Il est difficile de réaliser une forte adhésion entre deux hydrogels par un procédé simple. Récemment, un nouveau concept a été proposé par Leibler et ses collaborateurs pour coller des hydrogels ou des tissus biologiques. Il consiste à utiliser des nanoparticules sur lesquels s'adsorbent les chaînes de polymère et qui jouent ainsi le rôle de connecteurs. L'objectif principal de la thèse est d'identifier et de contrôler les mécanismes à l'origine de l'adhésion de deux hydrogels par des nanoparticules. De nombreuses questions sont abordées : la nature des nanoparticules de silice (taille, charge, concentration, état de dispersion), l'influence de la structure de l'hydrogel et son état de gonflement, la répartition des nanoparticules sur les interfaces. Les expériences sont menées avec plusieurs catégories d'hydrogels: le Poly(N,N diméthyl-acrylamide) (PDMA), le Polyacrylamide (PAAm), des gels nanocomposites (PDMA renforcé par des nanoparticules de silice), ou encore des gels à double-réseaux. Nous mesurons les propriétés adhésives à l'aide de tests de joints de recouvrement, de pelage à 90°, et de pelage en Y, que nous avons mis au point. Nous avons utilisé des expériences d'ATR-FTIR, de microcopie confocale à fluorescence et de microscopie électronique à balayage pour mettre en évidence l'adsorption des chaînes polymères à la surface des hydrogels, évaluer la quantité de particules de silice à la surface du gel, et caractériser leur distribution. Les résultats nous permettent de proposer un mécanisme d'adhésion et de définir les conditions qui permettent de réaliser une adhésion optimale. / It is very challenging to achieve strong adhesion between two soft and wet materials like hydrogels. Recently Leibler and his collaborators invented a new concept to assemble hydrogels or biological tissues using nanoparticles. The principle relies on the adsorption of gel chains at the surface of nanoparticles, which act as connectors, and on the ability of the adsorbed gel chains to reorganize under stress. The main objective of this work is to identify and control the physical mechanisms fundamental to gel adhesion by silica nanoparticles. Many questions are investigated: the nature of the nanoparticles (size, surface chemistry, concentration, state of dispersion), the gel structure and its state of swelling, the distribution of the nanoparticles at the gel surface. Experiments are conducted using several types of gels: Poly(N,N dimethylacrylamide) (PDMA), Poly(acrylamide) (PAAm), nanocomposite gels (PDMA reinforces with silica nanoparticles), or double-network (DN) gels. We quantify the adhesive properties using lap-shear experiments, peeling tests at 90°, and Y-peeling tests that we developed. We use ATR-FTIR experiments, confocal microscopy and scanning electron microscopy to demonstrate the adsorption of polymers onto the silica nanoparticles and characterize their spatial repartition. The results allow us to propose a mechanism explaining the adhesion and to define conditions for optimal adhesion.

