L'objectif de la thèse était d'étudier la mobilité de traceurs particulaires dans des milieuxcomplexes par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) combinée avec le suivi demultiple particules (MPT) et le recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP).Tout d'abord, nous avons étudié la diffusion de particules dans les gels formés par des protéinesglobulaires. Dans ce but, des gels avec structures variés ont été préparés en faisant varier lesconcentrations en protéine et en sel. La structure a été caractérisée par l'analyse des imagesobtenues par CLSM en termes de fonction de corrélation de paires. La mobilité de particulesavec une large gamme de tailles (2nm - 1 micron) a été étudiée à la fois dans des gels homogèneset hétérogènes et reliée à la structure du gel.Deuxièmement, nous avons étudié des émulsions eau dans eau préparées en mélangeant dessolutions aqueuses de PEO et de dextran. Il a été montré que lorsque des particules colloïdalessont ajoutées, elles sont emprisonnées à l'interface eau-eau, car elles réduisent la tensioninterfaciale. La structure et le déplacement des particules à l'interface ont été déterminés parCLSM combinée avec MPT.

L'Endomicrocopie Confocale par Minisondes (ECM) permet l'observation dynamique des tissus au niveau cellulaire, in vivo et in situ, pendant une endoscopie. Grâce à ce nouveau système d'imagerie, les médecins endoscopistes ont la possibilité de réaliser des "biopsies optiques" non invasives. Les biopsies traditionnelles impliquent le diagnostic ex vivo d'images histologiques par des médecins pathologistes. Le diagnostic in vivo d'images ECM est donc un véritable challenge pour les endoscopistes, qui ont en général seulement un peu d'expertise en anatomopathologie. Les images ECM sont néanmoins de nouvelles images, qui ressemblent visuellement aux images histologiques. Cette thèse a pour but principal d'assister les endoscopistes dans l'interprétation in vivo des séquences d'images ECM. Lors de l'établissement d'un diagnostic, les médecins s'appuient sur un raisonnement par cas. Afin de mimer ce processus, nous explorons les méthodes de Reconnaissance d'Images par le Contenu (CBIR) pour l'aide au diagnostique. Notre premier objectif est le développement d'un système capable d'extraire de manière automatique un certain nombre de vidéos ECM qui sont visuellement similaires à la vidéo requête, mais qui ont en plus été annotées avec des métadonnées comme par exemple un diagnostic textuel. Un tel système de reconnaissance devrait aider les endoscopistes à prendre une décision éclairée, et par là-même, à établir un diagnostic ECM plus précis. Pour atteindre notre but, nous étudions la méthode des Sacs de Mots Visuels, utilisée en vision par ordinateur. L'analyse des propriétés des données ECM nous conduit à ajuster la méthode standard. Nous mettons en œuvre la reconnaissance de vidéos ECM complètes, et pas seulement d'images ECM isolées, en représentant les vidéos par des ensembles de mosaïques. Afin d'évaluer les méthodes proposées dans cette thèse, deux bases de données ECM ont été construites, l'une sur les polypes du colon, et l'autre sur l'œsophage de Barrett. En raison de l'absence initiale d'une vérité terrain sur le CBIR appliquée à l'ECM, nous avons d'abord réalisé des évaluations indirectes des méthodes de reconnaissance, au moyen d'une classification par plus proches voisins. La génération d'une vérité terrain éparse, contenant les similarités perçues entre des vidéos par des experts en ECM, nous a ensuite permis d'évaluer directement les méthodes de reconnaissance, en mesurant la corrélation entre la distance induite par la reconnaissance et la similarité perçue. Les deux évaluations, indirecte et directe, démontrent que, sur les deux bases de données ECM, notre méthode de reconnaissance surpasse plusieurs méthodes de l'état de l'art en CBIR. En termes de classification binaire, notre méthode de reconnaissance est comparable au diagnostic établi offline par des endoscopistes experts sur la base des Polypes du Colon. Parce que diagnostiquer des données ECM est une pratique de tous les jours, notre objectif n'est pas seulement d'apporter un support pour un diagnostique ponctuel, mais aussi d'accompagner les endoscopistes sans leurs progrès. A partir des résultats de la reconnaissance, nous estimons la difficulté d'interprétation des vidéos ECM. Nous montrons l'existence d'une corrélation entre la difficulté estimée et la difficulté de diagnostic éprouvée par plusieurs endoscopistes. Cet estimateur pourrait ainsi être utilisé dans un simulateur d'entraînement, avec différents niveaux de difficulté, qui devrait aider les endoscopistes à réduire leur courbe d'apprentissage. La distance standard basée sur les mots visuels donne des résultats adéquats pour la reconnaissance de données ECM. Cependant, peu de connaissance clinique est intégrée dans cette distance. En incorporant l'information a priori sur les similarités perçues par les experts en ECM, nous pouvons apprendre une distance de similarité qui s'avère être plus juste que la distance standard. Dans le but d'apprendre la sémantique des données ECM, nous tirons également profit de plusieurs concepts sémantiques utilisés par les endoscopistes pour décrire les vidéos ECM. Des signatures sémantiques basées mots visuels sont alors construites, capables d'extraire, à partir de caractéristiques visuelles de bas niveau, des connaissances cliniques de haut niveau qui sont exprimées dans le propre langage de l'endoscopiste.

