’expertise de notre laboratoire, nous avons utilisé le dendrimère PEOT, un polymère monodisperse hyperbranché, comme plateforme pour améliorer les propriétés physicochimiques d’un composé bioactif, l’aminostéroïde AH-38, sur diverses lignées cancéreuses. Pour conjuguer l’AH-38 sur le PEOT, il a été nécessaire d’ajouter une méthode d’ancrage par la préparation d’une molécule d’espacement. L’idée initiale était d’utiliser un espaceur qui permettrait de lier de manière réversible l’aminostéroïde bioactif pour être libéré à la cible thérapeutique. La présence intrinsèque d’un groupement fonctionnel hydrophile dans la structure de la molécule d’espacement serait idéale pour une fonctionnalisation complète des terminaisons. De plus, la molécule d’espacement devrait pouvoir se conjuguer en périphérie du dendrimère par cycloaddition 1,3-dipolaire de Huisgen sans avoir recours à un catalyseur de cuivre. Plusieurs tentatives ont été effectuées sans succès pour fonctionnaliser une molécule d’espacement correspondant à ces critères. Finalement, nous avons choisi de ne pas avoir de fonction hydrophile dans l’espaceur et la conjugaison au dendrimère fait intervenir un catalyseur de cuivre. Dans ce mémoire de maîtrise, les avantages de la nanomédecine, le cheminement de pensée et les travaux effectués pour arriver aux molécules cibles sont présentés. / Each year, billions of dollars are invested in research to treat different illnesses using bioactive molecules. Nowadays, most drugs are synthesized by men; they usually comply with the Lipinski rule of 5 which analyses their physicochemical properties and their potential reach the biological target. However, there are still numerous extremely active compounds, but they do not act in accordance to the Lipinski’s rule. Many of those compounds are limited by their low hydrophilicity which reduces their physiological solubility. In the literature, many strategies have been published on ways to enhance this property. For example, a poorly water-soluble drug may be grafted onto a macromolecule such as a polymer, a polysaccharide or a peptide. Considering our laboratory area of expertise, we used the PEOT dendrimer -- a monodisperse hyperbranched polymer -- as carrier to enhance the physicochemical properties of the aminosteroid AH-38, a bioactive compound over multiple cancer cell lines. To graft the AH-38 onto the PEOT, a linker molecule must be used. In our preliminary research, we wanted to choose a structure that could link reversibly the bioactive aminosteroid to be released at the therapeutic target. In the linker’s structure, a hydrophilic functional group should be present, it would be ideal to completely functionalize the dendrimer’s terminis. Also, the linker should be able to graft onto the dendrimère using the Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition without any copper catalyst. Many attempts were made to synthesize a linker with following these criteria, but they all failed. Consequently, we opted for a linker that does not have a hydrophilic functional group and uses a copper catalyst to graft onto the dendrimer. In this master’s report, nanomedecine’s advantages, the entire thinking process and experiments that were performed in order to obtain the target’s molecules are presented.