La mitochondrie est un carrefour d’informations au centre du fonctionnement cellulaire puisque son rôle physiologique consiste à récupérer l’énergie fournie par la dégradation des produits issus de notre alimentation pour produire de l’ATP, par le processus d’oxydation phosphorylante. Cependant, des altérations du fonctionnement de la mitochondrie peuvent être responsables de nombreuses pathologies. Parmi les stress métaboliques pouvant entraîner un dysfonctionnement mitochondrial, l’ischémie-reperfusion est un phénomène présent également dans de nombreuses situations pathologiques. L’objectif de ce travail consiste à développer une approche méthodologique basée sur la microscopie confocale et l’analyse d’images afin de décortiquer les conséquences cellulaires des stress métaboliques induits lors d’épisodes de privation de substrats associée ou non à une privation partielle ou totale d’oxygène. Après avoir mis au point le programme d’analyse d’images basée sur la méthode du « tophat », deux approches ont été développées pour visualiser et quantifier la fonction mitochondriale. La première, qui combine le marquage du TMRM et l’autofluorescence du NADH, a permis de mettre en évidence des différences de réponses au stress d’ischémie-reperfusion au niveau de la chaîne respiratoire ou de l’ouverture du PTP pour les quatre types cellulaires testés : HMEC-1, INS1, RT112 ou hépatocytes primaires. La seconde approche a consisté à tester l’utilisation de biosenseurs permettant de suivre les variations de concentration d’ATP (Ateam) ou d’activation de l’AMPK (AMPKAR). Les conditions expérimentales réalisées dans ce travail n’ont pas permis de valider leur utilisation. / Mitochondria form an information hub at the center of the cellular metabolism because of its physiological role consisting in the porduction of ATP from the degradation of porducts stemming from our food through the OXPHOS process. However, changes in the functionnig of the mitochondria can be responsible for numerous diseases. Among the different foms of metabolic stress leading to mitchondrial dysfunctions, ischemia-reperfusion can be found in numerous pathological situations. This work aims at developing a methodological approach based on confocal microscopy and image analysis to dissect –at cell level- the consequences of metabolic stress induced by episodes of deprivation in substrata associated or not with hypoxia or anoxia. Having developed the program of image analysis based on the « tophat » method, two approaches were designed to vizualize and quantify the mitochondrial function. The first one, combining TMRM labelling with NADH fluorescence made it possible to highlight some differences in the response to the stress caused by ischemia-reperfusion at the level of the respiratory chain or concerning the PTP opening in the four cellular types that were tested : HMEC-1, INS1, RT112 or pirmary heaptocyes. The second approach consisted in testing the use of biosensors designed to follow the variations of ATP concentration (ATeam) or the activation of AMPK (AMPKAR). The experimental conditions established in this work did not allow us to validate their use.

L'administration systémique de gènes représente une voie intéressante pour le traitement par thérapie génique de la mucoviscidose ou des cancers pulmonaires. Dans cette optique, les polyplexes (complexes ADN/polymère cationique) doivent atteindre le poumon et traverser les vaisseaux sanguins pour transfecter les cellules épithéliales mutées ou les cellules cancéreuses. Il existe peu de données sur le passage transendothélial de polyplexes. Afin d'en améliorer les connaissances, nous avons mis au point un modèle d'endothélium microvasculaire pulmonaire et étudié l'influence de la polarisation cellulaire sur les voies d'internalisation de polyplexes formés avec la polylysine histidylée (pLK-His) et la polyéthylènimine (PEI), leur efficacité de transfection, leur capacité à traverser la barrière endothéliale et leur adhésion sur la monocouche de cellules endothéliales en conditions de flux. Les travaux réalisés montrent que la polarisation des cellules endothéliales diminue l'internalisation et l'efficacité de transfection des polyplexes pLK-His mais pas celles des polyplexes PEI. Par contre, la polarisation des cellules épithéliales n'a pas d'influence sur l'efficacité des polyplexes pLK-His. Les polyplexes pLK-His et PEI sont capables de traverser la monocouche de cellules endothéliales et transfecter des cellules épithéliales à la fois par leur côté apical et basolatéral. L'incubation des cellules endothéliales avec des cytokines pro-inflammatoires permet d'augmenter ce passage. Enfin, l'adhésion des polyplexes sur les cellules endothéliales est plus importante dans les conditions de flux des microvaisseaux que dans les conditions de flux des veines. L'adhésion des polyplexes PEI est légèrement supérieure à celle des polyplexes pLK-His. Des polyplexes formés avec une PEI sur laquelle a été greffée des motifs de tétraglucose spécifiques des cellules endothéliales adhèrent trois fois plus que les polyplexes formés avec la PEI ce qui montre un ciblage des cellules endothéliales pulmonaires en conditions de flux. L'ensemble des résultats montre qu'il est indispensable de mieux considérer les effets des conditions physiologiques des cellules (polarisation, effets du flux sanguin, conditions d'inflammation) sur la transfection pour concevoir de nouveaux vecteurs synthétiques afin d'améliorer leur efficacité in vivo.