Nous reportons ici le comportement rhéologique de suspensions concentrées - ou pâte - de particules granulaires ou colloïdales de ciment ou de silice sphérique et monodisperse. Le système modèle de particules de silice est utilisé pour pouvoir contrôler les propriétés physicochimiques de la suspension. Notre projet de recherche se centre sur deux points qui s'intéressent aux propriétés du coulis frais : (i) le premier est l'étude du processus de structuration par coagulation au repos et sa relation avec la prise. Nous avons utilisé des outils (ultrason, confocal) adaptés pour suivre et interpréter la coagulation et la prise du ciment.(ii). Le second est l'étude d'un phénomène de structuration dynamique, sous écoulement, typique des suspensions très concentrées et appelé " jamming ". Nous montrons que l'apparition de ce régime d'encombrement va de pair avec des fluctuations géantes de contraintes, avec une statistique caractéristique des événements critiques auto-organisés. L'état de surface des grains et du frottement intergranulaire est un paramètre important dans le blocage sous cisaillement. La simultanéité des fluctuations des efforts normaux et des efforts tangentiels aussi que des visualisations microscopiques suggère fortement que la formation de chaînes de contacts frottants est à l'origine du phénomène.

La membrane plasmique de la cellule est composée de lipides et interagit notamment avec le squelette de la cellule (le cytosquelette), par l'intermédiaire de protéines d'ancrages et de lipides clefs qui jouent un rôle spécifique dans certains types d'interactions. Parmi les protéines intervenant dans l'ancrage direct de la membrane plasmique au cytosquelette, des protéines de la famille des ERM (Ezrine, Radixine, Moésine) peuvent interagir spécifiquement avec un lipide, le phosphatidylinositol (4,5) biphosphate (PIP2), d'une part et avec l'actine du cytosquelette d'autre part. Dans le but de comprendre les interactions entre membrane plasmique et cytosquelette, nous avons réalisé des expériences in vitro sur des systèmes comportant un nombre minimal de constituants : des vésicules géantes (GUV) contenant du PIP2, de l'ezrine recombinante et de l'actine purifiée. Nous avons mis en évidence que la liaison au PIP2 induit des changements conformationnels de l'ezrine. L'ezrine est alors capable d'interagir avec les filaments d'actine. Nous avons caractérisé quantitativement l'incorporation de PIP2 dans la membrane de vésicule géantes, et montré que l'interaction de l'ezrine avec les vésicule géante contenant du PIP2, induit un partitionnement du lipide dans la bicouche lipidique et conduit à la formation d'agrégats de PIP2 et d'ezrine sur la membrane. La connaissance des effets de l'ezrine sur les membranes contenant du PIP2 et la connaissance des différents mécanismes se produisant lors des interactions permettra de définir plus précisément le rôle de l'ezrine in cellulo.

