Le but de cette thèse est de caractériser un continuum généré en régime femtoseconde dans une fibre microstructurée (puissance spectrale, durée des pulses, fluctuations tir à tir) et de valider son utilisation comme source optique dans des instrumentations dédiées aux domaines biologique et clinique.<br />La première application est l'élaboration d'un microscope confocal de fluorescence entièrement versatile en longueur d'onde : le continuum, filtré par un cristal acousto-optique, est ainsi utilisé comme une source accordable permettant l'excitation de n'importe quel fluorophore. Des images de cellules identifiées par différents marqueurs ont été réalisées.<br />Afin de disposer d'un outil alliant une grande versatilité spectrale à une très haute résolution spatiale, le dispositif précédent a été modifié en un microscope STED. Notre continuum est trop peu énergétique pour apporter une validation expérimentale, mais des simulations numériques prenant en compte les fluctuations du continuum permettent d'estimer que la résolution latérale peut atteindre 90 nm, voire 35 nm pour les pulses les plus puissants.<br />La troisième application est l'utilisation du continuum en tant que source large bande pulsée pour une expérience de spectroscopie de temps de vol dans les milieux diffusants tels le muscle, l'os, la moelle osseuse. Grâce à un modèle adapté de propagation de la lumière, les coefficients d'absorption, de diffusion et d'anisotropie des tissus ont été extraits des traces expérimentales, avec d'autant plus de précision que la plage spectrale utilisée est grande.<br />Même si des améliorations sont attendues, l'emploi de continua en microscopie de fluorescence et en spectroscopie est validé.

Cette thèse aborde le problème de la modélisation et de la détection des filaments dans des images 3D. Nous avons développé des méthodes variationnelles pour quatre applications spécifiques : l'extraction de routes où nous avons introduit la notion de courbure totale pour conserver les réseaux réguliers en tolérant les discontinuités de direction ; la détection et la complétion de filaments fortement bruités et présentant des occultations. Nous avons utilisé la magnétostatique et la théorie de Ginzburg-Landau pour représenter les filaments comme ensemble de singularités d'un champ vectoriel ; la détection de filaments dans des images biologiques acquises en microscopie confocale. On modélise les filaments en tenant compte des spécificités de cette dernière. Les filaments sont alors obtenus par une méthode de maximum à posteriori ; la détection de cibles dans des séquences d'images infrarouges. Dans cette application, on cherche des trajectoires optimisant la différence de luminosité moyenne entre la trajectoire et son voisinage en tenant compte des capteurs utilisés. Par ailleurs, nous avons démontré des résultats théoriques portant sur la courbure totale et la convergence de la méthode d'Alouges associée aux systèmes de Ginzburg-Landau. Ce travail réunit à la fois modélisation, résultats théoriques et recherche d'algorithmes numériques performants permettant de traiter de réelles applications.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Biosciences végétales : Toulouse, INPT : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 138 réf.