Grâce aux innovations technologiques récentes, l'exploration cutanée est devenue de plus en plus facile et précise. Le relevé topographique de la surface de peau par projection de franges ainsi que l'exploration des structures intradermiques par microscopie confocale in-vivo en sont des exemples parfaits. La mise en place de ces techniques et les développements sont présentés dans cette thèse. L'apport de l'imagerie est évident tant pour le traitement des acquisitions de ces appareils que pour l'évaluation de paramètres cutanés à partir de photographie par exemple. L'extension du modèle LIP niveaux de gris à la couleur a été réalisée pour apporter une évaluation proche de celle d'un expert grâce aux fondements logarithmiques du modèle, proches de la vision humaine. Enfin, la classification de données dans une image, sujet omniprésent dans le traitement d'images, a été abordée par les classifications hiérarchiques ascendantes, utilisant un cadre mathématique rigoureux grâce aux métriques ultramétriques.

Medicago truncatula est une Légumineuse établissant une interaction symbiotique avec une bactérie tellurique de la famille des Rhizobiacées, Sinorhizobium meliloti. Cette interaction induit l'organogénèse racinaire d'un nouvel organe, la nodosité dans laquelle s'établit un microenvironnement propice à la différenciation de S. meliloti en bactéroïde fixateur du diazote atmosphérique. Ce dernier réduit ainsi le N2 atmosphérique en ammonium, assimilé ensuite par la plante hôte. Cette réduction étant très endergonique M. truncatula fournit aux bactéroïdes des substrats carbonés issus de la photosynthèse. Cependant, cette interaction n'est pas pérenne, du fait de la mise en place d'un processus de sénescence ; processus conduisant à la lyse des bactéroïdes et des cellules hôtes végétales. Cependant, à l'heure actuelle, ce processus de rupture symbiotique reste largement méconnu. Afin de mieux caractériser ce processus de sénescence, nous avons développé de nouveaux outils cytologiques permettant par microscopie confocale de suivre in vivo la viabilité, mais également le fonctionnement des bactéroïdes au sein de la cellule hôte végétale. Ces nouvelles approches cytologiques pourraient ainsi offrir de nouvelles perspectives pour une caractérisation plus précise du déroulement du processus de sénescence nodositaire. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons également cherché à déterminer l'implication de deux cystéines protéases dans la mise en place du processus de sénescence nodositaire. Une des caractéristiques de ce processus de sénescence est une hausse de l'activité protéolytique, notamment des activités cystéine protéases. L'analyse transcriptomique par cDNA-AFLP du processus de sénescence nodositaire (Van de Velde et al. 2006) a pu mettre en évidence 508 gènes différentiellement exprimés dont deux cystéines protéases, MtCP6 et MtVPE. L'analyse spatio-temporelle de MtCP6 et MtVPE, par fusion transcriptionnelle avec le gène rapporteur GUS, a permis de mettre en évidence l'induction de ces deux gènes lors du processus de sénescence nodositaire aussi bien développementale qu'induit par un traitement abiotique ou lors d'une interaction symbiotique non efficace. De plus, nous avons pu démontrer, par génétique inverse, que la diminution de l'expression de ces deux protéases retarde la mise en place du processus de sénescence, alors que leur expression précoce conduit à la promouvoir. Enfin, l'étude par microscopie confocale de la localisation subcellulaire de ces protéases par fusion traductionnelle avec la GFP, démontre leur adressage aux bactéroïdes. Nos données tendent donc à démontrer le rôle clef de MtCP6 et de MtVPE dans le processus de sénescence nodositaire, où ces protéases pourraient participer directement au déclenchement d'une dégradation des bactéroïdes.