L'objectif global de cette étude est de fonctionnaliser les surfaces d'alliage de titane Ti6Al4V ELI (Ti) par des molécules bioactives dans le but de prévenir les infections sur une prothèse d'amputation transcutanée intra-osseuse (ITAP). Dans cette optique, deux stratégies ont été élaborées : l'une pour promouvoir l'attachement des cellules de la peau autour de l'implant et l'autre pour prévenir l'adhésion bactérienne à l'interface matériau-tissu. En premier lieu, la surface de Ti a été modifiée par la fibronectine (Fn), une glycoprotéine d'adhésion présente dans la matrice extracellulaire (MEC), qui favorise l'adhésion cellulaire. La Fn a été adsorbée ou greffée sur la surface de Ti. Deux bras d'ancrage différents ont été employés afin de greffer la Fn, soit la dopamine/l'anhydride glutarique (TiDopGA[indice g]Fn) et les phosphonates (TiPhos[indice g]Fn). Ces dernières conduisent à des groupes terminaux d'acide carboxylique sur le substrat, permettant le greffage covalent avec les groupements fonctionnels (NH₂) de la Fn. Le succès de chaque étape de modification a été vérifié par XPS et angle de contact. La quantité de protéine et la disponibilité des sites d'adhésion RGD (arginine-glycine-acide aspartique) de la Fn adsorbée ou greffée sur chacun des bras d'ancrage ont été évaluées par ELISA. L'effet des surfaces modifiées avec la Fn a été évalué sur la prolifération et l'étalement des fibroblastes d'une part et sur la force d'attachement des feuillets dermiques d'autre part. La Fn greffée via les phosphonates a une plus grande bioactivité et une meilleure activité biologique que celle greffée via la dopamine/l'anhydride glutarique ou lorsqu'elle a été adsorbée. La force d'arrachement des feuillets dermiques était significativement plus élevée autour des surfaces greffées de Fn via les phosphonates, par rapport aux surfaces non traitées. Par conséquent, cette étude met en évidence l'importance d'une sélection appropriée du bras d'ancrage pour contrôler étroitement les interactions cellulaires à l'interface tissu/implant. Le second volet de ce projet repose sur la fonctionnalisation de la surface de Ti par la vancomycine (Vanc), une glycopeptide ayant des propriétés antibactériennes. La Vanc a été greffée de façon covalente via les phosphonates (TiPhos[indice g]Vanc) selon une méthodologie similaire à celle utilisée pour greffer la Fn. Le greffage et la stabilité de la Vanc ont été confirmés par XPS et angle de contact. La surface modifiée par la Vanc permet de réduire l'adhésion des bactéries Staphylococcus epidermidis, bactéries responsables de la majorité des cas d'infections cutanées pour les implants percutanés, comparativement à la surface de Ti non traitée. Ces résultats soutiennent l'effet antibactérien des surfaces de Ti lorsqu'elles sont fonctionnalisées par la Vanc de façon covalente. / The overall goal of this study is to functionalize titanium alloys materials (Ti6Al4V ELI) using biomolecules in order to prevent infections on Intraosseous Transcutaneous Amputation Prosthesis (ITAP). In this context, two strategies have been developed: one to promote attachment of skin cells around the implant and the other to reduce bacterial adhesion at the material-tissue interface. First of all, the Ti6Al4V ELI was modified by fibronectin (Fn), an adhesion glycoprotein found in most extracellular matrices, which promotes cell recognition and adhesion. Fn was adsorbed or grafted onto the surface of Ti6Al4V ELI. Two different linkers were used to graft the Fn, dopamine/glutaric anhydride (TiDopGA[subscript g]) and phosphonate (TiPhos[subscript g]). The linking arms lead to terminal carboxylic acid groups on the substrate, allowing covalent grafting with the amine functions of Fn. The success of each modification step was assessed by XPS and contact angle. The quantity of protein and the availability of RGD adhesion sites of the Fn adsorbed or grafted via the two investigated linking arms were evaluated by ELISA. The effect of the Fn-modified surfaces was evaluated on the proliferation and spreading of fibroblast cells and on the attachment strength of the dermal layers. It has been evidenced that Fn grafted via phosphonates has a greater bioactivity and a better biological activity than Fn grafted via dopamine/glutaric anhydride or when adsorbed. The peeling force of the dermal layers was also significantly higher around surfaces grafted with Fn via phosphonates, compared to untreated surfaces. Therefore, this study highlights the importance of appropriate selection of the anchor arm to closely control cellular interactions at the tissue/implant interface. The second part of this study is based on the functionalization of the Ti6Al4V ELI surface by vancomycin (Vanc), a glycopeptide with antibacterial properties. Vanc was covalently grafted via phosphonate (TiPhos[subscript g]Vanc) using a similar methodology to that used to graft Fn. The grafting and stability of the Vanc was confirmed by XPS and contact angle. The Vanc-modified surface reduces the adhesion of Staphylococcus epidermidis bacteria, the bacterium responsible for the majority of skin infections in percutaneous implants, compared to the surface of untreated Ti6Al4V ELI. These results confirm the antibacterial effect of the Ti6Al4V ELI surfaces when covalently functionalized by the Vanc.