L'endomicroscopie confocale laser fibrée (pCLE, pour probe-based Confocal Laser Endomicroscopy) est une modalité d'imagerie qui permet d'obtenir des images d'un tissu en temps-réel, avec une résolution micrométrique, lorsque l'on place la sonde d'imagerie au contact de celui-ci. En chirurgie digestive, cette technologie peut être utilisée pour remplacer les biopsies extemporanées par des biopsies optiques, sans prélèvement de tissu. Ceci permet de réduire le temps opératoire et l'invasivité de l'opération. Généralement, afin de rendre un diagnostic clinique sur l'état cancéreux d'un tissu, les cliniciens analysent non seulement les cellules, mais également leur organisation relative. Cependant, pour des raisons techniques, il n'est pas possible d'avoir une sonde petite, donnant des images grand champ, et avec une résolution de l'ordre du micromètre. Ainsi, les images confocales sont la plupart du temps trop petites pour que les cliniciens puissent poser un diagnostic. Une solution possible à ce problème est de déplacer la sonde sur la surface du tissu afin de collecter une suite d'images que l'on recale afin grâce à un algorithme de mosaicing afin de reconstruire une image grand champ. Cette technique a fait l'objet de nombreuses études. Ces études ont essentiellement porté sur l'algorithme de mosaicing, et peu d'intérêt a été porté jusqu'à présent au mouvement de balayage de la sonde sur le tissu. La plupart du temps, ce mouvement est réalisé à la main en utilisant les manettes d'un fibroscope dans des applications de gastroentérologie. Ce type d'actionnement ne permet pas de contrôler la trajectoire de la sonde correctement, surtout en présence de mouvements physiologiques et de déformations des tissus sous l'action de la sonde. Notre travail porte sur la conception et le développement d'instruments minimalement invasifs robotisés permettant de réaliser des biopsies optiques dans la cavité abdominale. Premièrement, une méthode permettant d'estimer la vitesse dans les images endomicroscopiques est décrite et évaluée (chapitre 2). Cette méthode est alors utilisée pour mettre en évidence et modéliser les déformations des tissus mous lorsque la sonde est en mouvement à leur contact (chapitre 3). Un modèle phénoménologique simple utilisant un seul paramètre est proposé, ainsi qu'une procédure de calibration en ligne. Deux stratégies sont proposées afin de compenser les déformations, l'une utilisant une trajectoire ligne par ligne modifiée et l'autre utilisant un balayage en spirale qui permet de minimiser l'influence des déformations du tissu. Par ailleurs, un algorithme de commande par asservissement visuel est également proposé. Celui-ci est basé sur l'estimation de vitesse présentée dans le chapitre 2, et permet de contrôler précisément la position de la sonde tout en rejetant les déformations du tissus considérées comme une perturbation. Une variante de cet algorithme est également proposée pour contrôler la vitesse d'avance le long d'un balayage contraint à une trajectoire en spirale. On montre, lors d'expériences ex vivo réalisées avec un robot industriel de précision, que le bon contrôle de la position de la sonde le long de la trajectoire permet de réaliser des mosaïques significativement plus grandes que celles que l'on peut trouver dans la littérature existante. Enfin, les méthodes développées sont appliquées à des instruments minimalement invasifs. On propose ici une structure d'instrument qui combine des mouvements macroscopiques pour la navigation dans l'abdomen, un système passif de compensation des mouvements physiologiques, et un actionnement à l'échelle microscopique pour le balayage de la sonde. Deux systèmes de micro-actionnement sont proposés. Le premier utilise un actionnement hydraulique grâce à des micro-ballons et permet de réaliser des trajectoires arbitraires à la surface du tissu, tandis que le second a comme seul degré de liberté une rotation proximale qui est transformée en un mouvement de spirale grâce à un mécanisme distal. Des essais ex vivo et in vivo ont été menés avec succès afin de tester la précision et la robustesse des systèmes et algorithmes de commande proposés.

Durant les opérations de filtration membranaire, les industries font face à un problème majeur : le colmatage. En particulier, la formation d’un dépôt de particules sur la membrane provoque une chute de sa perméabilité et de sa sélectivité. L’étude a pour but de mieux caractériser la morphologie des dépôts de particules, en lien avec ses propriétés de transport, dans le but d’enrichir les modèles utilisés pour prédire les performances de filtration des dispositifs industriels. Des expériences de filtration de suspensions pures et mixtes de particules inertes et biologiques, sont réalisées sur des microsieves et observées in situ par microscopie confocale. Les propriétés spatiales du dépôt (arrangement des particules, épaisseur, porosité, taux de couverture de la membrane) sont déterminées par traitement d’images et corrélées aux variations de perméabilité. L’influence des paramètres tels que : la taille des particules, la géométrie de la microsieve (taille de pore, distance entre pores) et la nature des particules, est soigneusement analysée. Plusieurs mécanismes physiques sont mis en évidence : - La préfiltration de grosses particules avant la filtration des petites maintient un débit élevé.- Les particules déposées protègent les pores qui leurs sont périphériques lorsque le rapport « taille de particules / taille de pores » est élevé.-Dans les conditions expérimentales étudiées, la morphologie des dépôts de particules inertes et biologiques est identique.