Le phloème est un tissu complexe composé de plusieurs types cellulaires, dont les cellules compagnes et les tubes criblés. Il permet le transport et l'allocation à longue distance de nombreux métabolites et de macromolécules. Il existe dans les tubes criblés des structures très spécifiques dont la fonction est inconnue. Par exemple le rôle des protéines phloémiennes PP2 (Phloem Protein 2) qui ont été de longue date décrite dans les tubes criblés, reste à définir. Les protéines PP2 présentent une activité de lectine et d'interaction avec des protéines de sève phloémienne, suggérant un rôle dans le transport de macromolécules dans le phloème.Nous avons étudié la fonction de deux membres de la famille, PP2-A1 et PP2-A2, chez l'espèce modèle Arabidopsis thaliana. Plusieurs approches ont été mises en œuvre pour étudier ces protéines ; une approche cytologique, la recherche de partenaire protéiques et la création de lignées dérégulées pour l'expression des gènes PP2. L'étude de la localisation de PP2-A1 avec des étiquettes fluorescentes dérivées de la GFP a été réalisée par microscopie confocale, dans les cellules compagnes et dans les tubes criblés ; elle a montré que cette protéine présente une localisation nucléo- cytoplasmique dans les cellules compagnes tandis qu'elle forme des agrégats fixés dans les tubes criblés. Ceci suggère que PP2-A1 est ancrée dans les tubes criblés, à la membrane plasmique ou à certains organites. Des résultats similaires ont été obtenus pour PP2-A2. Sur la base de cette première étude, nous permettant d'identifier in vivo avec précision les cellules compagnes et les tubes criblés, et en utilisant plusieurs marqueurs subcellulaires fluorescents de référence, nous avons réalisé une cartographie subcellulaire fine des cellules compagnes et des tubes criblés in vivo. Cette approche a permis de décrire in vivo l'organisation subcellulaire de ces cellules. Elle a révélé la présence de nombreux organites présents à la périphérie des tubes criblés et de nature énigmatique, suggérant une activité importante dans ces cellules, en accord avec des données récentes de protéome des tubes criblés. L'étude de lignées surexprimant des versions étiquetées de PP2-A1 et PP2-A2 nous a permis de mettre en évidence un phénotype altéré avec des plantes qui présentent un retard de floraison et une biomasse plus importante. Ces observations suggèrent que PP2-A1 et PP2-A2 pourraient avoir un rôle dans la signalisation à longue distance. Ces travaux, qui illustrent la complexité des cellules du phloème, apportent ainsi des éléments nouveaux sur les voies de signalisation à longue distance utilisées par les végétaux pour coordonner leur croissance et leur développement.

Ce projet concerne l’analyse de l’organisation de populations microbiennes au sein de structures complexescomme des dépôts ou des biofilms.Si différentes méthodes sont couramment utilisées pour étudier la structure globale ou l’organisation localed’agrégats microbiens, peu d’entre elles, permettent de réaliser simultanément ces deux analyses et nécessitentsouvent des étapes de préparation qui pénalisent un approche in-vivo et en dynamique.La stratégie proposée repose sur la mise en oeuvre de micro-organismes modèles autofluorescents (levures etbactéries) qui peuvent sans aucun traitement être directement observés en microscopie. La similitude ducomportement physiologique de ces micro-organismes avec celui des souches sauvages a été démontrée. Lesconditions d’acquisition des images en microscopie confocale ont été optimisées. Des dispositifs spécifiques ontété conçus pour générer des dépôts ou des biofilms dans des conditions de contraintes physico-mécaniques etbiochimiques maîtrisées afin d’analyser simultanément leurs caractéristiques et les performances du bioprocédé.Ainsi les dépôts ont pu être observés in-vivo et in-situ grâce à une cellule de filtration équipée d’une fenêtred’observation. Le développement d’un biofilm mixte composé de levures et bactéries modèles autofluorescentes,dans un réacteur continu spécifique, a également été analysé par microscopie confocale.Le traitement et les analyses des images acquises au cours des expériences ont été effectués et ont permisd‘étudier la structure globale des agrégats biologiques et l’organisation tridimensionnelle des micro-organismesdans ces structures, en mettant par exemple en évidence une répartition hétérogène de deux populationsmicrobiennes dans des dépôts de filtration ou en comparant la capacité de deux espèces microbiennes à formerdes biofilms en étudiant in-vivo la dynamique de croissance de chacune des espèces.Cette étude a en outre permis de démontrer la pertinence de la méthode proposée, de définir ses limites et sonchamp d’application / The aim of this project