Vesicular delivery systems, like liposomes, represent an attractive approach to improving skin delivery of drugs. Liposomes are composed of one or several lipid bilayers surrounding an aqueous compartment. They are able to encapsulate hydrophilic compounds into their inner compartment and lipophilic compounds into their lipid bilayers. In the first part of this thesis, we developed a new dermal delivery system combining the advantages of cyclodextrin inclusion complexes and those of deformable liposomes. This system was called drugs-in-cyclodextrin-in-deformable liposome. Betamethasone was chosen as the model drug. These systems were successfully developed and characterised. In vitro diffusion studies using Franz diffusion cells and polycarbonate membranes gave promising results. In order to better mimic the in vivo conditions, ex vivo penetration studies using pig ear skin and Franz diffusion cells were developed. The tape stripping method was used to determine the amount of drug in the stratum corneum. The amount of drug in the epidermis, dermis and receptor medium was also assayed. These methods were successfully validated. Unfortunately, ex vivo penetration studies of the developed skin delivery system could not confirm the promising in vitro results. Our research was then directed towards studies allowing a better understanding of liposome skin penetration mechanisms. In the second part of this thesis, the influence of several parameters on the skin penetration behaviour of liposomes was investigated. The formulation importance on skin penetration efficiency was highlighted by the comparison of two liposomal systems. In the first system, betamethasone is encapsulated by the help of cyclodextrin inclusion complexes in the aqueous compartment. In the second system, betamethasone is encapsulated alone in the lipid bilayer. The second system shows high membrane permeability of the encapsulated betamethasone. Despite this decreased drug retention, the second system enhances the skin penetration of betamethasone. This high membrane permeability and the better penetration of the second formulation support the mechanism of penetration as a free drug substance. In addition, no difference in penetration is observed between liposomes containing betamethasone alone and a non liposomal dispersion. Several surfactants or edge activators were incorporated in the lipid bilayer of liposomes in order to obtain deformable liposomes. Unfortunately, these deformable liposomes are unable to enhance skin penetration compared to classical non deformable liposomes. The addition of charged lipids in the lipid bilayer of liposomes encapsulating either betamethasone or betamethasone dipropionate was investigated. The addition of negatively charged lipids enhances the penetration of the encapsulated drug. The use of negatively charged liposomes enhanced the epidermis accumulation of betamethasone 9.3 times compared with the ethanolic solution. This improvement is not observed with the corresponding non liposomal dispersion, indicating that the vesicle form is of high importance. In the case of the ester, the use of negatively charged liposomes enhances the epidermis accumulation 5.5 times compared with the Diprosone® lotion and only 1.6 times compared with the ethanolic solution. The penetration of a more lipophilic drug, with a high intrinsic penetration, is less enhanceable when incorporated in liposomes. Confocal microscopy was performed to visualise skin penetration of fluorescently labelled liposomes. The lipophilic dye rhodamine B encapsulated in the lipid bilayer as betamethasone penetrates the epidermis at the same level as NBD-phosphatidylcholine. On the other hand, the hydrophilic dye calcein encapsulated in the aqueous compartment as betamethasone-cyclodextrin complexes does not penetrate the epidermis. These observations seem to confirm the ex vivo results. In addition, the skin penetration of rhodamine B seems to be improved by the incorporation in negatively charged liposomes compared with classical ones. Finally, the efficiency of the negatively charged vesicles was evaluated in vivo on volunteers by the skin blanching assay. Carbomer gel containing the negatively charged vesicles seems to enhance the blanching response of encapsulated betamethasone in comparison with the ethanolic hydroxypropylcellulose gel. However, results are not significantly different. This could be explained by the small number of volunteers. On the other hand, in the case of formulations containing betamethasone dipropionate, no tendency could be highlighted. These results seem to confirm that the use of negatively charged liposomes is more attractive for improving the efficiency of a lesser lipophilic drug, betamethasone, in comparison with the more lipophilic ester, betamethasone dipropionate. These results need to be confirmed using a higher number of volunteers./ Les systèmes vésiculaires, comme les liposomes, représentent une approche intéressante pour améliorer ladministration cutanée de médicaments. Les liposomes sont des vésicules sphériques composées dune ou plusieurs bicouches lipidiques entourant une cavité aqueuse. Ils sont capables dencapsuler des molécules hydrophiles dans leur cavité aqueuse, ainsi que de retenir des molécules hydrophobes dans leur bicouche lipidique. Dans la première partie de la thèse, nous nous sommes intéressés au développement dun nouveau système