- Le dépôt est structuré en trois régions distinctes : une zone de germination en contact avec la membrane, une couche centrale dense, une région de capture superficielle / During the operations of filtration, the industries are facing a major problem: fouling. Indeed, the cake layer build-up on top of the membrane reduces its productivity and selectivity. The aim of this study is to characterize the particle deposit morphology at different operating conditions in order to enhance the models used to predict the filtration performances at the industrial level. Pure and mixed suspensions of inert and biological particles are filtrated with microsieves and observed in situ by Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM). The spatial properties of the cake (particle arrangement, thickness, porosity, microsieve coverage) are determined by image processing and correlated with the permeability reduction. The effect of the parameters such as: the particles size, the microsieve geometry (pore size, pore pitch) and the particles characteristics, is carefully analyzed. Several physical mechanisms are highlighted:- The prefiltration of large particles before the filtration of the small ones maintains a high flux.- Deposited particles protect the surrounding pores when the ratio "particles size/pores size" is high.- In the studied experimental conditions, the cake morphology of the inert and biological particles is similar.- The cake is structured in three regions: germination region in contact with the membrane, a central high particle concentration region and a superficial region, named capture region

Ce travail de thèse s’intéresse à l’introduction de méthodologies électrochimiques dans la problématique de la caractérisation du transport de peptides pénétrants (CPPs) à travers des membranes phospholipidiques. Malgré leur charge électrique globalement positive, ces peptides sont en effet capables de traverser les bicouches lipidiques de cellules réelles ou artificielles (liposomes) et il n’existe pas à ce jour de mécanisme d’internalisation universellement admis. Dans ce contexte, nous avons dans un premier temps développé des méthodologies visant à détecter des peptides pénétrants marqués par des sondes rédox en optimisant les conditions de volume et de confinement à l’électrode. Parallèlement, nous avons tenté d’observer le passage transmembranaire de ces peptides en utilisant un dispositif dérivé du patch-clamp, dans lequel un morceau (patch)de membrane lipidique est excisé d’une vésicule géante et le suivi du passage assuré par une détection ampérométrique sur ultramicro-électrode à proximité de la membrane. La sensibilité de la technique ampérométrique et le flux de CPP s’avérant faibles, nous nous sommes tournés vers une stratégie associant fluorescence (pour la sensibilité) et commande électrochimique (pour l’extinction de la fluorescence). Dans la mesure où les phospholipides constituent la barrière dynamique à travers laquelle doivent passer les CPPs, nous avons d’abord étudié l’extinction électrochimique de phospholipides marqués par une sonde à la fois rédox et fluorescente, le NBD. Observée sur des vésicules géantes au microscope confocale, la réduction électrochimique a permis l’extinction sélective des phospholipides situés sur le feuillet externe de la vésicule, un résultat que ne permettent ni la réduction par des agents chimiques (dithionite), ni les techniques de « photobleaching ». Cette propriété a été confirmée cette fois-ci pour des CPPs marqués par le NBD qui ont été mis à incuber en présence de vésicules géantes et pour lesquels un essai préliminaire semble confirmer une extinction de fluorescence essentiellement pour les peptides associés au feuillet externe de la vésicule. / This PhD work was aimed at introducing electrochemical strategies in the general topic devoted to the characterization of the passage of cell penetrating peptides (CPPs) across phospholipidic membranes. Although positively charged, CPPs are prone to cross lipidic bilayers of real and artificial cells (liposomes) and there is no commonly admitted internalization mechanism so far. Therefore, we first developed electrochemical setups aimed at improving the amperometric detection of redox-taggedCPPs, through optimization of volume and confinement. Additionally, we have made attempts to use patch-clamp inspired setups to monitor the passage of CPPs across a membrane patched from a giant vesicle using ultramicro-electrodes in the close vicinity of the patched membrane. Since the amperometric technique displayed poor sensibility and the flux of CPP was too narrow, we changed our strategy for a methodology coupling fluorescence (for the sensitivity) and an electrochemical command (to achieve fluorescence extinction). Considering that phospholipids are forefront actors of CPP internalization, we first focused on the electrochemical quenching of phospholipids tagged with a probe displaying both redox and fluorescent properties (NBD). Observed on giant unilamellar vesicles (GUVs) with confocal microscopy, the electrochemical reduction of the NBD probe led to the selective extinction of the phospholipids located on the outer leaflet of the vesicle, a selectivity which is not observed using chemical quenchers such as dithionite or photobleaching methods. That property was extended to NBD-tagged CPPs, previously incubated with unlabeled Guvs and that preliminary experiment confirmed that the electrochemical extinction mostly concerned peptides associated to the outer leaflet of the liposome.