deals with the analysis of both the local localization and organization of microbialpopulations in complex structures such as deposits or biofilms. Different methods are currently used to study theglobal structure or the local organization of biological aggregates but only few ones allow a combined approachand require ex-vivo analyses.The proposed strategy uses home-designed model auto-fluorescent microorganisms (yeasts and bacteria) whichcan be observed directly by microscopy without any dying treatment. Same kinetic behaviours between the wildstrains and their recombinant ones were demonstrated. The confocal microscopy conditions were optimised.Specific devices were developed to generate deposits or biofilms under controlled and known hydrodynamic orbiochemical environment conditions to analyse their structure characteristics linked to the bioprocessperformances.Based on the proposed strategy, microbial deposits modifications due to pressure constraints were observed invivo in a specifically designed flow cell equipped with a microscope glass coverslip. A mixed biofilm composedby our auto-fluorescent yeasts and bacteria was carried out in a specific bioreactor allowing the sampling ofbiofilms during their development to be analysed by confocal microscopy. Both studies have shown specificorganisations between yeasts and bacteria mainly depending on their size and on the environment conditions(pressure or dilution rate).These studies of both local and global structure of biological aggregates and 3D-organisation of themicroorganisms within theses structures demonstrated the relevance of the proposed strategy defining the limitsof the method and proposing various perspectives for further characterizations and applications

Les propriétés photoniques des tissus durs dentaires nous ont permis d’étudier l’email et la dentine a un niveau moléculaire (in vitro) en utilisant des techniques de microscopie optique non linéaires. La microscopie confocale Raman est technique d’imagine de haute résolution permettant d’analyse d’échantillon sans préparation spécifique ni marquage. Cette méthode nous a permis de reconstituer une cartographie de la réticulation du collagène et de la cristallinité au niveau de la jonction émail-dentine et cela avec une résolution spatiale non atteinte jusque-là. Cette analyse chimique de la jonction émail-dentine a permis de redéfinir la largeur de cette zone de transition. Cette largeur est nettement supérieure à celles proposées par les études précédentes. Par ailleurs, l’étude portant sur les changements de fluorescence intrinsèque entre les tissues dentaires sains et cariés suggèrent l’implication de la protoporphyrin IX et de la pentosidine dans l’expression de la fluorescence rouge des tissus cariés. La microscopie multiphotonique quant à elle nous a permis de détecter la lésion carieuse et de suivre son développement en utilisant la génération de seconde harmonique (SHG) et la fluorescence par excitation à deux photons (2PEF). Nos études ont démontré la validité du ratio SHG/2PEF comme paramètre fiable pour la détection de la lésion carieuse. Les études proposées par cette thèse montrent le potentiel des propriétés photoniques de l’émail et de la dentine en utilisant les microscopies Raman et multiphotoniques dans l’étude de ces tissus au niveau moléculaire. Cela offre de nouvelles perspectives en recherche et en applications cliniques. / Photonic properties of dental hard tissues allowed us to proceed to in vitro analysis of enamel and dentin on a molecular level. Confocal Raman microscopy has been used to produce a mapping of collagen cross-link and crystallinity of human dentin–enamel junction (DEJ) with a spatial resolution not achieved up to now. The method is a non-invasive, label-free and a high spatial resolution imaging technique. This chemical analysis of DEJ led us to redefine a wider width of this transition zone and advance our understanding of dental histology. A study on the intrinsic fluorescence changes of sound and carious tissues using conventional fluorescence microscopy suggests the involvement of protoporphyrin IX and pentosidine in the fluorescence red-shift observed in carious tissues. Multiphoton microscopy allowed to detect nonlinear optical signal changes during caries process using second harmonic generation (SHG) and two-photon excitation fluorescence (2PEF). Our studies led us to propose the ratio SHG/2PEF as valuable parameter to monitor caries lesion. Collectively, advances described in this thesis show the potential of photonic properties of enamel and dentin using Raman and multiphoton microcopies for molecular investigations on sound as much as on carious tissues. It opens new perspective in dental research and clinical applications.