La réparation des défauts osseux de taille importante (fracture, tumeur, nécrose de l'os) pour lesquelles une partie de l'os est manquante et doit être remplacée, demeure un défi important pour le domaine médical. Des matériaux synthétiques, comme des matériaux céramiques, métalliques, et polymères, sont ainsi développés comme substituts osseux. Mais ces matériaux n'interagissent pas suffisamment avec l'os du patient et finissent par être encapsulés par une couche de tissu fibreux, ce qui peut résulter en une fracture de l'os, de l'implant, ou de l'interface entre les deux. La recherche vise donc à étudier et comprendre les interactions entre les cellules et les matériaux, afin de développer des matériaux capables d'interagir avec les cellules, et de mettre au point des implants combinant un matériau bioactif, des cellules, et des facteurs bioactifs permettant la reconstruction du tissu osseux. Dans ce contexte, les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) ont gagné en popularité en médecine régénératrice compte tenu de leur capacité d'auto-renouvellement, leur multipotence, et leur taux de prolifération élevé. Cependant, une fois extraites du patient et cultivées in vitro, les MSCs ont tendance à se différencier de manière aléatoire, ce qui conduit à une population hétérogène de cellules avec laquelle il est difficile de reconstruire un tissu. Bien que les MSCs soient utilisées en clinique pour le traitement de diverses pathologies, une meilleure compréhension de leur comportement reste nécessaire pour permettre de contrôler leur différenciation vers une lignée spécifique et ainsi améliorer leurs performances en clinique. Les hydrogels ont émergé comme matériaux prometteurs pour la culture cellulaire puisqu'ils permettent de mimer la matrice extracellulaire naturelle des cellules. Notamment, de nombreuses études ont évalué l'impact de la rigidité des hydrogels sur la différenciation des MSCs et ont montré qu'une rigidité proche de celle d'un tissu naturel favorise la différenciation vers les cellules de ce tissu. Cependant, il est maintenant reconnu que les hydrogels et les tissus naturels ne sont pas caractérisés uniquement par leur rigidité, mais aussi par leur viscoélasticité. Or peu d'études ont été menées sur l'impact des propriétés viscoélastiques des hydrogels sur la différenciation des MSCs (15 articles sur les cinq dernières années via PubMed). Dans ce projet, il a été montré qu'il était possible de synthétiser des hydrogels de poly(acrylamide-co-acide acrylique) avec une rigidité et une viscoélasticité contrôlées, mesurées par compression et par AFM. Cinq hydrogels ont été choisis pour étudier l'impact des propriétés mécaniques sur la différenciation ostéogénique des MSCs en variant la rigidité et le pourcentage de relaxation : 15 kPa-15%, 60 kPa-15%, 140 kPa-15%, 100 kPa-30%, et 140 kPa-70%. Il a été montré que la fonctionnalisation de surface de ces hydrogels avec un peptide mimétique de la protéine BMP-2 a mené à une forme cellulaire étoilée après deux semaines de différenciation, sauf pour la rigidité la plus basse (15 kPa). Cette forme cellulaire étoilée correspondrait à une forme d'ostéocyte, qui est le dernier stade de différenciation ostéogénique des MSCs, et qui n'a jamais été obtenu in vitro à notre connaissance. De plus, une rigidité de 60 kPa a mené à une plus forte expression de marqueurs de différenciation ostéocytaires par rapport à des rigidités de 15 et 140 kPa, pour une même relaxation de 15%. Enfin, la plus forte expression de marqueurs de différenciation d'ostéoblastes et d'ostéocytes a été observée pour l'hydrogel présentant 70% de relaxation et une rigidité de 140 kPa. Ceci semble montrer qu'une viscoélasticité élevée favorise la différenciation ostéogénique des MSCs, même si elle est associée à une rigidité