La peau est un « avant poste » fascinant du système immunitaire. Elle forme une barrière entre l'environnement extérieur et l’organisme. Elle est aussi le point d'entrée pour les agents pathogènes, contre lesquels le système immunitaire organise des réponses adaptatives. Les acteurs de l'immunité innée de la peau contrôlent l'invasion des pathogènes et perçoivent également des changements environnementaux physiques et chimiques directs. Plusieurs composants du système immunitaire, tels que des cellules dendritiques (DCs), les macrophages (MΦ) et les mastocytes (MCs), participent à l'éradication des pathogènes et à l'initiation des réponses mémoires adaptatives. Ce qui permet une mobilisation rapide des cellules T effectrices ainsi que la sécrétion des anticorps par les cellules B à la suite d’une seconde exposition aux agents pathogènes. Les MCs qui sont des cellules résidentes du derme, jouent un rôle déterminant dans la libération de signaux d’alertes et sont classiquement considérés comme des cellules effectrices de la réaction allergique cutanée liée à l'IgE. Plusieurs observations récentes indiquent que les MCs seraient aussi impliqués dans les processus immunorégulateurs lors de l'initiation des réponses immunitaires adaptatives, dans le maintien de la tolérance périphérique aux composants de la peau et dans la régénération de la peau au cours des processus de cicatrisation. Cependant, les interactions entre les MCs et d'autres cellules immunitaires innées et adaptatives recrutées dans des conditions inflammatoires cutanées n'ont pas été élucidées en détail. Dans ce travail, nous décrivons l'utilisation d'une nouvelle souris possédant des MCs fluorescents (RMB), dans laquelle nous avons marqué les MCs FcεRI+ avec un marqueur fluorescent rouge tomato (TdT) et avec un système d'ablation conditionnelle basé sur l'expression concurrente du récepteur de la toxine diphtérique (DTR). Avec ces souris RMB, nous avons visualisé la dynamique des MCs et nous avons suivi les interactions entre les MCs et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) après l'activation des MCs par l'IgE, dans une réaction inflammatoire typique de l'anaphylaxie cutanée passive (PCA). Dans un second volet d’étude, nous avons évalué le rôle des MCs lors d'un modèle expérimental de la greffe de peau de l'oreille, afin de révéler leur influence dans la cinétique de rejet ou prise de greffe du transplant. Nous avons constaté que 1) l'activation et la dégranulation des MCs induites par le pontage du récepteur FcεRI via des IgE couplées à un antigène multivalent sont les seules responsables de la réaction de PCA, et induisent le recrutement de Tregs ayant une grande motilité sur le site de l'inflammation. Nous avons constaté dans ces conditions, que les MCs restent immobiles, et que les Tregs établissent des contacts dynamiques avec les MCs dans le derme. 2) En outre, nous avons mis en place un modèle pour identifier les paramètres moléculaires de l'interaction MC-Treg et avons constaté que le complexe de l'antigène avec l'IgE peut être présenté aux Tregs en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II, permettant la formation des contacts stables MC-Treg. 3) En utilisant un modèle de transplantation de la peau in vivo, nous avons montré que l'ablation conditionnelle des MCs conduit à une accélération du rejet du greffon dans le cas d'une transplantation en présence d’une disparité d’antigènes d’histocompatibilité mineurs depuis une souris mâle sur une souris femelle. Nous avons également constaté un impact inattendu de l'ablation des MCs dans la greffe de peau en l’absence de disparité antigénique d'une souris femelle sur une souris femelle, conduisant à un rejet rapide. Les MCs semblent donc être essentiels pour la cicatrisation et la régénération tissulaire après greffe. (...) / The skin is a fascinating outpost of the immune system. It performs a barrier function between the outside environment and the inner body and is also a port of entry for pathogens against which the immune system mounts adapted responses. The skin innate immune defenses control pathogen invasion and perceive also direct physical and chemical environmental changes. Several component of the immune system such as dendritic cells (DC), macrophages (MΦ) and mast cells (MC) participate in initial pathogen clearance and in initiating adaptive memory responses, allowing rapid mobilization of effector T cells and secretion of B cellderived antibodies after