dadministration cutanée combinant les avantages des complexes dinclusion dans les cyclodextrines et ceux des liposomes déformables, aboutissant à un nouveau concept appelé : « drugs-in-cyclodextrin-in-deformable liposome». La bétaméthasone a été utilisée comme molécule modèle. Ces nouveaux systèmes ont été mis au point et caractérisés avec succès. Les premières études de diffusion réalisées in vitro, à travers des membranes synthétiques et au moyen des cellules de diffusion de Franz, étaient prometteuses. Afin de se rapprocher des conditions in vivo, des études de pénétration des liposomes ont alors été mises au point, ex-vivo, au moyen de cellules de diffusion et à travers des peaux doreilles de cochons. La méthode du « tape stripping » a permis de déterminer la quantité de bétaméthasone dans le stratum corneum. La quantité de substance active dans lépiderme, le derme et le mileu récepteur des cellules de Franz a également été déterminée. Ces méthodes ont été validées avec succés. Malheureusement, les études sur peaux doreilles de cochons nont pas permis de confirmer nos premières conclusions. Les recherches ont alors été orientées vers des études permettant de mieux comprendre les mécanismes de pénétration cutanée des liposomes. Dans la seconde partie de la thèse, linfluence de différents paramètres sur la pénétration cutanée a été étudiée. La comparaison de la pénétration cutanée de deux systèmes liposomiaux différents a mis en évidence limportance de la formulation des liposomes sur leur efficacité. Dans le premier, la bétaméthasone est encapsulée comme précédemment à laide de cyclodextrines dans la cavité aqueuse des liposomes déformables. Dans le second système, la bétaméthasone est encapsulée seule au niveau de la bicouche lipidique des liposomes. Ce second système a montré une plus grande perméabilité de la molécule modèle encapsulée. Malgré cette plus faible rétention, le deuxième système a permis daugmenter la pénétration de la molécule modèle. La plus grande perméabilité et la meilleure pénétration du deuxième système permettent de conclure que la bétaméthasone pénétrerait sous une forme non encapsulée dans les liposomes. De plus, aucune différence na été observée entre la pénétration cutanée des liposomes encapsulant la bétaméthasone dans leur bicouche et une dispersion non liposomale. Plusieurs tensio-actifs ont également été incorporés au niveau de la bicouche des liposomes afin dobtenir des liposomes déformables. Malheureusement, la faible augmentation de pénétration observée par rapport aux liposomes classiques non déformables nest pas significative. Lajout de lipides chargés au niveau de la bicouche lipidique de liposomes encapsulant soit la bétaméthasone soit le dipropionate de bétaméthasone a été investigué. Laddition de lipides chargés négativement a permis daugmenter la pénétration de la molécule encapsulée. Lutilisation de liposomes chargés négativement a permis daugmenter la quantité de bétaméthasone au niveau de lépiderme dun facteur 9,3 par rapport à une solution éthanolique de bétaméthasone. Cette augmentation na pas été observée avec la dispersion non liposomale correspondante, indiquant que la formulation sous forme de vésicules est très importante. En ce qui concerne le dipropionate de bétaméthasone, lencapsulation dans les liposomes chargés négativement a augmenté la quantité dester dans lépiderme dun facteur 5,5 par rapport à la spécialité Diprosone® lotion et seulement dun facteur 1,6 par rapport à la solution éthanolique. Lencapsulation dans les liposomes chargés négativement semble donc moins avantageuse dans le cas dune molécule plus lipophile, comme le dipropionate de bétaméthasone et qui possède déjà une bonne pénétration cutanée intrinsèque par rapport à une molécule plus hydrophile comme la bétamethasone. La pénétration de liposomes rendus fluorescents a été visualisée grâce à la microscopie confocale. Un marqueur lipophile, la rhodamine B, encapsulé dans la bicouche comme la bétaméthasone, pénètre bien dans la peau de la même façon que la phosphatidylcholine fluorescente. Par contre, un marqueur hydrophile, la calcéine, encapsulé dans la cavité des liposomes comme les complexes bétaméthasone-cyclodextrines, ne pénètre pas dans lépiderme. Ces observations confirment les résultats de dosage ex vivo au moyen des cellules de Franz. De plus, la pénétration dans la peau de la rhodamine B semble être plus importante lorsquelle est encapsulée dans les liposomes chargés négativement par rapport aux liposomes non chargés. Enfin, lefficacité des liposomes négatifs a été évaluée in vivo sur des volontaires grâce à lévaluation du pouvoir de blanchiement des corticostéroïdes. Le gel de carbomère contenant les liposomes chargés négativement semble augmenter la réponse de la bétaméthasone par rapport au gel éthanolique dhydroxypropylcellulose. Cependant, les résultats ne sont pas significatifs. Une explication pourrait être le faible nombre de volontaires. Par contre, dans le cas des liposomes contenant le dipropionate de bétaméthasone, il a été plus difficile de dégager une tendance. Ces résultats semblent confirmer que lutilisation des liposomes chargés négativement est plus intéressante dans le cas dune molécule moins lipophile comme la bétamethasone par rapport à une molécule plus lipophile comme le dipropionate de bétaméthasone. Ces résultats nécessitent cependant dêtre confirmés sur un plus grand nombre de volontaires.