qui n'est pas la plus favorable. Ainsi, les propriétés viscoélastiques de la matrice auraient un impact non négligeable sur la différenciation des MSCs et devraient être considérées à l'avenir. / The repair of large bone defects, including large fracture, tumor, and necrosis for which a part of the bone is missing and has to be replaced, is still a challenge for the medical field. Synthetic materials, such as ceramic, metallic, and polymeric materials, have been developed as bone substitutes. However, these materials do not interact with the bone of the patient and generally end up being encapsulated by a layer of fibrous tissue, that might result in the fracture of the bone, the implant, or the interface between the two. The research therefore aims at studying and understanding cell-material interactions in order to develop materials capable of interacting with cells, and to create new implants combining a carrier material, cells, and bioactive factors, allowing bone reconstruction. In this context, mesenchymal stem cells (MSCs) have gained high interest in regenerative medicine considering their self-renewal ability, multipotency, and high proliferative rate. However, once extracted from the patient and cultivated in vitro, MSCs tend to differentiate randomly, which leads to a heterogeneous population of cells with which it is difficult to reconstruct any tissue. Therefore, although MSCs are used in clinics for the treatment of various pathologies, a better understanding of their biological behavior is still required to provide the ability to control their in vitro differentiation into a specific lineage and improve their clinical performance. Hydrogels have emerged as promising materials for cell culture as they allow to mimic the natural extracellular matrix of cells. Particularly, many studies have evaluated the impact of hydrogels stiffness on MSCs differentiation and showed that a stiffness close to that of a biological tissue leads to a differentiation towards cells of this tissue. Nevertheless, it is now recognized that hydrogels as well as biological tissues are not only described by their stiffness, but also by their viscoelastic properties. However, only few studies have been conducted on the impact of hydrogels viscoelastic properties on MSCs differentiation (15 articles over the past five years from PubMed). In this project, it has been shown that it was possible to synthesize poly(acrylamide-co- acrylic acid) hydrogels with different controlled stiffness and viscoelasticity, evaluated using compression and AFM. Five hydrogels have been chosen to study the impact of hydrogels mechanical properties on MSCs osteogenic differentiation by varying the stiffness and the relaxation percent : 15 kPa-15%, 60 kPa-15%, 140 kPa-15%, 100 kPa-30%, and 140 kPa- 70%. It has been shown that the surface functionalization of these hydrogels with a mimetic peptide of the BMP-2 protein led to star-like cells, except for the lowest stiffness (15 kPa). This star-like shape would correspond to the shape of osteocytes, which is the last stage of osteogenic differentiation, and which has never been obtained in vitro to our knowledge. Moreover, a stiffness of 60 kPa led to a higher expression of osteocyte markers as compared to stiffnesses of 15 and 140 kPa, for a constant low relaxation of 15%. Finally, the strongest expression of osteoblast and osteocyte differentiation markers has been observed for the hydrogel with a high relaxation of 70% and a stiffness of 140 kPa. This shows that a high viscoelasticity would favor MSCs osteogenic differentiation, even if it is associated with a stiffness that is not the most favorable. Thus, the viscoelastic properties of the matrix would have a significant impact on MSCs differentiation and should be considered in the future.