secondary pathogen challenge. MCs residing in the dermis exert a determinant alert function through the liberation of various factors and are classically considered as effector cells in the IgE-mediated cutaneous allergic reaction. As emerging now, MC are also involved in immunoregulatory processes during the initiation of adaptive immune responses, the maintenance of peripheral tolerance to skin components and skin regeneration during wound healing. Yet, the crosstalks between MCs and other innate and adaptive immune cells recruited during cutaneous inflammatory conditions have not been elucidated in detail. Here, we report the use of a novel Mast cell fluorescent reporter mouse (RMB), in which we tagged FcεRI+ MCs, with red fluorescence marker tomato (Tdt) and with a conditional ablation system based on concurrent diphtheria toxin receptor (DTR) expression. Using these RMB mice, we visualized MC dynamics and monitored MC interactions with regulatory T lymphocytes (Tregs) after IgE-mediated activation of MCs, in a typical passive cutaneous anaphylaxis (PCA) inflammatory reaction. Using another setting, we further assessed the role of MC during experimental ear skin grafting to reveal their potential influence in skin grafting and rejection. We found that 1) the activation and degranulation of MCs induced by FcεRI crosslinking by multivalent IgE is solely responsible for the PCA reaction and induces the recruitment of highly motile regulatory T cells (Tregs) to the site of inflammation. In these conditions, we found that MC remain sessile and Tregs establish dynamic contacts with MC in the dermis. 2) Further we set up a model system to reveal the molecular requirement for MC-Treg interaction and found that antigen complexed with IgE were able to be presented to Treg in association with major histocompatibility complex class II molecules allowing the formation of stable MC-Treg contacts. 3) Using in vivo skin transplantation model, we showed that conditional ablation of MCs leads to an acceleration of skin transplant rejection in sex-mismatched model (male skin transplant to female). We also found an unexpected impact of MC conditional ablation in sex-matched skin graft (female skin transplant to female) leading to rapid rejection, implying that MCs are essential for the wound healing reaction and the regeneration of tissue continuity after grafting. The aforementioned results point out to an important immunoregulatory role of MC beyond their classically described activator functions in inflamed tissues. The fact that MC constantly interact with Treg during inflammatory processes suggest that MCs could participate in skin homeostasis by exerting tolerogenic functions. These functions remain to be elucidated at the molecular level as presented in the discussion.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La microscopie confocale classique permet d'obtenir des images à haute résolution de cellules en culture ou dans un tissu biologique excisé. Cette technologie peut être adaptée aux applications in vivo grâce à l'utilisation de fibres optiques et d'optiques miniaturisées. A terme, la microscopie confocale fibrée devrait permettre aux médecins et biologistes de réaliser des biopsies optiques; c'est à dire un examen histologique, en temps réel, des tissus biologiques à l'intérieur d'un organisme vivant et directement au contact de la zone d'intérêt.<br /><br />Le but premier de cette thèse est de dépasser les limites matérielles de ces instruments d'imagerie en développant des outils de recalage d'images spécifiques et innovants. En particulier, le propos de ce manuscrit est cadré par l'objectif de proposer, au travers d'outils de création de mosaïques d'images, des biopsies optiques à grand champ aux médecins. Cette application est considérée, dans cette thèse, comme un système, ou un circuit, qui prendrait en entrée un flot de données brutes et délivrerait en sortie des mosaïques d'images à grand champ. Nous détaillons les éléments critiques de ce système, en particulier la reconstruction d'images en temps réel, le recalage linéaire d'images et le recalage non linéaire, avant de présenter la structure du système complet.