Le maintien de l'homéostasie énergétique est placé sous le contrôle de cytokines qui agissent dans le système nerveux central, notamment au niveau de l'hypothalamus. En particulier, la leptine, cytokine produite par le tissu adipeux, diminue la prise alimentaire et stimule la perte de poids. L'obésité est une épidémie mondiale qui progresse de façon alarmante, notamment chez les enfants et souvent associée à des pathologies sévères et des désordres endocriniens comme la résistance à la leptine ou à l'insuline. Le CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor) est une neurocytokine de la même famille que la leptine dont l'un des principaux avantages est qu'il stimule la perte de poids dans les cas de leptino-résistance en activant les mêmes voies de signalisation que la leptine (Benomar et al., 2009). Face à l'épidémie mondiale d'obésité,chez la population adulte comme enfantine, il apparaît nécessaire de décrypter les mécanismes impliqués dans la genèse de la maladie ainsi que les potentiels agents thérapeutiques.L'objectif premier de ce travail de thèse a été de caractériser l'impact d'une alimentation maternelle hyperlipidique (HF) sur les capacités de contrôle de l'homéostasie énergétique chez la descendance. En effet, le concept de " programmation métabolique " propose que des pertubations de l'environnement périnatal puissent influencer durablement la descendance, la rendant plus susceptible de développer une obésité dans un contexte nutrionnellement riche.Des études menées au sein du laboratoire ont montré qu'un régime maternel HF pouvait programmer l'acquisition de la leptino-résistance chez la descendance à l'âge adulte (Ferezou-Viala et al., 2007b). Nous avons donc testé la prédispostion de ces animaux à prendre du poids lorsqu'ils étaient nourris avec un régime hypercalorique (P). Nos données ont montréqu'étonnamment, le régime maternel HF protégeait la descendance contre le gain de poids induite par le régime P, induisait des modifications d'expression des marqueurs de l'homéostasie énergétique dans le foie et l'hypothalamus, ainsi que de profondes réorganisations cytoarchitectoniques dans le noyau arqué. Plus précisément, le régime maternel HF était associé à une réorganisation de la couverture astrocytaire périvasculaire dans le noyau arqué de la descendance qui persistait à l'âge adulte.Dans une seconde partie de la thèse, nous avons étudié les mécanismes d'action du CNTF. En effet, notre équipe a récemment mis en évidence que le CNTF endogène pourrait jouer un rôle dans la régulation de l'homéostasie énergétique. Les niveaux hypothalamiques de cette cytokine, présente dans les astrocytes et les neurones du noyau arqué, augmentent chez les animaux résistant à une alimentation hypercalorique. Cela pourrait suggérer un rôle protecteur du CNTF contre la prise de poids chez certains individus (Vacher et al., 2008). A ce jour, les mécanismes d'action du CNTF restent cependant mal compris car ce dernier ne possède pas de peptide signal et n'est donc pas sécrété selon des mécanismes d'exocytose classiques. Partant du constat que le CNTF et ses sous-unités réceptrices étaient distribuées de façon similaire dans les cellules du noyau arqué, nous avons émis l'hypothèse que le CNTF pourrait exercer une action intracellulaire sur les cellules de cette structure. Dans cette étude nous démontrons que le CNTF peut interagir directement avec ses récepteurs dans le noyau des neurones anorexigènes du noyau arqué, pour réguler leur activité transcriptionnelle. Ces données proposent ainsi un nouveau mécanisme à l'action anorexigène du CNTF

Les nanostructures d'or peuvent être utilisées comme antennes optiques : elles se couplent à un émetteur ou récepteur de photons en champ proche et amplifient l'interaction de celui-ci avec le champ lointain. Nous montrons ici comment des dimères de nanoparticules d'or assemblés autour d'un brin d'ADN fonctionnent comme des antennes aux fréquences optiques, alimentées par un émetteur quantique unique. L'électrophorèse permet d'isoler des nanoparticules de 36 nm de diamètre fonctionnalisées par un seul monobrin d'ADN de 30 ou 50 bases et, après hybridation de séquences complémentaires, de dimères de géométries contrôlées. Les fréquences de résonance de ces assemblages