Les 2,3-dialcoxy-acènes possèdent la faculté de s’auto-assembler en solution dans un empilement remarquable, conduisant à la formation de nano-fibres. Les interactions moléculaires au sein de ces nano-fibres et l’orientation des molécules, favorisent le transport d’énergie après exposition à la lumière. Les mécanismes de transfert d’énergie ont été élucidés en incorporant des accepteurs d’énergie permettant de sonder les états excités de la matrice hôte, et d’extraire l’énergie ; La microscopie confocale de fluorescence (spectrale, dynamique, sous lumière polarisée) a été la technique privilégiée pour la caractérisation de ces systèmes. La morphologie des nanostructures a également été déterminée par mesures en AFM. Des données spectroscopiques obtenues sur des cristaux à base de 2,3-dialcoxy-acènes nous ont permis d’affiner les résultats obtenus sur les fibres, et d’étudier l’effet du nano-confinement sur la diffusion des états excités. / 2,3-dialkoxy-acenes can self-assemble in solution, with a remarkable packing, leading to the formation nanofibers. The molecular interaction inside the nano-fiber and the relative orientation of the molecules, promote energy transport after light exposure. The energy transfer mechanisms have been elucidated incorporating energy acceptor which can allow to probe excited states inside the host matrix, extracting the energy. Fluorescence confocal microscopy (spectral, dynamic, under polarized light) has been used to characterize the photo-physic properties of these nanofibers. The nanostructure morphologies have also been determined by AFM measurements. Spectroscopic data obtained on 2,3-dialkoxy-acenes crystal , have allow us to refine the data obtained on the fibers, and to study nano-confinement effect on the dynamic of the excited state.

Les activités électriques ectopiques à l’origine des épisodes de fibrillation atriale pourraient être dues à des échanges calciques anormaux dans les cardiomyocytes (CM) de veine pulmonaire (VP). Le cycle du calcium des CM de VP a donc été caractérisé et comparé à celui des CM d’oreillette gauche (OG) et de ventricule gauche (VG). Des outils ont été développés pour mesurer la régularité d’organisation des réseaux de tubules transverses et la contractilité des CM de VP. Contrairement aux CM d’OG et de VG, l’organisation hétérogène du réseau de tubules dans la population des CM de VP conduit à une grande variabilité de forme des transitoires calciques et d’amplitude de contraction. Au sein des VP, ces différents types de CM sont regroupés en îlots. La fréquence des libérations calciques spontanées est également plus grande dans les CM de VP que dans ceux d’OG et de VG. La population des CM de VP présente une dynamique calcique aux caractéristiques uniques pouvant être source d’arythmies. / Ectopic foci leading to atrial fibrillation episodes might be due to abnormal calcium handling by the pulmonary vein (PV) cardiomyocytes (CM). Therefore, the calcium cycle of PV CM was characterized and compared to those of left atria (LA) and left ventricle (LV) CM. Some tools have been developed to measure the organization of transverse tubular networks and contractility of PV CM. Unlike LA and LV CM, the heterogeneous organization of the tubular networks in the PV CM population leads to wide ranges of calcium transient shapes and contraction amplitudes. Within the whole PV, these different types of CM are gathered in islets. The frequency of spontaneous calcium release is also higher in PV CM than in LA and LV CM. The special features of the calcium handling properties of the PV CM population could be a source of arrhythmias.