<br /><br />Les données brutes produites par la microscopie confocale fibrée sont difficiles à interpréter parce qu'elle sont modulées par la structure en nid d'abeille du réseau de fibres optiques et parce qu'elle sont entachées d'artefacts géométriques. Dans ce contexte, nous montrons qu'une reconstruction en temps réel des images peut être utilisée en pré-traitement afin de produire des séquences vidéos directement interprétables. Comme la microscopie confocale fibrée est une imagerie qui se fait au contact des tissus, le mouvement relatif du tissu par rapport à la sonde optique implique qu'il est parfois difficile d'obtenir de manière robuste certaines mesures quantitatives d'intérêt. Nous avons donc attaqué le problème du recalage linéaire, efficace et robuste de paires d'images. Nous montrons que des outils récents provenant du domaine du contrôle robotique par la vision peuvent surpasser les solutions standards utilisées en analyse d'images biomédicales. L'adéquation de ces outils au problème du recalage linéaire d'images nous a amenés à revisiter le problème du recalage non-linéaire. En interprétant le recalage non-linéaire comme un problème d'optimisation sur un groupe de Lie, nous développons un algorithme rapide de recalage difféomorphe non-paramétrique d'images. En plus d'être difféomorphe, notre algorithme produit des résultats qui sont similaires à ceux de l'algorithme des démons de Thirion mais qui sont plus lisses et plus proche de la vérité.<br /><br />Finalement, nous obtenons une boîte à outils de reconstruction et de recalage d'images que nous utilisons pour proposer un algorithme robuste de création de mosaïques d'images qui permette de calculer un alignement globalement cohérent à partir de résultats locaux, de compenser les distorsions liées au mouvement et de retrouver les déformations non-rigides. Par ailleurs, notre algorithme de mosaïques d'images a récemment été incorporé dans un essai clinique multicentrique. Cet essai illustre l'intérêt clinique de nos outils dans le cadre spécifique de la surveillance de l'œsophage de Barrett.

Ce travail de thèse est une approche originale de la compréhension des mécanismes physico-chimiques s'opérant à l'interface des restaurations céramo-céramiques par la microscopie confocale Raman. Il est scindé en trois parties. La première partie expose les caractéristiques d'une chape céramique à noyau zircone (Y-TZP) recouverte d'une céramique feldspathique. Les principaux facteurs responsables de la qualité de l'interface ont été recherchés par une revue de littérature. Le principe de la microscopie confocale Raman a été décrit. La seconde partie est la mise au point des méthodes d'analyse spectrale et d'imagerie Raman, en surface et en profondeur, sur matériaux isolés et à l'interface. La répartition des phases cristallines ou amorphes a été estimée de part et d'autre de cette dernière. La composition chimique élémentaire des composants et une ligne de balayage par traversée de l'interface ont été obtenues par spectroscopie dispersive en énergie (EDS). Le troisième chapitre explore les changements chimiques et morphologiques de l'interface sous différents procédés de fabrication : avec ou sans l'utilisation d'un Liner, avec ou sans utilisation d'une cuisson de régénération de l'Y-TZP. Les images Raman ont été traitées par la fonction d'analyse K-Means Cluster. Une cartographie de la distribution des éléments chimiques a été effectuée par EDS. / This thesis is an original approach to the understanding of the physical and chemical mechanisms operating at the interface of core-veneer all-ceramic restorations by confocal Raman microscopy. It is divided into three sections. The first part describes the characteristics of a zirconia core (Y-TZP) layered with feldspathic ceramic. The main factors affecting the interface have been investigated in the literature review. The principle of confocal Raman microscopy is described. The second part describes the development of spectral analysis and Raman imaging methods, on both the surface and at depth, on isolated materials and at the interface. The allocation of crystalline or amorphous phases was estimated around the interface. The elemental chemical analysis of the components and scanning line through the interface were obtained using energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS). The third section explores the chemical and morphological changes of the interface under different manufacturing methods : with or without an optional liner material between the two components and with or without the use of a regeneration firing of the Y-TZP core. Raman images were processed by K-Means Cluster analysis function. The elemental distribution around the interface was estimated using EDS.