indiquent un décalage spectral vers le rouge pour des distances interparticules réduites ; en excellent accord avec des calculs théoriques corrélés à une étude topologique par microscopie électronique cryogénique. En alimentant ces dimères par une unique molécule d'ATTO647N, nous produisons des sources de photons uniques dont les taux d'émission spontanée sont exaltés de deux ordres de grandeur par rapport à des fluorophores isolés. Les taux de désexcitation mesurés sur plusieurs centaines de molécules uniques (isolées et en présence d'une ou deux nanoparticules d'or) coïncident quantitativement avec les exaltations estimées en théorie de Mie. Des mesures d'ensemble par spectroscopie de corrélation de fluorescence indiquent également une exaltation de plus d'un ordre de grandeur des coefficients d'extinction molaire et un gain en signal de fluorescence pour les dimères les plus courts malgré une réduction notable du rendement quantique. En modifiant fondamentalement l'environnement électromagnétique local, ces nanostructures hybrides offrent une nouvelle voie d'ingénierie des propriétés photochimiques de systèmes moléculaires.

Nous étudions les propriétés optiques de boîtes quantiques GaN/AlN élaborées par épitaxie par jets moléculaires sur substrats Si(111). La spectroscopie résolue en temps de l'émission collective de plans de boîtes quantiques nous conduit à une détermination appropriée de l'état fondamental des boîtes quantiques et du champ électrique interne le long de l'axe de croissance. Nous observons et modélisons une dynamique de recombinaison non conventionnelle des porteurs. Ces résultats préliminaires nous permettent de sélectionner les boîtes quantiques idéales pour l'étude individuelle en micro-photoluminescence. Nos mesures sur boîte unique révèlent des effets de diffusion spectrale que nous étudions en détails. En analysant la polarisation linéaire, nous observons des propriétés liées à la structure fine excitonique, très différentes de celles de boîtes quantiques étudiées auparavant, ce que nous expliquons à l'aide d'un modèle tenant compte des effets d'échange et d'anisotropie.

Dans cette étude, nous avons développé un composé dérivé du NADPH, nommé Nanoshutter (NS). NS a été conçu pour inhiber l'activité catalytique de la NOS, c'est à dire la synthèse de NO, en occupant la place du NADPH dans le domaine réductase du NOS. La voie de synthèse de NO chez les mammifère correspond à l'oxydation de la L-arginine catalysée par la NOS, qui se produit dans son domaine oxygénase. Basée sur des données de modélisation moléculaire, la structure de NS est composée deux sous-unités: (i) le motif nucléotidique de reconnaissance du NADPH a été retenu, permettant au composé NS un ciblage approprié du site de liaison au NADPH de la NOS, (ii) le motif nicotinamide de NADPH a été remplacé par un groupe stilbène lié à un groupement terminal accepteur d'électrons. De plus, ce fragment est caractérisé par une très bonne section efficace d'absorption à deux photons (130 GM à 840 nm). NS1, le composé prototype de la famille NS, contient un groupe terminal NO2 en tant que groupe accepteur d'électrons. La valeur de Kd (~ 4,2 µM) a été estimée dans des expériences de titrage sous excitation un- ou deux-photons, et suggère une bonne affinité de liaison de NS1 à la NOS. De façon inattendue, NS1 présente une bonne sélectivité, en terme de rendement quantique de fluorescence, pour les isoformes de NOS par rapport à d'autres protéines qui contiennent ou non un site de liaison NADPH. En outre, il a été montré que NS1 inhibait de façon compétitive NOS par rapport au NADPH. Dans les expériences d'imagerie de fluorescence réalisées sur des cellules endothéliales (HUVEC), NS1 a démontré une internalisation rapide et efficace, avec un signal de fluorescence mis en évidence principalement dans la région périnucléaire, accompagné d'un signal plus sporadique à la membrane plasmique. Cette observation est en parfait accord avec la colocalisation de NS1 et eNOS mesurée par immunomarquage, démontrant ainsi que NS1 cible eNOS dans les cellules endothéliales. La vasoconstriction NO-dépendante attendue dans les anneaux aortiques isolés de souris a été montrée, mais uniquement en présence de catalase qui convertit H2O2 en H2O et O2. En