Les biomatériaux jouent un rôle majeur dans le développement du génie tissulaire. Au cours des dernières années, les propriétés physiques, chimiques, et en particulier biologiques de ces matériaux ont été optimisées pour différentes applications. Le polypyrrole (PPy) électriquement conducteur et ses matières composites sont utiles pour connecter des composants électriques, des cellules ou des tissus vivants. Des efforts ont été faits pour bio-activer le PPy en incorporant électrochimiquement des biomolécules comme l'héparine et l'acide hyaluronique. Cette méthode est cependant limitée par la petite taille des électrodes, la dénaturation des biomolécules pendant les réactions électrochimiques, le changement des propriétés physiques et surtout la conductivité du polypyrrole. Le but de cette étude est de bio-activer le polypyrrole par l'incorporation de molécules bio-actives telles que la fibronectine et l'albumine de sérum bovin. Ce biomatériau serait d'une grande utilité dans le domaine de l'ingénierie tissulaire et constituerait un support bioactif, biodégradable et électriquement conducteur pour la culture de différents types cellulaires avec de multiples applications biomédicales

Les maladies cardio-vasculaires sont la principale cause de mortalité dans le monde. Parmi celles-ci, et une des plus importantes, se trouve l'athérosclérose. Cette maladie se traduit par la formation d'une plaque sur les parois artérielles réduisant alors le diamètre luminal. La plaque d'athérome entrave la circulation du sang et peut se compliquer par la formation d'un thrombus artérielle pouvant provoquer un infarctus du myocarde. Une intervention capable de rétablir le flux (recanalisation) est alors nécessaire. Dans le cas des artères coronaires, l'intervention coronaire est percutanée (ICP) et consiste à amener et déployer jusqu'au site malade, une endoprothèse, appelé aussi stent. Un stent est un petit treillis métallique tubulaire qui permet de rouvrir la lumière de l'artère et de rétablir la circulation sanguine. Il sert aussi de support à l'artère malade pour empêcher son affaissement. Cependant, après implantation, certaines complications sont induites, telle que la resténose intra-stent (ISR) qui se caractérise par la réduction de la lumière de l'artère, reconduisant les problèmes créés par la plaque d'athérome. Ce phénomène est essentiellement dû à une prolifération excessive des cellules musculaires lisses, et qui résulte d'une lésion de l'endothélium lors de l'implantation. Afin de limiter cette complication, la première approche a été de changer les matériaux utilisés pour ces endoprothèses. Les principaux alliages utilisés pour fabriquer des stents sont l'acier inoxydable, les alliages de nitinol et ceux de chrome cobalt, plus particulièrement le L605. Ce dernier, dû à ses propriétés mécaniques, permet la fabrication de dispositifs plus minces, donc moins de métaux présents dans le corps humain, et a démontré induire moins de complications cliniques. Néanmoins, malgré la diminution des complications par rapport aux autres alliages, les endoprothèses nues en L605 ne s'intègrent que peu ou pas du tout dans le tissu artériel de l'hôte. Pour répondre aux exigences biologiques et cliniques, l'idéal serait d'avoir un dispositif qui favoriserait le recouvrement du dispositif par l'endothélium, ou « endothélialisation » et qui aurait un faible potentiel thrombotique et inflammatoire. L'approche couramment utilisée pour répondre à ces critères est de recourir à des dispositifs qui libèrent des médicaments anti-inflammatoires. Pour ce faire, il faut recouvrir les dispositifs métalliques avec des revêtements à base de polymères, en tant que couche intermédiaire, fonctionnalisée ensuite par des molécules bioactives. Toutefois, les dépôts de ces couches polymériques impliquent l'utilisation de chimie en solution incluant des solvants organiques. En outre, ces dernières démontrent avoir une faible adhésion au substrat métallique, dû au procédé utilisé, mais aussi un manque de cohésion. Lors de la procédure d'implantation, les stents subissent une déformation plastique, comme ces revêtements manquent de résistance, ils ont tendance à fissurer ou délaminer. Ce projet de recherche s'insère donc dans cette problématique générale, et propose une nouvelle approche qui permettrait d'éviter ce revêtement polymérique, tout en apportant les propriétés biologiques recherchées. Pour ce faire, la modification de surface proposée implique la fonctionnalisation directe des surfaces métalliques par un procédé plasma. Ce procédé permet de ne pas modifier les propriétés de cœur du matériau, et de créer des groupes fonctionnels en surface, ici des groupes amine réactifs (NH₂), qui servent de points d'ancrage pour le greffage ultérieur des molécules bioactives d'intérêt. En résumé, ce procédé original peut être divisé en 3 parties principales : a) préparation de la surface, b) fonctionnalisation par plasma et c) greffage de molécules bioactives. Tout au long de ce projet de recherche, l'optimisation de chaque partie a été réalisée en vue d'obtenir les propriétés adéquates et nécessaires pour l'application cardiovasculaire visée. Concernant la partie a), c'est-à-dire la préparation de la surface, les traitements suivants ont été testés : électropolissage, traitements thermiques et implantation ionique par immersion dans un plasma. Ces modifications ont été optimisées en vue d'obtenir une couche d'oxyde stable sous déformation présentant la meilleure résistance possible à la corrosion, tout en démontrant la plus haute efficacité d'amination directe par plasma pour la partie b). Enfin, en ce qui concerne le bloc c), le greffage de molécule bioactive, deux bras de liaison différents ont été étudiés pour évaluer leur impact sur la conformation et la performance biologique. Cette étude a été effectuée avec un peptide bioactif dérivé de la molécule d'adhésion des cellules endothéliales et des plaquettes (PECAM-1 ou CD31), en raison de ses propriétés anti-inflammatoire, anti-thrombotique et pro-endothélialisation. Les 2 bras d'ancrage testés sont un à chaine courte, l'anhydride glutarique (GA), contenant seulement 5 atomes de carbone, et un à longue chaine (600 atomes), le polyéthylène glycol (PEG) choisi aussi pour ses propriétés anti-adhérentes. Tout d'abord, cette stratégie a été développée sur des échantillons plats, qui facilitaient grandement les analyses de surface, telles que XPS et ToF-SIMS, et donc les processus d'optimisation de chaque étape, comme la résistance à la déformation, corrosion et l'analyse des propriétés biologiques. Ceci a permis de démontrer que le prétraitement de surface optimal pour les substrats L605 était l'électropolissage, agissant sur sa couche d'oxyde passive pour une efficacité maximale lors de l'étape d'amination. Le bras de liaison qui a démontré le plus grand potentiel pour immobiliser le peptide d'intérêt est le PEG, avec une augmentation significative de la migration et viabilité des cellules endothéliales, par rapport au substrat métallique nu. De plus, le greffage du peptide sur le PEG ajoutait des propriétés anti-thrombotique et anti-inflammatoire par rapport aux échantillons électropolis. Ce procédé a été ensuite adapté à des stents, dont la configuration 3D est très complexe. Après optimisation, les stents pegylées + peptides biomimétiques (Plasma-P8RI) ont été testés in vivo par implantation dans les coronaires de porc porcin pendant 7 jours et 28 jours et leur potentiel de ré-endothélialisation et anti-resténotique ont été évalués. Il a été constaté que la stratégie proposée dans ce projet de recherche favorisait la ré-endothélialisation après 7 jours par rapport au DES (Drug Eluting Stent) commercial, et limitait l'adhérence des leucocytes et des plaquettes lorsque comparé au BMS (Bare Metal Stent). Après 28 jours d'implantation le diamètre luminal des artères n'était pas réduit sur le stent Plasma-P8RI, ce qui signifie que ces stents modifiés ne présentaient pas de risque de resténose, contrairement aux BMS. Ce projet de recherche a permis de développer et de valider une stratégie prometteuse consistant à immobiliser directement des molécules bioactives sur des dispositifs cardiovasculaires en L605, alliage de chrome-cobalt. A notre connaissance, cette approche n'a jamais été rapportée dans la littérature à notre connaissance. Cette stratégie originale, dépourvue des limites associées à l'usage des polymères et basée sur un procédé plasma, présente des avantages évidents et ouvre la voie vers le développement de dispositifs cardiovasculaires innovants. / Cardiovascular diseases represent the leading cause of death in the world. Among them is atherosclerosis that characterizes by the formation of a plaque on the arterial walls that narrows the lumen diameter. This atherosclerotic plaque disrupts the blood flow and can be complicated by thrombosis which can ultimately lead to myocardial infarction. Efficient revascularization is mandatory to treat this disease and a percutaneous coronary intervention (PCI) is performed complemented with the deployment of a stent. Stents are tiny wire mesh that reopens the artery, re-establishing the blood flow whilst supporting the artery avoiding its collapse. Nevertheless, complications after stent implantation exist and in-stent restenosis (ISR) is one of the major concerns. This complication is characterized by the reduction of the lumen diameter, similar to an atherosclerotic plaque, and it is associated to the wound caused on the endothelium by the stent implantation followed by the over-proliferation of smooth muscle cells. One of the first strategies to decrease ISR involved the manufacture of stents using different alloys such as stainless steel, nitinol and cobalt chromium alloys (L605). The latest alloy, L605, has generated significant interest because it allows the fabrication of thinner devices, which have decreased post-implantation clinical complications. Nonetheless, despite the decrease in ISR, when compared to other alloys, the integration of L605 bare metal stents in the host tissue is minimal or inexistent. Thus, enhanced biological properties, such as endothelialisation, low thrombosis activity and anti-inflammatory behaviour represent mandatory requirements for clinical applications. To confer these properties onto metallic devices, polymeric-based coatings, as an intermediate layer to further functionalize with bioactive molecules, are often deposited. Nonetheless, major techniques to deposit these polymeric coatings involve the use of wet-chemistry and do not ensure total resistance during the stent implantation procedure due to lack of cohesion and delamination of the polymeric layer. Thus, a novel approach that foregoes this previously mandatory coating step was developed in this research project. This novel approach involves the use of plasma-based techniques to create functional groups (reactive amine groups, -NH₂), directly onto the metallic surface without modifying the bulk properties, that can be used as anchor points for the further grafting of bioactive molecules of interest. Briefly, this novel approach can be divided in 3 blocks: a) Surface preparation, b) plasma functionalization and c) bioactive molecule grafting. Throughout this research project the optimization of these main blocks was performed aiming for the desired cardiovascular application. Concerning block a), surface preparation, electropolishing, thermal treatments and plasma immersion ion implantations were performed to obtain an oxide layer deformation and corrosion resistant whilst demonstrating the highest direct plasma amination efficiency, for block b). Finally, as regards block c), bioactive molecule grafting, two different linking arms were studied to assess their impact on conformation, and the biological performance of a bioactive peptide derived from the platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1 or CD31) due to its pro-endothelialization, anti-inflammatory and anti-thrombotic potential: Glutaric anhydride (GA), as a short chain spacer of 5 carbons, and polyethylene glycol (PEG), as a long chain spacer with antifouling properties. Initially, this strategy was developed on flat samples where using a combination of high-resolution surface characterizations techniques, such as XPS and ToF-SIMS, and corrosion, deformation and biological tests it was confirmed that the optimal surface pre-treatment for L605 was electropolishing, due to its passive oxide layer and that it further allowed to obtain the highest amination efficiency. Furthermore, the best linking arm to immobilize the peptide was PEG, which demonstrated a significantly increase on endothelial cell viability with a faster migration, when compared to the bare metallic substrate. Moreover, peptides immobilized by PEG demonstrated that endothelial cells attached to the surface presented an anti-thrombotic and anti-inflammatory phenotype, when compared to electropolished samples. Thus, this biomimetic surface was selected for an in vivo trial in porcine model to evaluate its potential re-endothelialization and anti-restenotic activity. It was found that by directly attaching a CD31 agonist onto the bare metal stent by this strategy improved re-endothelialization after 7 days when compared to commercial DES, with further, low adhesion of leukocytes and platelets when compared to BMS. Moreover, after 28 days of implantation, Plasma-P8RI did not present a significant decrease on the lumen diameter, which was not the case for BMS that presented in-stent restenosis after this period. Overall, this research project allowed the development and validation of a promising strategy to directly immobilize bioactive molecules onto L605 cobalt chromium cardiovascular devices, providing clear advantages of medical devices currently on the market. Furthermore, to the best of our knowledge, such plasma-based multi-step strategy has never been previously reported in literature.