revanche, en l'absence de catalase, la vasorelaxation a plutôt été observée. Ce résultat indique que la NOS n'est très certainement pas l'unique cible de NS1 dans le système endothélial, et que d'autres cibles en rapport avec la modulation de ROS (Reactive Oxygen Species) sont impliquées. En accord avec ce résultat, NS1 provoque une réponse biphasique de la production de ROS dans les cellules HUVEC : Une phase d'augmentation est observée aux faibles concentrations de NS1 (en dessous de 2 µM), suivie d'une diminution (inhibition de ROS) pour des concentrations de NS1 plus élevées. En outre, NS1 inhibe la production de O2- dans les macrophages de souris et les productions de H2O2 et de O2- survenant dans des conditions de découplage de nNOS in vitro. Des explications possibles pour interpréter ces données sont: NS1 probablement inhibe la production de ROS, soit produites au niveau de la NADPH oxydase ou (et) au cours du découplage de la NOS. L'origine de la phase d'augmentation reste plus difficile à interpréter, mais pourrait correspondre au ciblage de la glucose-6-phosphate deshydrogénase. Enfin, NS1 exerce un effet anti -angiogénique sur les cellules endothéliales et empêche la prolifération de cellules du mélanome. En conclusion, NS1 rempli l'objectif principal de cibler et inhiber la NOS en ciblant plus particulièrement le domaine réductase - il est aussi caractérisé par des propriétés d'absorption et de fluorescence à deux photons intéressantes permettant des applications in vitro et in vivo. L'ensemble de ces caractéristiques présentent un profil intéressant pour de futures applications d'imagerie en temps réel et non-invasive, avec également un fort potentiel pour des applications cliniques liées aux maladies NO-dépendantes.

Pour mettre en relation les propriétés rhéologiques et la structure méso/microscopique d'un système modèle ou complexe, l'utilisation de la rhéo-optique est indispensable. Nous avons donc développé une cellule d'observation sous cisaillement adaptée à la microscopie confocale. Ce dispositif, breveté et nommé RheOptiCAD®, permet le cisaillement contrôlé d'un échantillon quelconque placé entre 2 plans parallèles en translation. Grâce à un système à dépression, la mise en place de l'échantillon est simple et rapide tout en assurant des propriétés optiques répétables et reproductibles (planéité, parallélisme). Par ailleurs, la température au sein de l'échantillon peut être régulée de façon à imposer une contrainte thermique, cause de nombreuses modifications de la mésostructure d'un système alimentaire. La cellule d'observation sous cisaillement permet donc de suivre l'évolution et la dynamique des changements de structures conséquences d'un traitement thermo-mécanique imposé. Un logiciel de pilotage et d'acquisition des données a été développé pour rendre son utilisation plus conviviale. La validation du fonctionnement de l'outil et de ses fonctionnalités a tout d'abord été réalisée sans échantillon puis à l'aide d'un système modèle contenant des particules fluorescentes dont le mouvement était suivi. Par la suite, dans le but de tester les potentialités de ce nouvel outil tout en développant la méthodologie de son utilisation, et en particulier l'équilibre entre propriétés optiques et mécaniques des échantillons, nous avons travaillé avec de la pâte de farine. Ce système alimentaire bien connu et maîtrisé d'un point de vue rhéologique au laboratoire présente des caractéristiques intéressantes dans ce cadre. L'évolution du réseau de gluten au cours d'un cisaillement oscillatoire en fonction de la formulation de la pâte a été étudiée. Grâce à une analyse d'image basée sur la morphologie mathématique, nous avons pu mettre en évidence des changements de structures au cours du temps. De même, à l'aide des capacités thermiques de la cellule de cisaillement, nous avons étudié le positionnement et le mouvement des lipides endogènes à l'interface air-protéine lors de la fermentation. Notre cellule d'observation sous cisaillement constitue donc un nouvel outil de caractérisation dynamique de systèmes complexes couplant rhéologie et microscopie. Son optimisation principale réside dans la mise en place d'un capteur de force, mesurant les contraintes mises en jeu lors des déformations imposées.